專利名稱：豬血超氧化物歧化酶的規模化提取方法
技術領域：
本發明屬于生物化工領域，特別是一種超氧化物歧化酶的提取方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)簡稱SOD是廣泛存在于好氧微生物和 動植物中的金屬酶。目前在厭氧生物體內也發現SOD的存在。它催化超氧化物陰離子自由 基發生歧化反應，SOD是生物體內主要的氧自由基清除劑，可催化超氧陰離子自由基(02_) 發生歧化反應202-+2H+ — H202+02SOD在維持生物體內超氧陰離子自由基產生與消除的動態平衡中起重要作用，它 可以防御氧毒性，增強機體抗輻射損傷能力，還可以預防衰老，以及在一些疾病如腫瘤、炎 癥和自身免疫的治療中有良好的療效，日前S0D已進入化妝品、食品和醫藥等領域。從豬血中制備S0D的方法比較多，與本發明相關的方法主要有(1)氯仿_乙醇沉 淀除去血紅蛋白；(2)丙酮沉淀濃縮收集粗酶；(3) —次膜分離；(4)層析柱吸附洗脫等步 驟組成。此類方法存在下列缺陷第一，氯仿-乙醇沉淀除去血紅蛋白，可以得到粗酶液，但 血紅蛋白被嚴重污染，無法綜合利用，造成資源浪費，同時有機溶劑成本較高，無形中增加 了生產的成本；第二，用丙酮沉淀濃縮可得粗酶液，但同時丙酮對酶的活力破壞比較大，會 使產品酶活力降低；每三，只用一次膜過濾截流無法對將蛋白質的分子量控制在一個較窄 的范圍之內；第四，生產工藝復雜，周期較長，規模小，不能直接放大規模化生產，這是此類 技術最突出的問題。
發明內容
本發明的目的就是要解決以上問題，提供一種豬血超氧化物歧化酶的規模化提取 方法，建立起一種規模化的豬血超氧化物歧化酶的最優化生產技術，盡可能少用或不用各 種有機溶劑，以減少有機溶劑對酶穩定性的破壞和帶來的毒性，并且使工藝簡單易操作，成 本低，生產處理量大，使豬血超氧化物歧化酶的生產技術達到工業化生產水平，使最后得到 的酶達到電泳純。本發明的技術方案是這樣得以實現的一種豬血超氧化物歧化酶的規模化提取方 法，其特點是將豬血加入抗凝劑檸檬酸鈉溶液后，以大容量連續分離機_蝶式離心機分離 血漿和紅細胞，紅細胞可保存于4°C的冷庫中，時間為5天以內；在紅細胞中加入2倍體積 的重蒸水，攪拌勻漿；在勻漿液中加入2%的葡萄糖作為保護劑，60°C熱變性20分鐘；以分 子膜進行超濾，一級超濾截流分子量36000道爾頓，二級截流分子量30000道爾頓，并對二 級截流液進行濃縮；酶液經層析柱純化，最后冷凍干燥得超氧化物歧化酶純品。本發明的有益效果是第一，本規模化生產工藝沒有使用有機溶劑，徹底革除乙醇 和氯仿等有機溶劑，簡化工藝過程，降低生產成本；第二，對環境的污染很小，主要原因是沒 有使用機溶劑；第二，副產品可進一步綜合利用，如分離出來的血紅蛋白沒有受到污染，可 進一步利用，如果用有機溶劑分離血紅蛋白，則沒法進一步加工；第四，膜過濾時采用二次截流，可以減化生產工藝，同時工藝的連續操作性更強；第五，該工藝簡單，處理量大，能夠 在幾小時內處理500Kg的豬血，并使生產周期僅為36小時；第六，機器的清洗難度小；第 七，生產過程緊湊，無太多浪費，成本低。生產的酶比活達到3500-10000U/mg。
具體實施例方式實施例1取10Kg豬血，加入7%的檸檬酸鈉溶液，用蝶式離心機連續分離得到紅細胞，并用 10Kg的生理鹽水洗滌后，加入20L重蒸水攪拌30分鐘，在勻漿液中加入2%的葡萄糖作為 保護劑量，60°C熱變性20分鐘，濾液用超濾柱進行分離，一級超濾截流分子量36000道爾 頓，二級截流分子量30000道爾頓，將二級截流液濃縮，再經蛋白層析柱純化后，用連苯三 酚檢測法檢測得酶的比活力為8600U/mg蛋白，透析脫鹽后，進行冷凍干燥得成品。實施例2 取500Kg豬血，加入7 %的檸檬酸鈉溶液，用蝶式離心機連續分離得到紅細胞，并 用10Kg的生理鹽水洗滌后，加入20L重蒸水攪拌30分鐘，在勻漿液中加入2%的葡萄糖作 為保護劑量，60°C熱變性20分鐘，濾液用超濾柱進行分離，一級超濾截流分子量36000道爾 頓，二級截流分子量30000道爾頓，將二級截流液濃縮，再經蛋白層析柱純化后，用連苯三 酚法檢測得酶的比活力為7400U/mg蛋白，透析脫鹽后，進行冷凍干燥得成品。
權利要求
一種豬血超氧化物歧化酶的規模化提取方法，其特征在于將豬血加入抗凝劑檸檬酸鈉溶液后，以大容量連續分離機-蝶式離心機分離血漿和紅細胞，紅細胞可保存于4℃的冷庫中，時間為5天以內；在紅細胞中加入2倍體積的重蒸水，攪拌勻漿；在勻漿液中加入2％的葡萄糖作為保護劑，60℃熱變性20分鐘；以分子膜進行超濾，一級超濾截流分子量36000道爾頓，二級截流分子量30000道爾頓，并對二級截流液進行濃縮；酶液經層析柱純化，最后冷凍干燥得純品。
全文摘要
本發明公開了一種豬血超氧化物歧化酶的規模化提取方法，是用新鮮豬血為原料生產超氧化物歧化酶，具體的工藝過程為，將豬血加入抗凝劑檸檬酸鈉溶液后，以大容量連續分離機分離出紅細胞、紅細胞冷藏、攪拌勻漿、熱變性、二級膜分離截流、柱層析、洗脫最后冷凍干燥得超氧化物歧化酶成品。工藝流程的特點，每一過程都采用能夠連續化生產的分離技術，使整個生產過程能夠規模化；工藝過程不使用有機溶劑，使環境污染降低到最低限度，副產品可進一步加工精深加工。得到的成品其比活力可達到3500-10000U/mg。本發明操作簡單，豬血原料充足的地區適合于工業化規模生產。
文檔編號C12N9/08GK101886062SQ20091002657
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月13日 優先權日2009年5月13日
發明者李豪, 谷燕, 黃維 申請人:李豪;谷燕