專利名稱：：一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及應用此方法制備的體外診斷試劑盒，可以檢測出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
背景技術：
：在本文中，術語"Rh"是恒河猴(RhesusMacacus)外文名稱的頭兩個字母。RhD抗原自1939年被發現以來，因導致新生兒溶血病、發生血管外遲發性溶血性輸血反應而成為紅細胞中僅次于ABO血型的重要抗原。Rh血型的抗原性很強，尤其以D抗原最強，僅次于ABO系統的A和B抗原。凡是人紅細胞上有RhD抗原者，為Rh陽性，反之為陰性。RhD陰性血型在中國人中所占比例約為3596e，屬于稀有血型。50%75。/。的Rh陰性個體通過輸血和妊娠，可受D抗原紅細胞免疫而產生抗D;隨著對Rh血型的不斷研究，認為Rh血型系統可能是紅細胞血型中最為復雜的一個血型系。世界各國的衛生組織都嚴格規定，個體在輸血時，只能輸用Rh陰性血液。Rh血型的發現，對更加科學地指導輸血工作和進一步提高新生兒溶血病的實驗診斷和維護母嬰健康，都有非常重要的意義。Rh抗原是由位于l號染色體短臂上的兩個同源及緊密連鎖的基因所編碼，即RhD和RhCE基因，每個基因都是由10個外顯子組成；RhD基因編碼D抗原，RhCE基因編碼Cc和Ee抗原。RhD和RhCE的外顯子與內含子有93.8%的同源性，外顯子l7編碼5060個氨基酸，外顯子810編碼最后58個殘基。兩者最顯著的區別是內含子4，RhD的內含子4少了約600bp。RhD和RhCE基因分別長57295bp和57831bp，兩個基因相隔約30kb，尾對尾形成排列(5，RhD3，-3，RhCE5，)，中間隔差一個功能未知的小膜蛋白l基因(SMP1基因)，RhD基因的兩端存在有兩個具有98.6M同源性的區域被稱為Rh盒子(Rhboxes);RhD陰性的RhD基因缺失，兩端的Rhboxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rhbox-hybrid),成為RhD陰性基因的特征。見附圖l。近年來，研究發現一些血清學初檢RhD陰性的個體經過進一步敏感的血清學檢驗，如吸收放散試驗，可以能檢出D抗原的存在，即部分RhD陰性個體擁有難以檢測出的D抗原。進一步的研究顯示，此類D抗原又可以分為部分D(partrial-D)和弱表現型D(weak-D)兩種類型；部分D個體制表達部分而非完整的D抗原，在數量和本質上都與RhD陽性的D抗原有區別，而弱D表達的D抗原是完整的與RhD陽性相比，只有在D抗原數量上有顯著區別。這兩類特殊血型中都可以檢出D基因，這就有兩個方面值得探討一是這些個體的基因屬于沉默基因或無效基因；二是這些個體并非真實RhD陰性，而是D抗原較弱，一般檢測方法未檢測到RhD抗原。現已發現RhD陰性的個體中存在著一種重要的RhD的弱表現型DEL(D-elution，elution中文意為洗脫)，DEL在所占比例在不同文獻報告中所占的比例也不同，國外報告在黑人和日本人中DEL4比例較高，約3050%，中國人初篩RhD陰性的人群中香港報告DEL占30X，內地占20~30%。目前已證實DEL基因外顯子均無缺失，RhD基因表達調控的差異可能是DEL的產生原因，已有的研究顯示在中國大陸、中國臺灣和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外顯子的1227位發生GA的突變引起的，導致mRNA產生變異，使蛋白質的表達量減少，但抗原性質未變；而1227位的G〉A突變也成為東亞人群的特異的很重要的基因標記。DEL血型引起了日益增加的關注主要源于兩個方面一是目前國內外對DEL血型作為RhD陰性血型對待，DEL血液仍用于供給RhD陰性患者使用，但國內外都有越來越多的報道證實RhD陰性患者輸用DEL血液后，產生了抗-D抗體或體內抗-D抗體效價升高，可能引起輸血反應，成為臨床輸血中的不安全因素；二是DEL表達的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能夠輸用D陽性血液，從而節約寶貴的RhD陰性血液資源？以上的研究都必須對DEL血型進行準確的鑒定，同時大規模的檢測也需要采用可靠、簡便和經濟的方法才能夠進行。用免疫血清學的方法對DEL血型的檢出有賴于使用的抗-D試劑和操作方法，可靠性較低，而且由于步驟繁瑣而不適合臨床大規模應用，可靠的方法是應用基因檢測的方法來檢出DEL血型。目前，國外已有多種根據1227位發生G〉A的突變而設計的檢測試劑盒問世，可用于DEL血型的檢出，但存在以下缺點1、價格昂貴產自德國的BAG和INNO-TRAIN公司的D基因檢測試劑雖然可靠性好，但每人份約需12001300人民幣元，非常昂貴；產自美國G&T公司試劑，雖然每人份約需100人民幣元，但可靠性較差，而且這個價格仍然是大規模檢測難以承受的；2、操作繁瑣德國的BAG和IVIN公司的D基因檢測試劑每人份需要48個反應管，而美國G&T公司試劑每人份需要12個反應管，樣本DNA和耗材的消耗量很大，而且加樣繁瑣，容易出錯，同時判讀困難，不適于大規模的檢測工作；3、內對照均為人類生長激素基因，但我們實際使用中發現有內對照有擴增條帶，但檢測帶無擴增產物，不能判斷有些陰性結果是否是由于Rh基因降解所致。
發明內容本發明的目的是為了克服前述試劑的缺點，提供一種經濟、簡便和直觀的分子生物學方法以及實施該方法的試劑盒。本發明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及為實施該方法制備的體外診斷試劑盒，用于檢測人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點的改變，設計多對引物，進行聚合酶鏈反應(PCR)來完成的。因此，本發明可被視為是基于PCR-SSP(Sequencespecificprimer,序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對不同位點而設計出序列特異性引物，然后通過優化序列特異性引物的混合比例、反應緩沖液組分和PCR反應條件，從而達到準確檢測出人類RhD血型基因型的目的。在本文中，術語"多重PCR"是指通過在同一個反應中同時完成多個基因的擴增的篩選檢測方法。研究表明，對于成功進行多重PCR尤為重要的因素是用于擴增不同基因的不同引物對之間的相對濃度、PCR緩沖液的濃度、循環溫度、氯化鎂和dNTP濃度間的平衡。在一個實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependoff管內加入12.8^1PCR引物緩沖液、2.0nl引物混合物、2.0pldNTP混合物、0.2nlTaqDNA聚合酶和3.0nl模板DNA,充分混合；(2)將Ependofff放入PCR擴增儀中，94'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，56°C、40秒和72'C、2分鐘)，隨后72"延伸5分鐘，然后將溫度降低到4。C;(3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照其中，所淑CR引物緩沖液包含2.0pl500mMKCl、2.0nl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.0pl25mMMgCl2、0.2nl1.0M(NH4)2SO4、0~2.0plDMSO、0~1.0(il甘油和4.06.1plDDW。所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴增片斷長度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴增片斷長度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴增片斷長度為在1921bp，其設計原理見附圖2，序列見表l。所有引物的濃度均為25pmol/pJ，其混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5，可選比例EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=3.5:3.5:1.5:1.5:1.5:1.5:7:7。在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependoff管內加入12.8nlPCR引物緩沖液、2.0nl引物混合物、2.0nldNTP混合物、0.2^1TaqDNA聚合酶和3.0nl模板DNA，充分混合；(2)將Ependofff放入PCR擴增儀中，94。C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，56°C、40秒和72'C、2分鐘)，隨后72'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C;以及(3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果并拍照；其中，所^PCR引物緩沖液包含.0nl500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6pi25mMMgCl2、0.2nl1.OM(NH4)2S04、1.0plDMSO和5.0plDDW。所有引物的濃度均為25pmol/nl，所述引物混合物混合比例為SEQIDN01:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:65:6i在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP混合物l管；(5)陽性對照2管，陰性對照l管；以及(6)使用說明書；其中，所述的PCR引物緩沖液包含2.0nl500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.0tU25mMMgCl2、0.2p1.0M(NH4)2SO4、02.0nlDMSO、0~1.0^1甘油和4.0~6.1plDDW;所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴增片斷長度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴增片斷長度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴增片斷長度為在1921bp，其設計原理見附圖2，序列見表l。所有引物的濃度均為25pmol/pl，其混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5，可選比例EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=3.5:3.5:1.5:1.5:1.5:1.5:7:7。在本發明的另一實施方式中，本發明一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP混合物1管；(5)陽性對照2管，陰性對照l管；以及(6)使用說明書；其中，所淑CR引物緩沖液包含.Ojil500mMKC1、2.0pi100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6nl25mMMgCl2、0.2fill.OM(NH4)2S04、〗.0filDMSO和5.0filDDW。所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5。在本發明另一實施方式中，本發明還涉及所述試劑盒在檢測人類RhD血型基因型中的用途。試劑盒為體外診斷試劑盒，用于檢測人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發明的一個或多個實施方式的細節在附圖和下面的說明中有描述。通過閱讀附圖、詳細描述和權利要求可以清楚地了解本發明的其他特征、目的和優點。附圖1描述的是Rh血型基因組結構圖。RhD和處CE基因尾對尾形成排列(5'RhD3，-3，RhCE5')，中間隔差一個功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)，RhD基因的兩端存在有兩個具有98.6%同源性的區域被稱為Rh盒子(Rhboxes);從圖中可以看到RhD陰性的RhD基因缺失，兩端的Rhboxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rhbox-hybrid),成為RhD陰性基因的特征。附圖2是RhD血型基因型檢測試劑盒引物設計原理圖，描述的是設計的引物所針對的D基因位置及特異性示意圖。本發明引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，SEQIDNOl最末堿基針對1227位發生G>A的突變而設計，SEQIDN02位于第9、10外顯子之間的內含子中，引物擴增片斷長度為102bp;SEQIDN03和SEQIDNO4分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物,作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，其中SEQIDN052位于第9、IO外顯子之間的內含子中，無序列特異性，SEQIDN06位于RhD基因第IO外顯子中，與同位置RhCE基因有11個堿基差異，具有序列特異性，擴增片斷長度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，其中SEQIDN07位于上游Rh盒子基因內，在下游Rh盒子基因無相同序列，SEQIDN08位于下游Rh盒子基因內，在上游Rh盒子基因無相同序列，擴增片斷長度為在1921bp。圖中紅色為3，端位點不符，不能進行相應的擴增，顯示出本發明所設計的引物具有很好的特異性。附圖3為單對引物的PCR反應電泳圖，通過單對引物的PCR反應結果，A為SEQIDNOl和SEQIDN02擴增結果，產物大小為102bp,與目標產物相符；B為SEQIDN03和SEQIDN04、SEQIDN05和SEQIDN06擴增結果，都獲得了目的片斷；C為SEQIDN07和SEQBDN08擴增結果，比對DL2000的標尺，產物大小為2000bp左右，與目的片斷的大小相符，說明設計的引物合適。附圖4為引物不同比例混合PCR電泳圖，其中，模板為DEL/d型，Marker為DL2000，描述的引物在不同比例的混合后PCR反應電泳的結果，樣本為DEL/d，目標條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp,從圖中可見，混合組分3和4可以將樣本DEL/d的所有4個條帶擴增出來，適用于本發明的多重PCR方法，其中組分3各產物的量較組分4更為均衡，為最佳混合比例，組分4為可選混合比例，其他混合比例都不能擴增出全部條帶。附圖5顯示的是不同配方緩沖液對混合PCR的影響，模板DNA為已知的DEL/d型，目標條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp，從圖中可見只有7號配方能夠是PCR反應擴增出所有目標條帶，而其他配方都有條帶丟失，說明不適于本發明。雖然在多重反應中，有報道5e/^10。/。的DMSO和甘油可以改善擴增的效率(提高產物量)和特異性(沒有非特異性產物)，但在本發明中，5。/。的DMSO是反應的最佳濃度，增加和減少都對反應不利。而甘油的添加對反應會產生抑制作用。同樣有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR擴增的效率，但在本發明中也沒有作用。'附圖6顯示的是不同的退火溫度對PCR反應的影響。樣本DNA為4例DEL，目的條帶3條，分別為102bp、206bp和261bp;2例DEL/d，目標條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp;l例d/d，目標條帶為2條，分別為206bp和1921bp;1例D/D型，目標條帶為2條，分別為206bp和261bp。圖中可見，5'C和5°C的退火溫度是反應出現了非特異性的條帶，而5'C的退火溫度使部分條帶未被擴增出來，而5"C退火溫度條件下，己知基因型的樣本都被正確檢出。附圖7'為本試劑盒檢測RhD基因型電泳圖，其中，M:Marker,Takara，DL2000。1、2為INNO-TRAIN公司的標準質控對照，l為D/d型，2為d/d型，38為待測樣本，3為D/D，4為D/d,5為del/d,6為d/d,7為del/d，8為d/d。描述的是檢測本試劑盒靈敏度和特異性的試驗結果，判定格局為D/d型，目標條帶為3條，分別為206bp、261bp和1921bp;d/d型，目標條帶為2條，分別為206bp和1921bp;D/D型，目標條帶為2條，分別為206bp和261bp。DEL/d，目標條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp;根據不同的條帶可以判斷出檢測結果，INNO-TRAIN公司的標準質控對照D/d型和d/d型也被準確檢出。附圖8為INNO-TRAIN公司試劑盒RhD基因分型電泳圖。描述的是用本發明試劑檢出的D/d型、DEL/d型和d/d型用INNO-TRAIN公司的D基因檢測試劑盒進行復檢，根據表5的格局判斷結果，兩種試劑盒結果相符。附圖9為對西安市Rh陰性無償獻血者RhD基因型檢測圖，根據擴增條帶判斷結果，D/d型，目標條帶為3條，分別為206bp、261bp和1921bp;d/d型，目標條帶為2條，分別為206bp和1921bp;D/D型，目標條帶為2條，分別為206bp和261bp。DEL/d，目標條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp;從反應結果可以看出，樣本中有D/d型、DEL/d型、D/D型和d/d型，本發明只要一個反應孔就可以鑒定出RhD血型的基因型，操作簡便，成本低，結果易于判定，適于大樣本量篩選和檢測。已采用本試劑盒篩選了437例西安市Rh陰性無償獻血者的基因型，檢出del/d基因型88例，占Rh陰性無償獻血者20%，無效D基因型(D/D和D/d)33例，占7.5%。具體實施方式本發明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法以及用于實施該方法的體外診斷試劑盒。本發明的方法和試劑盒可用于檢出人類RhD血型基因荊，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點的改變，設計多對引物，進行聚合酶鏈反應(PCR)來完成的。因此，本發明可被視為是基丁PCR-SSP(Sequencespecificprimer,序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對不同位點而設計山序列特異性引物，然后通過優化序列特異性引物的混合比例、反應緩沖液組分和PCR反應條件，從而達到準確檢測出人類RhD血型基閔型的目的。本發明的基礎部分在于對Rh血型基丙的認識。Rh抗原是由位于1號染色體短臂上的兩個同源及緊密連鎖的基閔所編碼，即RhD和RhCE基因，每個基閔都是由IO個外顯子組成；RhD基丙編碼D抗原，RhCE基因編碼Cc和Ee抗原。RhD和RhCE的外顯子與內含子有93.8%的同源性。RhD和RhCE基閔分別長57295bp和57831bp，兩個基因相隔約30kb,尾對尾形成排列(5'RhD3'-3'RhCE5')，中間隔差一個功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基W)，RhD基因的兩端存在有兩個具有98.6^同源性的區域被稱為Rh盒子(Rhboxes);RhD陰性的RhD基因缺失，兩端的Rhboxes基岡部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rhbox-hybrid),成為RhD陰性基肉的特征。中國人陸、中國臺灣和日本等地的DEL血刑，都是由丁-在RhD基閔第9外顯子的1227位發生G〉A的突變引起的，導致mRNA產生變異，使蛋白質的表達量減少，但抗原性質未變；而1227位的G〉A突變也成為東亞人群的特異的很重要的基因標記。W此，設計出的引物必須能夠特異性地擴增出RhD基因而非RhCE基因，同時還能夠對不同的D基因型加以區分。原理見附圖2。在一個實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基閔型的多重PCR方法，基丁對PCR-SSP以及由此發展出的多重PCR原理的應用。成功進行多重PCR尤為重要的因素是用于擴增不同基因的不同引物對之間的相對濃度、PCR緩沖液的濃度、循環溫度、氯化鎂和dNTP濃度間的平衡。該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependofft內加入12.8plPCR引物緩沖液、2.0nl引物混合物、2.0pldNTP混合物、0.2^1T叫DNA聚合酶和3.0pl模板DNA，充分混合；(2)將Ependofft放入PCR擴增儀中，9。C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9°C、40秒，5°C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C;(3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照。其中，緩沖液基于普通PCR緩沖液的基本配方(KCl+Tris-HCl)添加佐劑而配制，在實施方式中，試驗過不同濃度的甘油、DMSO、(NH4)2S04和BSA等佐劑。雖然在多重反應中，有報道5。/"10n/。的DMSO和10甘油可以改善擴增的效率(提高產物量)和特異性(沒有非特異性產物)。本發明所述PCR引物緩沖液包含2.0pi500mMKC1、2,0pl100mMTris陽HCl(PH9.0)、2.0pJ25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、0~2.0HiDMSO、0-1.0nl甘油和4.04.1nlDDW。所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴增片斷長度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp;SEQ1DN05和SEQIDN06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基岡的上下游引物，擴增片斷長度為261bp;SEQ1DN07和SEQIDN08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基丙的上下游引物，擴增片斷長度為在1921bp，其設計原理見附圖2，序列見表l。所有引物的濃度均為25pmol/nl，在實施方式中，試驗了多種不同引物對之間的相對濃度，采用同一模板(已知D基閔型)和反應條件下，對比產物的均衡性，最終確定了引物的的最佳比例。其混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQ1DN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5，可選比例EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEGIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=3.5:3.5:1.5:1.5:1.5:1.5:7:7。反應條件如下9'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9°C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7。C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。可選反應條件為9'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9°C、35秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7t:延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照；在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependoff管內加入12.8nlPCR引物緩沖液、2.0pl引物混合物、2.(^ldNTP混合物、0.2WTaqDNA聚合酶和3.0jil模板DNA，充分混合；(2)將Ependofft放入PCR擴增儀中，9'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9'C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4。C;(3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照；在本發明中，5。/。的DMSO是反應的最佳濃度，增加和減少都對反應不利。而甘油的添加對反應會產生抑制作用。同樣有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR擴增的效率，但在本發明中沒有作用。本發明所述PCR引物緩沖液包含.O^500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6pi25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、1.0^DMSO和5.0plDDW。所有引物的濃度均為25pmol/nl，所述引物混合物混合比例為SEQ1DNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5。在另一個實施方式中提供了本發明不同退火溫度下的反應結果，盡管許多基因能在退火溫度為5C6'C被特異的擴增，我們的經驗表明，，當同時擴增許多特異的基因時，擴增效率高的基因會使擴增效率低的基因的擴增產量降低。將退火溫度降低4。C6。C對于在多重PCR中擴增出同樣的基因是必需的。過低的退火溫度會出現非特異性的擴增條帶，高的退火溫度會導致擴增缺失。最終確定的反應條件如下9'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9'C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4i:。在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基閑型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP泡合物1管；(5)陽性對照2管，陰性對照l管；以及(6)使用說明書；其中，所述的PCR引物緩沖液包含2.0^1500mMKCl、2.0pllOOmMTris-HCl(PH9.0)、2.0pi25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2SO4、0~2.0plDMSO、0~1.0^1甘油和4.0~6.1plDDW;所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基閑的上下游引物，擴增片斷長度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯于的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴增片斷長度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴增片斷長度為在1921bp，其設計原理見附圖2，序列見表l。所有引物的濃度均為25pmol/nl，其混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5，可選比例EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQTDN05:SEQIDN06:SEQTDN07:SEQIDN08=3.5:3.5:1.5:在本發明的另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血辨基因型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP混合物1管；(5)陽性對照2管，陰性對照l管；以及(6)使用說明書；其中，所述PCR引物緩沖液包含2.0pi500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6nl25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、1.0nlDMSO和5.0nlDDW。所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDNCM、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。泡合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5。反應條件如下9'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9°C、40秒，5°C、40秒和7°C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4i:。取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照；在本發明另一實施方式中，本發明還涉及所述試劑盒在檢測人類RhD血型基肉荊中的用途。試劑盒為體外診斷試劑盒，用于檢測人類RhD血型基因荊，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因難。包含本發明所使用的多種其他試劑，如dNTP-Mk和Taq酶為非限制性的。現在已經一般性地描述了本發明，通過參考下面的實施例可以更容易地理解本發明，下面的實施例是通過說明的方式提供的，并不意味著對本發明的限制，除非特別說明。實施例實施例l引物序列的設計根據特異性的位點設計的引物序列，所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQTDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，SEQIDNOl最末堿基針對1227位發生G>A的突變而設計，SEQIDN02位于第9、10外顯子之間的內含子中，引物擴增片斷長度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，其中SEQIDN052位于第9、10外顯子之間的內含子中，無序列特異性，SEQIDN06位于RhD基因第lO外顯子中，與同位置RhCE基因有11個堿基差異，具有序列特異性，擴增片斷長度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，其中SEQIDN07位于上游Rh盒子基因內，在下游Rh盒子基因無相同序列，SEQIDN08位于下游Rh盒子基因內，在上游Rh盒子基因無相同序列，擴增片斷長度為在1921bp，其設計原理見附圖2，序列見表l表l本發明引物序列表引物名稱引物序列產物大小引物特異性SEQIDNOl5'-ATGACCAAGTTTTCTGGAAA-3'102bpDEL基因SEQIDN025'-CAGCAAGTCAACATATATACT-3'SEQIDN035'-ACTGACACCGACAGTCCTT-3'206bp內對照SEQIDN045'-GCTGTGTCCTGGCAATGGT-3'SEQIDN055'-GTAATGAGACATTTAGGCT-3'261bpD基因SE(JIDN065'-CAACTCCATTTTCTCTGACT-3'SEQIDN075'-AAGGTTTCCAAACCCCAA-3'1921bpRhbox勿brid(RhD陰性)SEQIDN085'-CTCTTTTCTGGCCTTAACAT-3'實施例2單對引物的PCR反應通過單對引物的PCR反應來驗證引物設計的合理性，以最終確定能夠用于多重PCR反應的引物組分。試驗材料為d/d、D/d和DEL型DNA，反應緩沖液為普通PCR緩沖液，Taq酶購自上海Promega公司，dNTP購自北京鼎國生物科技公司。反應體系為20nl:在0.5mL的Ependoff管內加入1.0jil引物、2.0plPCR緩沖液、2.0pl25mMMgCl2、l.OfildNTP混合物、0.2^1TaqDNA聚合酶、3.0pl模板DNA和11.8pl雙蒸水，充分混合.根據引物的Tm值確定退火溫度，反應條件分別如下SEQIDN01和SEQIDN02:9'C變性5分鐘，然后進行30個循環的PCR反應(9'C、30秒，6'C、30秒和7°C、30秒)，隨后7"C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。SEQIDN03和SEQIDN04:9。C變性5分鐘，然后進行30個循環的PCR反應(9'C、30秒，5'C、30秒和7'C、30秒)，隨后7。C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。SEQIDN05和SEQ1DN06:9。C變性5分鐘，然后進行30個循環的PCR反應(9'C、30秒，5'C、30秒和7'C、30秒)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。SEQIDN07和SEQIDN08:9。C變性5分鐘，然后進行30個循環的PCR反應(9'C、30秒，5'C、30秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。取出PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果并拍照；反應結果見附圖3，可見都有目的條帶，說明引物設計合理，可以擴增出目的條帶。實施例3引物混合比例的優化由于不同引物在同一個發應條件下的序列親和性和擴增效率有很大的不同，從而導致反應產物量的不同，因此通過本實施例的優化挑選，確定能夠實現各對引物都有較為明顯的擴增產物。弓I物同PH8.0的TE緩沖液溶解為濃度25pmol/fi1，按照表2所示為其中一次混合比例的試驗，按照表中所示比例分組配制混合引物。根據多重PCR退火溫度設定原則，退火溫度為5°C，模板DNA為DEL/d型，反應體系為20^1:在0.5mL的Ependoff管內加入2.0nl引物混合液、2力nPCR緩沖液、2.0^25mMMgCl2、2.0nldNTP混合物、0.2^1T叫DNA聚合酶、1.0nlDMSO,3.0nJ模板DNA和7.8jxl雙蒸水，充分混合；反應條件分別如下'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9'C、30秒，5'C、30秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V,20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照；試驗結果見附圖4，從圖中可見，混合組分3和4可以將樣本DEL/d的所有條帶擴增出來，適用于本發明的多重PCR方法，其中組分3各產物的量較組分4更為均衡，為最佳混合比例，組分4為可選混合比例，其他混合比例都不能擴增出全部條帶，不適于本發明。表2引物混合比例表組別SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN0811:1:1:1:1:1:4:421:1:1:1:2:2:4:434:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.543.5:3.5:1.5:1.5:1.5:1.5:7:75lr1:2:2:2:361:1.5:1.5:1.5:1.5:4:473:3r1:1:2:2:4:481:1:1:1:0J:0.5:5:5實施例4PCR緩沖液的配制緩沖液基于普通PCR緩沖液的基本配方(KCl+Tris-HCl)添加佐劑而配制，在實施方式中，試驗過不同濃度的甘油、DMSO和BSA等佐劑以及Mg^濃度等。表3為其中一組配方，以不斷增加甘油、DMSO和Mg^濃度，以對比反應產物特異性和量。根據多重PCR退火溫度設定原則，退火溫度為5'C，模板DNA為DEL/d荊，反應體系為20pl:在0.5mL的Ependoff費內加入12.8nlPCR引物緩沖液、2.0pl引物混合物、2.0nldNTP混合物、0.2nlTaqDNA聚合酶和3.0nl模板DNA,充分混合；將Ependofff放入PCR擴增儀中，9。C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9'C、40秒，5'C、40秒和7°C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C;取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照；反應結果見附圖5。從圖中可見，根據配方7的擴增產物可以判斷出待檢DNA為DEL/d型，其他配方不能完全擴增出所有的條帶，不適于本發明。在另一組反應中，BSA被證明對本發明無明顯作用，而10mM(NH^SO4的終濃度被認為是一個合適的佐劑濃度。雖然在多重反應中，有報道5。/。10。/。的DMSO和甘油可以改善擴增的效率(提高產物量)和特異性(沒有非特異性產物)，但在本發明中，5n/。的DMSO是反應的最佳濃度，增加和減少都對反應不利。而甘油的添加對反應會產生抑制作用。同樣有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR擴增的效率，但在本發明中沒有作用。因此，本發明提供的PCR反應緩沖液配方比例如下2.0^1500mMKCl、2.0^1100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6pl25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、1.0(ilDMSO和5.0(ilDDW。表3PCR緩沖液配方表<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例5不同退火溫度對PCR反應的影響在確定了引物混合比例和緩沖液配制組分后，通過不同退火溫度對PCR反應的影響，以確定最佳反應溫度。樣本為4例DEL,2例DEL/d，l例d/d和l例D/D艱DNA。在0.5mL的Ependo贈內加入12,8nlPCR引物緩沖液、2.0nl引物混合物、2.0nldNTP混合物、0.2^1TaqDNA聚合酶禾n3.0pl模板DNA，充分混合；將Ependoff管放入PCR擴增儀中，9。C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9"C、40秒'X'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4。C;取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠屯泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照；X為不同的退火溫度，按照表4所示設置，1、2、3、4為4組不同退火溫度的反應組。表4設置的不同退火溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>反應結果見附圖6，從圖中可見，5r和5'C的退火溫度是反應出現了非特異性的條帶，而5'C的退火溫度使部分條帶未被擴增出來，而5"C退火溫度條件下，已知基因型的樣本都被正確檢出。本發明提供的最終反應條件為9"C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9'C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7"C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4"C。實施例6本發明與其他試劑盒對比在本發明的另一實施方式中，本發明一種檢測人類RhD血荊基因型的試劑盒，該試劑盒包含引物混合物l管；PCR引物緩沖液1管；Taq聚合酶l管；dNTP混合物l管；陽性對照2管，陰性對照l管；以及使用說明書其中，所述PCR引物緩沖液包含2.0nl500mMKC1、2.0nl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6nl25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2SO4、1.0plDMSO和5.0nlDDW。待檢DNA包括有INNO-TRAIN公司的標準質控對照，D/d型和d/d型；按照使用說明書，在0.5mL的Ependo贈內加入12.8^dPCR引物緩沖液、2.0pl引物混合物、2.0nldNTP混合物、0.2nlTaqDNA聚合酶禾U3.(^l模板DNA，充分混合；反應條件如下9'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9'C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延仲5分鐘，然后將溫度降低到4'C;取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V,20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照。INNO-TRAIN公司的檢測試劑盒可以檢出RhD基因型，，其使用方法如下取1.5ml離心管l支，按照樣木的多少(設為X個樣本)加雙蒸水42Xpl、試劑盒的紅色反應液(redPCR)21X(il、T叫瞎(5U巾1)0.56Xnl，混勻備用；PCR反應液配制根據樣本數的多少，取X支1.5ml離心管，并標記好樣本編號，每管加入63^1前述配制的混合液，在加入7(ilDNA，混勻。將樣本加入試劑盒的反應管屮，10nl/孔，共6孔。反應條件如下9。C變性2分鐘，然后進行10個循環的PCR反應(9'C、20秒和6"C、l分鐘)，20個循環的PCR反應(9'C、20秒，6'C、l分鐘和7'C、30秒)，隨后7。C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。根據其反應格局判斷檢測結果，其反應格局見表5<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>附圖7為本發明試劑盒對樣本DNA的檢出結果，試劑盒可以于檢出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。將檢出的D/d、DEL/d和d/d基因型采用INNO-TRAIN公司的檢測試劑盒進行相符性的檢測，結果完全相符，見附圖8;在其他的實施方式中，隨機抽取20份樣本DNA，分別采用德國INNO-TRAIN公司和美國G&T公司D基因檢測試劑檢測，其結果與本發明檢測結果相符，說明本發明試劑盒有很好的可靠性。實施例7本發明試劑盒檢測RhD基因性本發明提供的一種檢測人類RhD血型基丙刑的試劑盒，該試劑盒包含弓l物混合物l管；PCR引物緩沖液l管T叫聚合酶l管；dNTP混合物l管；陽性對照2管，陰性對照l管；以及使用說明書；采用本試劑盒檢測西安市Rh陰性無償獻血者的RhD基丙型，按照使用說明書，在0.5mL的Ependoff管內加入12.8nlPCR引物緩沖液、2.0^1引物混合物、2.0(xldNTP混合物、0.2^1TaqDNA聚合酶和3.0^1模板DNA，充分混合；反應條件如下9'C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(9'C、40秒，5'C、40秒和7°C、2分鐘)，隨后7"C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4。C;取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠屯泳(200V,20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照。反應結果見附圖9，結果判斷參見附圖7，本發明只要一個反應孔就可以鑒定出RhD血刑的基閑型，包括純合子和雜合子'如D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型，操作簡便'成本低，結果易T判定，適丁-大樣本量篩選和檢測。已采用本試劑盒篩選了"7例西安市Rh陰性無償獻血者的基因型，檢出del/d基因型88例'占Rh陰性無償獻血者加％'無效D基丙型(D/D和D/d)33例，占7.5%。引物序列表<110>陜西省血液中心<120>—種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法及試劑盒<140><141><160>8<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1ATGACCAAGTTTTCTGGAAA<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2CAGCAAGTCAACATATATACT<210>3<211>19<212>DNA<220><223><400>3ACTGACACCGACAGTCCTT<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4GCTGTGTCCTGGCAATGGT<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5GTAATGAGACATTTAGGCT<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6CAACTCCATTTTCTCTGACT<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>7AAGGTTTCCAAACCCCAA<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>8CTCTTTTCTGGCCTTAACAT權利要求1、一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependoff內加入12.8μlPCR引物緩沖液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μlTaqDNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；(2)將Ependoff管放入PCR擴增儀中，9℃變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應，包括9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分鐘，隨后7℃延伸5分鐘，然后將溫度降低到4℃；(3)取出PCR產物，4％瓊脂糖凝膠電泳，200V20分鐘，紫外燈下觀察結果并拍照。2、如權利要求l所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物緩沖液包含2.0nl500mMKC1、2.0pl100mMPH9.0Tris-HCI、2.0pi25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、0~2.0jilDMSO、0~1.0nl甘油和4.06.1plDDW。3、如權利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述PCR弓I物緩沖液包含2.0nl500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6nl25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、1.0plDMSO和5.0nlDDW。4、如權利耍求l所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物木發明引物泡合物包含SEQIDNOl、SEQ1DN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDNOS，其序列見說明書中表l。5、如權利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQ1DN02、SEQ1DN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQ1DN06、SEQIDN07和SEQIDN08，本發明提供的最佳混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5。6、一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP混合物1管；(5)陽性對照2管，陰性對照l管；以及(6)使用說明書。7、如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其中所述的PCR引物緩沖液包含2.0pl500mMKC1、2.0pl100mMPH9.0Tris-HCl、2.0pi25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、0-2.0|ilDMSO、0~1.0|^1甘油和4.0~6.1HiDDW。8、如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，其中所述PCR引物緩沖液包含2.0nl500mMKCl、2.0^1100mMPH9.0Tris-HCl、2.6pi25mMMgC12、0.2nl1.0M(NH4)2S04、1.0piDMSO和5.0nlDDW。9、如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08,其序列見說明書中表l。10、如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08,本發明提供的最佳混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:65:6.5。11、如權利要求6-10中任一權利要求所述的試劑盒用于檢測人類RhD血型基因型，可以檢測出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。全文摘要本發明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及應用此方法制備的體外診斷試劑盒，可以檢測出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點的改變，設計多對引物，進行聚合酶鏈反應(PCR)來完成的。因此，本發明可被視為是基于PCR-SSP(Sequencespecificprimer，序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對不同位點而設計出序列特異性引物，然后通過優化序列特異性引物的混合比例、反應緩沖液組分和PCR反應條件，從而達到準確檢測出人類RhD血型基因型的目的。在一個實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法；在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒。本發明的一個或多個實施方式的細節在附圖和說明中有描述。通過閱讀附圖、詳細描述和權利要求可以清楚地了解本發明的其他特征、目的和優點。文檔編號C12Q1/68GK101597642SQ20091002215公開日2009年12月9日申請日期2009年4月23日優先權日2009年4月23日發明者葉世輝,張建耕,華徐,邢荷香申請人:陜西省血液中心