專利名稱：：一種米曲霉菌種及其制備高純度低聚半乳糖的方法
技術領域：
：本發明屬于功能性低聚糖生產領域，主要涉及米曲霉菌種直接發酵高濃度乳糖溶液進行低聚半乳糖的生產方法。
背景技術：
：低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides，簡稱GOS)屬非消化性低聚糖，同其他非消化性低聚糖相比具有專一性促進腸道內雙歧桿菌增值、生產用原料來源廣泛、使用安全性高、對食品加工熱處理穩定等優點。因此，生產和應用低聚半乳糖在食品工業領域具有巨大潛力。目前全球生產低聚半乳糖的廠家主要在日本，我國對低聚半乳糖的生產還未規模化，處于研究階段。低聚半乳糖是由P-半乳糖苷酶作用于乳糖，經水解及轉苷反應而得。產P-半乳糖苷酶的微生物有脆壁酵母、乳糖酵母、環狀芽孢桿菌及米曲霉等。此外，還發現繩狀青霉纖維素酶也可合成低聚半乳糖。工業上用曲霉、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)等生產低聚半乳糖。工業生產中常用游離酶水相合成低聚半乳糖，生產工藝相對成熟，但是生產中穩定性稍差。當前也有包括非水相酶反應及固定化酶技術生產低聚半乳糖。然而，非水相酶反應雖然通過控制水分使反趨于轉半乳糖苷，且較水溶液中低聚半乳糖有所增加，但是由于產物未得到分離使得產物會抑制低聚半乳糖的繼續生成，產品得率提高幅度不大，難以規模化生產；固定化酶技術對低聚半乳糖產率有較大影響，但針對廠家生產結果有的提高有的卻相反，因此此技術也正在進一步研究之中。發酵法生產低聚半乳糖的研究較少。發酵法生產低聚半乳糖的研究較少，但發酵法通過利用某些微生物細胞優先代謝葡萄糖、半乳糖或乳糖的特異性能將葡萄糖、乳糖等糖組分發酵去除，同時省去酶的分離純化等步驟，工藝簡單、設備投入成本較低。現有技術中，有專利文獻中公開了簡便快速制備含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的方法。這一專利制備了P-半乳糖苷酶粗酶液來處理乳清粉，在降低乳清粉中乳糖的同時得到了高含量的低聚半乳糖。但是對于高含量低聚半乳糖溶液中其他組分如單糖、乳糖等的分離并未提及，要實現工業生產高純度低聚半乳糖產品，還需要對高含量低聚半乳糖進行進一步分離純化處理。專利文獻中利用固定化酵母去除低聚半乳糖中單糖組分的方法，公開了一種利用固定化酵母去除低聚半乳糖中單糖組分的方法。這一專利是應用固定化酵母去除低聚半乳糖溶液中的單糖，除去了葡萄糖，從而提高低聚半乳糖含量。此專利較好的去除了部分單糖組分，但是半乳糖卻無法去除，同時雙糖組分乳糖并未得到很好的分離。酶法生產低聚半乳糖一般工藝流程圖見圖l。可以看出，酶法反應生產低聚半乳糖的過程中，需要進行酶的分離純化，因此酶的得率是影響此工藝的關鍵，而產品的分離純化方法直接影響到產品質量的高低。
發明內容本發明提供了一種米曲霉菌種(Aspeigillusoryzae)BLB-21，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏時間2009年3月17日，保減號CGMCCNo.2951。本發明同時提供了一種應用米曲霉菌種(Aspeigillusoryzae)BLB-21，直接發酵乳糖溶液，制備低聚半乳糖的方法。包括米曲霉菌種(AspeigillusOTyzae)BLB-21的擴大培養，使用擴大培養種子直接發酵高濃度的乳糖溶液和分離提純、加工制備高純度低聚半乳糖。本發明采用的技術方案包括如下步驟(1)菌種分離及誘變①菌種分離米曲霉BLB-12分離自禹城市奶牛場土壤，分離所用培養基為孟加拉紅培養基。米曲霉BLB-12的分離方法為稱取10g土壤，加入90mL無菌水中，震蕩搖勻，酒精擦拭后移入超凈工作臺。準備6支裝有9mL無菌水的試管，編號l-6。用移液槍移取1000iiL懸濁液置于1號試管，再移取1000iiL1號試管懸濁液置于2號試管，依次做六個試管梯度稀釋。用移液槍分別取4、5、6號試管溶液各200iiL(每個試管取2-4份)置于孟加拉紅培養基平板，用涂抹棒均勻涂抹。培養至平板長出成熟菌落。鑒定并分離純化米曲霉菌落，將單菌落接種斜面，并接種搖瓶，初篩測定酶活力。根據搖瓶培養酶活力大小選出優良斜面出發菌株-米曲霉BLB-12。分離培養條件為孟加拉紅培養基蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，1/3000孟加拉紅溶液100mL，蒸餾水1000mL，氯霉素O.lg，pH自然，培養溫度2830。C。斜面培養條件為5°Be'麥芽汁瓊脂培養基麥芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL;pH自然，培養溫度2830°C。搖瓶培養條件為葡萄糖300-500g/L，酵母膏15g/L，瓊脂粉15g/L，pH自然(約5.5)，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，尿素5g/L。②菌種誘變米曲霉BLB-21是經誘變處理出發菌株BLB-12篩選所得的生產用優良高產菌株。采用紫外線+LiCl復合誘變處理菌株。具體步驟接種環挑取米曲霉BLB-12斜面孢子于無菌的含2XLiCl溶液的三角瓶中，置于磁力攪拌器上振蕩lh，使菌體散開，孢子萌發。將孢子懸液倒入含無菌大頭針的無菌平皿。打開平皿蓋，在事先預熱好的20W的紫外燈下24cm處照射0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s，不同照射劑量菌液稀釋到10-、黑暗處放置lh。用生理鹽水分別稀釋菌液到10-3，吸取稀釋好的菌液O.lmL涂布503^麥芽汁瓊脂培養基平板，每個稀釋度涂布3個平板。將涂好的平皿用黑布包好，置生化培養箱28t:培養5d左右，至長出成熟菌落，統計致死率。(2)菌種篩選以米曲霉菌株BLB-12為對照，對誘變后菌株進行發酵培養產酶及轉糖苷活性檢測。產酶培養基及培養條件乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，CaCl20.11g/L，MnS040.001g/L，MgS047H200.3g/L，KH2P040.05g/L，FeS047H2O0.03g/L，pH6.0，30°C，180rmp，培養50h。測定酶活。轉糖苷活性檢測將粗酶液與乳糖溶液l:3(v/v)比例混合，于406(TC進行轉糖基反應410h。乳糖溶液濃度為30%(w/v)。反應完畢，12000rpm離心5min，上清液進行薄層層析(TLC)分析，以篩選活性高的生產菌株。薄層層析展開劑為正丁醇乙醇水=5:3:2，顯色劑為20%硫酸溶液和0.5%的3，5-二羥基甲苯混合液，通過斑點顏色和大小篩選出轉糖苷活性高的生產菌株，即米曲霉菌種(Aspeigillusoryzae)BLB-21。(3)米曲霉菌種(Aspeigillusoryzae)BLB-21的擴大培養一級種子、二級種子。種子培養基葡萄糖300-500g/L，酵母膏15g/L，瓊脂粉15g/L，pH自然(約5.5)，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，尿素5g/L;接種環挑取一環培養成熟的斜面孢子于500mL的搖瓶種子進行一級培養，培養24h后，再以10%(V/V)的量接入15L發酵罐，進行二級種子培養。(4)發酵乳糖溶液，制備低聚半乳糖。擴大培養所得二級種子以10%(V/V)的量接入到乳糖溶液(20%-40%)中，直接發酵生產低聚半乳糖。發酵罐體積150L，裝液量為60%，調節pH5.5，溫度204(TC，攪拌轉速250rpm，通氣量200L/h，發酵20-40h;制得含低聚半乳糖的發酵液。(5)分離提純及加工①超濾采用陶瓷膜超濾，去除菌體及發酵液中酶、蛋白質和核酸等大分子物質，初步得到糖組分混合液；②活性炭脫色對超濾后的糖溶液按2%加入活性炭，8(TC反應60min，脫色過濾；③離子交換采用強酸性陽離子-弱堿性陰離子-強酸性陽離子交換樹脂，溫度30-50°C，進樣量10L/h，樹脂高度lm進行分離脫鹽，經HPLC檢測可得低聚半乳糖含量。此時糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖；納濾分離采用有機復合納濾膜進行分離濃縮，操作條件為2.0-3.0MPa壓力，進料濃度20-30%，加水3-5BV，溫度20-35t:，通過選擇有機復合納濾膜，可將單糖、乳糖、半乳三糖等低聚糖分離，大大提高產品純度，低聚半乳糖純度可達80%以上。⑤蒸發濃縮經納濾分離的產品通過六效降膜式蒸發濃縮器得高純度低聚半乳糖漿；⑥噴霧干燥采用壓力式噴霧干燥塔干燥得高純度低聚半乳糖固體。本發明發酵法生產低聚半乳糖工藝與現有技術相比，有如下優點(l)采用米曲霉直接發酵，省去了制備純化P-半乳糖苷酶的過程，工藝簡單，易于工業化生產、產量高、周期短、效率高；(2)陶瓷膜超濾，去除菌體效率較傳統壓濾高；(3)采用有機復合納濾膜分離，很好的實現了低聚半乳糖溶液中單糖、乳糖的完全分離，產品純度可達80%。圖1是酶法生產低聚半乳糖一般工藝流程圖；圖2是高純度低聚半乳糖制備生產工藝流程具體實施例方式為了更好的闡述本發明所提出的高純度低聚半乳糖的制備方法，下面通過實施例對本發明作進一步說明。實施例1菌株BLB-21接入葡萄糖濃度為300g/L的種子液進行擴大培養。二級種子液(濃度菌絲濕重0.52%)以10X(V/V)的量接入到20X乳糖溶液中發酵，調節pH5.5，253(TC發酵40h。經超濾初步得到糖組分混合液，活性炭脫色后采用強酸性陽離子-弱堿性陰離子-強酸性陽離子交換樹脂，溫度3035t:，進樣量10L/h，樹脂高度lm進行分離脫鹽，經HPLC檢測得低聚半乳糖含量為55.80X的糖溶液。此時糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。以上糖溶液在2.02.4MPa壓力，進料濃度2025%，加水3BV，溫度2025t:條件下采用醋酸纖維素納濾膜進行分離。有效分離了乳糖、半乳糖與葡萄糖組分，產品低聚半乳糖純度達81.67%。表l應用醋酸纖維素納濾膜分離低聚半乳糖<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2菌株BLB-21接入葡萄糖濃度為400g/L的種子液進行擴大培養。二級種子液(濃度菌絲濕重0.45X)以10X(V/V)的量接入到30X乳糖溶液中發酵，調節pH5.5，3035t:發酵30h。經超濾初步得到糖組分混合液，活性炭脫色后采用強酸性陽離子-弱堿性陰離子-強酸性陽離子交換樹脂，溫度354(TC，進樣量10L/h，樹脂高度lm進行分離脫鹽，經HPLC檢測得低聚半乳糖含量為56.35X的糖溶液。此時糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。以上糖溶液在2.42.7MPa壓力，進料濃度2025%，加水4BV，溫度253(TC條件下使用醋酸纖維素納濾膜進行分離。乳糖、半乳糖與葡萄糖實現有效分離，產品低聚半乳糖純度達82.91%。表2應用醋酸纖維素納濾膜分離低聚半乳糖原料液蘼料鐘分低聚半乳糖(濃縮織)葡萄糖、半乳糖、乳糖《透銜液)回收率^ttf"^3tS，每糖19.08%2J7%46,15%9醒半歸，4,23%2.函3氛69%亂2%乳糖10,15%".58%6.機23馬.半乳糖三糖5謂％82.91%12.68%89,0%固形物eo皿25.0%5.8%實施例3菌株BLB-21接入葡萄糖濃度為500g/L的種子液進行擴大培養。二級種子液(濃度菌絲濕重0.56X)以10X(V/V)的量接入到40X乳糖溶液中發酵，調節pH5.5，354(TC發酵20h。經超濾初步得到糖組分混合液，活性炭脫色后采用強酸性陽離子-弱堿性陰離子-強酸性陽離子交換樹脂，溫度455(TC，進樣量10L/h，樹脂高度lm進行分離脫鹽，經HPLC檢測得低聚半乳糖含量為55.72X的糖溶液。此時糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。以上糖溶液在2.73.0MPa壓力，進料濃度2530%，加水5BV，溫度3035'C條件下使用醋酸纖維素納濾膜分離。乳糖、半乳糖與葡萄糖實現有效分離，產品低聚半乳糖純度達80.38%。表3應用醋酸纖維素納濾膜分離低聚半乳糖原料液原料組分低聚半乳糖(饞縮液)葡萄糖、半乳糖、乳糖(透析液)問收率葡萄糖20.43%3.76%4S息卯.7%半乳糖，4鵬2.66%34.07%卯.1%.乳糖9,69%10.20%6,纖22.68%低聚半乳糠55,72%g14,65%89,,固w60纖2S纖6,8%半乳糖14.23%2.64%34,腦91.2%乳糖10,15%11.58%6.48%23.6%半乳糖三糖56.54%82,91%12,6跳89.0%固形*60,0%25,0%5.8%實施例3菌株BLB-21接入葡萄糖濃度為500g/L的種子液進行擴大培養。二級種子液(濃度菌絲濕重0.56X)以10X(V/V)的量接入到40X乳糖溶液中發酵，調節pH5.5，354(TC發酵20h。經超濾初步得到糖組分混合液，活性炭脫色后采用強酸性陽離子-弱堿性陰離子-強酸性陽離子交換樹脂，溫度455(TC，進樣量10L/h，樹脂高度lm進行分離脫鹽，經HPLC檢測得低聚半乳糖含量為55.72X的糖溶液。此時糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。以上糖溶液在2.73.0MPa壓力，進料濃度2530%，加水5BV，溫度3035t:條件下使用醋酸纖維素納濾膜分離。乳糖、半乳糖與葡萄糖實現有效分離，產品低聚半乳糖純度達80.38%。表3應用醋酸纖維素納濾膜分離低聚半乳糖原料液原料組分低聚半乳糖(濃縮液)葡萄糖、半乳糖、乳糖(透析液)回收率葡萄糖20.43%3.76%45,12%90,7%半乳糖14.16%2.66%34,070/0亂1%■，％10,20%6,16%22.68%低聚半乳糖SS.72%80,38%1德％殷8%圏懇*亂0%25,0%6J%權利要求一種米曲霉菌種(Aspeigillusoryzae)BLB-21，已于2009年3月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2951。2.—種應用米曲霉菌種(Aspeigillusoryzae)BLB-21制備低聚半乳糖的方法，其特征包括米曲霉菌種的擴大培養，使用擴大培養種子直接發酵乳糖溶液和分離提純加工制備低聚半乳糖。3.如權利要求2所述的制備低聚半乳糖的方法，其特征在于米曲霉BLB-21的擴大培養包括斜面培養、一級、二級種子培養；斜面培養基5°Be'麥芽汁瓊脂培養基麥芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL;pH自然，培養溫度2830°C;種子擴大培養基葡萄糖300-500g/L，酵母膏15g/L，瓊脂粉15g/L，pH自然(約5.5)，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，尿素5g/L。4.如權利要求2所述的制備低聚半乳糖的方法，其特征在于發酵過程中擴大培養種子接種量5-10%(V/V);乳糖溶液濃度2040%;發酵條件為調節pH5.5，溫度20-40°C，發酵時間20-40h。5.如權利要求2所述的制備低聚半乳糖的方法，其特征在于低聚半乳糖的分離純化采用陶瓷膜過濾。6.如權利要求2所述的制備低聚半乳糖的方法，其特征在于低聚半乳糖產品的分離純化采用離子交換。7.如權利要求2所述的制備低聚半乳糖的方法，其特征在于低聚半乳糖產品的分離純化采用有機復合納濾膜分離。8.如權利要求7所述的制備低聚半乳糖的方法，其特征在于有機復合納濾膜為醋酸纖維素納濾膜。9.如權利要求2所述的制備低聚半乳糖的方法，其特征在于采用六效降膜式蒸發濃縮器加工得高純度低聚半乳糖漿。10.如權利要求2所述的制備低聚半乳糖的方法，其特征在于采用壓力式噴霧干燥塔干燥加工得高純度低聚半乳糖固體。全文摘要本發明涉及一種高純度低聚半乳糖的制備方法，包括米曲霉發酵，陶瓷膜超濾、納濾分離等產品分離純化步驟。本發明采用土壤中分離的Aspergillusoryzae米曲霉為出發菌株，經本實驗室誘變篩選所得的高效率轉化菌株米曲霉BLB-21(保藏號CGMCCNo.2951)直接發酵高濃度乳糖溶液，避免了酶法制備低聚半乳糖過程中酶的純化等步驟，省時省力；通過超濾、納濾分離得到高純度低聚半乳糖，工藝過程理想，條件溫和，具有廣闊的工業生產前景。文檔編號C12N1/14GK101691538SQ20091001845公開日2010年4月7日申請日期2009年9月29日優先權日2009年9月29日發明者馮志臣,李雙茹,李慶華,欒慶民,滕慧,袁衛濤申請人:保齡寶生物股份有限公司