專利名稱：：一種釀酒酵母及其篩選方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程
技術領域：
，具體地說是一種釀酒酵母及其篩選方法和應用。
背景技術：
：釀酒酵母屬于真菌屬，酵母菌科，是兼性厭氧微生物，有氧時，酵母菌則進行有氧呼吸，新陳代謝旺盛，繁殖快；缺氧時進行無氧呼吸，產生酒精和二氧化碳。菌體呈圓形、卵形或橢圓形，內有細胞核、液泡和顆粒體物質。通常以出芽繁殖；有的能進行二等分分裂；有的種類能產生子囊孢子。廣泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各種果品和蔬菜上更多，是重要的發酵素，能分解碳水化合物產生酒精和二氧化碳等。生產上常用的有面包酵母、飼料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。現用的釀酒酵母有啤酒酵母、葡萄汁酵母等。這些酵母在啤酒、葡萄酒等各自領域內能較好完成發酵任務，似用于釀造櫻桃酒時，得不到很好的發酵效果。分析原因主要有兩個一是酵母自身存在一定限制，如對酸、酒精耐受力較低、發酵溫度范圍較窄，另一個原因是櫻桃果肉硬度大、組織致密、酸度糖度較高，現用酵母適應不了發酵條件，致使生長繁殖速度慢、原料利用率低，影響最終發酵效果，達不到要求。
發明內容本發明的目的是提供一株適用于櫻桃酒、冰櫻桃酒、櫻桃露酒、櫻桃果酒等系列櫻桃酒釀造的菌株。該菌株也可用于葡萄酒及其他果酒的釀造。本發明所提供的一種適宜于系列櫻桃酒釀造的釀酒酵母菌株，酉良酒酵母SC203(Sacc/araOT_yc"ce"w^at"SC70)，己由中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)進行保藏，地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏日期為2008年12月5號，保藏編號為CGMCCN0.2786。本發明釀酒酵母SC203的基本生理特征細胞圓形、卵圓形或洋梨形；在顯微鏡下觀察，該菌叢呈圓形，乳白色，邊緣整齊，凸起；在幼年菌落中，細胞為4-14x3-7微米，長和寬的比率是l:1-1:2;在麥汁屮沉淀；子囊孢子圓形，平滑。本發明釀酒酵母SC203菌株是通過篩選，選育出的乙醇脫氫酶基因缺失或不表達的變異菌株，具有能耐受高濃度酒精、酸、二氧化硫的優點。本發明釀酒酵母SC203菌株同現在所使用的其他釀酒酵母菌菌株及原出發菌株相比，能耐受較高濃度的酒精和酸；其發酵周期比現有酵母縮短20%;S02耐受能力達到260mg/L;降糖能力范圍在30%-40%之間；發酵糖度在12%40%之間；低溫發酵能力較強，在5-15'C時，還能進行較活躍的發酵活動，且在此條件下具有良好發酵生產能力。本發明還提供了一種篩選和培養釀酒酵母SC203的方法。本發明所述的篩選和培養釀酒酵母SC203的具體操作方法如下(1)篩選從萊州大紅櫻桃園內土壤中篩選分離純化釀酒酵母A、取大紅櫻桃園內表層以下5-10cm的土壤0.5g，倒入帶玻璃珠的無菌水瓶中振蕩5-10min，此為10—2的土壤懸液，用無菌移液管吸10—s的土壤懸液0.5ml，放入4.5ml無菌水中，制成10^稀釋液，如此重復，依次制成10久10;的稀釋液；B、在超凈工作臺上，取融化后降溫至約5(TC的葡萄糖酵母膏(YPD)固體培養基約20ml倒入平板，在培養基中加入0.1-100mg/L濃度的抑制細菌的抗生素(如青霉素)，待培養基凝固后，取A歩驟制取的稀釋液0.05-0.1ml分別加入四個平板上，用三角刮鏟將菌液均勻涂布于平板表面；C、將制備好的平板置于23-28°〇培養箱'!-'培養2-3d;D、用接種環挑取經純化的各種典型酵母齒齒落至另一新葡萄糖酵母膏固體培養基平板劃線，將平板置于23-28t:培養箱中培養2-3d;E、持續D步驟操作，直至菌落完全純化，得到40株純的釀酒酵母菌株。(2)培養用櫻桃汁篩選富集優良釀酒酵母菌株A、將新鮮的大紅櫻桃榨汁(原漿濃度12%)，在12rc下滅菌30min;作為篩選富集釀酒酵母培養基。B、櫻桃汁培養基冷卻后分別接入純化后的40株酵母菌，置于23-28'C培養箱中，培養3-7d。C、由菌落的顏色判定酵母產酒精的能力，挑選紅色的菌落作為初篩入選菌。D、復篩是在加有杜氏小管的大試管液體培養基中，接入分離的斜面菌種，25。C恒溫培養箱中培養，每隔6h記錄菌體生長及發酵情況。將有典型酒香生成、氣泡較多的酵母菌作為復篩入選菌。E、將效果較好的20株酵母菌選出，分別進行耐S02能力、發酵糖能力和耐糖能力等性能方面的研究；F、耐S02能力實驗分別接種篩選出的酵母，在S02濃度為80、120、140、200、300mg/L時，發酵一周的過程中，觀察發酵液可溶性固形物含量隨時間的變化情況。實驗表明，當SO2濃度較低(〈230mg/L)時，濃度高低對酵母死亡率影響不顯著，而當SO2濃度達到300mg/L時，影響顯著。20株酵母中，S02耐受能力較高的菌株，達到280mg/L260mg/L;G、降糖能力實驗可溶性固形物(原漿)濃度15%、30%、40%、50%時，觀察酵母的降糖速度和生長滯后期時間。實驗表明，原漿濃皮在15%時，各個酵母菌株都能較快地利用糖，開始迅速降糖，發酵液屮酒精含量也相應地迅速增加。當nJ溶性固形物含量卨于40。/。時，大部分酵母的生fc在發酵的初期受到了一定的影響。表現為酵母的生長滯后期變長(由2d變到4d)。在高糖濃度50%時，各酵母發酵性能均受到很大程度的抑制。從整體上來看，降糖能力最強的酵母菌株，適宜范圍在30%-40%之間H、耐糖能力實驗隨著發酵液的可溶性固形物含量從30%升高到50%，酵母菌總數下降(從7.6降到6.46.8)，死亡率升高。這一現象說明高糖濃度對酵母的生長有很大影響。表現出較高的耐糖性的酵母在各種濃度下的生長能力均比其他酵母強，適合發酵糖度在]2%40%之間。I、低溫發酵能力實驗發酵溫度分別設置5'C、15°C、25°C、35°C、45。C時，觀察酵母的繁殖速度。實驗表明，原漿濃度在25-35。C時，各個酵母菌株都能較快繁殖。當溫度低于15'C和高于35"C時，大部分酵母的生長受到了較大的影響。當溫度在5"C時,各酵母發酵性能受到很大程度的抑制。從整體上來看，低溫發酵能力較強，的酵母菌株在5-15t:時，還能進行較活躍的發酵活動。綜合上述各項酵母發酵能力的實驗結果，選出綜合效果較好的酵母菌種進行復篩。J、將復篩入選菌種，按5%的接種量接種發酵培養基，于25。C生化培養箱中發酵7d，從發酵性能和發酵產物感官評定等方面綜合評價，選取綜合性能最佳，發酵后酒體果香濃郁，口味純正，風格獨特，酒精度在10度以上的菌種作為入選菌種，并將其命名為釀酒酵母SC203(S"cc/z"ra附yce5"w由/"e經過大量實驗，故將其與四種商業酵母進行發酵性能比較。K、釀酒酵母SC203與商品酵母發酵能力比對選擇四種商業酵母，R2、DVIO、D254、RC212，分別進行耐S02能力、發酵糖能力和耐糖能力、發酵溫度四方面的比較。比較結果見下表1。表1釀酒酵母SC203與四中商業釀灑fil./:j.發酵能力對比《<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通過比對試驗，釀酒酵母SC203綜合性能明顯優于這四種商業酵母，適用于系列櫻桃酒的釀造，也可用于其它類型酒類釀造。(4)種子培養釀酒酵母SC203要經過四級液體種子培養。A、菌種斜面培養菌種接種在YPD斜面上，置于23-28'C于生化培養箱培養12-48小時；B、大試管培養將上述YPD斜面上的菌種接入裝有5-10ml無菌麥汁液體培養基大試管，置于22-30。C搖床振蕩培養12-48小時；C、三角瓶一級擴大培養上述試管培養物轉接于裝有50-150ml麥芽汁的250ml三角瓶中，置于22-3(TC搖床振蕩培養12-48小時；D、酵母罐擴大培養上述試管菌體密度約為1(f-l()S個/ml的培養物50mL轉接于裝有1500-2500ml麥芽汁的5000ml酵母罐中，，置于22-30。C培養12-48小時；此時培養的酵母菌SC203可用于發酵生產，齒體密度為10、10"個/ml發酵液。上述釀酒酵母SC203在培養基中培養時，起始pH值為pH5.8，發酵過程中控制pH值在5.0-6.5之間。本發明的釀酒酵母SC203，具有生長快、起發早、發酵周期短、對低溫、酸、酒精、二氧化硫耐受力強等特點。本發明所制得的釀酒酵母SC203，特別適合應用于原衆櫻桃酒、冰櫻桃酒、櫻桃露酒、櫻桃果酒等的釀造，也可應用于葡萄酒、其他果酒以及啤酒的釀造。本發明所述的釀酒酵母SC203可以單獨使用，也可以與生香酵母和/或其它釀酒酵母一起作為合酵釀酒酵母在釀酒發酵生產過程中使用。具體實施例方式下述實施例將有助于理解本發明，但并不能限制本發明的內容。實施例1選擇含糖量高、充分成熟的櫻桃鮮果500kg，除掉劣果；洗凈表皮的污物，用3%的雙氧水浸泡，清洗后瀝干水分。榨汁，制成原漿濃度為15%的櫻桃汁，按原漿量0.3。/。。的比例加入150gVc，按料液量1.5。/。接入釀酒酵母SC203，控制SO2濃度150mg/L，進行控溫共同發酵，發酵溫度為24r，發酵時間為10d，主發酵結束，立即分離皮渣。控制后發酵溫度為16r，經30d后發酵醪殘糖^4g/L，后發酵停止。陳釀結束后，硅藻土過濾，殺菌，得原漿櫻桃酒。實施例2選擇含糖量高、充分成熟的櫻桃鮮果500kg，除掉劣果；洗凈表皮的污物，用3%的雙氧水浸泡，清洗后瀝干水分。榨汁，制成原漿濃度為30%的櫻桃汁，按原漿量0.396。的比例加入150gVc，按料液量1.6。/。接入釀酒酵母SC203和生香酵母(釀酒酵母SC203與生香酵母的比例為2:1)，控制SO2濃度150mg/L，進行控溫共同發酵，發酵溫度為24。C，發酵吋間為10d，卞發酵結束，立即分離皮渣。控制后發酵溫度為16。C，經30d后發酵醪殘糖^4g/L，后發酵停止。陳釀結束后，硅藻土過濾，殺菌，得度原漿櫻桃酒。實施例3選擇含糖量高、充分成熟的櫻桃鮮果500kg，除掉劣果；洗凈表皮的污物，用3%的雙氧水浸泡，清洗后瀝干水分。榨汁，制成原漿濃度為30%的櫻桃汁，按原漿量0.3%。的比例加入150gVc，按料液量1.6%接入葡萄酒酵母1450，控制S02濃度150mg/L，進行控溫共同發酵，發酵溫度為24。C，發酵時間為10d，主發酵結束，立即分離皮渣。控制后發酵溫度為16°C，經30d后發酵醪殘糖^4g/L，后發酵停止。陳釀結束后，硅藻土過濾，殺菌，得原漿櫻桃酒。表2實方包例13發酵結果比較表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>接種不同酵母，發酵櫻桃原漿生產櫻桃酒，發酵結果如表2所示。從櫻桃酒的理化指標和感官指標綜合評定可以得出結論釀酒酵母SC203的發酵性能要.W著優于葡萄酒酵母1450，而酵母釀灑酵母SC203與生香酵母合酵的發酵性能要優于酏酒酵母SC203單獨發酵。實例4選擇含糖量高、充分成熟的葡萄500kg，除掉劣果；洗凈表皮的污物，用3%的雙氧水浸泡，清洗后瀝干水分。搾汁，按葡萄汁原漿量0.3。/。。的比例加入150gVc，按料液量1.2。/。接入釀酒酵母SC203，控制SO2濃度120mg/L，進行控溫共同發酵，發酵溫度為25"，發酵時間為10d，主發酵結束，立即分離皮渣。控制后發酵溫度為15。C，經40d后發酵醪殘糖S4g/L，后發酵停止。陳釀結束后，硅藻土過濾，殺菌，最終得到16度葡萄酒。表3兩種酵母發酵葡萄酒結果比較項目總糖揮發酸總一.氧化干浸出物酒度Cg/L)g/L碳，m|/L9/L%(vol)釀酒酵母0.60.5132.128.112.5SC203葡萄酒酵母0.90.8185,819.611.31450國家標準24.0化0S200218.027.0由表可知，釀酒酵母SC203、葡萄酒酵母1450發酵生產的葡萄酒理化指標都符合國家標準。釀酒酵母SC203的發酵結果較葡萄酒酵母1450的發酵結果好。權利要求1.一種釀酒酵母菌株釀灑酵母SC203(SaccharomycescerevisiaeSC203)，由中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCCNO.2786。2.如權利要求1所述的釀酒酵母SC203，其特征是(1)基本生理特征細胞圓形、卵圓形或洋梨形，在顯微鏡下觀察，該菌叢呈圓形，乳白色，邊緣整齊，凸起。在幼年菌落中，細胞為4_l4x3_7微米，長和寬的比率是l:1-1:2;在麥汁中沉淀；子囊孢子圓形，平滑；(2)釀酒酵母SC203菌株是通過篩選，選育出的乙醇脫^酶基因缺失或不表達的變異菌株，具有能耐受卨濃度酒精、酸、二氧化硫的優點；3.如權利要求1所述的釀酒酵母SC203的篩選培養方法，其特征在于(1)篩選從萊州大紅櫻桃園內土壤中篩選分離純化釀酒酵母菌A、取大紅櫻桃園內表層以下5-10cm的土壤0.5g，倒入帶玻璃珠的無菌水瓶(無菌水95ml)中振蕩5-10min，制成10—2的土壤懸液，用無菌移液管吸10_2的土壤懸液0.5ml，放入4.5ml無菌水中，制成10—3稀釋液，如此重復，依次制成10—3-10-7的稀釋液；B、在超凈工作臺上，取融化后降溫至約5(TC的葡萄糖酵母膏(YPD)固體培養基倒平板，在平板中注入約20ml的培養基，在培養基中加入0.1-100mg/L濃度的抑制細菌的抗生素，待培養基凝固后，取上述稀釋液0.05-0.1ml分別加入四個平板上，用三角刮鏟將菌液均勻涂布于平板表面；C、將制備好的平板置于23-28'C培養箱中培養2-3d;D、用接種環挑取經純化的各種典型酵母菌菌落至另一新葡萄糖酵母膏固體培養基平板劃線，將平板置于23-28。C培養箱中培養2-3d;E、持續D步驟操作，直至菌落完全純化，得到40株純的酵母菌株。(2)用櫻桃汁富集篩選優良釀酒酵母菌株，其具體方法為A、櫻桃汁(原漿濃皮12%),12rC滅齒30min;B、分別接入純化后的酵母菌，置于23-28。C培養箱「1-'培養2-3d;C、將效果較好的20株酵母菌進行發酵能力實驗，從中挑選出綜合指標最好的釀酒酵母菌株；D、將選出的綜合性能優越的菌株與四株商品釀酒酵母進行性能比對；F、篩選出的釀酒酵母要經過四級種子培養。(如權利要求3所述的培養方法，其特征是所述釀酒酵母SC203經過四級液體種子培養，其具體方法為-A、菌種斜面培養菌種接種在YPD斜面上，置于23-28"C于生化培養箱培養12-48小時；B、大試管培養將i:述YPD斜面上的菌種接入裝有5-10ml無菌麥汁液體培養基大試管，置于22-3(TC搖床振蕩培養12-48小時；C、三角瓶一級擴大培養上述試管培養物轉接于裝有50-150ml麥芽汁的250ml三角瓶中，置于22-3(TC搖床振蕩培養12-48小時；D、酵母罐擴大培養上述試管菌體密度約為107-108個/1111的培養物50mL轉接于裝有1500-2500ml麥芽汁的5000ml酵母罐中，，置于22-3(TC培養12-48小時；此時培養的酵母菌SC203可用于發酵生產，菌體密度為10、10"個/ml發酵液。4.<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>5如權利要求3所述的培養方法，其特征是所述釀酒酵母SC203在培養基中培養時，起始pH值為pH5.8，發酵過程中控制pH值在5.0-6.5之間。6.如權利要求1所述的釀酒酵母SC203菌株的應用，其特征是用于櫻桃酒、冰櫻桃酒、櫻桃露酒、櫻桃果酒的釀造。7.如權利要求1所述的釀酒酵母SC203的應用，其特征是可以用于葡萄酒和其它果酒的釀造，也可以用于啤酒的釀造。8.如權利要求7所述的l'狼酒酵母SC203的應j目，其特征是n了以單獨使川，也可以與生香酵母和/或其它酵母合川。全文摘要本發明涉及一種適宜于系列櫻桃酒釀造的釀酒酵母的篩選及應用，屬于生物工程
技術領域：
。本發明的釀酒酵母SC203菌株，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，登記編號為CGMCCNo.2786。本發明菌株具有生長快、起發早、發酵周期短、對低溫、酸、酒精、二氧化硫耐受力強等特點，是一株適用于櫻桃酒、冰櫻桃酒、櫻桃露酒、櫻桃果酒等系列櫻桃酒釀造的菌株。此外，本發明菌株也可用于葡萄酒及其他普通果酒和冰酒的釀造。文檔編號C12R1/865GK101550400SQ20091001368公開日2009年10月7日申請日期2009年1月22日優先權日2009年1月22日發明者于磊娟,林曹,李敬龍,王超萍申請人:李敬龍;曹林