專利名稱：一種新的植酸酶基因及其表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種合成的新的植酸酶基因，是一種符合畢赤酵母密碼偏愛性的大腸 桿菌植酸酶密碼子的DNA序列；尤其還構建了一種能高效分泌表達該合成基因的畢赤酵母 工程菌。屬于微生物基因工程技術領域。
背景技術：
植酸(肌醇六磷酸)是谷物、豆類及油料等作物中磷的主要貯存形式，其含量高達 總磷量18%-88% (Reddy NR等，1982)。盡管作物植酸磷的含量很高，但是，由于單胃動物 消化道內缺乏植酸酶，不能把植酸在消化道內水解成無機磷酸鹽，因此植酸的利用率低。植 酸酶(EC3. 1.3.8)能水解植物性飼料中植酸磷，從而提高豬禽等單胃動物對磷的利用率。 植酸酶的添加可使畜禽糞便中磷的排出量減少40% 75%，可大大減輕養殖業造成的江 河或水域等環境污染，對發展養殖業和環境保護都有重要意義。雖然植酸酶已在飼料工業中得到廣泛使用，明顯降低飼料生產成本、改善環保，產 生可觀的經濟效益和社會效益；但是，飼用植酸酶的生產的不足是制約飼料加工業發展的 因素之一。因此，用現代生物技術改造和提升產量已成為植酸酶產業化的發展方向，它也是 各生物產業公司提高產品競爭力和取勝的關鍵因素之一。植酸酶的來源較為廣泛，如植物種子、米糠、原核生物如大腸桿菌、真菌如黑曲霉， 甚至是動物腸道。由于遺傳密碼的簡并性，不同物種間存在著密碼偏愛性，這也是影響基因 異源表達的重要因素。密碼偏愛性改造是提高外源基因表達量的重要手段。
發明內容
針對現有技術存在的不足，本發明所要解決的技術問題之一在于提供一種新的植 酸酶基因，使其符合畢赤酵母的密碼偏愛性，能夠在畢赤酵母中高效分泌表達。本發明所要 解決的技術問題之二在于提供一種該植酸酶基因的表達載體，并構建一種產此植酸酶的畢 赤酵母工程菌，使之高效分泌表達該植酸酶基因，并可通過高密度發酵生產植酸酶用于動 物飼料。為解決上述技術問題，本發明利用人工合成基因的方法，將大腸桿菌植酸酶appA 基因的密碼子改造為符合畢赤酵母的密碼偏愛性，為其在畢赤酵母中超水平表達奠定基 礎，并構建高水平表達植酸酶的畢赤酵母工程菌。本發明所采取的技術方案之一是一種新 的植酸酶基因，其符合畢赤酵母的密碼偏愛性，具有大小為1236bp的下列DNA序列1ATGCAATCTGAACCAGAATTGAAGTTGGAATCTGTTGTCATCGTCTCTAG
51ACATGGTGTTAGAGCACCAACCAAGGCCACCCAACTTATGCAAGATGTCA
101CCCCAGACGCTTGGCCAACCTGGCCAGTCAAGCTGGGTTGGTTGACACCT
151AGAGGTGGTGAGCTCATTGCTTACTTGGGTCACTACCAAAGACAGCGTCT
201TGTTGCCGACGGATTGTTGGCCAAGAAGGGTTGTCCACAATCTGGTCAAG
251TAGCTATTATTGCTGACGTCGACGAAAGAACCCGTAAGACAGGTGAAGCC
4
301TTCGCCGCCGGTCTTGCTCCTGACTGTGCCATTACCGTTCACACCCAAGC
351TGACACTTCTTCTCCAGATCCATTGTTCAACCCTTTGAAGACTGGTGTTT
401GCCAATTGGACAACGCTAACGTTACTGACGCTATCTTGTCCAGAGCTGGA
451GGATCCATTGCTGACTTCACCGGTCACAGACAGACTGCCTTCAGAGAGTT
501GGAAAGAGTTCTTAACTTCCCACAATCCAACTTGTGCCTTAAGCGTGAGA
551AGCAAGACGAATCCTGTTCCTTGACTCAAGCATTACCATCTGAGTTGAAG
601GTCTCCGCCGACAACGTCTCTTTGACCGGTGCTGTCAGCTTGGCTTCCAT
651GTTGACTAAAATCTTTCTTCTGCAACAAGCTCAAGGTATGCCTGAGCCAG
701GTTGGGGTAGAATCACCGACTCTCACCAATGGAACACCTTGTTGTCCTTG
751CACAACGCTCAATTCTACTTGCTGCAGAGAACTCCAGAGGTTGCTAGATC
801CAGAGCCACCCCATTGTTGGACTTGATCAAGACTGCTTTGACTCCTCACC
851CACCTCAAAAGCAAGCCTACGGTGTTACCTTGCCCACTTCTGTCTTGTTC
901ATTGCCGGTCACGATACTAACTTGGCAAATCTCGGCGGTGCTTTGGAGTT
951GAACTGGACTCTTCCTGGTCAACCTGATAACACTCCACCAGGTGGTGAGC
1001TCGTTTTCGAAAGATGGCGTAGACTATCTGATAACTCTCAATGGATTCAG
1051GTTTCGTTGGTCTTCCAAACTTTGCAGCAGATGAGAGACAAGACTCCACT
1101GTCTTTGAACACGCCTCCAGGAGAAGTCAAATTGACCTTGGCTGGATGTG
1151AAGAGAGAAATGCTCAGGGTATGTGTTCCTTGGCTGGTTTCACTCAAATT
1201GTTAACGAAGCTAGAATTCCAGCTTGTTCTTTGTAG。
本發明根據已報道的大腸桿菌植酸酶基因序列，按照畢赤丨酵母偏愛密碼子表，把
編碼植酸酶的密碼子轉換成畢赤酵母偏愛的形式。上述植酸酶基因通過以下途徑合成首先人工合成16條寡聚核苷酸引物，即正向引物8條F1_F8，反向引物8條 R1-R8，長度分別在95 106nt之間，引物間含20 23bp的重復序列(見引物表1)。取引 物Fl和Rl各25pmol進行PCR反應，反應體積50 μ L，反應條件95°C 4min ；94°C 40s, 52°C 40s, 72°C 20s，共25個循環；72°C延伸7min。反應后取0. 1 μ L反應產物做為模板，以F2和 R2 為引物，進行第 2 次 PCR 反應，反應條件94°C 4min ；94°C lmin，52°C 30s, 72°C 30s，共 25 個循環；72°C延伸lOmin。依此類推，進行其余6個PCR反應，但每個反應的延伸時間增加 IOs0共連續進行8次PCR反應，合成具有上述基因序列的符合畢赤酵母密碼偏愛性的植酸 酶基因。一種含有上述植酸酶基因的表達載體pKDN-Ι，通過以下途徑獲得設計引物Phy-F和Phy-R(見引物表1)，引物兩端分別引入Eco RI和Not I酶切 位點；以上述合成的植酸酶基因作模板進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠回收PCR擴增產物，接著 進行Eco RI和Not I雙酶切反應，然后再次凝膠回收酶切產物；將此酶切產物定向連接到 已Eco RI和Not I雙酶切載體PPIC9K，則獲得表達載體，命名為pKDN_l。一種含有上述表達載體pKDN-1的畢氏酵母菌，命名為Pichiapastoris KDN-I,已 保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 209130。其通過以下途徑獲得將載體pKDN-Ι酶切線性化后電擊導入畢氏酵母菌GS115，篩選轉化植酸酶基因高 拷貝數的重組畢赤酵母菌株，然后進行高密度發酵驗證，最后獲得高效表達植酸酶的畢赤 酵母工程菌。
表1合成植酸酶基因以及構建表達載體所用引物表
權利要求
一種新的植酸酶基因，其具有ID NO1所示的大小為1236bp的DNA序列，其符合畢赤酵母的密碼偏愛性，編碼具有ID NO2所示氨基酸序列的植酸酶。
2.根據權利要求1所述的植酸酶基因，其編碼的植酸酶具有IDNO :2所示氨基酸序列， 該氨基酸序列不含植酸酶的信號肽序列，其編碼的植酸酶為去信號肽的成熟蛋白，即N端 22氨基酸殘基的信號肽被剔除。
3.一種含有權利要求1所述植酸酶基因的表達載體pKDN-1。
4.一種含有權利要求3所述表達載體pKDN-1的畢氏酵母菌，其含有權利要求1所述的 植酸酶基因，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 209130。
5.一種構建權利要求4所述保藏編號為CCTCC M 209130的畢氏酵母菌的方法，包括下 列內容A、首先人工合成16條寡聚核苷酸引物，即正向引物8條，反向引物8條，連續進行8次 PCR反應，合成具有權利要求1所述基因序列的符合畢赤酵母密碼偏愛性的植酸酶基因；B、設計引物Phy-F和Phy-R，引物兩端分別引入EcoRI和Not I酶切位點；以步驟A合 成的植酸酶基因作模板進行PCR擴增；瓊脂糖凝膠回收PCR擴增產物，接著進行Eco RI和 Not I雙酶切反應，然后再次凝膠回收酶切產物；將此酶切產物定向連接到已Eco RI和Not I雙酶切載體PPIC9K，獲得表達載體pKDN-Ι ；C、將載體pKDN-Ι酶切線性化后電擊導入畢氏酵母菌GS115，篩選轉化植酸酶基因高拷 貝數的重組畢赤酵母菌株，獲得高效表達植酸酶的畢赤酵母工程菌。
6.根據權利要求5所述的構建畢氏酵母菌CCTCCM 209130的方法，其內容如下A、根據大腸桿菌植酸酶的CDS編碼氨基酸全序列中、編碼其在第23個氨基酸Gln處 經酶切后形成的分子量為44. 8kD、具有410個氨基酸殘基的成熟蛋白質的序列，從第23位 Gln殘基起設計符合畢赤酵母密碼偏愛性的引物，合成16條寡聚核苷酸引物，即8條正向 引物Fl至F8，8條反向引物Rl至R8 ；取引物Fl和Rl各25pmol進行PCR反應，反應體積 50 μ L，反應條件:95V 4min ；94°C 40s, 52°C 40s, 72°C 20s，共 25 個循環；72°C延伸 7mi η ； 反應后取0. 1 μ L反應產物做為模板，以F2和R2為引物，進行第2次PCR反應，反應條件 950C 4min ；94°C lmin, 52°C 30s, 72°C 30s，共 25 個循環；72°C延伸 7min ；依此類推，進行其 余6個PCR反應，但每個反應的延伸時間增加IOs ；連續進行8次PCR反應，合成符合畢赤 酵母密碼偏愛性的植酸酶成熟蛋白編碼區DNA片段；B、設計引物Phy-F和Phy-R，引物序列如下Phy-F :5’ -AA }/GAATT(^ CAATCTGAACCAGAATTGAAG-3，.................EcoRI ；Phy-R :5，-AA \GCGGCCGdf CTACAAAGAACAAGCTGGAAG-3‘..........Not I ；ι以合成的植酸酶基因為模板，以Phy-F和Phy-R為引物進行PCR擴增；PCR條件為 950C 4min ；94°C 40s, 52°C 40s, 72°C lmin，共 30 個循環；72°C延伸 7min ；凝膠回收 PCR 產物 并以Eco RI和Not I雙酶切；同樣，以Eco RI和Not I雙酶切pPIC9K ；然后把酶切后兩個 雙酶切產物連接獲得重組表達質粒PKDN-I ；C、高效分泌表達畢赤酵母工程菌的篩選a.重組質粒pKDN-Ι的線性化重組質粒pKDN-Ι用Bgl II酶切電泳鑒定后，經乙醇沉 淀濃縮，測定DNA濃度，以3 μ g/ μ L濃度稀釋質粒片段保存備用；b.畢赤酵母GS115感受態細胞的制備挑取GS115單菌落，在YPD培養基中30°C振蕩 培養過夜，再轉移到IOOmL YPD培養基中，培養至0D600 = 1. 5，冰浴IOmin, 4°C 5000rpm離 心3min，收集菌體；用預冷的無菌雙蒸水洗滌菌體2次，然后重懸于ImL預冷的電泳緩沖液 中，該緩沖液含 ImM MgCl2, IOmM HEPES，250mM 蔗糖，pH 7. 8 ；c.電擊轉化在80μ L感受態細胞中加入5 μ L線性化重組質粒pKDN-Ι ；用Imm電擊杯 在EMC830電轉儀轉化，其電擊條件為300V，16ms ；最后涂布于匪平板培養，挑選重組菌株； 該MM培養基組分1. 34% YNB，4X10_5%生物素，0. 5%甲醇；d.篩選高拷貝重組轉化子將尼龍膜轉放在浸過預變性液的濾紙上孵育15min，該預 變性液為50mM EDTA, 2. 5% β -巰基乙醇，pH 9. 0 ；然后把尼龍膜轉放在浸過酶解液的濾紙 上，37°C孵育4小時，該酶解液為lmg/ml Zymolyase 100T ；尼龍膜轉放在浸過變性液的濾 紙上5min，該變性液為0. 5M NaOHU. 5M NaCl混合液；將尼龍膜轉放在浸過中和液的濾紙 上5min，該中和液為1. 5M NaCUO. 5M Tris-Cl混合液；將尼龍膜轉放在浸過2 X SSC (檸檬 酸三鈉)的濾紙上5min ；然后室溫干燥尼龍膜30min ；將尼龍膜置于紫外燈下照射4min ； 進行Southern雜交，篩選獲得一個雜交信號強烈的菌種，將其命名為Pichia pastoris KDN-I，其保藏編號 CCTCC M 209130。
全文摘要
本發明公開了一種新的植酸酶基因，其具有ID NO1所示的大小為1236bp的DNA序列，其符合畢赤酵母的密碼偏愛性，編碼具有ID NO2所示氨基酸序列的植酸酶。并提供了一種含有該植酸酶基因的表達載體pKDN-1及利用表達載體pKDN-1轉化的畢氏酵母工程菌，將其保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 209130。還提供了一種構建畢氏酵母菌CCTCC M 209130的方法。本發明所提供的植酸酶基因，其符合畢赤酵母的密碼偏愛性，能夠在畢赤酵母中高效表達，所構建的高表達工程菌CCTCC M 209130進行高密度發酵時，酶活最高可達2000U/mL。
文檔編號C12N1/19GK101955957SQ20091001774
公開日2011年1月26日 申請日期2009年8月21日 優先權日2009年8月21日
發明者岳壽松, 彭虹旎, 陳剛, 黃亦鈞 申請人:青島康地恩生物科技有限公司