專利名稱：一種農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法，屬于植物基因工程領域。
技術背景甘薯是旋花科甘薯屬的蔓生性草本植物，產量高，其塊根營養豐富，淀粉含量高達 12%-20%，是重要的糧食作物及工業原料。但甘薯種間、種內雜交存在不親和性，限制 了親本的組配，而誘變育種往往效率不高且嵌合現象較為嚴重，因此通過遺傳工程技術 改良甘薯種質具有重大意義。農桿菌是一類革蘭氏陰性菌，包括根癌農桿菌(含有致瘤Ti質粒)和發根農桿菌 (含致根Ri質粒)，甘薯的遺傳轉化主要使用根癌農桿菌。根癌農桿菌的Ti質粒含有 T-DNA區，T-DNA可將攜帶的任何基因整合到植物基因組中，實現外源基因的導入。根癌農桿菌介導轉化的過程包括細菌在敏感細胞上吸附，植物傷口處產生酚類物 質或外源添加酚類物質激活vir基因表達，vir基因表達產物作用于T-DNA使其產生 T-DNA鏈，進一步形成T-DNA復合體進入細胞，此復合體在胞內蛋白與細菌蛋白的共同 作用下進入細胞核，而后整合入植物基因組。自1993年0tani等人首次獲得用毛狀根再生的轉基因甘薯植株，至今已有一些以 各種甘薯外植體為受體的轉基因報道，如Newell等以甘薯塊根為受體獲得轉基因植株， Gama等以愈傷組織為受體獲得轉基因植株，Cipriani等以甘薯葉片為受體獲得轉基因 植株。但與其他作物相比，甘薯的基因轉化進展還比較慢，缺乏高效的遺傳轉化及再生 體系，獲得的轉基因植株比較少(基本只局限在幾個品種)。因此，甘薯的轉基因體系 有待改進。 ' 發明內容本發明的目的是提供一種農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法，建立了一個適合多個 甘薯品種的不定芽發生體系，從而有效地克服了基因型對甘薯遺傳轉化的限制，使絕大 多數基因型的甘薯都能夠發生不定芽。此法取材不受季節限制，轉化頻率較高，且再生 植株無性系變異較小。本發明所述農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法包括無菌苗快繁，以甘薯莖段為受體 的遺傳轉化，不定芽再生及小苗生根，抗生素篩選和小苗移栽等步驟，具體是(1) 無菌苗的獲得及培養 將甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自來水沖洗30分鐘，剪去葉片將莖切成2cm左右小段，用70%乙醇消毒1分鐘，去凈乙醇后用O. l柳gCl2消毒10分鐘，無菌 水沖洗4遍，無菌濾紙吸去水分后將莖段放入固體培養基上，在22"C-25t下光照培養。 其中所述固體培養基配方為MS+0. Omg/L NAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂， pH5. 8。(2) 甘薯莖段的預培養將培養20-30天的甘薯無菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0. 5-1厘米的小段(每段 含1-2個節)，將莖段沿側芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見的側芽。經過上述 處理的甘薯莖段切面向下置于固體培養基上，22t-25"C下暗培養3天。其中所述固體培養基配方為MS+0. 1-1.0mg/L歸(萘乙酸)+20§/1^蔗糖+7§/1瓊脂，PH5.8。(3) 菌株的活化及菌液的制備將4 °C保存的帶有植物表達載體的農桿菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固體培養 基上劃線，28。C黑暗培養3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養 基，黑暗下28 °C、 200r/rain振蕩培養24小時后再次轉接，相同條件下培養16小時。 將菌液置于滅菌的離心管中，8000rpm離心5分鐘收集菌體，用5%蔗糖溶液重懸菌體， 調整至0D600值為0.6-1.0，備用。(4) 農桿菌侵染和共培養將預培養過的甘薯莖段浸入步驟(3)的農桿菌菌液中，侵染10-15分鐘。將莖段 取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于繼代培養基上，23t-25。C下暗培養5 天。其中所述繼代培養基配方為MS+0. l-1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。(5) 農桿菌脫菌及不定芽再生 將共培養后的組織塊用無菌水清洗3-4次，再用無菌濾紙吸干，轉接至不定芽誘導培養基上，在23。C-25°C、且每日光照14小時條件下，連續培養20士2天，分化出不 定芽。其中所述不定芽誘導譜養基配方為MS+0. 1-1. Omg/LKT (激動素)+0. 01-0. lmg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8，并添加200mg/L頭孢噻肟鈉抑制農桿菌生長。(6) 甘薯小芽的分割及生根當甘薯莖段上的不定芽長至1厘米左右時，將小芽單獨剪下，轉移到生根培養基上， 在23t -25"C、且每日光照14±1小時條件下，連續培養14天。其中所述生根培養基 配方為MS+0. 1-1. Omg/L醒+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻月虧 鈉。(7) 轉基因植株的篩選將已生根的甘薯小苗不傷及根部取出，轉接到篩選培養基上，在23t-25t、且每 曰光照14小時條件下，連續培養14天。其中所述篩選培養基配方為MS+0. 1-1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻肟鈉和25 mg/L卡那霉素。(8) 檢測及移栽當小苗經篩選存活、且根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養基移 入土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度(移栽成活率大于90%)。當小苗在土壤中長出4-7片新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。甘薯葉片經液氮研磨后迅速轉移至1. 5ml離心管中，加入600ii 165QC預熱的2xCTAB 提取緩沖液，顛倒離心管混勻，65。C水浴30分鐘。混合物冷卻至室溫后加入等體積的 酚:氯仿異戊醇(體積比25:24:1),混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉移至新管， 加入等體積氯仿異戊醇(體積比24: 1)，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉移 至新管，加入三分之二體積預冷的異丙醇，混勻，12000rpm離心IO分鐘，棄去上清液。 70%乙醇不打散沉淀洗滌3次，棄去乙醇將沉淀晾干。用30iil雙蒸水溶解后PCR檢測。本發明所述農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法的特點和有益效果是(1)不定芽再 生速度快，轉化周期短，從莖段預處理開始60-80天即可獲得轉基因植株；(2)以莖段 為外植體誘導不定芽可以避免愈傷組織培養中引起的不良變異；(3)本發明的莖段不定 芽再生體系再生率高且適用于多種甘薯品種(例如濟薯21，濟薯22，美國紅心，徐 薯18等)，適用性廣，克服了基因型對甘薯遺傳轉化的限制；(4)操作比較簡單，易于掌握，重復性好。本發明提出了一個甘薯遺傳轉化的新方法，以甘薯莖段為外植體，通過對其侵染及 誘導不定芽獲得轉基因植株，適用于多種基因型，且再生速度快，是一個能夠用于甘薯 轉基因育種的可靠體系。
圖1示沐GWS7載體圖(含《m基因)。圖2示pD0NR載體圖(含s朋c7基因)。圖3示p2K7GW7載體圖(含s朋c7基因)。圖4示預培養3天的甘薯莖段。圖5示農桿菌侵染后共培養5天的甘薯莖段。圖6示再生出的不定芽。圖7示小芽再生的植株。圖8示轉《"s基因PCR檢測電泳圖，其中M為Marker (DNA/HindlII-EcoRI)，泳 道l為質粒對照，泳道2-16為待檢測植株，泳道17為野生型對照。圖9示轉^ys基因PCR陽性植株的GUS染色結果(A圖為帶葉幼芽，B圖為根)。 圖10示轉扁c7基因PCR檢測電泳圖，其中M為Marker (DNA/HindlII-EcoRI)，泳 道l為質粒對照，泳道2-19為待檢測植株，泳道20為野生型對照。
具體實施方式
實施例1:以濟薯22為受體材料，轉化菌株為攜帶pKGWFS7載體的農桿菌菌株AGL104 (載體 購買自Invitrogen公司)。(1) 無菌苗的獲得及培養將甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自來水沖洗30分鐘，剪去葉片將莖切 成2cm左右小段，用70%乙醇消毒1分鐘，去凈乙醇后用0. P/。HgCl2消毒10分鐘，無菌 水沖洗4遍，無菌濾紙吸去水分后將莖段放入固體培養基上，在25。C下光照培養。其 中所述固體培養基配方為MS+1.0mg/LNAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。(2) 甘薯莖段的預培養將生長30天的甘薯無菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0. 5-1厘米的小段(每段含 l-2個節)，將莖段沿側芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見的側芽。經過上述處理 的甘薯莖段切面向下置于固體培養基上，25 t暗培養3天。所用固體培養基配方為 MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5.8。(3) 菌株的活化及菌液的制備將4 °C保存的農桿菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固體培養基上劃線，28 t黑暗 培養3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養基，黑暗下28。C、200rpm 振蕩培養24小時后再次轉接，相同條件下培養16小時。將菌液置于滅菌的離心管中， 8000rpm離心5分鐘收集菌體，用5%蔗糖溶液重懸菌體，調整至OD600值為0. 8。(4) 農桿菌侵染和共培養將預培養過的甘薯莖段浸入農桿菌菌液，侵染15分鐘。將莖段取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于繼代培養基上，25"C暗培養5天。所用繼代培養基配方為 MS+0.5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。(5) 農桿菌脫菌及不定芽再生 將共培養后的組織塊用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干，轉接至不定芽誘導培養基上。所用培養基為MS+0. 5mg/L KT+0. 05mg/L NAA+3。/。蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5.8,并添加 200mg/L頭孢噻肟鈉抑制農桿菌生長。25°C、每日14小時光照培養20天。不定芽再生 頻率為80%。(6) 甘薯小芽的分割及生根當甘薯莖段上的不定芽長至1厘米左右時，將小芽單獨剪下，轉移到生根培養基上。 所用培養基為MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻肟鈉。 25°C、每日14小時光照培養14天。小芽的生根頻率為79. 1%。(7) 轉基因植株的篩選將已生根的甘薯小苗不傷及根部取出，轉接到篩選培養基上。所用篩選培養基配方 為MS+0.5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5.8，添加200mg/L頭孢噻肟鈉和25mg/L 卡那霉素。23 nC -25°C、每日14小時光照培養14天，抗性小苗約占小苗總數的6. 9%。(8) 檢測及移栽當小苗經篩選存活、根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養基移入 土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。移栽成活率大于90°/。。當小苗在土壤中長出4-7片 新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。甘薯葉片經液氮研磨后迅速轉移至1. 5ml 離心管中，加入600u 165"C預熱的2乂CTAB提取緩沖液，顛倒離心管混勻，65 °C水浴 30分鐘。混合物冷卻至室溫后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1)，混勻后 12000rpm離心10分鐘，上清液轉移至新管，加入等體積氯仿異戊醇(體積比24: 1), 混勻后12000rpra離心10分鐘，上清液轉移至新管，加入三分之二體積預冷的異丙醇， 混勻，12000rpm離心IO分鐘，棄去上清液。70%乙醇不打散沉淀洗滌3次，.棄去乙醇將 沉淀晾干。用30u 1雙蒸水溶解。PCR檢測:向20u 1體系中加入以下成分引物(10iiM) Pl、 P2各1p1， Buffer2 yl， MgCl21.4yl， dNTP(2. 5誦o1 each)0. 4y 1， DNA模板100ng， Taq酶O. lul，用水 補足20yl。 PCR反應條件為:94('C變性5分鐘；94。C30秒，52°C40秒，72°C60秒，35 個循環；72('C10分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(檢測gus基因引物Pl 5'AACCACAAACCGTTCTACTT3' P2 5'CTGATACTCTTCACTCCACA3')。結果利用農桿菌介導的甘薯不定芽轉化系統，對濟薯22進行了農桿菌轉化。三 次生物學重復(共200莖段)，通過不定芽再生獲得510棵植株，經潮霉素篩選具有抗 性植株35株。轉基因陽性植株經PCR檢測，證明21株為陽性植株。對轉基因陽性植株 進行GUS染色發現，GUS活性出現在根、莖、葉中，進一步證明了 GUS基因轉入到甘薯 基因組中，并實現了GUS基因的表達。實施例2:以濟薯21為受體材料，轉化菌株為攜帶有5T^c7基因(p2K7GW7載體)的農桿菌 AGL104。 pD0NR及p2K7GW7載體購買自Invitrogen公司。 (1)無菌苗的獲得及培養將甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自來水沖洗30分鐘，剪去葉片將莖切 成2cm左右小段，用70%乙醇消毒1分鐘，去凈乙醇后用0. ly。HgCl2消毒10分鐘，無菌 水沖洗4遍，無菌濾紙吸去水分后將莖段放入固體培養基上，在25。C下光照培養。其 中所述固體培養基配方為MS+0. 5mg/L NAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。(2) 甘薯莖段的預培養將生長30天的甘薯無菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0. 5-1厘米的小段(每段含 1-2個節)，將莖段沿側芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見的側芽。經過上述處理 的甘薯莖段切面向下置于固體培養基上，22t-25uC暗培養3天。所用培養基為 MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。(3) 載體構建利用gateway方法構建otsc7基因的植物表達載體。以水稻的cDNA為模板，通過 一次PCR和二次PCR反應獲得平末端二次PCR產物。 一次PCR體系為5xPhusion HF BufferlOul， lOmMdNTPlul'正向引物(lOuM) 2.5tU,反向引物(10uM) 2. 5 u 1，模板(水稻cDNA) 2ul， DMS0 1.5iil， Phusion 0. 3ul， H20補足至50yl (正向 引物N1 5' AAAAAGCAGGCTGGATGGGGATGAGGAGGGAGAG 3'，反向引物N2 5， AGAAAGCTGGG TTTCAGAACGGGACCATGCC3' )。 二次PCR體系為5xPhusion HF Buffer 10 p 1 ， 10mM dNTP lul，正向引物(IOuM) 2. 5"1，反向引物(lOuM) 2. 5ul，模板(一次PCR產物) 2 y 1 ， DMSO 1. 5 u 1 , Phusion 0. 3 y 1 ， H力補足至50 u 1 (引物attB1-F 5， GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT 3' ， attBl-R 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT 3')。將二次PCR產物電泳檢測，切膠回收目的片段，用回收產物進行BP反應(BP反應 體系二次PCR產物(40-lOOfmol) 3. 5 y ] ， i扁R' ector (150ng/yl) 0. 5yl，BP Clonase enzyme mixture 1 u 1) , 25 "C溫育連接2-3小時后取BP反應產物1 u 1轉化 大腸桿菌DH5a的感受態細胞。37"C培養12-16小時后挑取單菌落檢驗。取BP反應后驗 證為陽性且測序正確的菌擴大培養并提取質粒，進行LR反應，反應體系為BP產物 (40-100fmo1) 3. 5 y 1 ， Destination vector (] 50ng/ u 1) ， BP Clonase enzyme misture lyl,25"C溫育連接3-24小時。取LR反應產物2y l轉化到大腸桿菌，37°C培養12-16 小時后挑取單克隆驗證。陽性菌擴大培養后提取質粒，轉化到農桿菌AGL104中。(4) 菌株的活化及菌液的制備將攜帶有s朋W基因的農桿菌接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養基，黑暗下 28('C、 20(kpm振蕩培養24小時后再次轉接，相同條件下培養16小時。將菌液置于滅菌 的離心管中，8000rpm離心5分鐘收集菌體，用5%蔗糖溶液重懸菌體，調整至0D600值 為0.8。(5) 農桿菌侵染和共培養將預培養過的甘薯莖段浸入農桿菌菌液，侵染15分鐘。將莖段取出，用無菌濾紙 吸去多余菌液，切面朝下置于固體培養基上，23 °C -25QC暗培養5天。所用培養基為 MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。(6) 農桿菌脫菌及不定芽再生 將共培養后的組織塊用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干，轉接至不定芽誘導培養基上。所用培養基為MS+0.5mg/L KT十0.05mg/L NAA+3W蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5.8，并添加 200mg/L頭孢噻肟鈉抑制農桿菌生長。23 t -25"C、每日14小時光照培養20天。不定芽再生頻率為75%。(7) 甘薯小芽的分割及生根當甘薯莖段上的不定芽長至1厘米左右時，將小芽單獨剪下，轉移到生根培養基上。 所用培養基為MS+0. 5mg/L NAA+2. 0°/。蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻肟鈉。 23 UC -25°C、每日14小時光照培養14天p小芽生根頻率為80°/o。(8) 轉基因植株的篩選將已生根的甘薯小苗不傷及根部取出，轉接到篩選培養基上。所用培養基為-MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻后鈉和25 mg/L卡 那霉素。23"C -25"C、每日14小時光照培養14天。轉基因抗性植株約占植株總數的6. 2%。(9) 檢測及移栽 ，當小苗經篩選存活、根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養基移入 土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。移栽成活率大于90%。當小苗在土壤中長出4-7片 新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。甘薯葉片經液氮研磨后迅速轉移至1. 5ml 離心管中，加入600u 165°C預熱的2xCTAB提取緩沖液，顛倒離心管混勻，65 t水浴 30分鐘。混合物冷卻至室溫后加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1),混勻后 12000rpm離心IO分鐘，上清液轉移至新管，加入等體積氯仿異戊醇(體積比24: 1)， 混勻后12000rpm離心IO分鐘，上清液轉移至新管，加入三分之二體積預冷的異丙醇， 混勻，12000rpm離心IO分鐘，棄去上清液。70%乙醇不打散沉淀洗漆3次，棄去乙醇將 沉淀晾干。用30u 1雙蒸水溶解。PCR檢測:向20u 1體系中加入以下成分弓l物(10uM) Pl、 P2各lul， Buffer2 Ul， MgClal.4ul， dNTP(2. 5mmo1 each) 0. 4 w 1, DNA模板100ng， Taq酶O. lul，用水 補足20ul。 PCR反應條件為:94('C變性5分鐘；94"C30秒，55°C40秒，72°C60秒，35 個循環；72"C10分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(檢測35S引物P1 5' GAGATCAAATACCTTCCC 3' P2 5' ATTGTGCGTCATCCCTTA 3')結果利用農桿菌介導的甘薯不定芽轉化系統，對濟薯21進行了農桿菌轉化。三 次生物學重復(共190莖段)，通過不定芽再生獲得513棵植株，經卡那霉素篩選獲得 抗性植株32株。轉基因陽性植株經PCR檢測，證明19株為陽性植株。以100、 150 mmol/LNaCl處理轉基因植株與野生型對照，s;7sc/轉基因植株鮮重/干重均高于野生型， Na7K+比值低于野生型對照，說明耐鹽性較野生型有一定的提高。
權利要求
1、一種農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法，步驟包括無菌苗快繁，以甘薯莖段為受體的遺傳轉化，不定芽再生及小苗生根，抗生素篩選和小苗移栽，其特征在于所述以甘薯莖段為受體的遺傳轉化方法是將培養20-30天的甘薯無菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0.5-1厘米的小段，每段含1-2個節，將莖段沿側芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見的側芽；再將經過上述處理的甘薯莖段切面向下置于固體培養基上，22℃-25℃下暗培養3天；然后將上述暗培養的甘薯莖段在OD600為0.6-1.0的農桿菌懸液中侵染10-15分鐘，而后用無菌濾紙吸去菌液，切面朝下置于繼代培養基上，23℃-25℃下暗培養5天；所述不定芽再生及小苗生根的方法是將上述暗培養5天的甘薯莖段用無菌水清洗3-4次，再用無菌濾紙吸干，轉接至不定芽誘導培養基上，在23℃-25℃、且每日光照14小時條件下，連續培養20±2天，分化出不定芽；當甘薯莖段上的不定芽長至1厘米時，將小芽單獨剪下，轉移到生根培養基上，在23℃-25℃、且每日光照14小時條件下，培養14±1天，進行生根；所述抗生素篩選的方法是將已生出1-2cm根的甘薯小苗不傷及根部取出，轉接到含相應抗生素的篩選培養基上，在23℃-25℃、且每日光照14小時條件下，培養14±1天；其中所述篩選培養基配方為MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，并添加200mg/L頭孢噻肟鈉和25mg/L卡那霉素，pH5.8。
2、 根據權利要求1所述農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法，其特征在于所述固體 培養基配方為MS十O. 1-1.0mg/L NAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。
3、 根據權利要求1所述農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法，其特征在于所述繼代 培養基配方為MS+O. 1-1.0mg/L NAA ('萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。
4、 根據權利要求1所述的農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法，其特征在于所述不 定芽誘導培養基配方為MS+0. l-1.0mg/L KT (激動素)+0.01-0. lmg/L NAA (萘乙酸) +308幾蔗糖+7§/^瓊脂，并添加200mg/L頭孢噻肟鈉，pH5. 8。
5、 根據權利要求1所述農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法，其特征在于所述生根 培養基配方為MS+0. 1-1. Omg/L NAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，并添加200mg/L 頭孢噻躬鈉，pH5.8。
全文摘要
本發明公開了一種農桿菌介導的甘薯不定芽轉化方法。該方法包括以下步驟(1)無菌苗的獲得及培養，(2)甘薯莖段的預培養，(3)菌株的活化劑菌液的制備，(4)農桿菌侵染和共培養，(5)農桿菌脫菌及不定芽再生，(6)甘薯小芽的分割及生根，(7)轉基因植株的篩選，(8)檢測及移栽。本發明提出了一個甘薯遺傳轉化的新方法，以甘薯莖段為外植體，通過對其侵染及誘導不定芽獲得轉基因植株，適用于多種基因型，且再生速度快，是一個能夠用于甘薯轉基因育種的可靠體系。
文檔編號C12N15/82GK101608188SQ20091001733
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月27日 優先權日2009年7月27日
發明者向鳳寧, 鵬 王, 趙翠珠 申請人:山東大學