一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)及遺傳分析方法

專利名稱：一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)及遺傳分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)遺傳育種領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種三疣梭子蟹多元高通量 遺傳標(biāo)記系統(tǒng)及遺傳分析方法。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記也在不斷更新，目前廣泛應(yīng)用在海洋
動(dòng)物遺傳學(xué)分析中的標(biāo)記是線粒體序列和微衛(wèi)星標(biāo)記。線粒體序列(mtDNA) 作為核外遺傳物質(zhì)，具有進(jìn)化速度快、非重組變異和母系遺傳等特點(diǎn)，完 全相同的序列信息表明樣品來(lái)源于同一母本。常用作種內(nèi)遺傳分析的mtDNA 片段有COI， 16S和CR。微衛(wèi)星(SSRs)是在真核和原核生物基因組中存在的 由2-6個(gè)堿基構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)序列，具有高度多態(tài)性和共顯性特點(diǎn)。微衛(wèi) 星標(biāo)記能夠提供雙親的遺傳信息，尤其應(yīng)用在揭示個(gè)體間和群體間的基因 交流、推測(cè)親權(quán)關(guān)系和雜交現(xiàn)象的分析中，能更全面的反映群體間的遺傳 關(guān)系?；蚪M微衛(wèi)星標(biāo)記常被用于瀕危珍貴保護(hù)動(dòng)物以及海洋經(jīng)濟(jì)物種的
遺傳多樣性評(píng)估及系譜認(rèn)證。目前，三疣梭子蟹序列信息(國(guó)際共享數(shù)據(jù) 庫(kù)GenBank中公布112個(gè)核苷酸序列和494個(gè)EST序列)還沒(méi)有被系統(tǒng)的
開(kāi)發(fā)并真正應(yīng)用于遺傳育種所需的系譜認(rèn)定和遺傳關(guān)系分析中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、有效的三疣梭子蟹多元高通量遺傳 標(biāo)記及遺傳分析方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為
三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)所述多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng) 為線粒體序列信息系統(tǒng)和微衛(wèi)星分子標(biāo)記系統(tǒng)，其中微衛(wèi)星分子標(biāo)記系統(tǒng) 為由7個(gè)SSR標(biāo)記的系統(tǒng)1和6個(gè)SSR標(biāo)記的系統(tǒng)2組成；
系統(tǒng)1由7個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增7個(gè)SSR標(biāo)記的7對(duì)引物分別是
E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT);
P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);
E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);
E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);
C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);
C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);
H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT); 系統(tǒng)2由6個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增6個(gè)SSR標(biāo)記的6對(duì)引物分別是 E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG); E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC);E28(F : CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG);
C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA);
H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA);
E17 (F:ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
所述線粒體序列信息系統(tǒng)，擴(kuò)增CO 1, 16S和CR序列的三對(duì)引物分別是 LCO1490 (GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA); 16Sar-L (CGCCTGTTTATCAAAAACAT) 和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT); 12ST (AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT) 和CRT (GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的遺傳分析方法首先，運(yùn)用線 粒體的三對(duì)引物擴(kuò)增COI, 16S和CR的序列的信息作為分子標(biāo)記，將混養(yǎng) 家系中同一母本和不同母本所產(chǎn)的后代根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分開(kāi)，
然后再運(yùn)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記，將已區(qū)分母本的后代根據(jù)遺傳距離和遺傳多 樣性進(jìn)行父本的區(qū)分，從而完成三疣梭子蟹遺傳育種過(guò)程中的系譜認(rèn)證并 確認(rèn)近交系數(shù)。所述擴(kuò)增COI, 16S和CR序列的三對(duì)引物分別是 LCO14 9 0 (GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA); 16Sar-L(CGCCTGTTTATCAAAAACAT) 和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT); 12ST (AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT) 和CRT(GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
所述微衛(wèi)星分子標(biāo)記由系統(tǒng)1和系統(tǒng)2組成；
系統(tǒng)1由7個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增7個(gè)SSR標(biāo)記的7對(duì)引物分別是 E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT) ，■
P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);
E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);
E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);
C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);
C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);
H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT); 系統(tǒng)2由6個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增6個(gè)SSR標(biāo)記的6對(duì)引物分別是 E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG); E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC); E28(F :CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG); C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA); H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA); E17 (F: ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)。 所有引物方向?yàn)?'—3'方向。所述三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng) 遺傳分析的方法可同時(shí)檢測(cè)成百上千個(gè)樣品。 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1. 育種的遺傳背景清晰，避免了傳統(tǒng)育種的盲目性。本發(fā)明利用線粒 體序列和微衛(wèi)星作為分子標(biāo)記，解析了我國(guó)海域三疣梭子蟹野生群體的遺 傳多樣性，明確了育種基礎(chǔ)群、育種選擇群個(gè)體間的遺傳關(guān)系，使育種材 料的選擇具有更強(qiáng)的目的性。
2. 本發(fā)明線粒體序列和微衛(wèi)星分子標(biāo)記的結(jié)合，既避免了僅用線粒體 序列無(wú)法明確父系信息的缺點(diǎn)，也減少了僅用微衛(wèi)星標(biāo)記的繁瑣，有利于 快速確認(rèn)所研究個(gè)體的系譜發(fā)生。
3. 本發(fā)明應(yīng)用多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)對(duì)育種群體遺傳多樣性的實(shí)時(shí) 監(jiān)測(cè)，可以有效避免遺傳育種過(guò)程中的近交衰退，保障育種的科學(xué)性和可 持續(xù)性。


圖1為本發(fā)明遺傳分析三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)(其中數(shù) 字代表每個(gè)標(biāo)記的等位基因數(shù)，橫軸所示標(biāo)記名稱，縱軸所示等位基因的 大小。)。
圖2a和圖2b為運(yùn)用本發(fā)明方法模擬檢測(cè)圖(其中在雙親信息未知的 情況下，運(yùn)用軟件Cervus Version2. G的Simulation功能，區(qū)分400個(gè)家 系的準(zhǔn)確率為100%;由線粒體信息確定母本后、在一個(gè)親本信息已知的情 況下，區(qū)分1000個(gè)家系的準(zhǔn)確率為100%。)。
圖3為運(yùn)用本發(fā)明家系鑒定圖(其三個(gè)家系，每個(gè)家系個(gè)體數(shù)分別為 10、 14和16。運(yùn)用本發(fā)明檢測(cè)，運(yùn)用軟件populations1.2. 30,釆用DAS 法計(jì)算遺傳距離，UPGMA圖顯示，正確率為100%。)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例
1)三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)為線粒體序列信息系統(tǒng)和微衛(wèi) 星分子標(biāo)記系統(tǒng)，其中微衛(wèi)星分子標(biāo)記為由7個(gè)SSR標(biāo)記的系統(tǒng)1和6個(gè) SSR標(biāo)記的系統(tǒng)2組成(參見(jiàn)圖1);
系統(tǒng)l由7個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增7個(gè)SSR標(biāo)記的7對(duì)引物分別是
E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT);
P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);
E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);
E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);
C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);
C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);
H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT); 系統(tǒng)2由6個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增6個(gè)SSR標(biāo)記的6對(duì)引物分別是 E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG); E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC); E28(F : CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG);C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA); H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA); E17 (F: ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)。 以上引物參見(jiàn)序列表。
2)三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)遺傳分析的方法首先，運(yùn)用 線粒體的三對(duì)引物擴(kuò)增COI， 16S和CR的序列的信息作為分子標(biāo)記，將混
養(yǎng)家系中同一母本和不同母本所產(chǎn)的后代根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分 開(kāi)，然后再運(yùn)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記，將已區(qū)分母本的后代根據(jù)遺傳距離和遺 傳多樣性進(jìn)行父本的區(qū)分，從而完成三疣梭子蟹遺傳育種過(guò)程中的系譜認(rèn) 證并確認(rèn)近交系數(shù)。
(1) 運(yùn)用線粒體的三對(duì)引物擴(kuò)增COI, 16S和CR的序列的信息
a. 提取三疣梭子蟹樣品的DNA;
b. 以步驟 a 的 DNA 為模板，用引物 LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)擴(kuò)增 COI 片段，用引物 16Sar-L (CGCCTGTTTATCAAAAACAT)和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT)擴(kuò) 增 16S 片段，用引物 12ST(AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和 CRT (GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)擴(kuò)增CR片段。上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收、 純化并測(cè)序。PCR擴(kuò)增條件為95。C變性2分鐘，32-35個(gè)循環(huán)包括95"C變 性30秒、54-56。C退火45秒、72。C延伸60秒，最后72。C延伸5分鐘.
(2) 運(yùn)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記
c. 以步驟a的DM為模板，分別用引物
E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT);
P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);
E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);
E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);
C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);
C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);
H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT)
擴(kuò)增系統(tǒng)1的全部微衛(wèi)星標(biāo)記共計(jì)7個(gè)。分別用引物E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG);
E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC);
E28(F : CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG);
C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA);
H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA);
E17 (F: ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)擴(kuò)增系 統(tǒng)2的全部微衛(wèi)星標(biāo)記共計(jì)6個(gè)。PCR擴(kuò)增條件為95。C變性2分鐘，28-32個(gè)循環(huán)包括95。C變性30秒、54-58。C退火45秒、72。C延伸60秒，最后72°(3延伸5分鐘。
將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，并應(yīng)用Cervus Version2. G軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 應(yīng)用例1
運(yùn)行Cervus的模擬分析功能得到使用本發(fā)明三疣梭子蟹多元高通量遺 傳標(biāo)記系統(tǒng)遺傳分析的方法，區(qū)分混養(yǎng)家系的數(shù)目與家系鑒別成功率之間 的關(guān)系，見(jiàn)圖2。從圖2a中紅線所示，完全使用本發(fā)明方法，由線粒體信息 確定母本后、在一個(gè)親本信息已知的情況下，再運(yùn)用SSR標(biāo)記系統(tǒng)1和系統(tǒng)2 可成功區(qū)分1000個(gè)家系(準(zhǔn)確率100%);從圖2a中黑線所示，若不先使用線 粒體信息確定母本、在雙親信息未知情況下，應(yīng)用SSR標(biāo)記系統(tǒng)1和系統(tǒng)2僅 能區(qū)分400個(gè)家系(準(zhǔn)確率100%);從圖2b中紅線所示，由線粒體信息確定 母本后、在一個(gè)親本信息已知的情況下，單獨(dú)應(yīng)用SSR標(biāo)記系統(tǒng)1或系統(tǒng)2可 成功區(qū)分300個(gè)家系(準(zhǔn)確率100%);從圖中黑線所示，若不先使用線粒體 信息確定母本、在雙親信息未知情況下，單獨(dú)應(yīng)用SSR標(biāo)記系統(tǒng)1或系統(tǒng)2可 成功區(qū)分20個(gè)家系(準(zhǔn)確率100%)。
應(yīng)用例2
三個(gè)家系的樣品于2008年8月21日取自浙江省寧?？h振海水產(chǎn)有限公
司，每個(gè)家系都為一雌、 一雄所產(chǎn)的全同胞家系。分別從每個(gè)家系中隨機(jī) 取IO、 14和16只幼蟹個(gè)體，分別編號(hào)明確其親緣關(guān)系組成樣本I 。從另一個(gè) 養(yǎng)殖群體中隨機(jī)選6只雌蟹和6只雄蟹分別編號(hào)后與真正的3對(duì)親本一起共 同作為候選親本組成樣本II。進(jìn)行混養(yǎng)家系的分析時(shí)假定樣本I 、 II之間 的親緣關(guān)系未知，將樣本I與樣本II 一起應(yīng)用本發(fā)明方法進(jìn)行遺傳分析，具
體為先測(cè)定所有樣本的線粒體信息，明確母本信息并將不同母親的個(gè)體分 開(kāi)；再應(yīng)用SSR系統(tǒng)1和系統(tǒng)2檢測(cè)所有樣本的基因型，明確父本信息，并根 據(jù)樣本I中40個(gè)個(gè)體基因型的數(shù)據(jù)，用Populations軟件計(jì)算出個(gè)體之間 的遺傳距離，用UPGMA的方法根據(jù)個(gè)體間遺傳距離將三個(gè)家系的40個(gè)個(gè)體
分別聚成三類，同一家系的個(gè)體均被單獨(dú)聚成一類，分析的結(jié)果與記錄編號(hào) 比對(duì)，正確率100% (圖3)。<110>
<120〉
<130〉 〈160〉
<170>
<210〉 〈211> <212> <213>
<220〉 <221> <222> <223〉
SEQUENCE LISTING 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)及遺傳分析方法 32
Patentln version 3.1 1
20 DNA
人工設(shè)計(jì)
satellite (l).. (20)
<400〉 1
aaggaggagg ctttgatatg 20
〈210〉 2
<211> 20
〈212〉 脆
<213〉 人工設(shè)計(jì)
〈220〉
<221〉 satellite
<222> (l)..咖 <223>
〈400> 2
gtcttccact cccttactgt 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
〈213〉 人工設(shè)計(jì)
<220>
<221> satellite
<222〉 (l).. (22) 〈223〉
〈400〉 3
gccactatct tgctgaggtt ga 22
〈210〉4
<211>22
<212>DNA
〈213〉人工設(shè)計(jì)
<220>
<221>satellite
〈222〉(l).. (22)
<223>
<400>4
gccatagcac gaacactttt〈210〉 5
〈211〉 19
<212> DNA
〈213〉 人工設(shè)計(jì)
<220〉
<221> satellite
<222> (1)..(19) 〈223〉〈400> 5
cctcagggca gctctggat 19
<210> 6
<211〉 20
〈212> DNA <213>人工設(shè)計(jì)
<220>
<221〉 satellite
<222〉 (l)..咖 〈223〉
<400〉 6
cccggactag gtgacaggtt 20
〈210〉7
<211>21
<212〉腿
〈213〉人工設(shè)計(jì)
<220〉
〈221>satellite
<222>(21)
〈223〉
<400>7
aactatgggt cctgagtatt<210〉 8
<211> 18
<212〉 DNA
〈213〉 人工設(shè)計(jì)
〈220〉
<221〉 satellite
〈222〉 (1)..(18) 〈223〉
<400〉 8
ctcggtttct gtccactt 18
〈210〉 9
〈211〉 21
<212〉 DNA
<213> 人工設(shè)計(jì)
〈220>
<221> satellite
<222〉 (1)..(21) <223〉
<400〉 9
ctgtctgatg agtgaggcta c 21
<210> 10
<211〉 18
〈212〉 腿
<213> 人工設(shè)計(jì)
<220>
〈221〉 satellite
<222> (1)..(18) <223>
〈400〉 10
tgaccacgag gaaaggag 18
<210〉 11 <211〉 20 〈212〉 DNA<213〉 人工設(shè)計(jì) <220>
<221> satellite
<222〉 (l)..咖 <223〉
〈400〉 11
tataagggct taagtgtacg 20
〈210〉12
<211〉20
<212>廳
〈213〉人工設(shè)計(jì)
<220>
<221〉satellite
<222>(l).. (20)
<223>
<400>12
gatctaaact C33ggcaaaa<210>13
<211〉21
<212〉DNA
<213〉人工設(shè)計(jì)
〈220>
〈221>satellite
<222>(l).. (21)
<223〉
<400〉13
aatcacttca ctacaccttt21
<210〉14
〈211〉18
<212>脆
<213>人工設(shè)計(jì)
〈220〉
〈221>satellite
〈222〉(l).. (18)
<223〉
<■〉14
cttgatgggt ggcagtct<210> 15
<211> 20
〈212> 腿 〈2L3〉人工設(shè)計(jì)
〈220>
<221〉 satellite
<222> (l)..咖 <223>
<400〉 15
tactg卿cg ccgctggtta 20
〈210> 16
<211〉 20
〈212〉 腿
〈213〉 人工設(shè)計(jì)
〈220〉
<221〉 satellite
<222〉 (1)..(20) 〈223〉<400>16
acaagatcct tcgtggtggg〈210>17
<211〉18
<212〉DNA
<213>人工設(shè)計(jì)
<220〉
<221〉satellite
〈222〉(1). (18)〈223>
<400>17
ccacaactgc aaacacct<210>18
<211>20
<212>DNA
〈213〉人工設(shè)計(jì)
<220>
<221〉satellite
<222>(l)..咖
<223>
〈400〉18
ttggcatttt catcacttac<210> 19
〈211〉 21
<212〉 腿 <213〉人工設(shè)計(jì)
<220>
<221> satellite
〈222> (1)..(21) <223>
〈400> 19
cgttactgaa agagtggtga a 21
<210>20
<211〉18
<212〉腿
<213〉人工設(shè)計(jì)
<220>
<221>satellite
<222>(l).. (18)
<223〉
<400>20
gcagaggttg taccaccg<210>21
<211>18
<212>腿
<213>人工設(shè)計(jì)
<220>
<221〉satellite
<222〉(l).. (18)
<223>
<柳>21
agtgagatta acgcaact<210〉 22
<211> 18
〈212〉 腿
<213〉 人工設(shè)計(jì)<220>
<221> satellite <222〉 (1).. (18) <223>
<400> 22
catctttcat tacaggga 18
<210> 23
<211〉 20
<212〉 腿
<213> 人工設(shè)計(jì)
〈220〉
<221〉 satellite
<222〉 (l)..咖 〈223>
<400〉 23
atgggcaagc ctcttaatgt 20
<210〉 24
<211〉 20
<212〉 DNA <213〉人工設(shè)計(jì)
<220>
<221> satellite
<222〉 (1)..(20) <223>
<400〉 24
ggatcttcgg gt鄉(xiāng)actga 20
<210>25
<211>22
<212〉DNA
<213〉人工設(shè)計(jì)
〈220〉
<221〉satellite
<222>(l).. (22)
<223〉
<400〉25
ataaatatct tggaagccct<210>26
<211>22
<212〉DNA
<213>人工設(shè)計(jì)
<220>
<221>satellite
〈222〉(l).. (22)
〈223〉
<400>26
acgccacata gaacactcac<210〉27
<211〉25
〈212〉醒
<213>avertebrate
〈220〉
<221〉gene
<222〉 <223>(l).. (25)
<400〉27ggtcaacaaa tcataaagat attgg
25
〈210〉28
<211>26
<212>腿
<213>avertebrate
〈220〉
<221>
〈222〉(l).. (26)
〈223>
<400〉28
taaacttcag ggtgaccaaa aaatca
26
<210>29
<211〉20
〈212〉腿
<213>avertebrate
<220〉
〈221〉
〈222〉(l)..咖
<223>
<400>29
cgcctgttta tcaaaaacat<210>30
<211>22
<212>醒
〈213〉avertebrate
<220>
<221〉gsne
<222>(l).. (22)
<223>
20
〈400〉 30
ccggtctgaa ctcagatcac gt
22
〈210〉 <211> <212〉 <213>
31 25 腿
人工設(shè)計(jì)
<220> 〈221〉 <222> <223>
gene
(l).. (25)
<400〉 31
aggaattaag aaacaatcaa acttt
25
<210〉32
〈211〉27
<212〉DNA
〈213〉人工設(shè)計(jì)
<220〉
<221〉
〈222>(l).. (27)
〈223>
〈400〉32
gccgttgagt gaagagtgtt cagatag
27
1權(quán)利要求
1.一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于所述多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)為線粒體序列信息系統(tǒng)和微衛(wèi)星分子標(biāo)記系統(tǒng)，其中微衛(wèi)星分子標(biāo)記系統(tǒng)為由7個(gè)SSR標(biāo)記的系統(tǒng)1和6個(gè)SSR標(biāo)記的系統(tǒng)2組成；系統(tǒng)1由7個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增7個(gè)SSR標(biāo)記的7對(duì)引物分別是E13(FAAGGAGGAGGCTTTGATATG；RGTCTTCCACTCCCTTACTGT)；P04(FGCCACTATCTTGCTGAGGTTGA；RGCCATAGCACGAACACTTTTGA)；E20(FCCTCAGGGCAGCTCTGGAT；RCCCGGACTAGGTGACAGGTT)；E24(FAACTATGGGTCCTGAGTATTA；RCTCGGTTTCTGTCCACTT)；C13(FCTGTCTGATGAGTGAGGCTAC；RTGACCACGAGGAAAGGAG)；C31(FTATAAGGGCTTAAGTGTACG；RGATCTAAACTCAAGGCAAAA)；H4(FAATCACTTCACTACACCTTTT；RCTTGATGGGTGGCAGTCT)；系統(tǒng)2由6個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增6個(gè)SSR標(biāo)記的6對(duì)引物分別是E9(FTACTGAGACGCCGCTGGTTA；RACAAGATCCTTCGTGGTGGG)；E18(FCCACAACTGCAAACACCT；RTTGGCATTTTCATCACTTAC)；E28(FCGTTACTGAAAGAGTGGTGAA；RGCAGAGGTTGTACCACCG)；C14(FAGTGAGATTAACGCAACT；RCATCTTTCATTACAGGGA)；H13(FATGGGCAAGCCTCTTAATGT；RGGATCTTCGGGTAGGACTGA)；E17(FATAAATATCTTGGAAGCCCTCA；RACGCCACATAGAACACTCACTC)。
2. 按權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，其特征 在于所述線粒體序列信息系統(tǒng)，擴(kuò)增COI， 16S和CR序列的三對(duì)引物分別 是 LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA); 16Sar-L (CGCCTGTTTATCAAAAACAT) 和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT); 12ST (AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT) 和CRT (GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
3. —種按權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的遺 傳分析方法，其特征在于首先，運(yùn)用線粒體的三對(duì)引物擴(kuò)增COI, 16S和 CR的序列的信息作為分子標(biāo)記，將混養(yǎng)家系中同一母本和不同母本所產(chǎn)的 后代根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分開(kāi)，然后再運(yùn)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記，將已 區(qū)分母本的后代根據(jù)遺傳距離和遺傳多樣性進(jìn)行父本的區(qū)分，從而完成三 疣梭子蟹遺傳育種過(guò)程中的系譜認(rèn)證并確認(rèn)近交系數(shù)。
4. 按權(quán)利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的遺傳分 析方法，其特征在于所述擴(kuò)增COI， 16S和CR序列的三對(duì)引物分別是 LC01490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG) 和 HC02198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA);16Sar-L (CGCCTGTTTATCAAAAACAT) 和16Sbr-H (CCGGTCTGAACTCAGATCACGT); 12ST (AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和CRT (GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
5. 按權(quán)利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的遺傳分 析方法，其特征在于所述微衛(wèi)星分子標(biāo)記由系統(tǒng)1和系統(tǒng)2組成；系統(tǒng)l由7個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增7個(gè)SSR標(biāo)記的7對(duì)引物分別是E13(F: AAGGAGGAGGCTTTGATATG; R: GTCTTCCACTCCCTTACTGT);P04(F: GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA; R: GCCATAGCACGAACACTTTTGA);E20(F: CCTCAGGGCAGCTCTGGAT; R: CCCGGACTAGGTGACAGGTT);E24(F: AACTATGGGTCCTGAGTATTA; R: CTCGGTTTCTGTCCACTT);C13(F: CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC; R: TGACCACGAGGAAAGGAG);C31(F: TATAAGGGCTTAAGTGTACG; R: GATCTAAACTCAAGGCAAAA);H4(F: AATCACTTCACTACACCTTTT; R: CTTGATGGGTGGCAGTCT); 系統(tǒng)2由6個(gè)SSR標(biāo)記組成，擴(kuò)增6個(gè)SSR標(biāo)記的6對(duì)引物分別是 E9(F: TACTGAGACGCCGCTGGTTA; R: ACAAGATCCTTCGTGGTGGG); E18(F: CCACAACTGCAAACACCT; R: TTGGCATTTTCATCACTTAC); E28(F :CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA; R: GCAGAGGTTGTACCACCG); C14(F: AGTGAGATTAACGCAACT; R: CATCTTTCATTACAGGGA); H13(F: ATGGGCAAGCCTCTTAATGT; R: GGATCTTCGGGTAGGACTGA); E17 (F: ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA; R: ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
6. 按權(quán)利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的遺傳分 析方法，其特征在于所有引物方向?yàn)?'—3'方向。'
7. 按權(quán)利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的遺傳分 析方法，其特征在于所述三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)遺傳分析 的方法可同時(shí)檢測(cè)成百上千個(gè)樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及水產(chǎn)遺傳育種領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種三疣梭子蟹多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)及遺傳分析方法。多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)為線粒體序列信息系統(tǒng)和微衛(wèi)星分子標(biāo)記系統(tǒng)，其中微衛(wèi)星分子標(biāo)記系統(tǒng)為由7個(gè)SSR標(biāo)記的系統(tǒng)1和6個(gè)SSR標(biāo)記的系統(tǒng)2組成；方法運(yùn)用線粒體的三對(duì)引物擴(kuò)增COI，16S和CR的序列的信息作為分子標(biāo)記，將混養(yǎng)家系中同一母本和不同母本所產(chǎn)的后代根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分開(kāi)，再運(yùn)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記，將已區(qū)分母本的后代根據(jù)遺傳距離和遺傳多樣性進(jìn)行父本的區(qū)分，從而完成三疣梭子蟹遺傳育種過(guò)程中的系譜認(rèn)證并確認(rèn)近交系數(shù)。本發(fā)明在有效利用物種遺傳信息的基礎(chǔ)上，使用多元高通量遺傳標(biāo)記系統(tǒng)區(qū)分子代之間的親緣關(guān)系，同時(shí)有效避免近交衰退。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101565744SQ200910015428
公開(kāi)日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者媛 劉, 吳丹華, 崔朝霞, 王鴻霞, 烽 譚 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所