專利名稱：：食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及用于食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒及檢測方法，尤其涉及基于PCR-DHPLC的快速檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術：
：金黃色葡萄球菌在不同食物、不同溫度和pH值的條件下，產生的腸毒素是不同的。金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)有12個血清型，分別為剝脫毒素ETA(exfoliativetoxinA)、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、中毒休克毒素TSST(toxicshocksyndrometoxin)、SED、SEH、SEG。金黃色葡萄球菌在pH值低于5的條件下很少產生腸毒素，當pH值高于9.8時，無論何型葡萄球菌腸毒素都不能產生。葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上，于2(TC37"C下經4h8h產生毒素，在5。C6'C低溫下18d產生毒素或不產生毒素。在含水分、蛋白質和淀粉較多的食品中，葡萄球菌較易繁殖并產生毒素，如帶菌的生肉餡，于37"C下經18h19h產生毒素，若在肉餡中加入少量饅頭碎屑，在同樣溫度下只經過8h就能產生毒素，可見淀粉對形成毒素有促進作用。引起金黃色葡萄球菌腸毒素中毒的食品主要為肉、奶、魚、蛋類及其制品等動物性食品。糕、涼拌切粉、剩大米飯和米酒等也曾引起過中毒；熟肉類如在熟后污染了致病葡萄球菌，又在2(TC30。C的環境下放置較長時間，則極易引起中毒；奶和奶制品以及用奶制作的冷飲(冰激凌、冰棍)和奶油糕點常是引起中毒的食品；油煎雞蛋、熏魚、油浸魚罐頭等含油脂較多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能產生毒素。金黃色葡萄球菌在空氣中氧分低時較易產生腸毒素，因此帶有此菌的食品，在通風不良的高溫下放置，極有利此菌生長并產生毒素。當食品污染了葡萄球菌并同時污染了其他微生物時，葡萄球菌的繁殖則受到抑制。如食品經加熱，原有的各種微生物已被殺死，拮抗微生物也不復存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，則將會促進葡萄球菌的生長并形成毒素。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在世界各地均有發現。常發生于夏秋季節，這是因為氣溫較高，有利于細菌繁殖。但在冬季，如受到污染的食品在溫度較高的室內保存，葡萄球菌也可繁殖并產生毒素。當此細菌數〉106個/克時，產生的腸毒素可引起食物中毒等病癥。因此，建立對金黃色葡萄球菌12種毒素基因，g卩ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的快速、準確、高靈敏的檢測方法就尤為必要。
發明內容本發明首先提供用于檢測金黃色葡萄球菌12種毒素基因，即ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的試劑盒。本發明所述的食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒中包括檢測溶液A和檢測溶液B:檢測溶液A中含10mMTris《1、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5UL及ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六種毒素基因引物對各10這6種毒素基因的特異性引物序列如下毒素基因引物序列(5'-3')擴增產物(bp)ETACTAGTGCATTTGTTATTCAATGCATTGACACCATAGTACT119SEBTCGCATCAAACTGACAAACGGCAGGTACTCTATA2AGTGCC257SECGACATAAAAGCTAGGAATTTAAATCGGATTAACATTATCC317SEETAGATAAGGTTAAAACAAGCTAACTTACCGTGGACCCTTC350SEICTCAAGGTGATATTGGTGTAGGAAAAAACTTACAGGCAGTCCATCTC375SEAAAAGTCCCGATCAATTTATGGCTAGTAATTAACCGAAGGTTCTGTAGA478檢測溶液B中含10mMTris'C1、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/nL及SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六種毒素基因引物對各lOpM;檢測溶液B中這6種毒素基因的特異性引物序列如下毒素基因引物序列(5'-3')擴增產物(bp)SEJCATCAGAACTGTTGTTCCGCTAGCTGAATTTTACCATCAAAGGTAC142ETBACGGCTATATACATTCAATTTCCATCGATAATATACCTAA200TSSTATGGCAGCATCAGCTTGATATTTCCAATAACCACCCGTTT350SEDCTAGTTTGGTAATATCTCCTTAATGCTATATCTTATAGGG482SEHCAATCACATCATATGCGAAAGCAGCATCTACCCAAACATTAGCACC576SEGAATTATGTGAATGCTCAACCCGATCAAACTTATATGGAACAAAAGGTACTGATTC642本發明還提供了利用上述試劑盒檢測食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的方法，包括如下歩驟①PCR反應取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的檢測溶液A和14ul滅菌超純水，總體積25ul;另取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的檢測溶液B和14ul滅菌超純水，總體積25ul;兩個反應體積分別在5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增予頁變性:94。C，3min;進入循環94r變性60s，6(TC退火60s，72'C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②將PCR擴增產物進行DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3pm;柱溫50°C;流動相(體積比):O.Omin，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50,2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;2.8min，40.9%緩沖溶液A，59.1%緩沖溶液B;5.0min，37.3%緩沖溶液A，62.7%緩沖溶液B;7.3min，35.5%緩沖溶液A，64.5%緩沖溶液B;79.5min,34.3%緩沖溶液A，65.7%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5)iL。檢測結束后，根據DHPLC檢測圖譜中特征色譜峰的峰形、保留時間以及與陽性對照譜圖的對照，來確定樣品的染菌情況。本發明采用mPCR-DHPLC技術，針對食品中金黃色葡萄球菌毒素基因建立靈敏便捷的檢測方法，并建立應用于該方法的快速檢測試劑盒。使用本發明的檢測試劑盒及檢測方法，可以高靈敏度地檢測食品中12種金黃色葡萄球菌毒素基因，并且檢測耗時短，操作簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。本發明附圖12幅，分別是圖1是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因各自單一PCR電泳圖2是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因mPCR—電泳圖3是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因mPCR-DHPLC檢測譜圖4是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG基因各自單一PCR電泳圖5是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG基因mPCR—電泳圖6是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG基因mPCR-DHPLC檢測譜圖7是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因mPCR-DHPLC檢測靈敏度試驗結果；圖8是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因mPCR-凝膠電泳檢測靈敏度試驗結果，其中1，100bpLadderDNAMarker;2，104數量級的菌濃度；3，103數量級的菌濃度；圖9是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的mPCR-DHPLC檢測靈敏度試驗結果；圖10是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG基因mPCR-凝膠電泳檢測靈敏度試驗結果，1，100bpLadderDNAMarker;2，104數量級的菌濃度；3，103數量級的菌濃度；圖11是A模擬污染樣品mPCR-DHPLC檢測圖譜；圖12是B模擬污染樣品mPCR-DHPLC檢測圖譜。上述附圖中，橫坐標均為保留時間(單位分鐘min)，縱坐標表示吸收峰信號強度(單位毫伏mV)。具體實施例方式下面為本發明的具體實施例，其對本方法的建立及其應用作進一步的說明，但并不以任何形式限制本發明的內容。若無特殊說明，本部分所使用的主要試劑、儀器及其商品來源為營養肉湯培養液，普通瓊脂培養平板，以及本部分所使用的各菌株的增菌、分離和生化鑒定培養基等均按照相關的國家標準(GB)、檢驗檢疫行業標準(SN)或國際權威標準方法中的配方，購于美國BD公司。細菌基因組DNA提取試劑(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)及ExTaq等試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；三乙胺乙酰鹽(TEAA，色譜純)購自Transgenomic公司；乙腈(色譜純)購自Fisher公司。本部分所使用的標準菌株分分別購自美國ATCC標準生物品收藏中心和中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)。本部分所涉及的試驗菌株，均采用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA，保存于-2(TC備用以待檢測。實施例1、食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒及檢測方法的建立(1)引物的設計、合成與試劑盒的組裝，所述引物如下所述:毒素基因引物序列(5'-3')擴增產物Cbp)ETACTAGTGCATTTGTTATTCAATGCATTGACACCATAGTACT119SEBTCGCATCAAACTGACAAACGGCAGGTACTCTATA2AGTGCC257SECGACATAAAAGCTAGGAATTTAAATCGGATTAACATTATCC3179SEETAGATAAGGTTAAAACAAGC350TAACTTACCGTGGACCCTTCSEICTCAAGGTGATATTGGTGTAGG375AAAAAACTTACAGGCAGTCCATCTCSEAAAAGTCCCGATCAATTTATGGCTAGTAATTAACCGAAGGTTCTGTAGASEJCATCAGAACTGTTGTTCCGCTAGCTGAATTTTACCATCAAAGGTACETBACGGCTATATACATTCAATTTCCATCGATAATATACCTAATSSTATGGCAGCATCAGCTTGATATTTCCAATAACCACCCGTTTSEDCTAGTTTGGTAATATCTCCTTAATGCTATATCTTATAGGGSEHCAATCACATCATATGCGAAAGCAGCATCTACCCAAACATTAGCACCSEGAATTATGTGAATGCTCAACCCGATCAAACTTATATGGAACAAAAGGTACTGATTC在此基礎上，設計用TmPCR-DHPLC檢測的試劑盒試劑盒中包括檢測溶液A和檢測溶液B:檢測溶液A中含10mMTris'C1、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/|iL及上述ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六種毒素基因引物對各10^M;檢測溶液B中含10mMTris'C1、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/jiL及上述SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和$EG六種毒素基因引物對各10)iM。(2)mPCR-DHPLC檢測方法的建立本檢測方法使用本實施例建立的mPCR-DHPLC檢測的試劑盒，包括如下步驟①待檢樣品的制備a.—般食品樣品取食品樣品25g，加入無菌0.2mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液25mL，均質成勻漿。放入滅菌的200mL腸毒素產毒培養基中，36。C培養48h。b.菌株樣品的制備待測菌株接種在營養瓊脂上，36。C培養24h。用約3mL滅菌鹽水洗下菌苔，放入腸毒素產毒培養基中，36'C振蕩培養48h。取培養的相應腸產毒素培養基中的培養液lmL，用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA，保存于-2(TC備用以待檢測。②PCR擴增本實施例建立兩組復合PCR體系，第一組復合PCR體系一次檢測金黃色葡萄球菌毒素ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA基因；第二組復合PCR體系一次檢測金黃色葡萄球菌毒素SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG基因。取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的檢測溶液A和14ul滅菌超純水，總體積25ul;另取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的檢測溶液B和14ul滅菌超純水，總體積25ul;兩個反應體積分別在5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，6(TC退火60s，72。C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②將PCR擴增產物進行DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3)im;柱溫50°C;流動相(體積比):O.Omin，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;2.8min，40.9%緩沖溶液A，59.1%緩沖溶液B;5.0min，37.3%緩沖溶液A，62.7%緩沖溶液B;7.3min，35.5%緩沖溶液A，64.5%緩沖溶液B;9.5min，34.3%緩沖溶液A，65.7%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5inL。實施例2、多重反應體系檢測對比試驗分別采用PCR-電泳和實施例1建立的PCR-DHPLC方法進行檢測和對比。本實施例建立兩組復合PCR體系，第一復合PCR體系檢測對象包括ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA基因；第二復合PCR體系檢測對象包括ETASEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG基因。第一復合PCR體系ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA六種毒素基因的PCR預期擴增片段分別為119bp、257bp、317bp、350bp、375bp、478bp;其單獨的PCR-電泳檢測結果見附圖1所示，mPCR-電泳檢測結果見附圖2所示；mPCR-DHPLC檢測結果見附圖3所示。從由圖l和圖2可見，當這6種毒素基因作單一PCR擴增和電泳檢測時，均能明顯地檢測出各自單一的條帶；而當該6種毒素基因作復合PCR擴增和電泳檢測時，317bp、350bp、375bp的擴增條帶卻無法分開；從圖3可以看出，6種毒素基因的mPCR-DHPLC信號峰各自清晰可辨，顯示出比mPCR-電泳更好的檢測結果。第二復合PCR體系SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG六種毒素基因的PCR預期擴增片段分別為142bp、200bp、350bp、482bp、576bp、642bp;其單獨的PCR-電泳檢測結果見附圖4所示，mPCR-電泳檢測結果見附圖5所示；mPCR-DHPLC檢測結果見附圖6所示。從由圖4和圖5可見，當這6種毒素基因作單一PCR擴增和電泳檢測時，均能明顯地檢測出各自單的條帶；而當該6種毒素基因作復合PCR擴增和電泳檢測時，576bp、642bp的擴增條帶卻無法分開；從圖6可以看出，6種毒素基因的mPCR-DHPLC信兮峰各自清晰可辨，顯示出比mPCR-電泳更好的檢測結果。實施例3、檢測方法特異性試驗取表1中所列的參考菌株，按照實施例1所建立的方法進行檢測。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2金黃色葡萄球菌3金黃色葡萄球菌SEA4金黃色葡萄球菌SEB5金黃色葡萄球菌SEC6金黃色葡萄球菌SEDiS鄉/^/ococc船犯Z)7金黃色葡萄球菌SEE8金黃色葡萄球菌SEG9金黃色葡萄球菌SEI10金黃色葡萄球菌SEH11金黃色葡萄球菌SEJ12金黃色葡萄球菌ETA13金黃色葡萄球菌ETB14金黃色葡萄球菌TSST15普通變形桿菌16奇異變形桿菌17致病性嗜水氣單胞菌18非致病性嗜水氣單胞菌19類志賀鄰單胞菌20綿羊李斯特氏菌21英諾克李斯特氏菌22威爾斯李斯特氏菌23西爾李斯特氏菌24格氏李斯特氏菌25脫氮李斯特氏菌26沙門氏齒27鼠傷寒沙門氏菌28甲型副傷寒沙門氏菌29乙型副傷寒沙門氏菌30丙型副傷寒沙門氏菌31豬霍亂沙門氏菌iS"/聽we〃"e她r/cas由,32豬霍亂沙門氏齒33豬霍亂沙門氏菌34腸炎沙門氏菌35亞利桑那沙門氏齒36阿巴特圖巴沙門氏菌37湯卜遜沙門氏菌38圣保羅沙門氏菌39海德堡沙門氏菌40都柏林沙門氏菌41銅綠假單胞菌42綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)43綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)44熒光假單胞菌45惡臭假單胞菌46產堿假單胞菌<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>取表l中所列試驗菌種，經培養后分別提取基因組DNA，建立模板庫。然后以這些基因組DNA為模板，分別采用第一復合PCR體系中的ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA六種毒素基因和第二復合PCR體系中的SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG六種毒素基因為目的基因采用實施例1所建立的條件進行mPCR-DHPLC分析檢測。結果顯示，在第一復合PCR反應體系中，僅產ETA的金黃色葡萄球菌菌株在2min出現ETA吸收峰，其他菌株均為陰性結果；產SEB的金黃色葡萄球菌菌株在3.6min出現SEB吸收峰，其他菌株均為陰性結果；產SEC的金黃色葡萄球菌菌株在4.7min出現SEC吸收峰，其他菌株均為陰性結果；產SEE的金黃色葡萄球菌菌株在5.4min出現SEE吸收峰,其他菌株均為陰性結果；產SEI的金黃色葡萄球菌菌株在5.7min出現SEI吸收峰,其他菌株均為陰性結果；產SEA的金黃色葡萄球菌菌株在7.8min出現SEA吸收峰,其他菌株均為陰性結果。在第二復合PCR反應體系中，產SEJ的金黃色葡萄球菌菌株在2.9min出現SEJ吸收峰,其他菌株均為陰性結果；產ETB的金黃色葡萄球菌菌株在3.9min出現ETB吸收峰，其他菌株均為陰性結果；產TSST的金黃色葡萄球菌菌株在6.6min出現TSST吸收峰,其他菌株均為陰性結果；產SED的金黃色葡萄球菌菌株在7.7min出現SED吸收峰,其他菌株均為陰性結果；產SEH的金黃色葡萄球菌菌株在8.5min出現SEH吸收峰,其他菌株均為陰性結果；產SEG的金黃色葡萄球菌菌株在8.9min出現SEG吸收峰，其他菌株均為陰性結果。實施例4、靈敏度試驗將已知濃度的各種金黃色葡萄球菌產毒株，即以比濁度法確定的表2和表3中的LLo8濃度的復合增菌液，按照權利要求1所建立的方法進行檢測，確定各種產毒株腸毒素檢測的靈敏度。表2、第一組梯度稀釋細菌數量表序號L01產ETA-119菌株170000\產SEB-257菌株240000\產SEC-317菌株190000\產SEE-350菌株460000\產SEI-375菌株710000\產SEA-478菌株430000L02產ETA-119菌株17000\產SEB-257菌株24000\產SEC-317菌株19000\產SEE-350菌株46000\產SEI-375菌株71000\產SEA-478菌株43000L03產ETA-119菌株1700\產SEB-257菌株2400\產SEC-317菌株1900\產SEE-350菌株\產SEI-375菌株7100\產SEA-478菌株4300L04產ETA-119菌株170\產SEB-257菌株240\產SEC-317菌株190\產SEE-350菌株\產SEI-375菌株710\產SEA-478菌株430表3第二組梯度稀釋細菌數量表序號L05產SEJ-142菌株340000\產ETB-200菌株610000\產TSST-350菌株570000\產SED-482菌株370000\產SEH-576菌株290000\產SEG-642菌株320000L06產SEJ-142菌株34000\產ETB-200菌株61000\產TSST-350菌株57000\產SED-482菌株37000\產SEH-576菌株29000\產SEG-642菌株32000L07產SEJ-142菌株3400\產ETB-200菌株6100\產TSST-350菌株5700\產SED-482菌株3700\產SEH-576菌株2900\產SEG-642菌株3200L08產SEJ-142菌株340\產ETB-200菌株610\產TSST-350菌株570\產SED-482菌株_370\產SEH-576菌株290\產SEG-642菌株320_靈敏度試驗結果如附圖710所示如附圖7所示，第一組的mPCR-DHPLC可以檢測到表2中LM梯度:產ETA菌株170CFU/mL，產SEB菌株240CFU/mL，產SEC菌株190CFU/mL,產SEE菌株210CFU/mL，產SEI菌株710CFU/mL，產SEA菌株430CFU/mL，即可以檢測到102的數量級的菌濃度；而PCR-凝膠電泳卻只能檢測到Lo2梯度(104的數量級)的菌濃度，如附圖8所示。15如附圖9所示，第二組的mPCR-DHPLC可以檢測到表2中"8梯度產SEJ菌株340CFU/mL，產ETB菌株610CFU/mL，產TSST菌株570CFU/mL，產SED菌株370CFU/mL，產SEH菌株2卯CFU/mL，產SEG菌株320CFU/mL，即可以檢測到102的數量級的菌濃度；而PCR-凝膠電泳卻只能檢測到L。6梯度(104的數量級)的菌濃度，如附圖10所示。進行上述靈敏度檢測的同時，對幾種方法的檢測靈敏度進行了比較，包括PCR-凝膠電泳法、膠體金免疫測試條法、VIDAS方法及實施例1所建立的mPCR-DHPLC法。幾種檢測方法比較的結果如表4和表5所示。表4、第一組金黃色葡萄球菌毒素四種不同方法檢測結果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5、第—.組金黃色葡萄球菌毒素四種不同方法檢領j結果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從上述比較的結果可見PCR-DHPLC檢測的靈敏度比其他四種方法的靈敏度都要高。實施例5、模擬污染樣品檢測試驗在選供測試的食品樣品中添加金黃色葡萄球菌產毒標準菌株，A模擬樣品是在魚糜中添加了金黃色葡萄球菌產ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA毒素株；B模擬樣品是在魚糜中添加了金黃色葡萄球菌產SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG毒素株，模擬樣品直接增菌1824h，按照實施例1所建立的方法提取其基因組，并進行檢測。A組模擬污染樣品復合增菌金葡菌的接種量如表6所示表6、A組模擬污染樣品復合增菌金葡菌的接種量菌株菌濃度(cfu/mL)金葡產ETA-119株2900金葡產SEB-257株1700金葡產SEC-317株4300金葡產SEE-350株5000金葡產SEI-375株2100金葡產SEA-478株3600B組模擬污染樣品復合增菌金葡菌的接種量如表7所示:表7、B組模擬污染樣品復合增菌金葡菌的接種量菌株菌濃度(cfu/mL)金葡產SEJ-142株6200金葡產ETB-200株1800金葡產TSST-350株4700金葡產SED-482株2800金葡產SEH-576株3300金葡產SEG-642株2200附圖11為A模擬樣品復合增菌試驗DHPLC檢測結果，實驗結果表明檢測出這六種產毒素株。圖12為B模擬樣品復合增菌試驗DHPLC檢測結果，實驗結果表明檢測出這六種產毒素株。實施例6、本發明的試劑盒及檢測方法在實際樣品檢測中應用將實施例1所建立的試劑盒及多重PCR-DHPLC方法用于實際檢驗工作中，并與現有其他檢測方法進行比較，驗證檢測方法的實用性和可靠性。自2007年12月至2008年6月的7個月期間，采用本研究建立的多重PCR-DHPLC方法快速篩選，同時采用國家標準的培養鑒定方法(GB/T4789.10-2003)、膠體金和VIDAS方法進行驗證比較，同時檢測實際樣品，共檢測3840份樣品。結果從所檢測出的349株金黃色葡萄球菌中，用多重PCR-DHPLC方法篩選檢出54株金黃色葡萄球菌產毒素株陽性(以毒素血清型統計)，采用膠體金和VIDAS方法進行驗證，驗證比較結果見表8。目前市售的膠體金僅有金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C三種免疫測試條，VIDAS方法也僅能檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E五種腸毒素，且不能具體分型。從三種方法的驗證比較結果來看，本研究所建立的PCR-DHPLC方法具有鑒定的種類全，同時能進行分型檢測的優勢，顯示該方法具有較好的適用性。表8.不同檢測方法驗證對實際樣品檢測結果3M測試片法膠體金法VIDAS方法PCR-DHPLC法樣品數量(份)3840384038403840金黃色葡萄球菌陽性結果(株)349———金葡菌毒素株陽性結果(株)—101254金黃色葡萄球菌陽性率(％)9.09%——金葡菌毒素株陽性率(％)—0.26%0.31%1.41"':,對以PCR-DHPLC法所分離檢測出的54份金黃色葡萄球菌產毒素株陽性樣本，通過PCR-DHPLC方法進行了毒素分型檢測，結果發現從凍鱈魚樣品中分離出的287株金黃色葡萄球菌檢測到毒素基因的有33株，占11.5%，同時攜帶2種及以上毒素基因的菌有4株，占1.4%;從肉制品中分離的37株金黃色葡萄球菌檢測到毒素基因的有14株，占37.8%;從其它食品樣品中分離的25株金黃色葡萄球菌檢測到毒素基因的有7株，占28.0%。同時攜帶2種及以上毒素基因的菌有4株，占10.8%。其中，SEA毒素基因的最多，有29株，占53.7%，而含其它傳統毒素基因類型SEB、SEC、SED基因的菌株只有6株，占11.1%(SEB、SEC、SED分別占3.7。/。、1.8%、5.6%)，沒有檢測到攜帶SEE、ETB、TSST基因的菌株。攜帶新發現的毒素基因SEG、SEH、SEI、SEJ和ETA的菌株較多，有19株，占35.2%,其屮SEG基因的菌株3株，SEH基因的菌株7株，SEI基因的菌株3株，SEJ基因的菌株5株，ETA基因的菌株1株，分別占5.6%、13.0%、5.5%、9.3%和1.8%。18權利要求1、食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒，其特征在于包括檢測溶液A和檢測溶液B檢測溶液A中含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六種毒素基因引物對各10μM；檢測溶液B中含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六種毒素基因引物對各10μM；其中，檢測溶液A中6種毒素基因的特異性引物序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>檢測溶液B中6種毒素基因的特異性引物序列如下<tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>2、食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測方法，其特征在于使用權利要求l所述的試劑盒，包括如下步驟①PCR反應取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的檢測溶液A和14ul滅菌超純水，總體積25ul;另取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的檢測溶液B和14ul滅菌超純水，總體積25ul;兩個反應體積分別在5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，60。C退火60s，72。C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②將PCR擴增產物進行DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3柱溫50°C;流動相(體積比):0.0min，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;2.8min，40.9%緩沖溶液A，59.1%緩沖溶液B;5.0min，37.3%緩沖溶液A，62.7%緩沖溶液B;(7.3min，35.5%緩沖溶液A，64.5%緩沖溶液B;(9.5min，34.3%緩沖溶液A，65.7%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液;緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5)iiL。全文摘要食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒中包括檢測溶液A和檢測溶液B檢測溶液A和B中均含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL，還分別含有ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六種毒素基因引物對各10μM或SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六種毒素基因引物對各10μM。使用本發明的檢測試劑盒及檢測方法，可以高靈敏度地檢測食品中12種金黃色葡萄球菌毒素基因，并且檢側耗時短，操作簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。文檔編號C12R1/445GK101580873SQ200910010798公開日2009年11月18日申請日期2009年3月20日優先權日2009年3月20日發明者曹際娟申請人:曹際娟