專利名稱：：一種短小芽孢桿菌及其在防治楊樹潰瘍病中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于植物保護領域，尤其涉及一種短小芽孢桿菌及其在防治楊樹潰瘍病中的應用。
背景技術：
：楊樹是重要的速生用材樹種，具有頗高的經濟價值和生態效益。然而，楊樹在生長過程中不斷受到病蟲害的威脅。楊樹潰瘍病是一類危害嚴重的楊樹枝干病害，病原種類繁多，癥狀多種多樣，很難防治。目前，楊樹潰瘍病的防治主要以化學防治和培育抗性品種為主。采用抗病育種的方法雖然取得一定的效果，但卻存在抗性退化、抗性較低等問題；而化學農藥的大量使用又易造成環境污染和生態平衡破壞等。大量研究表明，生物防治在植物病害綜合控制中有著不可替代的作用。近年來，拮抗細菌以其生長繁殖旺盛、易人工培養等優點受到人們的普遍關注，己成為生物防治應用的主力軍。拮抗細菌是否發揮其生防作用，主要取決于是否能在植物體上有效定殖。因此，從楊樹生態系統中分離篩選對楊樹潰瘍病原真菌具有拮抗作用的生防細菌，并進一步利用開展對楊樹潰瘍病的生物防治，是一種較為理想的控制楊樹潰瘍病的方法。芽孢桿菌(Sac///^^;;.)在自然界分布非常廣泛，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態優勢種群之一。它們可以產生豐富的具有潛在植物病害防治和醫學應用價值的抗菌物質，是植物病害生防微生物的重要組成部分(Tamenhiro，2002;蒙顯英，2004)。而且芽孢桿菌內生芽孢，繁殖能力強，有利于工業生產，是自然界中廣泛存在的非致病細菌，對人無害，不污染環境。Mari等(1996)研究發現短小芽孢桿菌(及/ww7m)對某些真菌及病菌具有拮抗作用，是一種有開發前途的生防菌。目前國外主要將短小芽孢桿菌應用于防治蔬菜的根際病害，Akhtar等(2008)報道短小芽孢桿菌用于防治鷹嘴豆根腐病有很好的效果；近年來，我國也有用短小芽孢桿菌防治番茄灰霉病、黃瓜菌核病菌等植物病害的報道(李桂霞等，2009;于婷等，2009)。但短小芽孢桿菌防治楊樹潰瘍病國內外未見報道。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種高效防治楊樹潰瘍病的短小芽孢桿菌。本發明還要解決的一個技術問題是提供上述短小芽孢桿菌的用途。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下高效防治楊樹潰瘍病的短小芽孢桿菌(^d//iwj^m7^)JK-SXOOl，是一種從楊樹干部篩選獲得的對楊樹潰瘍病菌具有拮抗作用且具有內生性的生防細菌菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏號M209026。短小芽孢桿菌(5ad/topwm7w)JK-SX001在牛肉膏蛋白胨培養基平板上菌落較大，淡黃色，直徑一般5~6mm，圓形，邊緣整齊，中間有褶皺，光滑濕潤，菌體直桿狀，大小為lx(l2)pm，周生鞭毛。革蘭氏染色表現為陽性；淀粉水解陰性；兼性好氧；氧化酶反應為陰性；過氧化氫酶反應陽性。測得16SrDNA大部分序列1448bp，具體如SEQIDNo:1所示。16SrDNA基因序列已提交GenBank，登記號GQ169785。將所測16SrDNA序列通過BLAST比對，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與JK-SX001菌株相似性最高的是5ad//^戶m/to，同源性達到99%。構建進化樹發現，JK-SX001與Bfld〃wspmm7ws同屬一個遺傳分枝，親緣關系十分接近。Biolog公司根據細菌代謝的氧化-還原過程，于1989年推出了用于細菌鑒定的Biolog自動鑒定系統。該系統利用細菌對95種碳源的代謝情況來鑒定菌種，即每種細菌形成各自特有的代謝指紋圖譜，選用四唑紫作為細菌能否利用供試碳源的指示劑。與傳統方法相比，Biolog系統具有自動化和標準化程度高、結果快速準確和操作簡便等優點。Biolog細菌鑒定系統己廣泛應用于細菌快速鑒定。通過Biolog系統對JK-SX001進行鑒定，該菌株在鑒定板培養1624h時的讀數相似值(SIM值)為0.802，大于0.50，符合Biolog系統關于理想結果的要求，而且鑒定結果的相似性(PROB)都為99%，因此該菌株利用Bi0l0g系統，準確鑒定到了種，為短小芽孢桿菌(^￡77/^/7,//船)。上述短小芽孢桿菌(&cZ/to戸m/^)JK-SX001及其代謝產物對楊樹潰瘍病原金黃殼囊孢菌(Cyosporac/20^o^ew7fl)、擬莖點霉(P/wj"o;w"sp.)和七葉樹殼梭孢菌(50^70^toen'G^AWea)都具有一定的抑菌作用，因此能夠高效防治楊樹潰瘍病。并且上述短小芽孢桿菌(Sad/^pmrn'/^)JK-SX001對楊樹還具有促生長的作用。上述短小芽孢桿菌(^^7/^;"附//^)JK-SX001產生抑菌物質最多的最佳發酵條件如下培養基每1000mL蒸餾水，含牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，pH8。工藝條件為pH8，通氣量l:1，28°C，搖床轉速200轉/分，發酵48小時。通過上述發酵工藝得到的發酵液即為一種微生物殺菌劑。該發酵液直接施加到土壤中對植物進行灌根處理即可發揮其殺菌作用。有益效果(1)短小芽孢桿菌(Ba"7/wpww7w)JK-SX001為植物內生菌，對楊樹潰瘍病菌抑制作用強，具有拮抗細菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用'例如數量眾多，在植物體內外大量存在；對病原菌的作用方式多樣化；繁殖速度快；在植物體內外定殖力強；能夠人工培養，易于操作，便于生產應用；促進植物的生長等優點，尤其是對楊樹潰瘍病的防治具有重要意義。(2)短小芽孢桿菌JK-SX001培養條件簡單、容易保存，易于工業化生產，具有良好的開發應用前景。短小芽孢桿菌(^ad〃^;w/m7^)JK-SX001，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏號M209026，保藏日2009年2月18日。圖1短小芽孢桿菌JK-SX001對楊樹的促生長作用照片。圖2~圖4短小芽孢桿菌JK-SX001對楊樹潰瘍病溫室防治照片。具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例l:短小芽孢桿菌JK-SX001對楊樹潰瘍病原金黃殼囊孢菌(Q;toy/7orac^7sos;grwa)、擬莖;"^、霉(尸/wmo/wz.51sp.)、七葉樹殼梭孢菌(尸ws/coccwmaescw//)平板抑菌作用。將用NA斜面活化的短小芽孢桿菌JK-SX001菌株劃線接種于PDA平板兩側，再將楊樹潰瘍病病原菌PDA平板培養物用直徑5mm的打孔器打取同質同量的菌塊，點接于平板中間。28'C培養4天觀察抑菌帶的有無，并記錄其寬度(表l)。試驗結果表明，JK-SX001對三種病原菌均有強拮抗作用。表1JK-SX001對3種楊樹潰瘍病病原菌的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2:短小芽孢桿菌JK-SX001的代謝產物對3種楊樹潰瘍病原菌(包括擬莖點霉(尸/wj"o/w^sp.)、金黃殼囊孢菌(Cytos/orac/o^aspe/7wa)、七葉樹殼梭孢菌(fmw.coccwmae;yc"http://))的平板抑菌作用。在PDA平板上鋪上無菌玻璃紙，涂布接種短小芽孢桿菌JK-SX001，3(TC培養48小時，揭去玻璃紙，再分別在平板中央接種病原菌，28'C培養。以不接生防菌對照，待對照菌絲長滿平板后，觀察拮抗活性，并統計抑菌率(表2)。試驗結果表明，JK-SX001代謝產物對三種病原菌均有強拮抗作用。表2JK-SX001的代謝產物對3種病原菌的抑制處理金黃殼囊孢菌(mm)擬莖點霉(mm)七葉樹殼梭孢菌(mm)JK-SX0015.006.567.12對照CK79.0278.4578.66抑菌率(％)10097.8897.12實施例3:短小芽孢桿菌JK-SX001對美洲黑楊實生苗150天的促生長情況。將短小芽孢桿菌JK-SX001接種于NB培養基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，pH7.27.4，蒸餾水lL)發酵48小時，用發酵液浸泡美洲黑楊種子3小時，無菌水沖凈后，進行播種。以無菌水浸泡種子為對照。苗高15cm定苗，每盆4株，150天后測量苗高、地徑。與對照相比，接種JK-SXOOl發酵液能夠顯著的促進實生苗的生長(表3)。與對照(CK)相比，接種JK-SX001的處理在地莖和苗高上差異顯著，促生效果明顯，見圖l。表3JK-SX001對楊樹實生苗生長的影響菌株地徑(cm)苗高(cm)JK-SX0014.77a35.34a對照CK2.56b24.75b注P<0.05短小芽孢桿菌JK-SXOOl內生性試驗。將用利福平(300微克/毫升)標記過的短小芽孢桿菌JK-SX001接種于NB培養基發酵48小時，用該菌株48小時發酵液浸泡美洲黑楊種子3小時，無菌水沖凈后，進行播種。以無菌水浸泡種子為對照。苗高15cm定苗，每盆4株，30天后分別采集楊樹苗的葉子和干部0.5克，將其表面消毒后，力卩2mL無菌水研磨，分別涂布于利福平(300微克/毫升)的NA平板。3(TC培養4天，觀察平板是否有短小芽孢桿菌JK-SX001菌落長出。結果表明，葉子和干部均能回收到短小芽孢桿菌JK-SXOOl。這說明JK-SX001能在楊樹體內較長時期存在，其具有內生性。實施例5:短小芽孢桿菌JK-SX001對溫室盆栽苗楊樹潰瘍病的防治情況。用打孔器分別在金黃殼囊孢菌(Cyas/orac/w^o^wma)、擬莖點霉(P/wmo/w^平)、七葉樹殼梭孢菌(Aw'coco/w"eww//)菌落邊緣處均勻打孔，獲得大小、生長速度一致的菌絲塊。接種的楊樹苗用單面的手術刀片分別在苗干離地面1米處和離地面1.52米處做燙傷處理，然后在燙傷處斜切一小傷口，用鑷子分別將3種病原菌菌絲塊輕輕放在切好的傷口部位，用封口膜將菌絲塊固定在樹皮下的傷口內，并放上一小塊帶有無菌水的棉球保濕。病原菌接種后用JK-SX001液體殺菌劑(109cfij/mL)進行楊樹苗土壤灌根處理，每株50mL。共設3個處理(Tl:接種金黃殼囊孢菌及JK-SX001、T2:接種擬莖點霉及JK-SX001、T3:接種七葉樹殼梭孢菌及JK-SX001)，每處理30個重復，以無菌水灌根為對照(CK1:接種金黃殼囊孢菌、CK2:接種擬莖點霉、CK3:接種七葉樹殼梭孢菌)，另外設一個不接病原菌，以無菌水土壤灌根對照(CK)，以校正發病率，每對照同樣30個重復。上述JK-SX001液體殺菌劑按如下方法制得培養基每1000mL蒸餾水，含牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，pH8。工藝條件為pH8，通氣量l:1，2S。C，搖床轉速200轉/分，48小時。1個月后調查發病情況，結果如表4所示。大部分用JK-SX001液體殺菌劑處理過的苗木接種口愈合，對照病原菌大部分接種口及周圍產生黑色子實體及金黃色分生孢子角，個別嚴重者整株死亡。說明接種短小芽孢桿菌JK-SX001能很好的防治楊樹潰瘍病的發生。對金黃色殼囊孢菌引起的楊樹潰瘍病的防治效果見圖2(A、示對照的發病情況B、示接種JK-SXOOl后沒發病的健康組織)。對擬莖點菌引起的楊樹潰瘍病的防治效果見圖3(A、示對照的發病情況B、示接種JK-SX001后沒發病的健康組織)。對七葉樹殼梭孢菌引起的楊樹潰瘍病的防治效果見圖4(A、示對照的發病情況B、示接種JK-SX001后沒發病的健康組織)。表4室內楊樹潰瘍病防治效果處理發病率(％)感病指數防治效果(％)Tl158.7670.06CK16536.42/T2127.0275.76CK25728.98/T31610.7465.16CK36030.83/SEQUENCELISTING〈110〉南京林業大學<120〉一種短小芽孢桿菌及其在防治楊樹潰瘍病中的應用〈130〉njfufp090322<腸1<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211〉1448〈212〉DNA〈213〉短小芽孢桿菌(^adZ/^/^w/Zw^)<400>1CCTTGTCACTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAA60CTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCT120GATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAAC180TGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTAAACCTTGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTTCTGTCCA240TTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCT300TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGA360TCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAA420GGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAG480GATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGC540TTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGG600AGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCA660TCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCC720TCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTAC780GCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTT840CCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCG900AGCCCTTTACGCCCAATAATTCCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGC960TGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCAAGCAGTTACTCT1020TGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCG1080GCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGG1140AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATC1200GTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAG1260TGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTA1320GCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCC1380GTCCGCCGCTAACATCCGGGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGCAC1440GCGCCCGT1448權利要求1、一種短小芽孢桿菌JK-SX001，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，其保藏編號是M209026，保藏日期2009年2月18日。2、權利要求1所述的短小芽孢桿菌在防治楊樹潰瘍病中的應用。3、權利要求1所述的短小芽孢桿菌在促進楊樹生長中的應用。4、一種防治楊樹潰瘍病殺菌劑，其特征在于該殺菌劑按如下方法制備將短小芽孢桿菌JK-SX001接種于培養基中，pH8，通氣量l:1，28°C，搖床轉速200轉/分，48小時，得到的發酵液即為防治楊樹潰瘍病殺菌劑。5、根據權利要求4所述的防治楊樹潰瘍病殺菌劑，其特征在于所述培養基中，各物質含量如下每1000mL蒸餾水，含牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，pH8。全文摘要本發明公開了一株短小芽孢桿菌JK-SX001，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，其保藏編號是M209026，保藏日期2009年2月18日。本發明還公開了上述短小芽孢桿菌在防治楊樹潰瘍病中的應用和在促進楊樹生長中的應用。本發明還提供了一種防治楊樹潰瘍病殺菌劑，即將JK-SX001接種于培養基中發酵培養所得。本發明的JK-SX001為植物內生菌，對楊樹潰瘍病菌抑制作用強，且培養條件簡單、容易保存，易于工業化生產，具有良好的開發應用前景。文檔編號C12N1/20GK101643711SQ200910027349公開日2010年2月10日申請日期2009年5月31日優先權日2009年5月31日發明者任嘉紅,葉建仁,吳小芹,王艷芳申請人:南京林業大學