專利名稱：：高粱抗蚜基因緊密連鎖的scar標記及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及高粱抗蚜基因緊密連鎖的SCAR標記及其應用，特別是高粱抗蚜基因的RAPD標記以及由該標記轉化的SCAR標記，以及該標記在抗岈品種鑒定中的應用。
背景技術：
：高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)是世界上重要的禾谷類作物之一，主要分布在熱帶干旱和半干旱地區，溫帶和寒帶地區也有種植。從世界范圍看，它僅次于小麥、水稻、玉米、大麥，居第五位。高粱岈蟲[Melanaphissacchari(Guen6e)]是我國高粱生產區經常發生的主要蟲害之一，一般造成減產15%左右，嚴重發生時減產達30%以上。過去采用化學藥劑防治既費時、費工又產生抗藥性，污染環境，因此選用抗性品種是最為有效的途徑。引進新的抗性基因、培育抗性品種既可提高作物對蚜蟲的抵抗能力，又有利于環境保護。植物病蟲害抗性的分子標記研究和利用非常活躍并富有成效，許多學者對水稻、小麥、玉米等作物主要農藝性狀基因進行識別、定位和分離研究，構建它們的基因圖譜，取得了較大的進展(王京兆1995;李立家1998;李松濤1995;黎裕2004;儀治本2007;楊新泉2007)。在高粱方面，2000年Bhattramakki等將高粱的RFLP標記和SSR標記整和在一起，建立了一個含有232個SSR標記的基因圖譜，并將這些標記定位于高粱的十條染色體上，含蓋1406.3cM的染色體基因組。CatherineS等(1999)利用RFLP方法分析美國高粱對于麥二叉蚜的抗性，得出抗蚜基因至少分布于9個位點，8個連鎖群，其中多數是不完全顯性的。2006年，常金華等用已定位到連鎖群上的微衛星標記和分離群體分析法，對抗蚜基因進行了連鎖分析，發現1個與抗蚜基因連鎖的微衛星標記(SSR標記)，與抗蚜基因的遺傳距離為8.7cM。長期以來，作物育種的選擇都是依靠表現型進行的，而分子標記輔助選擇MMAS(MolecularrMarker-AssistedSelection),將給傳統的育種研究帶來重要的變革。本發明將RAPD和SCAR兩種標記技術結合起來，以抗高粱岈的國外高粱品種BTAM428為試材，篩選和高粱抗蚜基因緊密連鎖的分子標記，并將該標記應用于高粱抗蚜品種的早期選擇，淘汰感蚜基因型，加快育種進程，節省選育所需的試驗用地和成本，具有較大的實用價值，同時填補高粱抗蚜基因分子標記輔助選擇研究的國、內外空白。
發明內容本發明的目的是針對上述現有技術的不足，而通過最為有效的途徑選用抗蚜品種來解決采用化學藥劑防治高粱蚜蟲費工、費時、費錢，又產生抗藥性，污染環境的技術難題。本發明的目的一應用PCR擴增技術獲得了兩個與高粱抗蚜基因緊密連鎖的OPN-07m和OPN-07^標記，核苷酸序列為圖所示，并通過分子作圖構建了抗蚜基因的連鎖圖。本發明的目的二將RAPD標記轉化為穩定性、重復性強的SCAR標記，并用此標記對&代及部分高粱抗感品種進行了檢測，建立抗感品種篩選的快速鑒定標準，為實踐了分子標記輔助育種、縮短育種周期提供了技術保障。本發明的目的三應用該方法選育抗蚜優良品系，已應用該方法選育抗蚜優良品系，并已應用生產。本發明的目的是通過下述技術方案實現的(1).對高粱后代的抗蚜性進行田間及室內的生理生化鑒定，從而建立起F2代的抗感群體。(2).確定提取高粱葉片總DNA的最佳方法。即CTAB-II法。(3).應用PCR擴增儀，建立并優化了高粱RAPD反應體系，獲得了穩定高效的RAPD擴增結果。(4).獲得了與高粱抗蚜基因緊密連鎖的RAPD標記。應用RAPD技術篩選500個隨機引物，共擴增出1614條DNA譜帶，其中引物OPN-08^和PN-07m與抗蚜基因緊密連鎖。(5).對抗蚜基因的RAPD標記進行克隆測序。將特異的DNA片段OPN-07^和OPN-08373回收純化之后，克隆于pMD18-TVector中，測序結果表明，兩片段長分別為727bp和373bp。故將這兩個標記命名為OPN-07727、OPN-08373。(6).將抗蚜基因的RAPD標記轉化為SCAR標記。對F3代及部分抗感品種進行SCAR檢測。抗性品種中也得到了OPN-07727，OPN-08373二條特異譜帶，而感性品種中則未見，從而為分子標記輔助育種提供了可靠的依據。(7).構建了抗蚜基因的連鎖群，為克隆該基因奠定了堅實的基礎，這2個標記一方面可作為染色體步移的起點。另一方面，可在此基礎上進一步篩選更近的分子標記。豐富抗蚜基因的連鎖群，并進而利用染色體登陸法對該基因進行克隆。(8).對&代及部分抗感品種進行SCAR檢測。將&代抗感群體留種，種于田間，取在孕穗期F3植株葉片提取總DNA進行SCAR分析，得到了F3抗感個體的特異性譜帶，同時在部分抗性品種中也得到了OPN-07m，OPN-08^二條特異譜帶，而感性品種中則未見，從而為分子標記輔助育種提供了可靠的依據。本發明首次對高粱優異抗蚜種質BTAM428的抗蚜性進行了分子標記，發現了兩條高抗蚜蟲的DNA特異譜帶，并構建了抗蚜基因圖譜，為分離和克隆抗蚜基因，實現抗蚜轉基因育種奠定了基礎。與此同時本發明將這兩個標記應用于抗蚜種質鑒定，作為高粱抗蚜鑒定的輔助手段，節省了大量人力、物力資源。經計算節省80%的田間育種工作量和70%的試驗用地。具有廣闊的推廣應用前景。圖1為本發明的RAPD引物OPN-07727標記擴增抗蟲感蟲基因組DNA的電泳圖譜。圖2為本發明的RAPD引物OPN-07373標記擴增抗蟲感蟲基因組DNA的電泳圖4圖3為本發明的RAPD標記轉化為SCAR標記OPN-07727標記擴增抗蟲感蟲基因組DNA的電泳圖譜。圖4為本發明的RAPD標記轉化為SCAR標記OPN-07373標記擴增抗蟲感蟲基因組DNA的電泳圖譜。圖5為本發明的RAPD標記與抗蚜基因的連鎖圖譜。圖6為本發明應用OPN-07727SCAR標記對已經鑒定的抗蟲感蟲品種基因組DNA的電泳圖譜。圖7為本發明應用OPN-07373SCAR標記對已經鑒定的抗蟲感蟲品種基因組DNA的電泳圖譜。具體實施例方式1.材料和方法1.1供試材料高粱試驗試材BTAM428(抗親)、ICS-12B(感親)由遼寧省農業科學院生物技術室提供。BTAM428來源于美國得克薩斯州A&M大學農學系，經多年鑒定高抗麥二叉蚜(在美國侵染高粱的優勢小種)，20世紀80年代初引入我國后經遼寧省農科院植保所和高粱所多年鑒定，高抗甘蔗黃蚜(我國高粱蚜蟲優勢小種)，抗蚜性為一級。列為最佳抗蚜源。試材田間隨機排列，設單行區，小區行長5m，每區不少于30株，除防治粘蟲外，一律不施藥。6月20日7月20日蚜蟲大發生期間，先后3次人工接蟲逐漸鑒定&的抗蚜性。首次調查前1015天，取有無翅若蚜20頭的小葉片，去掉天敵，卡在接蚜株下數第三片葉腋間。每區從第三株起連續接10株，調查葉蚜量，依葉蚜量對&劃分抗性等級，盛發期調查23次。確定抗性等級選擇抗性為l級的高抗單株98株，抗性為9級的高感單株34株。表1抗蚜性分級標準Table1Thestandardofresistantaphid5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注抗蚜性標準來自全國農作物品種資源鑒定專業組制定的高粱抗蚜性分級標準。Notes:Thestandardofresistantaphidofsorghumdrawupbyspecializecertificationstandardofthewholenationcropvarietalresource.1.2藥品、儀器與設備10-mer弓|物A-Z(除去B組)購自Operon公司。Taq酶購自PE公司。PCR儀美國PE公司的"PE9600"。紫外透射反射分析儀，型號NT。1.3實驗總體設計近等基因池的建立一基固組DNA的提取(CTAB法)一RAPD擴增一瓊脂糖電泳一電泳譜帶分析一數據處理分析一多態性片段的回收、純化、克隆與鑒定、序列分析—RAPD標記轉化為SCAR標記一用于抗性品種鑒定一確定抗感鑒定方法一選育新品種1.4近等基因池的建立應用分離群體分組分析法(BulkedSegregationAnalysis)即BSA法。將F2代分為抗池及感池，抗池和感池是分別由F2代98株抗岈株葉片及34株感岈株葉片提取DNA混勻而成，制備時每株均取2ngDNA。1.5RAPD分析PCR擴增反應系統總體積為25iiL，含1倍擴增緩沖液，1.5UTaq酶，50ng的模板DNA，100iimol/L的dNTP，0.2ymol/L引物，上覆礦物油。反應程序為預變性94°C3min—變性94°C20s，退火38°C30s，延伸72°Clmin，循環35次一延伸72°C10min。用Operon公司生產的A-Z(除B組外)共500個引物，對親本及抗池、感池4個樣品進行分析，如4個樣品擴增出的RAPD產物帶型相同，則無多態性，而如擴增產物中的帶型有差異，則對這些引物進行重復并進行連鎖分析。1.6產物檢測擴增產物在1.4%含0.5iig/mLEB的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為每厘米3-4伏，電泳結果用紫外透射反射分析儀觀察。61.7連鎖分析當某一引物在鑒定的抗蚜基因的F2代抗感分離群體(即抗池及感池)及抗感親本間選到穩定的多態性片段(RAPD)標記后，取&抗、感單株各10株，用篩選到的引物進行分析。如果存在連鎖關系進一步擴大群體分析，統計單株的RAPD標記，計算重組率和遺傳距離。若RAPD標記與抗病基因緊密連鎖，則進行多態性片段回收。交換型抹數重組率=抗性林數+感性株^100%交換型株數=抗性單株樣本群中不含多態性譜帶的株數+感性單株樣本群中含有多態性譜帶的株數。再通過Mapmaker3.0計算機軟件分析，可將重組率轉換為遺傳距離即是圖距單位(centimorgan，cM)。1.8多態性片段的回收、純化、克隆與鑒定將回收純化的片段克隆于pMD18-TVector載體上。在ABIPRISMTM377XL測序儀上進行測序。1.9RAPD標記轉化為SCAR標記根據測序結果，從序列兩端按引物的要求設計出一對20-24堿基的引物，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。SCAR的PCR擴增條件擴增反應物總體積為25iiL，含2.5iiL擴增緩沖液；5UTaq酶，50ng的模板DNA，100ymol/L的dNTP，0.2ymol/L的引物I，0.2ymol/L的引物II，上覆20iiL礦物油。通過對特異引物OPN-07和OPN-08的PCR反應條件進行優化，SCAR反應程序分別定為預變性94°C3min—變性98°C30s，退火60°C59s，延伸72°C59min，循環35次一延伸72°ClOmin。預變性94°C3min—變性98°C30s，退火52°C59s，延伸72°C59min，循環35次—延伸72°ClOmin。用這對引物檢測BTAM428(抗親)、ICS-12B(感親)及二者雜交后的F2抗池、感池和單株，比較其與RAPD分析的一致性和可靠性。1.10對高梁F3代及部分抗感品種的SCAR分析在孕穗期分別選F3代抗感單株20株，進行SCAR分析。取已鑒定的穩定的抗蚜保持系TAM428，LR9198,5-27，2000-3259B-1及感蚜品種ICS-12B，矮四，TX622B，三尺三進行SCAR分析。實施例1:抗蚜基因連鎖的RAPD多態性標記的獲得應用RAPD技術篩選500個隨機引物，共擴增出1614條DNA譜帶，其中引物OPN-07，OPN-08和OPY-14的擴增產物出現具有連鎖性的多態性片段，對這3條引物進行了進一步的連鎖分析，共分析了&代分離群體132株，其中98株抗蚜，34株感蚜。0PN-07727、OPN-08373及OPY-146oo的重組率分別為3.0X、6.1%及9.1%。應用Mapmaker3.0軟件包換算成圖距單位分別為3.2cM、6.5cM和11.7cM。OPN-07727、OPN-08^的F2單株擴增結果見圖1、2。從圖1可見，抗親(1)、抗池(3)及抗蚜單株(6，9，11，13，15，16，18)都擴增出了OPN-07^這條多態性片段，而感親(2)、感池(4)及感蚜單株(5，10，12，14，17)則未擴增出這條多態性片段。其中第7譜帶為回收的OPN-07m多態性片段。圖l中抗親-l，感親-2，抗池-3，感池-4，F2抗單株(6，9，11，13，15，16，18)，？2感單株(5，10，12，14，17)，Marker(100bpDNAladderplus)。從圖2可見，抗親(1)、抗池及抗蚜單株(5)都擴增出了OPN-08373這條多態性片段，而感親(2)、感池(4)及感蚜單株(6)，都未擴增出這條多態性片段。圖2中抗親-l，感親-2，F2抗池-3，F2感池-4，F2抗蚜單株-5，？2感蚜單株-6，Marker(PBR322/BstNI)-7。實施例2:與抗蚜基因連鎖的RAPD標記的回收，克隆及測序將OPN-07727和OPN-08373二條多態性片段回收、克隆和測序。測序結果OPN-08擴增的多態性片段為373bp，而OPN-07擴增出的多態性片段測定出的核苷酸序列如序列見表2和表3。根據測序結果將這兩個多態性片段命名為OPN-07727和OPN-08373。圖中黑體劃線堿基為隨機引物序列。表2RAPD標記OPN-07727的測序結果Table2SequencedresultsofpolymorphismfragmentofOPN-071AAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCAGCC101TGCTGGAATCTACTAAGCATTAACTGGGACAAATCCCTCCAACCTTTTGG151TATGCTGATCAAAGTTAGAACAGATTTTGGAATGCACATCTTTAGAGAAA201TTTTCATCTCGGCTTGCTGGTCAATCTGGAAAGTCAGAAATAGAATTATC251TTTGACAATAAGGCACTCTCCTTAGTTGAATGGAAATTGGTCCAAAAAGA301GGATCTTAGACTGGTTTGCATTAGGGCTAAGAGGAAAATTGCAGAACCCT401TTGGCCGTGAGGGCCTTGTACCCCCTATTCTAACGGAGCATCTAATTAAG551TATGACACAACTAGTACATGCGCTTATTGGCCAGAACCCTGTCTTTCATG8651GCGATGCTTTGGAGAATGGAAGCATTTCTACCTATTTTGTCGGCACAAAA701GGCTAACTCACAGACATTGTAAGTTTGTAACGAATGCATTAGTGCAAATT751TGTTTCCATGAACTCTGGGCTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAG表3RAPD標記OPN-08373的測序結果Table3SequencedresultsofpolymorphismfragmentofOPN-0751TCAGCTCGAAAAGAAATAGTGGAGTCATAAGAGTACCTAAAAAGATGCTTCTTATAAATTTTTGATAATTGATATATTTAGGCCGCCATCCATCTTGTTGCATCTTGTTG401TTTATTATTGGAGCTGAGGTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGGCTTGG實施例3:RAPD標記轉化為SCAR標記根據特異片段OPN-07727、OPN-08373兩端序列和引物設計原則(避免發夾結構，適當的G+C含量)，在序列兩端設計了兩對特異性引物。用這對引物檢測BTAM428(抗親)、ICS-12B(感親)及二者雜交后的F2抗池、感池和單株，結果表明SCAR標記和抗岈基因的RAPD標記的連鎖性完全一致，以OPN-08373a和OPN-08373b為引物進行PCR擴增(即SCAR分析)，結果見圖3。從圖3中可見，抗親(l)、抗池(3)及抗蚜單株(5-13)都擴增出OPN-08^—條譜帶，而感親(2)、感池(4)及感蚜單株(14-22)都未擴增出任何片段。圖4是以OPN-07727a和OPN-07727b為弓|物進行的PCR擴增(即SCAR分析)，結果可見，抗親(l)、抗池(3)及抗蚜單株(513)擴增出了OPN-07m譜帶，而感親(2)、感池(4)及感蚜單株(1422)均未有此譜帶的出現。說明SCAR標記特異性強，PCR產物只為一條727bp或373bp的條帶，易于區分。這樣就順利地將RAPD標記轉化為了穩定性重復性很好的SCAR標記。實施例4:抗蚜基因連鎖群的建立OPN-07727、OPN-08373及OPY-146。。與抗蚜基因的圖距單位分別為3.2cM、6.5cM、11.7cM。3個分子標記與抗蚜基因的連鎖順序為OPN-08373-抗蚜基因-OPN-07727-OPY-146。。。繪制連鎖圖見圖5:實施例5:幾種抗感品種的SCAR分析取已鑒定的穩定的抗蚜保持系TAM428,LR9198,5-27，2000-3259B-1及感蚜品種ICS-12B，矮四，TX622B，三尺三于3葉1心期取葉片，每個品種取20株的葉片裝入塑料袋，用四分法取樣，分別提取各個品種的DNA，以提取的DNA為模板進行SCAR分析。分析結果如圖6，7所示。從圖6和圖7中可見，對抗岈品種TAM428(1)，LR9198(2，3)，5-27(4，5)，200-3259B-l(6)分別以OPN-07727a，OPN-07727b及OPN-08373a、OPN-08373b二對特異性引物進行擴增，結果分別擴增出了OPN-07^、OPN-08^這兩條特異性譜帶。而在感蚜品種ICS-12B(7)，矮四(8)，TX622B(9)，三尺三(10，11)的擴增產物中都沒有擴增出任何產物。這再一次證實了SCAR標記檢測的可靠性及其應用與抗蚜基因緊密連鎖的分子標記作為抗蚜育種輔助選擇的可行性。實施例6:抗感品種的鑒定新品種的選育應用本發明進行抗蚜品種的選育，已經應用本發明進行品種鑒定，已鑒定的品種為遼雜17號(124AX801)，306AX304雜交種以及0126AX304雜交種，其母本都應用本發明鑒定為抗蚜。權利要求高粱抗蚜基因緊密連鎖的SCAR標記，其所述高粱抗蚜基因的SCAR標記OPN-07727和OPN-07373。2.如權利要求1所述的高粱抗蚜基因緊密連鎖的SCAR標記的應用，其所述的SCAR標記OPN-07727和OPN-07373在后代植株選育中的應用。全文摘要本發明涉及高梁抗蚜基因緊密連鎖的SCAR標記及其應用。以BTAM428×ICS-12B雜交后代為材料，采用BSA法，應用RAPD和SCAR篩選技術對高粱抗蚜基因進行了分子標記，獲得了兩個與高粱抗蚜基因緊密連鎖的RAPD標記OPN-07727和OPN-07373。該基因的RAPD標記OPN-07727和OPN-07373與高粱抗蚜基因緊密連鎖，經測序得到核苷酸序列。同時本發明將OPN-07727和OPN-07373轉化為穩定的SCAR標記，并用此標記對F2代及部分高粱抗感品種進行了檢測，從抗性品種中找到了分子標記特異譜帶，為分子標記輔助育種提供了依據，克服了那些由于表型鑒定采用通常的方法輔助選擇工作量非常巨大的困難，為實現分子標記輔助育種、縮短育種周期提供了技術保障。文檔編號C12N15/11GK101691603SQ20091001336公開日2010年4月7日申請日期2009年8月25日優先權日2009年8月25日發明者劉天華,彭霞,徐昕,李玥瑩,李雪梅,林鳳,鄒劍秋,陳琳,陶思源,馬純艷申請人:沈陽師范大學