專利名稱：一種遲緩愛德華氏菌重組亞單位疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種遲緩愛德華氏菌 (Edwardsiella tarda)重組亞單位疫苗及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種革蘭氏陰性病原菌，具廣譜宿主范 圍，包括人、動(dòng)物和魚類等。在我國，遲緩愛德華氏菌是多種養(yǎng)殖魚類(大菱鲆、牙鲆和鰻 魚等)的重要病原，其所誘發(fā)的愛德華氏菌病每年給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目 前遲緩愛德華氏菌病的防治主要依賴于使用抗生素和疫苗，后者只局限于小部分國家/地 區(qū)。由于抗生素眾所周知的危害，其使用逐漸收到限制。與抗生素相反，疫苗被公認(rèn)是綜合 效應(yīng)最好的病害預(yù)防措施之一。常見的疫苗包括滅活疫苗、亞單位疫苗以及核酸疫苗等。就 遲緩愛德華氏菌而言，商業(yè)化的疫苗只有滅活疫苗。較之于滅活疫苗，基于蛋白質(zhì)的重組亞 單位疫苗具有免疫特異性強(qiáng)以及重復(fù)性較好等優(yōu)點(diǎn)。然而目前雖有幾例遲緩愛德華氏菌重 組亞單位疫苗抗原報(bào)道，其中保護(hù)效應(yīng)(相對(duì)存活率)達(dá)到70%以上者只有一例(日本科 學(xué)研究者報(bào)道)。因而，具高保護(hù)效應(yīng)的重組亞單位疫苗尚有待研發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種遲緩愛德華氏菌疫苗及其制備和應(yīng)用方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種免疫保護(hù)性重組亞單位疫苗，具序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列。所述的重組亞單位疫苗的制備1)質(zhì)粒pETXV21的構(gòu)建將質(zhì)粒pET28用Ndel/Xhol酶切，回收5. 3kb片段；以遲 緩愛德華氏菌TXl為模板，用引物XVF和XVR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后用Ndel/Xhol酶切， 回收1. 4kb片段，將其與上述5. 3kb片段連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含卡那霉素 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PETXV21 ；2)疫苗蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將質(zhì)粒PETXV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得轉(zhuǎn) 化子BL21/pETXV21 ；將BL21/pETXV21于含有Kn的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取過夜后的 培養(yǎng)液加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至0D_為0. 5，加入終濃度為ImM的IPTG 并于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4-5h，然后在離心后菌液中加入裂解液，在室溫?fù)u動(dòng)1-2小時(shí)；將菌液離 心，回收上清；將上清液用凝膠柱回收，即得序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所編碼的重 組亞單位疫苗蛋白。將上述所得的重組亞單位疫苗蛋白與菌株B187于PBS中混合，所得疫苗混合液對(duì) 遲緩愛德華氏菌具免疫保護(hù)作用。將所述疫苗混合液腹腔注射牙鲆，21天后加強(qiáng)免疫一次，即可使牙鲆對(duì)遲緩愛德 華氏菌侵染具抵抗作用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1.高保護(hù)率。本發(fā)明的重組亞單位疫苗XV21對(duì)遲緩愛德華氏菌的免疫保護(hù)效率 達(dá) 72%。2.應(yīng)用簡單，無需商業(yè)化佐劑。
圖1 :His Trap HP Columns回收產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果(泳道2)。 泳道1，分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相 應(yīng)試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”；4. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡皆按Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)進(jìn)行。實(shí)施例1疫苗XV21由序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。疫苗XV21的制備方法1)質(zhì)粒pETXV21的構(gòu)建將質(zhì)粒pET28(購于美國Novagen)用Ndel/Xhol酶切，回收5. 3kb片段。以遲緩 愛德華氏菌TX1(保存于CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 2330，保藏證明已于20080509于申 請(qǐng)案200810016124. 3遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法中提交)為模板，用引物XVF (5’ -GCGCATATGCAATACACCAAATTGCGTT-3’，劃線堿基為 NdeI 位點(diǎn))和 XVR (5’-CTCGAGCACCC GGTTATACTCCT-3，，劃線堿基為XhoI位點(diǎn))按下列條件進(jìn)行PCR :94V 60s預(yù)變性模板DNA， 然后 94°C 40s, 53°C 60s, 72°C 60s，5 個(gè)循環(huán)后改為 94°C 40s,61°C 60s, 72°C 60s，25 個(gè)循環(huán) 后再在72°C延伸反應(yīng)7-lOmin。PCR產(chǎn)物純化后用Ndel/Xhol酶切，回收1. 4kb片段，與上 述5.3kb片段連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后在含卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固體 培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pETXV21 ；所述LB固體培養(yǎng)基組成成分按重量百分比計(jì)1. 0%蛋白胨，0. 5%酵母粉，1. 0% 氯化鈉，瓊脂1. 5 %，96 %蒸餾水；2)疫苗抗原XV21的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將上述步驟1)的質(zhì)粒pETXV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自于“天根生化科技 有限公司”，北京)，在含有Kn(50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取一個(gè)菌落，將其命名為BL21/pETXV21。將BL21/pETXV21于含有Kn(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中 過夜培養(yǎng)；取Iml過夜后的培養(yǎng)液將其加入IOOml新鮮的含有Kn(50ug/ml)的LB液體培 養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6，加入終濃度為ImM的isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside，37°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速 160rpm 搖動(dòng)培養(yǎng) 4_5h，而后離心(5000g， 4°C，IOmin)，收集菌液，加入 5ml 裂解液(IOmM NaH2PO4, IOmM Tris, 8M 尿素，pH 8. 0)，在室 溫于搖床上緩慢搖動(dòng)1-2小時(shí)，直至菌懸液變澄清為止。將菌液離心(10000g，30min, 4°C )， 回收上清。將上清用His Trap HP Columns(購于GE Healthcare)回收，將回收產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺濃度為12% )，發(fā)現(xiàn)只有一種蛋白(圖1)，其分子量 與疫苗抗原蛋白XV21的分子量吻合；由于XV21上帶有His標(biāo)簽，故進(jìn)一步用His抗體(購 于“天根生化科技(北京)有限公司”)進(jìn)行免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)回收的蛋白能與His抗體 特異性結(jié)合，說明其帶有His標(biāo)簽。這些結(jié)果表明所回收得到的蛋白即為具序列表SEQ ID Nol中的堿基序列的保護(hù)性疫苗抗原蛋白XV21。序列表SEQ ID NolATGCAATACACCAAATTGCGTCTGATGGTTGGTGGGCTGGCGCTGGCCATGGTCGGTACCAGCGTGCAT TCTGAAACGCTACAGCCCGATCCGGCCTGGCAGGAGGGCAAGCTGCCGAACGGTTTTTCTTGGCAGATCCTGGCGAC GCCGCAGCGTCCATCCGATCGTATTGAGCTACGTATGATCGTCAACACCGGCTCGCTGTCGGAGTCTCCTCAGCAGG TGGGGTATGCCCACCTGCTGCCGCGCCTGGCTCTGGCGCAGGGCAAGGGGCTTGACGCGACCGCCCTGCAGTCGTTT TGGCAGCAGGCAATCGATCCCGTGCGTCCGATGCCGGCGGCGATCACCTCGTATGATTACACCAGCTATAACCTGAG CCTGCCCAATAACCGCCCCGATCTGATGAAGGATGCCCTGCGCTGGCTGGCCAATACCGCCGGCGATCTGCAGGTGA ATGCCGAGACGGTCGGTGAGGCGCTGAAAGGCAGCGACAGCCGCGTGATGGCGCTGCCCGGCGAAGCCGGCGATCCC TGGTGGCGCTACCGTCTGAAGGGCTCCAACCTGCTGGGCCATGAGCCTGGACGAACGGCGGCGGTTCCGCTGGCGCC GGCGCAGCTGAAGGCCTTTTATCATCAGTGGTATACCCCCGATGCGATAACGCTGTACGTGGTCGGCAACGTGGATG CCCGGGCGCTGAGCGAACAGATCAATCAGACCTTCGGCCCCCTGAGCGGCAAGCGGGAGACGCCGGCCACGGTGCCG GCGCTGCCGGCGCTGGCCGCGGCGCCGGTGAGCCTGATCGCCGATGGCGCCAAGCAGGATATTCTGTCGCTGGTCTG GGATACGCCGTGGCAGCCGATCCGTGACTCTCAGATGCTGCTGCGCTATTGGCGTAGCGACTTGGCGCGCGAGGCGC TGTTCTGGCATCTACAGCAGGTGCTGGCCAACAGCGCGCTGAAGGGCAGCGTGAACCTGAGCTTTAACTGCCAGGTG CAGTATCAGCGCTCGCAGTGCGCGATCCATTTAGAGACGGCTCAGGCGTCATTGAGCAAGACGCTGGCGTTTATCGC CGATGAGATGTCCGCGCTGCGCGATGATGGGATTACCCAGCCGGAGTTTGACACCCTGCTGGGGCAGAAGAACGATC AGCTGAGTCACCTGTTCGCCACCTATGCGCGAACCAATACCGACATCCTGATGAGTCAACGCCTGCGCTCACAGCAA AGCGGCGTGGTGGACATCGCTCCGGAGGCGTATCAGAAGCTGCGCCAGACGTTCCTGAGCGCGCTGACGCTGGACGA TATTAACCAAGAGCTGCATATCATGCTGTCGCGGGAGCCCGCCGTGGTGCTGCGTCAGCCGCGCGGTGAGGCCGAGG AGAACGTGGGCCGCCTGCTGGAGGAGTATAACCGGGTG(a)序列特征 長度1416bp 類型堿基序列 鏈型雙鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設(shè)否
(d)反義否(e)最初來源遲緩愛德華氏菌TXl(f)特異性名稱XV21實(shí)施例2重組亞單位疫苗XV21的免疫應(yīng)用步驟1)疫苗混合液的制備。將菌株B187(保存于CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 2331，保藏證明已于20080229 于申請(qǐng)案200810014711. 9 —種交叉保護(hù)性疫苗抗原其制備方法和應(yīng)用中提交)于LB培養(yǎng) 基中于30°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 8，然后離心(5000g，4°C ) IOmin0收集菌體，將其懸浮于PBS 中至終濃度為2xl08cfu/ml，即為B187-PBS。而后在每毫升B187-PBS混合液中加入0. 2mg 上述實(shí)施例1步驟2純化的疫苗抗原XV21 ；所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,其余為水。步驟2)重組亞單位疫苗XV21的免疫應(yīng)用。將60條牙鲆(每條重約IOg)隨機(jī)分 為2組，每組30條。將這2組分別命名為A和B組。將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul 上述步驟1)的疫苗混合液。將B組(對(duì)照組)的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟1) 的B187-PBS。21天后將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul疫苗混合液；將B組的每條魚分 別腹腔注射IOOul PBS。步驟3)遲緩愛德華氏菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌TXl 至OD6tltl為0.6，然后離心(5000g，4°C )10min。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為 5xl07cfu/mlo步驟4)重組亞單位疫苗XV21針對(duì)遲緩愛德華氏菌的免疫保護(hù)效應(yīng)檢測。在步驟 2)第一次免疫注射后的第34天，用上述步驟3)的遲緩愛德華氏菌懸液腹腔注射步驟2)的 兩組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的14天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。 14天后，統(tǒng)計(jì)各組魚的總死亡數(shù)目A組，7條；B組，25條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)存活率 (RPS)RPS = 100x(l-免疫組魚的總死亡百分比/對(duì)照組魚的總死亡百分比)由此得出重組亞單位疫苗XV21針對(duì)遲緩愛德華氏菌的免疫保護(hù)效率(以RPS計(jì)) 為72%。該結(jié)果表明，按上述方法所純化和應(yīng)用的XV21是一種高效的保護(hù)性抗原，能夠顯 著提高牙鲆對(duì)遲緩愛德華氏菌的感染能力。疫苗SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院海洋研究所<120> 一種遲緩愛德華氏菌重組亞單位疫苗及其應(yīng)用<130><160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1416
1651701750100]CCCtggtggCgCtacCgtCtgaagggctccaacCtgCtgggccatgag5760101]ProTrpTrpArgTyrArgLeuLysGlySerAsnLeuLeuGlyHisGlu0102]1801851900103]cctggacgaacggcggcggttCCgCtggcgCCggcgcagctgaaggcc6240104]ProGlyArgThrAlaAlaValProLeuAlaProAlaGlnLeuLysAla0105]1952002050106]ttttatcatcagtggtataccCCCgatgcgataacgCtgtacgtggtc6720107]PheTyrHisGlnTrpTyrThrProAspAlalieThrLeuTyrValVal0108]2102152200109]ggcaacgtggatgccegggcgCtgagegaacagateaatcagaccttc7200110]GlyAsnValAspAlaArgAlaLeuSerGluGlnlieAsnGlnThrPhe0111]2252302352400112]ggcCCCCtgageggcaagegggagacgCCggccacggtgCCggcgctg7680113]GlyProLeuSerGlyLysArgGluThrProAlaThrValProAlaLeu0114]2452502550115]CCggcgCtggccgcggcgCCggtgageCtgategccgatggcgccaag8160116]ProAlaLeuAlaAlaAlaProValSerLeulieAlaAspGlyAlaLys0117]2602652700118]caggatattCtgtcgCtggtctgggatacgCCgtggcagCCgateCgt8640119]GlnAsplieLeuSerLeuValTrpAspThrProTrpGlnProlieArg0120]2752802850121]gactctcagatgCtgCtgCgCtattggCgtagegacttggcgCgCgag9120122]AspSerGlnMetLeuLeuArgTyrTrpArgSerAspLeuAlaArgGlu0123]2902953000124]gcgCtgttctggcatctacagcaggtgCtggccaacagegcgctgaag9600125]AlaLeuPheTrpHisLeuGlnGlnValLeuAlaAsnSerAlaLeuLys0126]3053103153200127]ggcagegtgaacCtgagetttaactgccaggtgcagtat cag cgc tcg10080128]GlySerVal Asn Leu Ser Phe Asn Cys Gln Val Gln Tyr Gln Arg Ser0129]3253303350130]cagtgcgcgatecatttagagacggetcaggcgteattg age aag acg10560131]GlnCysAla lie His Leu Glu Thr Ala Gln Ala Ser Leu Ser Lys Thr0132]3403453500133]Ctggcgtttategccgatgag atg tccgcgCtgCgCgat gat ggg att11040134]LeuAlaPhelie Ala Asp Glu Met Ser Ala Leu Arg Asp Asp Glylie0135]3553603650136]acccagCCggagtttgacaccCtgCtggggcagaagaac gat cag ctg11520137]ThrGlnPro Glu Phe Asp Thr Leu Leu Gly Gln Lys Asn Asp Gln Leu0138]3703753800139]agtcacCtgttcgccacctatgcgcgaacc￡1￡ acc^ac ate ctg atg0140]SerHisLeuPheAlaThrTyrAla Arg Thr Asn Thr AsplieLeu Met0141]3853903954000142]agtcaaCgCCtgCgCteacagcaaageggcgtggtg^ac ate get ccg0143]SerGlnArgLeuArgSerGlnGln Ser Gly Val Val AsplieAla Pro0144]4054104150145]gaggcgtatcagaagCtgCgCcagacgttcctg age^cg ctg acg ctg0146]GluAlaTyrGlnLysLeuArgGlnThrPheLeuSerAlaLeuThr Leu0147]4204254300148]gacgatattaaccaagagCtgcatateatgctgtcg"gg gag ccc gcc0149]AspAsplieAsnGlnGluLeuHislie Met Leu Ser Arg Glu Pro Ala0150]4354404450151]gtggtgCtgCgtcagCCgCgCggtgaggccgaggagaac gtg ggc cgc0152]ValValLeuArgGlnProArgGlyGluAlaGluGluAsnValGly Arg0153]4504554600154]CtgCtggaggagtataac egg gtg0155]LeuLeu Glu Glu Tyr AsnArgVal0156]4654700157]<210>20158]<211>4720159]<212>PRT0160]<213>遲緩愛德華氏菌TXl0161]<400>20162]MetGlnTyrThrLysLeuArgLeuMetValGlyGlyLeuAlaLeu Ala0163]1510150164]MetValGlyThrSerValHisSerGluThrLeuGlnProAspPro Ala0165]2025300166]TrpGlnGluGlyLysLeuProAsnGlyPheSerTrpGlnlieLeu Ala0167]3540450168]ThrProGlnArgProSerAspArglieGluLeuArgMetlieVal Asn0169]5055600170]ThrGlySerLeuSerGluSerProGlnGlnValGlyTyrAlaHis Leu0171]657075800172]LeuProArgLeuAlaLeuAlaGlnGlyLysGlyLeuAspAlaThr Ala0173]8590950174]LeuGlnSerPheTrpGlnGlnAlalieAspProValArgProMet Pro0175]1001051100176]AlaAlalieThrSerTyrAspTyrThrSerTyrAsnLeuSerLeu Pro0177]1151201250178]AsnAsnArgProAspLeuMetLysAspAlaLeuArgTrpLeuAlaAsn0179]1301351400180]ThrAlaGlyAspLeuGlnValAsnAlaGluThrValGlyGluAlaLeu0181]1451501551600182]LysGlySerAspSerArgValMetAlaLeuProGlyGluAlaGlyAsp0183]1651701750184]ProTrpTrpArgTyrArgLeuLysGlySerAsnLeuLeuGlyHisGlu0185]1801851900186]ProGlyArgThrAlaAlaValProLeuAlaProAlaGlnLeuLysAla0187]1952002050188]PheTyrHisGlnTrpTyrThrProAspAlalieThrLeuTyrValVal0189]2102152200190]GlyAsnValAspAlaArgAlaLeuSerGluGlnlieAsnGlnThrPhe0191]2252302352400192]GlyProLeuSerGlyLysArgGluThrProAlaThrValProAlaLeu0193]2452502550194]ProAlaLeuAlaAlaAlaProValSerLeulieAlaAspGlyAlaLys0195]2602652700196]GlnAsplieLeuSerLeuValTrpAspThrProTrpGlnProlieArg0197]2752802850198]AspSerGlnMetLeuLeuArgTyrTrpArgSerAspLeuAlaArgGlu0199]2902953000200]AlaLeuPheTrpHisLeuGlnGlnValLeuAlaAsnSerAlaLeuLys0201]3053103153200202]GlySerValAsnLeuSerPheAsnCysGlnValGlnTyrGlnArgSer0203]3253303350204]GlnCysAlalieHisLeuGluThrAlaGlnAlaSerLeuSerLysThr0205]3403453500206]LeuAlaPhelieAlaAspGluMetSerAlaLeuArgAspAspGlylie0207]3553603650208]ThrGlnProGluPheAspThrLeuLeuGlyGlnLysAsnAspGlnLeu0209]3703753800210]SerHisLeuPheAlaThrTyrAlaArgThrAsnThrAsplieLeuMet0211]3853903954000212]SerGlnArgLeuArgSerGlnGlnSerGlyValValAsplieAlaPro0213]4054104150214]GluAlaTyrGlnLysLeuArgGlnThrPheLeuSerAlaLeuThrLeu0215]420425430
AspAsplie Asn Gln Glu Leu HislieMetLeuSer Arg GluPro
435 440445
ValValLeu Arg Gln Pro Arg GlyGluAlaGluGlu Asn ValGly
450455460
LeuLeuGlu Glu Tyr Asn Arg Val
465470
權(quán)利要求
一種免疫保護(hù)性重組亞單位疫苗，其特征在于具序列表SEQ ID No.1中的堿基序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的重組亞單位疫苗的制備，其特征在于1)質(zhì)粒pETXV21的構(gòu)建將質(zhì)粒pET28用Ndel/Xhol酶切，回收5.3kb片段；以遲緩愛 德華氏菌TXl為模板，用引物XVF和XVR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后用Ndel/Xhol酶切，回 收1. 4kb片段，將其與上述5. 3kb片段連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含卡那霉素的 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PETXV21 ；2)疫苗蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將質(zhì)粒PETXV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得轉(zhuǎn)化子 BL21/pETXV21 ；將BL21/pETXV21于含有Kn的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取過夜后的培養(yǎng) 液加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5，加入終濃度為ImM的IPTG并于 37°C繼續(xù)培養(yǎng)4-5h，然后在離心后菌液中加入裂解液，在室溫?fù)u動(dòng)1-2小時(shí)；將菌液離心， 回收上清；將上清液用凝膠柱回收，即得序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所編碼的重組亞 單位疫苗蛋白。
3.一種按權(quán)利要求1所述的重組亞單位疫苗的應(yīng)用，其特征在于將上述所得的重組 亞單位疫苗蛋白與菌株B187于PBS中混合，所得疫苗混合液對(duì)遲緩愛德華氏菌具免疫保護(hù) 作用。
4.按權(quán)利要求1所述的重組亞單位疫苗的應(yīng)用，其特征在于將所述疫苗混合液腹腔 注射牙鲆，21天后加強(qiáng)免疫一次，即可使牙鲆對(duì)遲緩愛德華氏菌侵染具抵抗作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種遲緩愛德華氏菌重組亞單位疫苗及其制備和應(yīng)用方法。所述疫苗具序列表SEQ ID No.1中的堿基序列。其制備方法構(gòu)建疫苗抗原表達(dá)質(zhì)粒pETXV21，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)后回收重組蛋白，將其與菌株B187混合后溶于PBS，即為對(duì)遲緩愛德華氏菌具免疫保護(hù)作用的疫苗混合液。將疫苗混合液腹腔注射魚類，即可達(dá)到免疫保護(hù)目的。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101991844SQ20091001795
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者孫黎, 焦緒棟 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所