專利名稱：：水產品中5種致病性弧菌檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發明涉及食品中病原微生物的檢測方法，尤其涉及利用mPCR-DHPLC技術檢測水產品中致病性弧菌的方法。還涉及檢測所使用的組合物，即試劑盒。
背景技術：
：隨著生活水平的提高以及我國加入WTO后的逐步開放，人們對水產品的需求不斷增大，同時水產品的進出口貿易也在擴大。然而，水產品中致病性微生物、尤其是致病性弧菌的監控和檢測一直是限制我國水產品貿易的重要問題之一。1998年和2000年我國出口到法國的鱈魚片和出口到瑞典的水產品被檢出創傷弧菌和擬態弧菌而遭取消代號處理。2001年起我國出口到韓國的水產品全部要求檢驗霍亂弧菌，因此致病性弧菌的檢驗越來越受到重視。現有的檢測方法中，對水產品中致病性弧菌的檢測仍采用常規的微生物檢測方法，這些方法費時費力，無法滿足快速高通量檢測的要求，檢測時還會出現假陽性，影響結果分析，可能會帶來較大的經濟損失。并且，現有的微生物學檢驗方法無法提供準確的分型信息。而水產品檢測中經常是一份樣品同時檢測幾種致病性弧菌。因此，有必要研究一種方法，可同時針對多個致病性弧菌，快速且大批量進行檢測，并且能夠在檢測出時能快速分型。變性高效液相色譜(DHPLC)采用離子對反相高效液相色譜的原理，是通過使用特殊的耐高溫液相色譜分離柱同時采用溫度調控的方式，對核苷酸片段分子進行分析分離的方法，因此，也有人稱該技術為溫度調控離子對反相高效液相色譜。該技術的發明為生命科學領域里的核酸分析提供了方便實用的技術平臺。其快速高通量、全自動化操作、準確度高、重復性好及敏感性高的優點使其在核酸分析中具有無可替代的優勢。DHPLC技術檢測微生物是很好的培養不依賴的混合微生物樣本的分析平臺，不僅能鑒定常見的微生物，還能鑒定不常見的，苛刻的，和厭氧的細菌。該技術在已知和未知基因突變的檢測和篩選、基因分型、基因定量和長度多態性分析等領域已經得到廣泛應用。本發明人即旨在建立利用DHPLC技術的能快速、高通量檢測多樣本、多種弧菌的檢測方法。
發明內容本發明的目的在于提供一種用于靈敏快捷地檢測樣品、尤其是檢測水產品中致病性弧菌以判定待檢樣品是否受到污染的mPCR-DHPLC檢測試劑盒及其檢測方法。首先，本發明所述的水產品中5種致病性弧菌檢測試劑盒包括lmL檢測溶液含10mMTrisCl、50mMKC1、25mMMgC12、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(5U/WJ及5種致病性弧菌上、下游引物對各10WVI;其中，這5種水產品中致病性弧菌的目的基因及特異性引物序列如下菌株擴增基因引物名稱上、下游引物序列(5'-3')產物大小(bp)副溶血弧菌不耐熱溶血TXH-FAAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG450(V.p)毒素基因TLH-RGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC溶藻弧菌膠原酶基因VAC陽FCTTATGGGACTTCGGTGATGGCT210(V.a)VAC陽RCGCCCACCGCTTACTTTACTTTG霍亂弧菌膠原酶基因VCC-FCCTAATGAGCAACCGACTATCAAAGA155(V.c)VCC-RTGTTCTGAAGCGGTGAGCCATAC創傷弧菌溶細胞素VVHA-FTTGGTCCATTCGCCAGCAGTTAC582(V.v)基因VVHA-RTGTTGGTTGACGAGCCCGCAGAG擬態弧菌溶血素基因VMH-FAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA243(V.m)VMH-RCGACCATTTGTTGACGCCCATCT本發明還提供了利用上述試劑盒檢測水產品中致病性弧菌的檢測方法，包括如下步驟①取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14jil滅菌超純水，總體積25pl;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，56。C退火60s，72'C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3拜；柱溫50°C;流動相(體積比):O.Omin,55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;3.6min，41.8%緩沖溶液A，58.2%緩沖溶液B;6.8min，38.2%緩沖溶液A，61.8%緩沖溶液B;9.9min，36.3%緩沖溶液A，63.7%緩沖溶液B;13min，35.0%緩沖溶液A，65.0%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5pL。檢測結束后，根據DHPLC檢測圖譜中特征色譜峰的峰形、保留時間以及與陽性對照譜圖的對照，來確定樣品的染菌情況。上述檢測方法中所述的待測樣品DNA溶液是指用常規的細菌基因組提取的基因組DNA。疑似染菌的樣品可以通過常規方法增菌培養后用于提取基因組DNAo本發明采用多重PCR結合變性高效液相色譜(PCR-DHPLC)技術，針對水產品中5類致病性弧菌建立靈敏便捷的檢測方法，并建立水產品中5類致病性弧菌快速檢測試劑盒。本方法檢測5類致病性弧菌檢測下限低于100cfU/mL，只要每毫升菌液里各致病性弧菌數有100個，用本方法就可以檢測出來。此外，本方法檢側時間比傳統方法短，方法更加簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。本發明附圖6幅，其中圖1是mPCR-DHPLC方法特異性試驗中擬態弧菌的檢測圖；圖2是mPCR-DHPLC方法特異性試驗中創傷弧菌的檢測圖譜；圖3是mPCR-DHPLC方法特異性試驗中副溶血弧菌的檢測圖譜；圖4是mPCR-DHPLC方法特異性試驗中溶藻弧菌的檢測圖譜；圖5是mPCR-DHPLC方法特異性試驗中霍亂弧菌的檢測圖譜；圖6是5類致病性弧菌的mPCR-DHPLC檢測結果；上述附圖中，橫坐標均為保留時間(單位分鐘min)，縱坐標表示吸收峰信號強度(單位毫伏mV)。具體實施例方式下面為本發明的具體實施例，其對本方法的建立及其應用作進一步的說明，但并不以任何形式限制本發明的內容。若無特殊說明，本部分所使用的主要試劑、儀器及其商品來源為MgCl2，純度大于99.9%,購自美國Ameresco公司；KC1，純度大于99.9%，購自美國Ameresco公司；Trizmabase，純度大于99.9%，購自美國Ameresco公司；甘油，純度大于99.9%，購自美國Ameresco公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；DNAmarkerI購自天根生化科技有限公司；dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP等摩爾混合物，各10mmol/L)，購自天根生化技術有限公司；5xBuffer(含15mmol/LMgCl2)，購自Promega公司；GoTaqDNA聚合酶(5U/VL)，購自Promega公司；2xTaqPCRMasterMix(0.1UTaqPolmerase4iL，500(imol/LDNTPeach,20mmol/LTris隱HCLpH=8.3，100mmol/LKCL，3mmol/LMgC12)，購自天根生化科技有限公司。PCR儀德國Biometm公司生產的梯度PCR儀(型號為Tgradient96)及MJResearch公司生產的4槽PCR儀(型號為PTC220);凝膠成像儀美國KODAK公司生產(型號為KODAK);核酸蛋白分析儀英國安瑪西亞公司生產(型號為Ultrospec1100pro);臺式離心機德國eppendorf公司生產(型號為Minispin);培養箱美國LBA-LINE儀器有限公司生產的LBA-LINE3554-26廣溫培養箱；變性高效液相色譜儀美國Tmnsgenomic公司生產(型號WAVE4500);VITEK全自動細菌鑒定儀；DNA/RNA真空濃縮儀；本部分內容涉及的標準菌株及標準菌株基因組DNA分別購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)和中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)，詳見表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>33腸致病性大腸埃希氏菌ATCC4388734腸侵襲性大腸埃希氏菌ATCC4389335阪崎腸桿菌ATCC5132936福氏忐賀氏菌幼—〃aATCC1202237金黃色葡萄球菌ATCC2921338金黃色葡萄球菌&ap/2>7oc:oc:cz^"臟W5aw/^uyATCC4944439小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC961040溶血性鏈球菌CMCC3212141普通變形桿菌ATCC4902742奇異變形桿菌ATCC2924543空腸彎曲菌ATCC3356044空腸彎曲菌ATCC3329145空腸彎曲菌基因組DNAC纖/—勿,聽'5W/wp.ATCCgewo鼎:cZ)假33560D-546蠟樣芽孢桿菌ATCC1457947產氣莢膜梭菌ATCC13124使用前，取表l中所列試驗菌種，經培養后分別提取基因組DNA，建立模板庫。弧菌接種于4mL3XNaCl營養肉湯中(37iiyC培養1824h，彎曲菌屬的菌株在布氏肉湯中，于42"C微需氧環境下培養(5M氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣)24h。其他的菌株在營養肉湯中，于37r培養24h。實施例1、水產品中5種致病性弧菌檢測試劑盒及其檢測方法的建立本實施例確定用于檢測的目的基因及其引物如下表所示菌株擴增基因引物名稱上、下游引物序列(5'—3')產物大小(bp)副溶血弧菌不耐熱溶血TLH-FAAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG450(V.p)毒素基因TLH-RGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC溶藻弧菌膠原酶基因VAC-FCTTATGGGACTTCGGTGATGGCT210(V.a)VAC-RCGCCCACCGCTTACTTTACTTTG霍亂弧菌膠原酶基閑VCC-FCCTAATGAGCAACCGACTATCAAAGA155(V.c)VCC-RTGTTCTGAAGCGGTGAGCCATAC創傷弧菌溶細胞素WHA-FTTGGTCCATTCGCCAGCAGTTAC582(V.v)基因VVHA隱RTGTTGGTTGACGAGCCCGCAGAG擬態弧菌溶血素基因VMH-FAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA243(V.m)_VMH-RCGACCATTTGTTGACGCCCATCT_在此基礎上，設計用于PCR擴增的水產品中5種致病性弧菌檢測試劑盒lmL檢測溶液含10mMTris.Cl、50mMKC1、25mMMgC12、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5UL及上表中5種致病性弧菌引物對各10|iM。使用該試劑盒檢測樣品中5種致病性弧菌的mPCR-DHPLC方法包括如下步驟①待測樣品DNA溶液的制備a.水產品樣品無菌方法稱取25克樣品于225mL3%氯化鈉營養肉湯中培養1824h，使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-2(TC保存。b.標準菌株挑取單個菌落，弧菌接種于3Q/^NaCl營養肉湯中(37士1)"C培養1824h，彎曲菌屬的菌株在布氏肉湯中，于42"C微需氧環境下培養(5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣)24h。其他的菌株在營養肉湯中，于37'C培養24h。使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-2(TC保存。②取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14pl滅菌超純水，總體積25iil;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，56。C退火60s，72"C延伸60s,35次循環;終止延伸72°C，7min;③DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3pm;柱溫50°C;流動相(體積比)O.Omin，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;3.6min，41.8%緩沖溶液A，58.2%緩沖溶液B;6.8min，38.2%緩沖溶液A，61.8%緩沖溶液B;9.9min，36.3%緩沖溶液A，63.7%緩沖溶液B;13min，35.0%緩沖溶液A，65.0%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液;緩沖溶液B是濃度為O.IMTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5pL。實施例2、特異性試驗取表l中所列試驗菌種，經培養后分別提取基因組DNA，建立模板庫。然后以這些基因組DNA為模板，以霍亂弧菌的膠原酶基因(vcc)、擬態弧菌的溶血素基因(vmh)、副溶血弧菌的不耐熱溶血毒素基因(tlh)、溶藻弧菌的膠原酶基因(vac)及創傷弧菌的溶細胞素基因(vvh)為檢測的目的基因采用實施例1所建立的試劑盒及檢測方法進行mPCR-DHPLC檢測。5類致病性弧菌DHPLC特異性檢測圖譜如附圖16所示。結果顯示，在mPCR反應體系中，a.擬態弧菌全部擴增出了vmh目的基因片段，而其他非擬態弧菌菌株則全部為陰性結果(附圖1);b.創傷弧菌全部擴增出了vvh目的基因片段，而非創傷弧菌菌株則全部為陰性結果(附圖2);c.副溶血弧菌全部擴增出tlh目的基因片段，而非副溶血弧菌菌株則全部為陰性結果(附圖3);d.溶藻弧菌擴增得到vac目的基因片段，其余非溶藻弧菌菌株全部為陰性結果(附圖4)。e.霍亂弧菌擴增得到vcc目的基因片段，其余非霍亂弧菌菌株全部為陰性結果(附圖5)。上述結果表明本實驗設計的5重引物適用于mPCR-DHPLC檢測5類致病性弧菌，具有很好的特異性。實施例3、同時檢測5種致病性弧菌的mPCR-DHPLC檢測試驗、溶藻弧菌ATCC17749、霍亂弧菌ATCC14035標準菌株在36°C培養18h，測其OZ)值，估計其菌數，然后按10—1，10—2，10—3等倍數梯度稀釋，取幾個適宜梯度的菌液進行平板計數，重復2次，取平均值確定其菌濃度。取幾個適宜梯度的菌液，采用試劑盒提取法制備基因組DNA，制備待測樣品DNA溶液，采用上述條件進行mPCR-DHPLC分析檢測。測量結果的DHPLC譜圖如附圖6所示。由該結果可見，5類致病性弧菌的mPCR-DHPLC行為具有明顯的差異，本發明的試劑盒及檢測方法可以在一次檢測中非常有效地將染菌樣品中的這5種菌區分識別。實施例4、靈敏度試驗分別取擬態弧菌ATCC33653、創傷弧菌ATCC27562、副溶血弧菌ATCC17803、溶藻弧菌ATCC17749、霍亂弧菌ATCC14035標準菌株在36°C培養18h，測其OZ)值，估計其菌數，然后按10—1，10—2，10—3等倍數梯度稀釋，取幾個適宜梯度的菌液進行平板計數，重復2次，取平均值確定其菌濃度。將適當濃度的5種菌液混合，并按1(T1，10_2進行倍數梯度稀釋，形成三個混合菌液系列(如表2)，每個系列梯度菌液采用試劑盒提取法制備模板DNA，進行PCR-DHPLC檢測，確定反應體系的靈敏度。表2擬態弧菌創傷弧菌副溶血弧菌溶藻弧菌霍亂弧菌(CFU/mL)(CFU/mL)(CFU/mL)(CFU/mL)(CFU/mL)系列182006700370052003500系列2820670370520350系列38267375235結果表明，在5類致病性弧菌的混合液中，當菌液濃度為擬態弧菌82CFU/mL、創傷弧菌67CFU/mL、副溶血弧菌37CFU/mL溶藻弧菌52CFU/mL霍亂弧菌35CFU/mL時，各類致病性弧菌依然可被檢出。實施例5、應用于食品檢測試驗2007年11月2008年5月，將實施例1所建立的試劑盒及mPCR-DHPLC的檢測方法用于海產品中弧菌的檢測，同時采用標準方法(GB/T4789.7-2003、SN/T1022-2001、MNKLNo.156)進行比較。共檢測196份樣品，包括魷魚及其加工產品、蟲下仁、黑鯧、午魚、魚肚、魚鰭、鯊魚肉、鰹魚、金槍魚、秋刀魚和帶魚等。對mPCR-DHPLC檢測結果結果的判斷標準是將待測樣品的PCR-DHPLC檢測譜圖與陰性對照及陽性對照(標準菌株)的PCR-DHPLC檢測譜圖比較，當陰性對照無任何特異性吸收峰出現，而陽性對照出現位置正確的特異性吸收峰時，若被檢樣品在與陽性擴增的同一位置上出現特異性吸收峰，且峰高>2mV時，判定為陽性；若被檢樣品在該位置無特異性吸收峰，則判定為陰性；若被檢樣品在與陽性擴增的同一位置上出現特異性吸收峰，但峰高<2mV時，則為可疑樣品，需要通過其他方法進行確認。試驗統計結果如表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>經統計，用實施例1所建立的試劑盒及mPCR-DHPLC方法檢出的12份陽性樣本采用經典的標準方法驗證，均證實為陽性。mPCR-DHPLC方法檢測出的陰性結果與標準方法結果符合。試驗中mPCR-DHPLC方法吻合率為100%，顯示該方法具有廣泛而且良好的適用性。本實施例中，使用傳統培養的方法，檢測每個樣品平均總耗時(包括樣品制備)96h，檢測耗時(不包括樣品制備)94h;使用mPCR-DHPLC方法，檢測每個樣品平均總耗時(包括樣品制備)25h，檢測耗時(不包括樣品制備)0.5h。權利要求1、水產品中5種致病性弧菌檢測試劑盒，其特征在于1mL檢測溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及5種致病性弧菌引物對各10μM；其中，5種致病性弧菌的特異性引物序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="138"></tables>2、水產品中5種致病性弧菌的檢測方法，其特征在于使用如權利要求1所述的試劑盒，包括如下步驟①取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14|il滅菌超純水，總體積25pl;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，56'C退火60s，72°。延伸60s，35次循環;終止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3柱溫50°C;<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>,6.8min，38.2%緩沖溶液A，61.8%緩沖溶液B;9.9min，36.3%緩沖溶液A，63.7%緩沖溶液B;13min，35.0%緩沖溶液A，65.0%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5pL。全文摘要一種用于食品微生物污染檢測及監控的水產品中5種致病性弧菌檢測試劑盒及其檢測方法，所述的試劑盒中，1mL檢測溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及5種致病性弧菌引物對各10μM。采用本發明的試劑盒及檢測方法，可以一次檢測出水產品中5類致病性弧菌。并且檢測下限低于100cfu/mL，只要每毫升菌液里各致病性弧菌數有100個，用本方法就可以檢測出來。此外，本方法檢側時間比傳統方法短，方法更加簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。文檔編號C12Q1/68GK101633952SQ20091001079公開日2010年1月27日申請日期2009年3月20日優先權日2009年3月20日發明者邵碧英,晶鄭,黃曉蓉申請人:邵碧英;鄭晶;黃曉蓉