專利名稱：利用pre-miR159a構建的抗病毒植物表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和生物技術領域，具體涉及了一種采用擬南芥pre-miR159a的克 隆、改造、轉化以及轉基因制得的抗病毒載體。
背景技術：
植物病毒病是農作物的主要病害，目前約有iooo多種植物病毒病已被人們所認識。每年
全世界的農作物因病毒侵害的損失高達200億美元，對農業生產構成了嚴重的威脅。因此， 植物病毒病的防治早已是農業工作者關注和研究的重要對象。早期對病毒病的防治措施主要 是栽培管理和傳統的抗病育種。通過改善裁培管理來增強植物的抗病性，這一措施只能是減
輕植物的發病程度但不能從根本上解決植物病毒發生的問題；而傳統的抗病育種由于育種周 期長，加之絕大多數植物缺少抗病毒基因或植物對某一病毒的抗性是一種多基因效應，很難 通過傳統育種的方式獲得抗病毒植株，因此，通過傳統的育種方法來防治植物病毒病已遠遠 無法滿足人們的要求。近年來，植物分子生物學和基因工程技術的發展給植物病毒病的抗病 育種幵辟了新途徑。利用病毒本身的一些基因或經改造合成的基因轉入受體植物中去，可獲
得抗病毒的轉基因植株。最早獲得成功的是使用病毒外殼蛋白基因(CP),這一策略是使轉 CP基因在植株內表達，干擾病毒的正常增殖環節，從而達到抗病目的。此外，利用病毒的復
制酶基因、運動蛋白基因轉化植物也是植物抗病毒基因工程的重要策略，并已成功地應用于 一些病毒病的防治中。早期的研究大多是通過表達病毒的蛋白質來實現抗病的，轉基因序列 表達蛋白量的多少直接影響著抗性水平的高低，因此這類抗性常稱作蛋白質介導的抗性。其 主要特征是抗性水平與轉基因的蛋白質表達量成正相關。但是，隨著研究的深入，與蛋白質 介導的抗性特點相背的例子逐漸增多，甚至在無翻譯起始密碼子的情況下，轉基因仍可以賦
予植物抗性，這是不同于蛋白質介導抗性的另一種抗病類型，即RNA介導的病毒抗性。
在植物抗病毒基因工程育種中，RNA介導的病毒抗性是同源依賴的抗性，即轉入的病毒 基因在細胞核內正常轉錄或高水平轉錄，轉基因mRNA轉運到細胞質后與同源的入侵病毒核酸 發生堿基互補，形成雙鏈核酸，然后被寄主內的核酸酶所降解，轉基因發生了RNA沉默，而 入侵病毒則不能進一步復制，從而賦予轉基因植物對特異病毒的抗性。在這一過程中轉基因 植物發生的RNA沉默是由于病毒入侵轉基因植物所導致的，因此又稱這類RNA沉默為病毒誘 導的RNA沉默。另一種是在沒有病毒侵染的情況下轉入的病毒基因發生了 RNA沉默，即由于 轉基因插入方式的不同、轉基因高拷貝的存在、轉基因插入位點等造成了轉基因高水平轉錄，
3形成了大量異常RNA,這些異常RNA很容易被寄主內的RNA依賴的RNA聚合酶所識別，然后 以異常RNA為模板，轉錄形成雙鏈RNA,進一步被寄主體內的核酸酶降解，轉基因發生了MA 沉默。當同源的病毒入侵時，病毒的核酸被細胞內已經發生的RNA沉默機制所降解，病毒不 能復制，轉基因植物表現為對特異病毒的抗性。這類RNA沉默稱之為轉基因誘導的RNA沉默。 研究發現，無論是病毒誘導的RM沉默還是轉基因誘導的RNA沉默，直接導致MA沉默發生 的是小分子干擾RNA (small interference RNA， siRNA)。因此，將上述兩類RM沉默介導 的病毒抗性統稱為siRNA參與的RNA沉默介導的病毒抗性。在植物抗病毒工程中這一策略得 到了廣泛地運用，獲得了大量抗病毒的轉基因植物。但是，隨著研究的深入人們發現這一策 略存在著一些弊端，主要體現在三個方面第一，siRM的產生和傳播受寄主植物內一些酶 活性、環境溫度的變化和病毒抑制子等相關因素的影響。如這類轉基因植物的病毒抗性往往 因溫度的降低而抗病性喪失、能產生沉默抑制子的病毒入侵，通過抑制RM沉默而打破了轉 基因植株的抗病性。第二，這一策略需要完整的病毒基因或較長的病毒cDM片斷，而長片斷 在植物中如果沒有足夠大的同源性則容易造成脫靶，不會發生RNA沉默，轉基因植物就不會 產生抗病毒作用。第三，轉入長的病毒cDNA片斷存在著與其他入侵病毒或寄主植物的基因 組發生重組的風險，轉基因植物的安全性得到一定程度的質疑。因此，在目前研究的基礎上 很有必要探討更有效的植物抗病毒育種新策略。
近年來，隨著對小分子RM研究的深入，人們發現植物內還存在著一類稱為microRM的 小分子RM,它們在植物的發育調控、植物的抗逆生理等過程中具有重要的生物學功能。曲 靜等首次將microRNA應用到植物抗病毒基因工程中，對pre-miM59a基因進行克隆、改造、 轉化，使轉基因植株產生amiRNA (artificial microRM)，由于amiRNA與入侵的病毒核酸 發生互補，從而抑制了病毒的復制。曲靜等采用這一策略獲得了抗黃瓜花葉病毒(CMV)的轉 基因煙草。但是通過該方法所獲得的轉基因植物只能針對單一的病毒具有抗性，采用該策略 獲得抗多種病毒的轉基因植株尚未報道。
發明內容
根據現有技術，發明人進行了進一步的研究和實驗，最終利用擬南芥中的pre-miR159a, 針對煙草的不同病毒TMV、 PVX、 PVY改造pre-miR159a為pre-miR159a""、 pre-miR159a"5、 preiiR159,—"。。利用基因重組技術將以上三個前體串聯整合成一段新的基因序列，置于CaMV 35S啟動子之下，構建植物表達載體，采用農桿菌介導的方法轉化煙草品種本生煙。
一種抗病毒載體，其基因序列中含有至少一段下列序列
a. pre-miR159a"26,其序列如Seq ID No: 1所示；
b. pre-miR159aP25，其序列如Seq ID No: 2所示；c. pre-miR159aw，其序列如Seq ID No: 3所示。
其中a. pre-miR159aP'"是將不同地區的TMV的126kDa核苷酸進行同源比對，選取保守 的21nt區域作為靶序列，之后根據選定靶序列設計特異引物并進行PCR擴增制得的，其中具 有能產生成熟amiR159a""和其反義鏈(amiR159aP126* )的序列，序列如Seq ID No: 1中所示。
同理，b. pre-tniR159a"5和c. pre-miR159a"。加均采用同樣的方法針對PVX的25kDa和 PVY的HC-Pro制得，其中preiiR159a"5具有能產生成熟amiR159ap"和其反義鏈 (amiR159aP25*)的序列，序列如Seq ID No: 2中所示；而pre-(niR159a^^具有能產生成熟 amiR159a11。P"和其反義鏈(amiR159a"cP'°"的序列，序列如Seq ID No:3中所示。
為了使所得的轉基因植株能夠具有多重病毒的抗性，可以根據現有的生物技術，采用限 制性內切酶和連接酶作為生產手段，將上述的序列串聯在一起，從而獲得同時含有 pre-miR159a， pre-miR159aP25、 pre-miR159a"26的表達載體，其序列如SEQ ID NO: 17所示， 進而培養相應的植株。由于本發明所針對的主要是煙草等雙子葉植物的轉基因工作，因此所 采用的表達載體為PBI，本發明采用的為PBI122,也可根據具體情況采用其他的雙子葉表達載 體，含有pre-miR159aHC—Pr°、 pre-miR159aP25、 pre-miR159a"26的三者的串聯序列在載體中的位 置并沒有特殊規定，但是由于酶切位點的限制和載體的選擇，我們構建的三者串聯的前體排列 順序才如上所述。采用這種方法獲得的轉基因煙草中能產生與病毒的126kDa、 25kDa、 HC-Pro 蛋白基因保守序列中的21個核苷酸互補的成熟amiR159a。當病毒入侵時，amiR159a與病毒 核酸的靶序列結合，由于植物要保持自身的基因組結構完整性，會啟動對靶序列進行剪切， 從而使轉基因植株對病毒具有高度的抗性。運用此法，獲得了能高度抗TMV、 PVX、 PVY的轉 基因煙草植株。
本發明是在microRNA已有的研究基礎上，首次利用microRM構建一種能同時產生三種 不同類型的amiRNA的植物病毒載體，轉化植物，獲得了抗多種病毒侵染的轉基因煙草。這一 策略的應用不僅能豐富植物抗病毒基因工程理論體系，獲得多抗、高抗的轉基因煙草，而且 對于培育其它植物同時抗多種病毒的種質材料也具有重要的現實意義。
圖1. pre-miR159a的改造、表達載體的構建以及表達示意圖中F代表正向引物；R代表反向引物。A、 B、 C分別代表araiR159aHC—P'°, amiR159aP25， amiR159a"", A*、 B*、 C承分別代表amiR159aM_p'°, amiR159a"5, amiR159a，的反向互補序列； 圖2. T。代轉基因煙草的PCR鑒定電泳結果
圖中泳道1所示為DL2000 plus MARKER; 泳道2、 3、 4所示為引物Fl分別與引物Ra、 Rb、 Rc組合進行PCR擴增，用于檢測pre-miR159a"26、 pre-miR159a"5、 pre-miR159a"c—P"是否成功轉入煙草；
圖3.實施例6中L代轉基因煙草植株與非轉基因植株(WT)的抗病性對比圖4.轉基因植株中表達pre-miR159apl26、 pre-miR159a"5、 pre-miR159a"。P"串聯序列，
及其產生的amiR159aP126 、 amiR159aP25、 amiR159aH。p'、t TMV、 PVX、 PVY三種病毒的抗病示意圖。
具體實施方式
實施例1:擬南芥pre-miR159a的獲得
以普通條件下生長的擬南芥的葉片為材料，用十二烷基硫酸鈉(SDS)的方法提取擬南芥 基因組DNA。根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫中公布的擬南芥的pre-miR159a 的核苷酸序列，設計DM特異引物分別為
pre-miR159aF,其序列如Seq ID No: 5所示
pre-miR159aR,其序列如Seq ID No: 6所示
以上述提取的擬南芥DNA為模板，利用這對特異引物進行常規RCR擴增。擴增條件為-. PCR反應體積為50^1,包括以下成分
10x反應緩沖液 5pl
脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4|jl
正向引物(5pM) 化l
反向引物(5^M) 4^1
模板DNA 化l
Taq DNA聚合酶 0. 5^1
ddH20 28. 5|jl
PCR反應條件為94。C5分鐘；然后進入下列循環94。C50秒，55'C50秒，72'C30秒， 共35個循環；最后72'C延伸5分鐘。
取2pl PCR產物與pMD18-T si即le載體(TAKARA公司產品)連接，方法按照KAKERA產 品說明進行，連接產物轉化DH5ct細菌(購于北京全式金生物技術公司)，轉化菌在 LB/ampicillin固體培養基培養，37'C倒置培養12-20小時，篩選重組子，保存菌液，提取 質粒，進行酶切和PCR鑒定。
克隆基因序列分析結果如下 (a)序列特征
長度184堿基對 類型核酸
6鏈型雙鏈 拓撲結構線性
(b) 分子類型DNA
(c) 假設:否
(d) 反義否
(e) 最初來源擬南芥
(f )序列描述SEQ IN NO. 4
實施例2:不同地區的TMV、 PVX、 PVY沉默抑制子的同源比較
(l)將不同地區的TMV的126kDa核苷酸進行同源比對，選取保守的21nt區域作為耙序 列，以矩形框標注。
(2)將不同地區的PVX的25kDa蛋白的核苷酸進行同源比對，選取保守的21nt區域作 為乾序列，以矩形框標注，
(3)將不同地區的PVY的HC-Pro的核苷酸進行同源比對，選取保守的21nt區域作為耙 序列，以矩形框標注。
AJ01脳 AGG脇丁TGCGATC丁丁薦ACTC-GAATATCTGJlT涯C鹿TCCCT認ATCAn
AF273221 AGC'TGGATTGCGATCTTTAG"CTC-GAATATCTGATGATGC"ATTCCCTACGGATCAn
AF395127 AGC-TGGATTGCGATCTTTAW ACTGGAATATCTGATGATGW AATTCCCTACGGATCATT
AF395128 AGGTGGA丁TGCGATCTTTAGI ACTC-GAATATCTGATGATGCJIAATTCCCTACGGATCATT
AF395129 AGGTGGATTGCGATCTTTAG4 ACTGGAATATCTGATGATGCA AATTCCCTACGGATCATT
Target of amiR159a
M72416
AB05S719
AF111193
咖344
EF423572
CCTrATCAGGCACCTGAGTnAGCCTAi|AGCCCCACTTCTACTTSGAAA C CTTATC AGGCACC TGAGTTTAGC C TJ\4 AGCC C C AC TTC 了AC TTGGAAA
CTCATTTCGA tATCATTTCGA
CCTTATCAGGCACCTGAGnTAG:CTA( AGCCCLIACTTCTACTTGGAM :ATCATTTCGA CCTTATCAGC-CACCTGAGTTTAGCCTA( AGCCCCACTTC7ACTTGGAAA :ATCATTTCGA CCTUTCAGGCACCTGAGTTTAGCCTA( .AGCCCCACTTCTACTTGGAAA :ATCATTTCGA
Target of amiRlS9aP25
AB270705
M236852 DQ157180 EF02S075
AAGTATTCMG AAGTATTCAAGTCTATAGGG(
AAGTATTCAAGTCTATAGGGC AGAAGCAACAATCACCTTTW WAACCTGAATATTCTGA AAGTATTCAAC-TCTATAGGGC AGAAGCAACAATCACCTTTC/^AAACCTGAA:■ATTCTGA AAGTATTCAAC-TCUTAGGGf AGAAGCAACAATGACCTTTW MACCTGAATATTCTGA！ ;TCTATAGGGC AGAAGCAACAATCACCTTTW UiAACCTGAATATTCTGA AGAAG':AACAATCACCTTTC/^AAACCTGAATATTCTGA
Target of amiR159a
HC-Ero
o o Q o o
s s K- s CD
<u o
s lb實施例3: pre-attiiR159a的改造
(1) 根據選定的TMV提取物的126kDa蛋白基因保守的21nt序列設計特異引物 pre-ndR159a,:其序列如Seq IDNo:7所示
序列中5-10堿基對處為酶切位點，12-32堿基對處為amiR159a" 在前體中的序 列(即amiR159a"26特征靶序列在前體中的體現，下同) pre-miR159apl26R:其序列如Seq ID No: 8所示 序列中5-IO堿基對處為酶切位點，12-32堿基對處為amiR159a" 在前體中的序列。
(2) 根據選定的PVX提取物的25kDa蛋白基因保守的21nt序列設計特異引物 pre-miR159aP25F:其序列如Seq ID No: 9所示
序列中5-10堿基對處為Z&I酶切位點，12-32堿基對處為amiR159aP 在前體中的序列。
pre-miR159aP25R:其序列如Seq ID No:lO所示
序列中5-10堿基對處為/fe I酶切位點，12-32堿基對處為amiR159a"、在前體中的序列。 pre-raiR159aP25F-2:其序列如Seq ID No: 13所示 序列2-22堿基對處為amiR159a P25h^在前體中的序列。 pre-miR159aP25R-2:其序列如Seq ID No: 14所示
序列中5-IO堿基對處為Xba I酶切位點，12-32堿基對處為amiR159aP25^在前體中的序列。
(3 )根據選定的PVY提取物的HC-Pro蛋白基因保守的21nt序列設計特異引物 pre-miR159aHe_P'°F:其序列如Seq ID No: 11所示
序列中5-10堿基對處為Jfe I酶切位點，12-32堿基對處為amiR159a"e—"°*在前體中的序列。
pre-miR159a,。R:其序列如Seq ID No: 12所示
序列中5-10堿基對處為^/1酶切位點，12-32堿基對處為amiR15Sa"。p 在前體中的序列。 (4)用上述引物進行PCR擴增，序列測定在北京博尚生物公司進行。 (a) pre-miR159a""序列分析結果如下
序列特征
長度204堿基對 類型核酸 鏈型雙鏈拓撲結構線性 分子類型DNA 假設否 反義否 最初來源
序列描述SEQ IN NO. 1 (b) pre-miR159a"5序列分析結果如下 序列特征
長度204堿基對
類型核酸
鏈型雙鏈
拓撲結構線性 分子類型DNA 假設否 反義否 最初來源
序列描述SEQ IN NO. 2 (c ) pre-miR159aHe—p'。序列分析結果如下 序列特征
長度204堿基對
類型核酸
鏈型雙鏈
拓撲結構線性 分子類型DM 假設否 反義否 最初來源
序列描述SEQ IN NO. 3 (d ) pre-miRl59aP25-2序列分析結果如下: 序列特征
長度194堿基對
9類型核酸
鏈型雙鏈
拓撲結構線性 分子類型DNA 假設否 反義否 最初來源
序列描述SEQ IN NO. 15 實施例4:表達載體的構建
1. 將測序正確的pre-miR159a"e—P'。片段(Seq ID No. 3)與pMD18-T simple Vector進行連 接，方法按照TAURA產品的說明進行。連接產物轉化DH5a細胞(購于北京全式金生物技術 公司，下同)，轉化菌在氨芐青霉素的LB固體培養基培養，37'C倒置培養12-20小時，篩選 重組子，保存菌液，提取質粒，進行PCR和酶切鑒定；
2. 用&/I和I兩個限制性內切酶將pre-raiR159a"w。片段從PMD18-T simple載體 上切下。與用相同酶酶切的PBI122表達載體連接。連接產物轉化DH5oc細胞，然后在卡那霉 素的LB固體平板上培養，對菌落進行PCR鑒定和質粒DNA的酶切分析；
3. 將測序正確的pre-miR159aP25-2片段(Seq ID No. 15)與pEASY-Tl載體按照Transgen 產品說明進行連接，采用與步驟1相同的方法進行培養并鑒定；
4. 用限制性內切酶J化I將測序正確的preiiR159aP25_2片段(Seq ID No. 15)從pEASY-Tl 載體上切下。酶切下后的片段如Seq ID No. 16。再用Wal酶切步驟2中構建好的 pre-miR159^、的表達載體。用T,連接酶將二者連接。連接產物轉化DH5 cc細胞，然后在卡 那霉素的LB固體平板上培養，對菌落進行PCR鑒定和質粒DNA的酶切分析；
5. 將測序正確的pre-miR159a""片段(Seq ID No. 1)與pMD18-T simple Vector進行連 接，采用與步驟l相同的方法進行連接、培養并鑒定；
6. 用限制性內切酶/力oI將測序正確的pre-miR159a"26片段(Seq ID No. 1)從pMD18-T simple載體上切下。與用限制性內切酶J力ol酶切的步驟3中構建好的含有pre-miR159a對" 和pre-miR159aP"的表達載體用1"4連接酶相連(序列如Seq ID No: 17所示)。連接產物轉化 DH5a細胞，然后在卡那霉素的LB固體平板上培養，對菌落進行PCR鑒定和質粒DNA的酶切 分析。
7. 將構建好的含有pre-miR159a"e—P"、 Pre-miR159aP25 、 pre-miR159a""的表達載體PBI122-PPH轉化農桿菌LBA4404。上述所述的酶切及連接等各種生物技術，均釆用現有的相 應技術。
實施例5:轉基因植株的獲得
1. 將本生煙種子播種于MS基本培養基中，至5-6片真葉期，備用。
2. 挑取農桿菌(攜帶重組質粒的農桿菌單菌落)接種于含有50mg/L卡那霉素的YEP培 養基中，28°C, 250轉/分鐘，振蕩培養約48小時，至對數生長后期；將菌液用MS培養液稀 釋10倍，待用。
3. 取煙草葉片，剪成小塊(0.5 cmxO. 5 cm),將剪好的煙草葉片，置于MS預分化培養 基中，28'C,光照時間16小時/天，光照強度2,000 Lux，預培養2天。
4. 將預培養后的煙草葉片浸入菌液5-10分鐘，然后用滅菌的濾紙吸干多余菌液，接入 MS基本培養基；弱光下，28'C共培養2天。
5. 共培養后的外殖體先用含羧節青霉素250 mg/L的無菌水洗滌3次，再用含羧芐青霉 素250 mg/L的MS培養液洗1次，然后用滅菌濾紙吸千，轉入含有卡那霉素100 mg/L,羧芐 青霉素250 mg/L的MS選擇培養基上，恒溫培養(條件同預培養)；每15天更換一次培養基。
6. 待芽長至l cm左右時，切下，移入MS生根培養基(附加卡那霉素50 mg/L,羧芐青 霉素250 mg/L)中，促其生根。
7. 根系發育好后(5-6片葉)，移入盛有無菌土的花盆中，溫室常規管理。
8. 對所得到的To代轉基因植株進行分子鑒定。根據CaMV 35S啟動子序列設計正向引物 記作F1: (5' -TCAGAAAGAATGCTAACCCACAG-3');根據轉入的pre-miR159a隨，pre-miR159aP25， pre-miR159aTO—P"基因序列設計三條反向引物，分別記作Ra, Rb, Rc。
Ra: (5' -ACTGGAATATCTGATGATGCA-3'); Rb: (5' -AGCCCCACTTCTACTTGGAAA-3'); Rc: (5' -AGAAGCAACAATCACCTTTCA-3')。
提取獲得的轉基因植株的基因組DNA,以Fl和Ra、 Rb、 Rc分別組合形成三對引物，進 行常規聚合酶鏈式反應，電泳結果見附圖2。電泳結果與設計引物擴增的目的帶相符合。由 此可知pre-miR159a""、 pre—miR159aP25、 pre—miR159a"c-pr°已經成功轉入煙草。且轉入的順 序為pre-miR159aP126、 pre-miR159a"5、 pre—miR159aHC_Pl°。
實施例6:轉基因植株的抗病性分析
為了確定轉基因植株的功能，我們對T,代轉基因植株進行抗病毒分析。將獲得的1\代轉基因煙草(amiR-PPH)分為A、 B、 C、 D四組，分別取實驗室所保存的 PVX、 PVY、 TMV三種毒源，按1/10(W/V)比例用磷酸緩沖液(PH7. 0)稀釋，離心后取上清即 為接種物。采用摩擦接種的方法對A組接種PVX、 B組接種PVY、 C組接種TMV、 D組接種以上 三種病毒的混合液，以同樣接種的非轉基因植株(WT)為對照。
兩周后，如見附圖3所示單一和混合接種病毒的T,代轉基因植株均生長正常，未觀察 到發病癥狀；接種TMV的WT植株生長緩慢，嚴重矮化且具有典型的花葉癥狀，新葉嚴重畸形； 接種PVY的WT植株葉片出現巻曲、小葉葉緣下翻、植株矮化、發病嚴重的植株部分葉片出現 壞死；接種PVX的FT植株葉片出現不均勻的斑駁和壞死斑點，葉片泛黃，植株矮化，下部葉 片出現萎蔫等現象；混合接種的WT植株新葉表現出嚴重的畸形和花葉癥狀，且出現嚴重的矮 化萎蔫。<110〉山東農業大學
<120>利用pre-miR159a構建的抗病毒植物表達載體及其應用
<160〉 17
<210> 1
<211〉 204
<212>陽
<213>人工序列
<220>
<222> (12) ... (32)
<223> amiR159a""的反義鏈在前體中的序列
<220>
<222> (173)…(193)
<223> amiR159a""在前體中的序列
<400> 1
gcgcctcgag gactggaata tctgatgatg cacatgagtt gsigcagggta aagaaaaigct 60 gctaagctat ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat 120 ggattgcaU tctcaggagc Utaacttgc cctUaatgg cttttactct tctgcatcat 180 cagatattcc agtcctcgag gcgc 204
<210> 2 <211> 204 <212>廳 <213>人工序列 <220>
<222> (12) ... (32)
<223> amiR159aP25的反義鏈在前體中的序列
<220>
<222> ( 173 ) ... ( 193 )
<223> amiR159aP25在前體中的序列
<400〉 2
13gcgctctaga gagccccact tctacttgga a編tgagtt gagcagggta aag謹agct 60
gcUagctat ggatcccata agccctaatc cttgt雄gt a譜aaggat ttggttaUt 120
ggattgcata tctcaggagc ttUacttgc cctttaatgg cttttactct tctttccaag 180
tagaagtggg gctctctaga gcgc 204
<210> 3 <211> 204 <212> DM <213>人工序列 <220>
<222> (12 ) ... ( 32 )
<223> amiRl59aHe—P'n的反義鏈在前體中的序列 <220>
<222> (173) ... (193)
<223> amiRl"a"c—化°在前體中的序列
<400> 3
gcgctctaga gagaagcaac aatcaccttt cacatgagtt gagcagggta aagaaaagct 60
gctaagctat ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat 120
ggattgcata tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg cttttactct tctgaaaggt 180
gattgttgct tctcgtcgac gcgc 204
<210> 4
<211> 184
<212> DM <213〉人工序列 <220>
<222> (2) ... (22)
<223> miR159a的反義鏈在前體中的序列
<220>
<222> ( 163 ) ... ( 183 )
<223> miR159a在前體中的序列<400〉 4
gUgagctcc ttaaagttca aacatgagtt gagcagggta aagaaaagct gctaagctat 60
ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt編aaaggat ttggttatat ggattgcata 120
tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg cttttactct tctttggatt gaagggagct 180
ctac 184
<210> 5 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 5
gtagagctcc ttaaagttca aac 23
<210> 6 <211> 23 <212>薩 <213>人工序列 <400> 6
gtagagctcc cttcaatcca aag 23
<210〉 7 <211> 53 <212> DNA <213>人工序列 <400> 7
gcgcctcgag gactggaata tctgatgatg cacatgagtt gagcagggta aag 53
<210> 8 <211> 53 <212>腿 <213>人工序列<400> 8
gcgcctcgag gactggaata tctg"gatg cagaagagta aaagccatta aag 53
<210> 9 <211> 53 <212> DNA <213>人工序列 <400〉 9
gcgctctaga gagccccact tctacttgga aacatgagtt gagcagggta aag 53
<210> 10 <211> 53 <212>醒 <213>人工序列 <400> 10
gcgctctaga gagccccact tctacttgga aagaagaigta aaagccatta aag 53
<210> 11 <211> 53 <212> DNA <213>人工序列 <400> 11
gcgctctaga gagaagcaac aatcaccttt cacatgagtt gagcagggta aag 53
<210> 12 <211> 53 <212> DNA <213>人工序列 <400> 12
gcgcgtcgac gagaagcaac aatcaccttt cagaagagta aaagccatta aag 53
16<210> 13 <211> 43 <212〉腿 <213>人工序列 <400> 13
gagccccact tctacttgga aacatgagtt gagcagggta aag 43
<210> 14 <211〉 53 <212> DNA <213>人工序列 <400> 14
gcgctctaga gagccccact tctacttgga aagaagagta aaagccatta aag 53
<210> 15
<211> 194
<212>腿
<213>人工序列
<220〉
<222> (2) ... (22)
<223〉 amiR159a"5的反義鏈在前體中的序列 <220>
<222> (163)…(183)
<223> amiR159a p25在前體中的序列
<400> 15
gagccccact tctacttgga aacatgagtt gagcagggta aagaaaagct gctaagctat 60
ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat ggattgcaU 120
tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg ctttUctct tctttccaag tagaagtggg 180
gctctctaga gcgc 194
<210> 16<211> 245 <212> , <213>人工序列 <220>
<222> ( 58 ) ... ( 78 )
<223> araiR159a^的反義鏈在前體中的序列
<220>
<222> ( 219 ) ... ( 239 )
<223〉 amiR159a^在前體中的序列
<400> 16
tctagatgca tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat ctgcagaatt gcccttgagc 60
cccacttcU cttggaaaca tgagttgagc agggtaaaga aaagctgcta agctatggat 120
cccataagcc ctaatccttg aaagtaaaaa aggatttggt tatatggatt gcatatctca 180
ggagctttaa cttgcccttt aatggctttt actcttcttt ccttgtagaa gtggggctct 240
ctaga 245
<210> 17
<211> 634 <212>腿 <213>人工序列 <220>
<222> (12) ... (32)
<223> amiR159a""的反義鏈序列
<220>
<222> (195) ... (215)
<223> amiR159a,序列<220〉
<222> ( 252 ) ... ( 272 ) <223〉 amiR159aP25的反義鏈序列 <220>
<222> ( 413 ) ... ( 433 ) <223> amiR159a ^序歹'J 〈220>
<222> ( 452 ) . ( 472 )
<223> amiR159aK—Pr。的反義鏈序列
<220>
<222> ( 602 )…(622 ) <223> amiR159aHc令。序列 <400> 17
gcgctctaga tgcatgctcg aggactggaa tatctgatga tgcacatgag ttgagcaggg 60
taaagaaaag ctgctaagct atggatccca taagccctaa tccttgtaaa gtaaaaaagg 120
atttggttat atggattgca tatctcatgga gctttaactt gccctttaat ggcttUact 180
cttctgcatg atcagatatt ccagtcgagc tccggccgcc agtgtgatgg atatctgcag 240
aagtgccctt gagccccact tctacttgga aacatgagU gagcagggta aagaaaagct 300
gctaagctat ggatcccat'a agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat 360
ggattgcata tctcaggagc Utaacttgc cctttaatgg cttttactct tctttccttg 420
tagaagtggg gctctctaga gagaagcaac aatcaccttt cacatgagtt gagcagggta 480
aagaaaagct gctaagctat ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat 540
ttggttatat ggattgcata tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg cttttactct 600
tctgaaaggt gattgttgct tctcgtcgac gcgc 634
19
權利要求
1. 一種利用擬南芥pre-miR159a制得的含有病毒基因特殊序列的抗病毒載體，其特征在于其基因序列中含有至少一段下列序列a. pre-miR159aP126，其序列如Seq ID No1所示；b. pre-miR159aP25，其序列如Seq ID No2所示；c. pre-miR159aHC-Pro，其序列如Seq ID No3所示。
2. 根據權利要求1所述的抗病毒載體，其特征在于其基因序列中具有 pre-miR159apl26、 pre-miR159aP25、 pre-miR159aHC—Pr°的三者串聯序列，其序列如 Seq ID No: 17所示。
3. 根據權利要求1或2所述的抗病毒載體，其特征在于所用表達載體為 PBI122。
4. 如權利要求1所述的抗病毒載體，用于獲得抗TMV或PVX或PVY的轉基 因植株。
5. 如權利要求2所述的抗病毒載體，用于獲得同時抗TMV和PVX和PVY的 轉基因植株。
全文摘要
本發明涉及擬南芥microRNA159a前體(pre-miR159a)的克隆、改造、轉化及轉基因植株的抗病毒分析，屬于分子生物學和生物技術領域。從擬南芥中克隆pre-miR159a的核苷酸序列并對其產生成熟miR159a的序列進行定點突變。分別對煙草花葉病毒的126kDa蛋白、馬鈴薯X病毒的25kDa蛋白、馬鈴薯Y病毒的HC-Pro蛋白基因突變得到三段突變序列。將這三段序列串聯，構建植物表達載體，采用農桿菌介導的方法轉化本生煙，得到轉基因煙草。這些轉基因植株對上述三種病毒都具有高度的抗病性。此抗病毒策略具有抗病性強、抗病持久、生物安全等優點，在植物抗病毒基因工程育種領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/82GK101519659SQ200910019780
公開日2009年9月2日 申請日期2009年4月3日 優先權日2009年4月3日
發明者李善偉, 艾濤波, 郭興啟 申請人:山東農業大學