專利名稱：：一種防治小麥病害的芽孢桿菌及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物農藥
技術領域：
，涉及一種防治小麥病害的新菌株，特別涉及一種防治小麥病害的芽孢桿菌及其制備方法和應用。
背景技術：
：小麥是世界性的重要糧食作物，全世界約有35%40%的人口以小麥作為主要糧食(金善寶.中國小麥學.北京:中國農業出版社，1996:1-3.)。20世紀80年代以來隨著矮稈、半矮稈品種的推廣和水肥條件的改養，小麥病害的發生及危害在我國日趨嚴重。小麥條銹病在我國西南、西北麥區20012005年連年成災，由偶發性病害發展成常發性病害，使得我國廣大麥區的小麥生產處于條銹病大流行危害的威脅中；小麥全蝕病90年代以來在關中地區渭北旱塬、洛河下游、秦嶺北麓23個縣區也呈現擴大趨勢。目前，還沒有好的抗病品種來控制這幾種小麥主要病害的發生，因而殺菌劑的應用在小麥病害的防治中仍然占有重要地位。雖然化學防治具有見效快、效果穩定、明顯、易于操作和低成本的特點，在控制小麥病害的發生中也取得了一定的成效，但無論哪種殺菌劑，大量單一類型長期使用，均有出現病菌產生抗藥性的風險，而且浪費人力、物力和財力，特別是會造成環境污染。因此，在推行的無公害農藥和可持續農業生產的今天，開發和研制不易產生抗藥性的、較少引起污染的環境友好型生物殺菌劑已成為農藥發展的必然趨勢。植物內生菌是一種能在植物組織中定殖與運轉，対植物無害甚至有益的微生物，由于它在植物體內有穩定的生存空間，且能產生與宿主植物代謝相同或相似的生理活性物質，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。近年來，隨著植物內生菌(endophytes)及其物種多樣性和功能多樣性的發現，特別是由于內生菌的獨立進化，它們可更好地適應宿主、或產生某些對宿主有益的功能如產生抗菌等生理活性物質抵抗病原菌、害蟲的侵害，因而在植物病害的生物防治方面具有優勢并引起了植物病理學家的廣泛關注(AndrewsJH.Biologicalcontrolinthephylloshere.AnnRevPhytopathol,1992，30:603~605.)。本發明將報道一株內生細菌一芽孢桿菌EIR-j菌株的發現及其防病作用。，芽孢桿菌是一種比較常見的細菌，在植物病害防治的應用上備受重視。這是因為其會與病原菌競爭根系中的營養，進而成為優勢菌株，降低病原菌的危害；加上可以產生內生孢子，在逆境下容易存活；且在產孢過程中能產生對多種病原菌有抑制作用的抗生物質，應用性極廣。目前，對芽孢桿菌的研究很多，但是對于植物內生芽孢桿菌的研究卻甚少。
發明內容本發明的目的旨在探尋生物農藥的新來源，利用植物內生菌資源而開發一種可以用于小麥主要病害防治的高效、可產業化生產的生防菌菌株及其菌株的制備方法。實現上述發明目的的技術方案具體如下芽孢桿菌(Ba"'〃船)EIR-j菌株，(以下簡稱為EIR-j菌株)，己于2007年8月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.!2134，保藏單位地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。本發明的ElR-j菌株分離方法，具體包括下列步驟1)將來自中國陜西省田間自然生長的小麥根系用自來水沖洗后展開晾干，每株取l/4根系剪碎，各植株的根段樣品混合后稱取lg進行表面消毒；2)將消毒后的材料在消毒研缽中加、9mL無菌水研磨至糊狀，取原液、稀釋100倍液和1000倍液，分別搖勻后取200nL涂在加有多菌靈的PDA平板上，每個處理重復3皿，在27'C下培養1周后，可分離到ElR-j菌株，于-80°。保藏。所述的表面消毒的條件是樣品先用70%酒精處理608，接著在濃度為3.125%NaC10中處理6min，再用70%酒精處理30s，最后用無菌水沖洗35次。所述的多菌靈是濃度為50pg/mL的25%可濕性粉劑。檢測表面消毒是否徹底的方法是將消毒后的無菌水取20(VL涂在PDA平板上。本發明的ElR-j菌株經菌落和形態的顯微觀察、染色反應、常規生理生化特性試驗以及16SrDNA序列分析，該菌株鑒定為芽孢桿菌的一個新菌株(ElR-j)，具有以下特征(A)形態特征菌體為桿狀，2x8^im，革蘭氏染色陽性，芽孢中生，周生鞭毛；(B)培養特征菌落呈現圓形，表面有皺褶，無光澤，不光滑，菌落邊緣不規則擴展；(C)生理生化特征生長溫度2050'C，最適生長溫度為3(TC;在pH為5.7的培養基中可以生長，可以耐受10n/。的NaCl;'甲基紅試驗和纖維素分解試驗為陰性；接觸酶試驗、脲酶試驗、擰檬酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗、硫化氫產生試驗和明膠液化試驗均為陽性；(D)16SrDNA序列分析結果在GeneBank中進行最大同源性比較，發現16SrDNA測序結果與芽孢桿菌16SrDNA序列同源性達到100%。本發明還有一個目的是提供ElR-j菌株的菌體，它是按照下列方法制備的將-8(TC保藏的ElR-j菌株接種在NA培養基上，2528'C培養2d后，將其單菌落接種到lOOmLLB培養液中，于37°C、150rpm黑暗振蕩培養1824h，然后按照1%的種子液接種到100mL的LB培養液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養4048h，所得菌液經800010000rpm離心20min后，所得沉淀即為ElR-j菌株的菌體。所述的NA培養基由10g蛋白胨、5gNaCl、3g酵母粉、14g瓊脂粉和1000mL蒸餾水組成；LB培養液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸餾水組成，其pH值為7.2。本發明還有一個目的是提供ElR-j菌株的抗菌活性物質，是按照下列方法制備的將-80。C保藏的ElR-j菌株接種在NA培養基上，25-28。C培養48h后，將其單菌落接種到lOOmLLB培養液中，于37。C、150rpm黑暗振蕩培養1824h，然后按照1%的種子液接種到lOOmL的LB培養液中，于28匸、150rpm黑暗振蕩培養4048h，所得菌液經8000rpm離心20min后，所得的無菌上清液用80%飽和度硫酸銨鹽析，4。C過夜，經12000rpm離心30min所得沉淀進行透析并濃縮的物質。本發明還有一個目的是提供ElR-j菌株在防治小i全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病及促進小麥種子萌發和小麥生長中的應用。本發明還有一個目的是提ElR-j菌株的菌體在防治小麥全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病及促進小麥種子萌發和小麥生長中的應用。本發明還有一個目的是提供ElR-j菌株的抗菌活性物質在防治小麥全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病及促進小麥種子萌發和小麥生長中的應用。本發明的ElR-j菌株的抗菌活性物質成分通過鹽析，電泳和層析技術所得，經鑒定為多種抗菌蛋白質。本發明的ElR-j菌株有較強的抑制小麥主要病原真菌活性，具備了芽孢桿菌和內生菌作為生防因子的雙重特性，是一種很有開發潛力的生物農藥，可用于小麥主要病害的防治。本發明的ElR-j菌株來源于小麥根部，篩選方法簡單，操作方便，產品質量穩定，無毒副作用，綠色環保，對防治小麥全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病效果顯著。圖lElR-j菌株的菌體和抗菌活性物質對小麥全蝕病、小麥白粉病和小麥條銹病的盆栽防治作用的對照圖2ElR-j菌株的菌體對小麥生長的促生作用的對照圖3ElR-j菌株的抗菌活性物質對小麥全蝕病菌抑制作用的對照圖。圖4ElR-j菌株的抗菌活性物質進行PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。具體實施例方式下面通過發明人給出的制備實施例和使用效果試驗例來進一步詳述本發明ElR-j菌株的有益效果，但本發明的內容并不局限手此。實施例l:ElR-j菌株的分離、鑒定將采自陜西長武縣自然生長的小麥根系用自來水沖洗后展開晾干，每株取1/4根系剪碎，所有植株的根段樣品混合后稱取lg進行表面消毒(70%酒精60s~>3.125%NaClO中處理6min—70%酒精30s—無菌水沖洗3-5次)。將最后一次沖洗過的無菌水取200pL涂在PDA平板上，用于檢測表面消毒是否徹底。將表面消毒后的樣品材料在消毒研缽中加9mL無菌水研磨至糊狀，取原液、稀釋100倍液和1000倍液，分別搖勻后取200pL涂在加有多菌靈(50jxg/mL，25%可濕性粉劑，浙江一帆農化廠生產)的PDA平板上，每個處理重復3皿，在27。C下培養1周后，可分離到ElR-j菌株^所得菌株采用甘油保藏法于-8(TC保藏。將分離到的ElR-j菌株分別接種于含4mLLB培養液的試管中，于37'C、150rpm黑暗振蕩培養48h，培養液離心后沉淀用無菌水懸浮，取0.1mL接種于PDA平板邊緣，小麥全蝕病菌和小麥紋枯病菌菌餅(0-4mm)置PDA平板中央，每個處理重復3皿。25'C培養3d后每天測量病原真菌直徑，并計算抑菌率。對照不接種細菌菌體。其中，抑制率(％)=(對照菌落直徑一處理菌落直徑y對照菌落直徑xl00n/。，菌落直徑單位(cm)根據內生細菌對小麥全蝕病菌和紋枯病菌的抑制結果，篩選到一種高效抗菌的活性菌株，經顯微觀察、染色反應、常規生理生化特性試驗以及16SrDNA序列分析，鑒定為芽孢桿菌ElR-j菌株。實施例2:ElR-j菌株菌體的制備方法將-80。C保藏的ElR-j菌株接種在NA培養基上，2528。C培養2d后，將其單菌落接種到lOOmLLB(Luria-Bertani:10g蛋白胨;'10g酵母粉；5gNaCl;1000mL蒸餾水，調pH-7.2)培養液中，于37°C、150rpm黑暗振蕩培養1824h，然后按照1%的種子液接種到100mL的LB培養液中，于28"、150rpm黑暗振蕩培養48h，所得菌液經8000rpm離心20min后，所得沉淀即為ElR-j菌株的菌體。實施例3:ElR-j菌株的抗菌活性物質的制備方法將-8(TC保藏的ElR-j菌株接種在NA培養基上，2528。C培養2d后，將其單菌落接種到100mLLB培養液中，于37°C、150rpm黑暗振蕩培養1824h，然后按照1%的種子液接種到100mL的LB培養液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養4048h，所得菌液經8000rpm離心20min后，所得的無菌上清液用80%飽和度硫酸銨鹽析，4匸過夜，經12000rpm離心30min所得沉淀進行透析并濃縮的物質。試驗例1:ElR-j菌株的抗菌活性物質離體抑菌活性實驗將實施例3所述的1R-j菌株的抗菌活性物質用細菌過濾器過濾，取濾液0.2mL加入到50mL放有2個小麥全蝕病菌菌餅(0-4mm)的PD培養液中，每處理重復三瓶，20°C、100rpm黑暗振蕩培養7d后，稱量各瓶菌絲干重并計算抑制率。對照加入滅菌的LB培養液。抑制率(％)=(對照菌絲干重一處理菌絲干重)/對照菌絲干重xlOO%，菌絲干重單位(g)結果表明，ElR-j菌株的抗菌活性物質對小麥全蝕病菌生長的抑制作用顯著(見圖3)，圖中a代表清水對照，b代表抗菌活性物質(濃度0.2mg/ml)，抑制率可達到73.63%。試驗例2:ElR-j菌株的活性物質的分析實施例3中所述ElR-j菌株的抗菌活性物質進行PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳(見圖4)，對其中幾條明顯的條帶切膠回收進行抑菌活性實驗，結果表明多種蛋白質具有抑制全蝕菌生長的活性。試驗例3:ElR-j菌株的菌體防治小麥全蝕病的盆栽實驗將ElR-j菌株在NB培養基上活化后，在lOOmLLB培養液(Luria-Bertani:10g蛋白胨；10g酵母粉；5gNaCl;1000mL蒸餾水，調pH-7.2)中接種兩環，于37°C、150rpm黑暗振蕩培養1824h，然后按照1°/。的種子液接種到lOOmL的LB培養基中，于28'C、150rpm黑暗振蕩培養48h,發酵液經8000rpm離心20min后，沉淀用無菌水制成孢子懸浮液，濃度為108109cfU/mL。將內生細菌的孢子懸浮液30mL同時澆灌于剛播種并接有全蝕病菌的花盆中，以只接種全蝕菌接種體作為發病對照，每個處理3個重復。于15'C放置34周后，用水沖去植株根部的沙土，調查每株的根長、株高、根鮮重、根干重、地上部鮮重、地上部干重以及發病情況，用病根面積占總根面積的百分率作為嚴重度指標，嚴重度分為5級。以澆灌清水為空白對照，小麥種子量1%的25%多菌靈粉劑拌種處理為藥劑對照，計算病情指數和防效，并進行方差分析。病情指數S(各級病株數x代表數值)/(調査總株數x發病最重級的代表數值)xlOO防治效果(％)=(對照組病情指數一處理組病情指數)/對照組病情指數xlOO%結果表明，ElR-j菌株的菌體對小麥全蝕病的防治效果可達到70%以上，根部、地上部重量以及病情指數與空白對照在0.05水平上差異顯著，而與藥劑對照間差異不顯著(圖l，A)，其中A:對小麥全蝕'病，a:清水+小麥全蝕病菌接種體；b:25%多菌靈可濕性粉劑(按照1%種子量拌種)+小麥全蝕病菌接種體；c:ElR-j菌株的菌體(濃度108109cfu/mL)+小麥全蝕病菌接種體。試驗例4:ElR-j菌株的菌體防治小麥全蝕病的田間小區試驗采用隨機區組分析，3個重復，每個小區面積為lm2，種5行，每行播種2.5g種子和5g小麥全蝕病菌接種體，同時澆灌ElR-j菌株的菌體(濃度108109cfb/mL)500mL，濃度為108~109cfli/mL。以只接種全蝕病菌的為發病對照，不接種的為空白對照，只接種ElR-j菌株的為生防菌對照。分別在小麥苗期、拔節期和乳熟期，調查發病株數，計算發病率和防治效果。同時在小麥乳熟期，調査穗數、穗粒數、白穗數、計算產量、千粒重等。在小麥播種后10d對試驗小區麥田的出苗情況進行了調査，結果發現，沒有接種Ggt的健康和生防菌對照出苗都很好，麥苗生長健壯，葉色較綠，接種全蝕病菌的出苗比健康對照稀疏，葉色有的發黃。在小麥拔節期對植株的生長情況進行調查發現，沒有接種Ggt的健康和生防菌對照明顯比接種全蝕病菌的發病對照和生防菌處理長勢好，植株健壯。只接種內生細菌的比健康對照略微高一些，沒有明顯的差異。用生防菌處理的小區發病率較發病對照要小，ElR-j菌株的菌體處理的防治效果達到了26.08%(表1)。表1ElR-j菌株在小麥拔節期對植株的影響處理株高(cm)發病率(cm)病情指數防治效果(％)發病對照67.9383.3331.94—ElR-j+Ggt71.1377.7823.6126.08健康對照70.8055.5615.28一ElR-j77.8777.7830.56—ElR-j菌株的菌體在小麥乳熟期對植株的株高、平均穗粒數、千粒重和產量都有不同的影響。內生細菌處理與發病對照相比，平均株高、平均穗粒數、千粒重和產量都有不同程度的增加。只接種生防菌的對照和健康對照相比，平均株高和千粒重也都有所增加，但是與對照差異不顯著(表2)。表2ElR-j菌株在小麥乳熟期對植株的影響處理株高(cm)平均穗粒.數千粒重(g)產量(g)發病對照61.934.931.8568.3ElR-j+Ggt70.237.433.8575.0健康對照70.439.333.6673.0ElR-j72.437.135.5690.0試驗例5:ElR-j菌株的菌體對小麥種子萌發及小麥生長的促進作用用不同濃度的ElR-j菌株的菌體(無菌水懸浮為10U10^cfb/mL)浸泡濾紙，然后將小麥種子(97148)進行表面消毒(5y。NaCIO表面消毒5min，無菌水沖洗3次)，放在濾紙上進行催芽，每張濾紙上放20粒種子。每個處理重復三次，用無菌水浸泡濾紙作為空白對照。48h后測量根長、芽長以及出芽率。結果顯示，ElR-j菌株對小麥種子的萌發有不同程度的促進作用，對種子的萌發率沒有抑制作用。盆栽方法同試驗例3，處理僅用ElR-j菌株的菌體(濃度108109cfo/mL)，對照不做任何處理。結果表明處理的小麥苗在根長、苗高、干重和濕重上都較對照要生長得好(見圖2)，圖2中a表示清水對照；b表示ElR-j菌株菌體(濃度108109cfu/mL)處理。試驗例6:ElR-j菌株的菌體對小麥條銹病的防治效果選取直徑10cm的小花盆，每盆種20顆種子，16r下，16h光周期在溫室中生長。78d苗齡后，用條銹菌32號生理小種夏孢子接種第一片真葉。接種后15。C下保濕24h，然后取出放在溫室中，溫度控制在1220°C，曰照每天為16h，進行培養。ElR-j的保護作用測定在接種條銹菌前24h和同時，分別接種ElR-j菌株的菌體(濃度為108109cfii/mL)，每個處理3盆，以清水噴施的作為對照。治療作用測定在接種條銹菌后24h和7d后，噴施ElR-j菌株的菌體(濃度為108109cfli/mL)，每個處理3盆，以清水噴施的作為對照。待對照充分發病后調查嚴重度，病斑面積，計算病情指數和防病效果。結果表明，ElR-j菌株的菌體對小麥條銹病具有非常好的保護作用，防治效果高達93.8%，但并沒有治療作用(圖1C;表3)。圖1C表示對小麥條銹病的防治效果，a:對照，僅接種小麥條銹病菌；b:ElR-j菌株的菌體(濃度108109cfu/mL)+小麥條銹病菌。表3不同處理內生ElR-j菌株對小麥條銹病的防治作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>試驗例7:ElR-j菌株的菌體及抗菌活性對小麥白粉病的防治效果小麥2葉1心期時，在接種小麥白粉病菌前24h和接種后24h，分別用ElR-j菌株的菌體(無菌水懸浮為108109cfii/ml濃度)和抗菌活性物質噴施葉片，對照為噴施清水。每一個處理所用的菌液為lOOml，分為3個重復，每個重復20株小麥。接種小麥白粉菌后，黑暗保濕24hp2(TC下培養10d后，統計發病嚴重度，計算病情指數和防治效果。結果表明，用抗菌活性物質處理過的小麥葉片幾乎看不到白粉病斑如(圖1，B)，圖中B表示對小麥白粉病，a表示接種小麥白粉病菌；b表示抗菌活性物質+小麥白粉病菌，防效可以達到80%以上，而ElR-j菌株的菌懸液處理的防治效果低于前者，為41.20%。1權利要求1.芽孢桿菌(Bacillussp.)E1R-jCGMCCNo.2134。2.制備權利要求l所述的芽孢桿菌ElR-j菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將來自中國陜西省田向自然生長的小麥根系用自來水沖洗后展開晾干，每株取l/4根系剪碎，各植株的根段樣品混合后稱取lg進行表面消毒；2)將消毒后的材料在消毒研缽中加9mL無菌水研磨至糊狀，取原液、稀釋100倍液和1000倍液，分別搖勻后取200|iL涂在加有多菌靈的PDA平板上，每個處理重復3皿，在27'C下培養1周后，可分離到ElR-j菌株，于-80。C保藏。3.根據權利要求2所述的芽孢桿菌ElR-j菌株的制備方法，其特征在于，所述的表面消毒的條件是樣品先用70%酒精處理60s，接著在濃度為3.125%NaC10中處理6min，再用70%酒精處理30s，最后用無菌水沖洗35次。4.根據權利要求2所述的芽孢桿菌ElR-j菌株的方法，其特征在于所述的多菌靈是濃度為50嗎/mL的25%可濕性粉劑。5.權利要求1所述的芽孢桿菌E1R-J菌株的菌體，其特征在于，它是按照下列方法制備的將一8(TC保藏的ElR-j菌株接種在NA培養基上，2528t:培養2d后，將其單菌落接種到100mLLB培養液中，于37"C、150rpm黑暗振蕩培養1824h，然后按照l。/。的種子液接種到100mL的LB培養液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養4048h，所得菌液經800010000rpm離心20min后，所得沉淀即為芽孢桿菌ElR-j菌株的菌體。所述的NA培養基由10g蛋白胨、5gNaCl、3g酵母粉、14g瓊脂粉和lOOOmL蒸餾水組成；所述的LB培養液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸餾水組成，其pH值為7.2。6.權利要求1所述的芽孢桿菌E1R-J的抗菌活性物質，其特征在于，它是按照下列方法制備的將一8(TC保藏的ElR-j菌株接種在NA培養基上，2528"C培養48h后，將其單菌落接種到lOOmLLB培養液中，于37°C、150rpm黑暗振蕩培養1824h，然后按照1%的種子液接種到100mL的LB培養液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養4048h，所得菌液經8000rpm離心20min后，所得的無菌上清液用80°/。飽和度硫酸銨鹽析，4'C過夜，經12000rpm離心30min所得沉淀進行透析并濃縮的物質。7.權利要求1所述的芽孢桿菌ElR-j在防治小麥全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病及促進小麥種子萌發和小麥生長中的應用。8.權利要求5所述的芽孢桿菌ElR-j菌體在防治小麥全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病及促進小麥種子萌發和小麥生長中的應用。9.權利要求6所述的芽孢桿菌ElR-j的抗菌活性物質在防治小麥全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病及促進小麥種子萌發和小麥生長中的應用。全文摘要本發明公開了芽孢桿菌(Bacillussp.)E1R-j，于2007年8月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2134；還公開了該菌株的分離與鑒定方法、菌體制備方法、抗菌活性物質的制備方法；還公開了E1R-j菌株及其菌體和抗菌活性物質在防治小麥全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病及促進小麥種子萌發和小麥生長中的應用。本發明的E1R-j菌株來源于小麥根部，篩選方法簡單，操作方便，產品質量穩定，無毒副作用，綠色環保，對防治小麥全蝕病、小麥白粉病、小麥條銹病效果顯著。文檔編號C12N1/20GK101486981SQ200910021079公開日2009年7月22日申請日期2009年2月10日優先權日2009年2月10日發明者喬宏萍,冰劉,宮宇飛,康振生,高小寧,黃麗麗申請人:西北農林科技大學