編碼類黃酮途徑酶的基因序列及其用途的制作方法

專利名稱：編碼類黃酮途徑酶的基因序列及其用途的制作方法
本申請是申請日為1997年2月28日、申請號為97193973.X、發明名稱為“編碼類黃酮途徑酶的基因序列及其用途”的發明專利申請的分案申請。
本發明一般涉及編碼類黃酮途徑中代謝酶更具體地，類黃酮3’-羥化酶(下文稱為“F3’H”)或其衍生物的基因序列及其它們在植物和其它生物中控制色素形成的作用。
本說明書中作者提及的發表文章的文獻目錄詳情收錄在說明書結尾部分。說明書和權利要求書中提及的核苷酸和氨基酸序列的序列鑒定號(SEQ ID NOS)在文獻目錄后定義。SEQ ID NOS的概述及其所涉及的序列在實施例前提供。
在本說明書全文中，除非上下文另有要求，單詞“包含”或其諸如現在時(comprcies)或進行時(comprising)的時態變化將理解為指包括所述元件或整體或元件或整體組但不排除任何其它元件或整體或元件或整體組。
重組DNA技術迅速發展的改進極大地促進了與生物技術有關工業領域的研究和發展。園藝工業已成為該技術最近的受益者，該技術有助于在扦插后表現出衰老延緩的植物和花中形成疾病抗性。也有些注意力集中在控制花的顏色上。
花卉工業致力于形成新的和沒的開花植物品種。產生這樣的新品種的一個有效的途徑是通近控制花的顏色。使用經典育種技術已成功地產生了大多數商業花卉品種的許多顏色。然而，這種方法因受具體種類基因庫的局限而受到限制，因此，很少使單一種類具有全色譜的有色品種。另外，傳統的育種技術缺乏精確性。花的美學吸引力是諸如形態，香味和顏色的許多因素的組合通過雜交對一種特征的修飾常常犧牲一種同樣有價值的特征。在切花和觀賞種類中以遺傳工程精確改變顏色的能力在產業上將提供有意義的商業機會，它具有迅速的產品轉向且其中新穎性是重要的市場特征。
花的顏色主要是由于兩種類型的色素類黃酮和類胡蘿卜素。類黃酮提供由黃到紅到藍的顏色范圍。類胡蘿卜素提供橙色或黃色且通常是黃色或橙色花中的主要色素。對花的顏色起主要作用的類黃酮分子是花青苷，它是花青素，花翠素，3’-甲花翠素，甲基花青素，二甲翠雀素和花葵素的糖基化衍生物，且位于液泡中。不同的花青苷可產生明顯不同的顏色。花的顏色也受無色類黃酮，金屬復合物，糖基化，乙酰化和液泡pH的輔助色素形成作用的影響(Forkmann，1991)。
類黃酮色素的生物合成途徑(下文稱為“類黃酮途徑”)已充分了解并在表示于

圖1a和1b中(Ebel和Hahlbrock，1988；Hahlbrock和Grisebach，1979；Wiering和De Vlaming，1984；Schram等，1984；Stafford，1990；van Tunen和Mol，1990；Dooner等，1991；Martin和Gerats，1993；Holton和Cornish，1995)。該途徑中第一個參與的步驟涉及3個丙二酰-CoA分子與一個對香豆酰-CoA分子的縮合。該反應由查耳酮合成酶(CHS)催化。該反應的產物2’，4’，4’，6’-四羥基查耳酮正常情況下由查耳酮黃烷酮異構酶(CHI)迅速異構化產生4’，5，7-三羥黃烷酮。4’，5，7-三羥黃烷酮隨后由黃烷酮3-羥化酶(F3H)在中央環的3位羥基化產生二氫四羥基黃酮(DHK)。
DHK B環的羥基化方式在決定花瓣顏色中起著關鍵性作用。B環可在3’處或在3’及5’兩處羥基化分別產生二氫櫟皮黃酮(DHQ)和二氫楊酶黃酮(DHM)。在該途徑中涉及的兩個關鍵酶是類黃酮3’-羥化酶和類黃酮3’，5’-羥化酶，兩者均是細胞色素P450類。細胞色素P450酶在自然界中廣泛分布，已從脊椎動物，昆蟲，酵母，真菌，細菌和植物中分離并測序了它的基因。
類黃酮3’-羥化酶作用于DHK產生DHQ且作用于4’，5，7-三羥黃烷酮產生圣草酚。DHQ的還原和糖基化產生花青素糖苷和甲基花青素糖苷色素，在許多植物種類(例如玫瑰，石竹和菊)中這些色素產生紅色和粉紅色花色。這些花青苷的合成也可產生其它花色。例如，蘭色矢車菊含有花色素苷。在開花植物中控制類黃酮3’-羥化酶活性或類黃酮途徑中涉及的其它酶的能力可提供控制花瓣顏色的方法。由此可產生單一栽培品種的不同顏色形式，且在有些情況下，單一種類可產生更寬色譜的顏色 已克隆了編碼矮牽牛屬類黃酮3’-羥化酶的核苷酸序列(本文稱為SEQ ID NO26)(見國際專利申請號PCT/AU93/00127[WO93/2026])。然而，該序列沒有能力調節植物中3’-羥基化花青苷的合成。因此，需要鑒定其它有效調節植物中類黃酮化合物羥基化的編碼類黃酮3’-羥化酶的進一步的基因序列。更具體地說，需要鑒定有效調節植物中3’-羥化花青苷合成的編碼類黃酮3’-羥化酶的進一步的基因序列。
根據本發明，編碼類黃酮3’-羥化酶的基因序列已得到鑒定和克隆。本發明的重組基因序列可以通過，例如，從頭表達，過度表達，抑制，反義抑制和核酶活性來調節編碼該酶的基因的表達。控制植物中類黃酮3’-羥化酶合成的能力可以調節每個花青苷的組成及改變類黃醇和花青苷的相對水平，從而能控制組織的顏色，如花瓣，葉，種子和果實的顏色。下文中描述的本發明涉及花的顏色的控制，但應理解為可延伸到控制其它植物組織比如葉，種子和果實。
因此，本發明的一個方面提供了分離的核酸分子，包含編碼類黃酮3’-羥化酶或其衍生物的核酸序列，其中所述的類黃酮3’-羥化酶或其衍生物比SEQ ID NO26所述的核苷酸序列編碼的類黃酮3’-羥化酶能更有效地調節植物中類黃酮化合物的羥化。
本文所用的效率涉及類黃酮3’-羥化酶在植物細胞中羥化類黃酮化合物的能力。這給植物提供了類黃酮途徑中其它酶的額外底物，從而能通過，例如，糖基化，酰基化和鼠李糖基化進一步修飾該分子以合成有助于形成一系列顏色的各種花青苷。由此，3’-羥基化的花青苷可以得到調節。其效率可以方便地通過選自下列參數的一種或多種參數來估計以產生的mRNA的量測定的轉錄水平；4’，5，7-三羥黃烷酮和/或DHK的羥基化水平；以合成的翻譯產物的量測定的mRNA翻譯水平；DHQ或DHM的花青苷衍生物的合成水平；對組織如，花，種子，葉或水果的顏色的影響程度。
本發明的另一方面是關于分離的核酸分子，包含定位于矮牽牛屬中名為Ht1或Ht2的遺傳基因座上或其它有花植物種類相同的這類基因座上的核苷酸序列，其中所說的分離的核酸分子編碼類黃酮3’-羥化酶或其互補于編碼該酶的序列。
本發明的另一方面包含一種分離的核酸分子，包含對應于矮牽牛屬中名為Ht1或Ht2的遺傳基因座，或含控制3’-羥化類黃酮合成的序列的其它有關植物種類中基因座的核苷酸序列，其中所說的分離的核酸分子編碼類黃酮3’-羥化酶或其衍生物，后者比SEQ ID NO26所述的類黃酮3’-羥化酶能更有效地將DHK轉化成DHQ。
根據本發明的上述方面，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO1所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO1所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
在有關實施方案中，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO3所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO3所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
在另一相關實施方案中，本發明涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO5所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO5所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
還有另一個相關的實施方案提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO7所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO7所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
還有本發明另一個實施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO9所述的或具有與其編碼區至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO9所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
在另一實施方案中，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO14所述或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO14所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
在另一實施方案中，本發明涉及一種核酸分子。它包含基本上如SEQ ID NO16所述或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQID NO16所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
還有另一個實施方案提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO18所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO18所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
而且，本發明的另一實施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO20所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低等嚴格條件下與SEQ ID NO20所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
還有另一個實施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO22所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO22所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
在另一實施方案中，本發明提供了一個核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO24所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低等嚴格條件下與SEQ ID NO24所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
在一個特別優選的實施方案中，提供了一種分離的核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO1所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴格條件下與SEQ ID NO1所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列，其中所述的核革酸序列定位到矮牽牛屬中稱為Ht1或Ht2的遺傳基因座上或在其它開花植物種類中相應的這類基因座上，且其中所述的分離的核酸分子編碼類黃酮3’-羥化酶，或與編碼該酶的序列互補。
本文參考的42℃的低度嚴格條件包括和包含用于雜交的從至少大約1％到至少大約15％的甲酰胺和從至少大約1M到至少大約2M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約1M到至少大約2M的鹽。如果需要，可使用替換的嚴格條件，如中等嚴格條件，它包括和包含用于雜交的從至少大約16％到至少大約30％的甲酰胺和從至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽，或高度嚴格條件，它包括和包含用于雜交的從至少大約31％到至少大約50％甲酰胺和從至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽。雜交可在不同溫度下進行，如果這樣，可據此調節其它條件。
本發明的另一方面提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQID NO2所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或與該編碼序列互補的核苷酸序列。
在有關實施方案中，提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO4所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或與該編碼序列互補的核苷酸序列。
本發明的另一相關實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO6所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。
還有另一相關的實施方案提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO8所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。
還有另一相關的實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO10或SEQ ID NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列或其互補序列。
在另一實施方案中，本發明涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO15所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。
還有在另一實施方案中，提供子一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO17所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。
在另一實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ IDNO19所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。
而且，本發明的另一實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO21所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。
還有一個實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ IDNO23所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。
在另一實施方案中，本發明提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO25所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。
在一個特別優選的實施方案中，提供了一種分離的核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO2所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列，其中所述的核苷酸序列定位到矮牽牛屬中稱為Ht1或Ht2的遺傳基因座上或其它開花植物種類中相應的這類基因座上，其中所述的分離的核酸分子編碼類黃酮3’-羥化酶或其衍生物或是該編碼序列的互補序列。
本文使用的術語“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平上所比較的序列間完全相同。在核苷酸水平上沒有相同性的地方，“相似性”包括產生在結構，功能，生物化學和/或構象水平上互相相關的不同氨基酸的序列之間的差異。在氨基酸水平上沒有相同性的地方，“相似性”包括在結構，功能，生物化學和/或構象水平上互相相關的氨基酸。
SEQ ID NO1所示的核酸分子編碼來自矮牽牛屬的類黃酮3’-羥化酶。其它適合的F3’H基因的例子來自石竹(SEQ ID NO3)，金魚草屬(SEQ ID NO5)，擬南芥屬(SEQ ID NO7)，擬南芥屬基因組DNA克隆(SEQ ID NO9)，玫瑰(SEQ ID NO14)，菊(SEQID NO16)，蝴蝶草屬(SEQ ID NO18)，日本牽牛花(SEQ ID NO20)，龍膽(SEQ ID NO22)和lisianthus(SEQ ID NO24)。盡管本發明特別列舉了上述F3’H基因，但本發明可延伸到任何植物種類的F3’H基因，只要這些F3’H基因在核苷酸水平上具有與選自SEQ ID NO1或3或5或7或14或16或18或20或22或24的核酸分子至少大約60％的相似性或在氨基酸水平上具有與選自SEQ ID NO2或4或6或8或10，11，12，13或15或17或19或21或23或25的氨基酸分子至少大約50％的相似性。本發明進一步延伸到來自任何植物種類的F3’H基因，只要這些F3’H基因在核苷酸水平上具有與SEQ ID NO9的編碼區域至少大約60％的相似性。
本發明的核酸分子一般是在非天然存在狀態下的基因序列。一般來說，這意味著從其天然狀態分離出來或人工合成或在非天然存在環境中產生。更具體地，它包括體外形成或維持的核酸分子，包括基因組DNA片段，重組或合成的分子和與異源性核酸連接的核酸。它也延伸到編碼F3’H的基因組DNA或cDNA或其部分，或者相對于其自身的或其它啟動子方向相反的部分。它進一步延伸到相對于其它核酸序列至少部分純化的天然存在的序列。
術語“核酸分子”包括核酸分離物和基因序列，在本文中以其最普遍的含義使用，它包括F3’H中的氨基酸序列直接地或經堿基的互補系列限定的任何核苷酸堿基的接近系列。該氨基酸序列可組成全長的F3’H或其有活性的截短形式或可相應于該酶的特定區域，如N-端，C-端或中間部分。本文涉及的核酸分子也包含作為基因探針或作為能調節植物中相應基因表達的“反義”分子的寡核苷酸。本文使用的“反義分子”也可包括含有相對于其自身的或另一啟動子反向的結構基因組或cDNA基因或其部分的基因構建體。因此，本發明的核酸分子可適用于作為共同抑制分子，核酶分子，有義分子和反義分子以調節3’-羥基化花青苷的水平。
在另一實施方案中，編碼F3’H的核酸分子或其各種衍生物用于減小內源性F3’H的活性，選擇性地，編碼該酶的核酸分子或其各種衍生物以反義方向使用以減小F3’H的活性。盡管不希望以任一理論限制本發明，但將該核酸分子導入細胞中通過降低同源內源性基因的轉錄或通過增加相應mRNA的轉換來產生這一結果是可能的。使用含有有義或反義方向的F3’H核酸分子或其各種衍生物的基因構建體可實現這一點。在更進一步的改進方案中，可使用核酶滅活靶核酸分子。選擇性地，核酸分子編碼一種功能性F3’H且它用于升高植物中該酶的水平。
本文提及的類黃酮F3’H活性的改變涉及將活性升高或降低到正常內源性或現存活性水平之上或之下達30％，或更優選30-50％，或甚至更優選50-75％或更優選75％或更大。使用Stotz和Forkmann(1982)所述方法的改進方式(見實施例7)或通過按實施例5所述測定F3’H產物，比如櫟皮黃酮，花青素或甲基花青素的量可較容易地測定活性水平。
本發明進一步延伸到以寡核苷酸引物或探針形式存在的核酸分子，該引物或探針在高度，優選在中等，且最優選在低等嚴格條件下能與上述核酸分子，特別是選自SEQ ID NO1，3，5，7，9，14，16，18，20，22或24中所述的核酸分子的一部分雜交。優選地該部分對應于F3’H基因的5’或3’端。為了方便，本文所說的5’端定義為基本上在初級轉錄子5’端至該基因中央部分之間的區域，本文所說的3’端定義為基本上在該基因中央部分至初級轉錄子3’端之間的區域。因此，很明顯寡核苷酸或探針可與5’端或3’端或與5’和3’端共有的區域雜交。
核酸分子或其互補形式可編碼全長酶或其部分或其衍生物。“衍生物”指相對于天然存在的酶有任意單一或多處氨基酸取代，缺失和增加，且包括部分，片段，分部，融合分子，同源物和類似物。關于這點，核酸包括天然存在的編碼F3’H的核苷酸序列或可包含對所述天然存在的序列的單一或多個核苷酸取代，缺失和/或增加。融合分子可以是編碼2個或多個F3’H的核苷酸序列之間的融合，或編碼F3’H的核酸序列與編碼任何其它蛋白質類分子的核苷酸序列之間的融合。融合分子在改變底物特異性中有用。
本發明的核酸分子或其互補形式或F3’H的衍生物也可包括不管其是否具有活性的“部分”。有活性的或有功能的核酸分子是編碼具有F3’H活性的酶的分子。有活性的或有功能的分子進一步包括具有部分活性的分子，例如，底物特異性降低的F3’H應認為具有部分活性。核酸分子的衍生物可作為寡核苷酸探針，作為用于聚合酶鏈式反應或各種突變技術的引物，用于產生反義分子或核酶構建體。它們也可用于形成共同抑制構建體。根據本發明這一方面的核酸分子可編碼或不編碼具有功能的F3’H。“部分”可來自該核酸分子的5’端或3’端與5’及3’端共有的區域。
本發明的F3’H的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羥基末端融合物以及單個或多個氨基酸的序列內插入。插入氨基酸序列的變異體是那些其中將一個或多個氨基酸殘基導入了蛋白質的預定位點的變異體，盡管也可能進行隨機插入并適當篩選所得的產物。缺失變異體的特征在于從序列中去掉了一個或多個氨基酸。置換氨基酸變異體是那些其中序列中的至少一個殘基被去掉并在其位置插入不同的殘基的變異體。典型的置換是根據下面表1進行的取代。
表1 適合于氨基酸置換的殘基 原始殘基典型的置換 Ala Ser Arg Lys Asn Gln；His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn；Gln Ile Leu；Val Leu Ile；Val Lys Arg；Gln；Glu Met Leu；Ile Phe Met；Leu；Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp；Phe Val Ile；Leu 在F3’H通過氨基酸置換改變時，氨基酸一般被具有相似特性，如疏水性，親水性，電負性，側鏈大小等的其它氨基酸置換。典型的氨基酸置換是單一殘基。氨基酸插入通常是大約1-10個氨基酸殘基的級別，缺失變化范圍為1-20個殘基。優選地，缺失或插入在相鄰的堿基對中進行，即，缺失2個殘基或插入2個殘基。
使用本領域熟知的肽合成技術，如固相肽合成(Merrifield，1964)等，或經重組DNA操作可較容易地制備上面提及的氨基酸變異體。在含已知或部分已知序列的DNA的預定位點進行置換突變的技術是熟知的，包括，例如，M13突變。用以產生表現為置換，插入或缺失變異體的變異蛋白質的DNA序列操作一般在，例如，Sambrook等(1989)中進行了描述。
本發明的F3’H的重組或合成突變體或衍生物的其它例子包括單個或多個置換，缺失和/或增加與酶相連的任意分子，如糖類、脂類和/或蛋白質或多肽。
術語“類似物”和“衍生物”也延伸到F3’H的任意的不管其是否有功能的化學等效物，還可延伸到上述任意氨基酸衍生物。如果本發明這個方面的“類似物”和“衍生物”是非功能性的，它們可作為F3’H活性的興奮劑或拮抗劑。為了方便，本文提到的“F3’H”包括提及的任何衍生物，包括其部分，突變體，片段，同源物或類似物。
本發明用來自矮牽牛屬，石竹，玫瑰，金魚草屬，擬南芥屬，菊，lisianthus，蝴蝶草屬，牽牛花和龍膽的核酸序列為例，因為它們代表了至今最常見和優選的材料來源。然而，本領域的技術人員將馬上意識到相似的序列可以從任何來源，如從其它植物或某些微生物中分離。其它植物的例子包括，但不限于玉米，煙草，矢車菊，天竺葵屬，蘋果，扶郎花屬和非洲紫羅蘭。本發明包括所有這些直接或間接編碼類黃酮途徑的酶且特別是F3’H的核酸序列，而不考慮它們的來源。
本文期望的核酸分子能以單獨的方式存在，也可與載體分子，如表達載體結合。術語載體分子以其最廣的含義使用，包括用于核酸分子的能幫助將核酸轉化入植物細胞和/或幫助整合到植物基因組中的任何中間載體。例如，中間載體可適合在電穿孔，微粒轟擊，土壤桿菌介導的轉化中使用或由DNA或RNA病毒插入。本文包含的中間載體和/或核酸分子可以或不必穩定整合入植物基因組。這樣的載體分子也可在原核細胞中復制和/或表達。優選地，載體分子或其部分能整合到植物基因組中。核酸分子可另外含有能指導核酸分子在植物細胞中表達的啟動子序列。核酸分子和啟動子也可通過如上所述的任何方式導入細胞中。
根據本發明，編碼F3’H或其衍生物或其部分的核酸分子可以任一方向導入植物來允許，許可或促進細胞質內mRNA的生產水平和/或由mRNA合成酶的水平，從而提供將DHK和/或其它合適的底物(如果在植物細胞中合成)最終轉變成花色素的花青苷衍生物，如花青素和/或甲基花青素，或選擇性地通過降低或消除內源性或現存的F3’H活性來抑制該代謝物這種轉變。細胞質中mRNA的合成和/或由mRNA合成酶在本文中稱為“表達”。花青素的合成有助于產生紅或蘭色的花色。在植物中以任一方向表達核酸分子可以是組成型的，誘導型的或發育型的，也可以是組織特異性的。
根據本發明的這一方面，提供了產生能合成F3’H或其功能性衍生物的轉基因植物的的方法，所述的方法包括在允許所述的核酸分子最終表達的條件下用含有編碼所述的F3’H的核酸序列的核酸分子穩定轉化合適植物的細胞，從該細胞再生轉基因植物并在足以允許核酸分子表達的條件下讓所述的轉基因植物生長一段時間。由此轉基因植物可以產生相對于可比較的非轉基因植物中表達的量更高水平的F3’H活性。
本發明的另一方面涉及一種用于產生減少內源性或現存F3’H活性的轉基因植物的方法，所述的方法包括用含有編碼F3’H的核苷酸序列或其互補序列的核酸分子穩定轉化合適植物的細胞，從該細胞再生轉基因植物，且如果需要，則在足以允許該核酸分子表達的條件下讓所述的轉基因植物生長。
本發明的另一方面涉及產生內源性或現存F3’H活性減小的遺傳修飾的植物的方法，上述的方法包含通過用導入植物細胞的適當改變的F3’H基因或其衍生物或部分經同源重組修飾內源性序列來改變F3’H基因并從該細胞再生遺傳修飾的植物。
根據本發明的這些方面，優選的核酸分子基本上如SEQ ID NO1，3，5，7，14，16，18，20，22，24所述，或是9的編碼區域，或具有與它們至少大約60％的相似性，或能在低度嚴格條件下與它們雜交。
在優選的實施方案中，本發明包含產生表現出改變的花色的轉基因開花植物的方法，上述的方法包含用本發明的核酸分子穩定轉化合適的植物細胞，從這些細胞再生轉基因植物并在足以允許該核酸分子表達成F3’H酶的條件下讓上述的轉基因植物生長一段時間。選擇性地，上述的方法可包括用本發明的核酸分子或其互補序列穩定轉化合適的植物的細胞，從該細胞再生轉基因植物并在足以改變內源性或現存F3’H活性水平的條件下讓上述的轉基因植物生長一段時間。優選地，改變了的水平應低于可比較的非轉基因植物中內源性或現存的F3’H活性水平。
在相關實施方案中，本發明包含產生表現了改變的花色的開花植物的方法，所述的方法包含通過用導入植物細胞的適當改變的F3’H基因或其衍生物經同源重組修飾內源性序列來改變F3’H基因并從該細胞再生遺傳修飾的植物。
本發明的核酸分子可以是或不是發育調控的。優選地，3’-羥基化的花青苷水平的調節導致花色改變，包括根據受體植物的生理條件產生紅色花或其它顏色差別。“受體植物”是指能合成F3’H酶的底物或合成F3’H酶本身，且具有所需顏色發育必需的適當生理特性和基因型的植物。它可包括但不限于矮牽牛屬，石竹，菊，玫瑰，金魚草屬，煙草，矢車菊，天竺葵屬，lisianthus，扶郎花屬，蘋果，鳶尾，百合花，非洲紫羅蘭，龍膽，蝴蝶草屬和日本牽牛花。
因此，本發明推延到產生能調節3’-羥基化的花青苷水平的轉基因植物的方法，所述的方法包括用含有編碼F3’H或其衍生物的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列的核酸分子穩定轉化合適植物的細胞或細胞團，從所述的細胞或細胞團再生轉基因植物。
本領域的技術人員會馬上知道可應用于本發明的方法的各種變化，如增加或減小靶植物中天然存在的酶活性水平使得顏色的差異不同。
因此，本發明延伸到含有全部或部分本發明的核酸元件和/或其任何同源或相關形式或它們中任何一個的反義形式的所有轉基因植物，特別是那些表現出花色改變的轉基因植物。該轉基因植物可含有導入的核酸分子，該核酸分子含有編碼F3’H的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列。一般來說，該核酸可穩定地導入植物基因組，盡管本發明還延伸到將F3’H核苷酸序列導入能在植物細胞內復制的自主復制核酸序列，如DNA或RNA病毒。本發明還延伸到從該轉基因植物獲得的種子。這類種子，特別是如果有色，則可用作植物的特有標記。
本發明的另一方面涉及F3’H的重組形式。該酶的重組形式提供了用于研究的材料來源來發展活性更大的酶，且可用于建立產生有色化合物的體外系統。
本發明還有一個方面涉及本文所述的基因序列在制造用于調節植物或植物細胞中的3’-羥基化花青苷水平的基因構建體中的用途。
本發明的另一方面提供了表現出花色改變的來自本文所述的轉基因植物的花，特別是切花。
本發明的另一方面涉及含有編碼F3’H或其衍生物的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列的核酸分子，其中所述的核酸分子能在植物細胞中表達。術語“表達(expressed)”相當于上文定義的術語“表達(expression)”。
根據本發明的這一和其它方面的核酸分子，相對于國際專利申請號PCT/AU93/00127[WO 93/20206]公開的質粒PCGP809中包含的PCGP619cDNA插入片段的效率而言允許，許可或促進更高效率地調節3’-羥基化花青苷。術語“植物細胞”包括單個的植物細胞或植物細胞團，如愈傷組織中，小植株或植株或其部分，包括花和種子。
本發明的另一方面提供了包括編碼F3’H的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列的核酸分子，其中所述的核酸分子的翻譯產物含有氨基酸序列RPPNSGA。優選地，所述的核酸分子的翻譯含有氨基酸序列RPPNSGAXHXAYNYXDL，且更優選地，所述的核酸分子的翻譯產物包含氨基酸序列RPPNSGAXHXAYNYXDL[X]nGGEK，其中X代表任意氨基酸，[X]n代表0至500位氨基酸的氨基酸序列。
本發明進一步由以下提及的非限制性的附圖和實施例進行描述。在附圖中 圖1(圖1a和1b)是P.hybrida花中類黃酮生物合成途徑的示意圖，顯示了轉化中涉及的酶和遺傳基因座。該途徑中涉及的酶表示如下PAL＝苯丙氨酸氨基裂解酶；C4H＝肉桂酸鹽-4-羥化酶；4CL＝4-香豆酸；CoA連接酶；CHS＝查耳酮合成酶；CHI＝查耳酮異構酶；F3H＝黃烷酮-3-羥化酶；F3’H＝類黃酮3’-羥化酶；F3’5’H＝類黃酮3’5’羥化酶；FLS＝黃烷醇合成酶；DFR＝二氫黃烷醇-4-還原酶；ANS＝花青苷合成酶；3GT＝UDP-葡萄糖花青苷-3-葡萄糖苷；3RT＝UDP-鼠李糖花青苷-3-葡萄糖苷鼠李糖苷轉移酶；ACT＝花青苷-3-蕓香糖苷酰基轉移酶；5GT＝UDP-葡萄糖花青苷5-葡萄糖苷轉移酶；3’OMT＝花青苷O-甲基轉移酶；3’，5’OMT＝花青苷3’，5’-O-甲基轉移酶。在該途徑中的3種類黃酮表示為P-3-G＝花葵素-3-葡萄糖苷；DHM＝二氫楊酶黃酮；DHQ＝二氫櫟皮黃酮。在P.hybrida中僅以較低水平合成類黃醇，楊酶黃酮且極少合成花青苷，花葵素。
圖2是質粒pCGP161的示意圖，該質粒含有編碼來自P.hybrida的肉桂酸-4-羥化酶的cDNA克隆(F1)。0.7kb EcoR I/XhoI片段的32P標記的片段用于探測美國國旗紅花瓣的cDNA文庫。詳情見實施例4。縮寫如下Amp＝氨芐青霉素抗性基因；ori＝復制起點；T3＝T3RNA聚合酶的識別序列；T7＝T7RNA聚合酶的識別序列。也標記了限制性酶位點。
圖3是質粒pCGP602的示意圖，pCGP602含有編碼來自P.hybrida的類黃酮3’5’羥化酶(Hf1)的cDNA克隆(617)。含Hf1編碼區的1.6kb Bsp HI/Fsp I片段的32P標記的片段用于探測國旗紅花瓣的cDNA文庫。詳情見實施例4。縮寫如下Amp＝氨芐青霉素抗性基因；ori＝復制起點；T3＝T3RNA聚合酶的識別序列；T7＝T7RNA聚合酶的識別序列。還標記了限制性酶位點。
圖4是質粒pCGP175的示意圖，pCGP175含有編碼來自P.hybrida的類黃酮3’5’羥化酶(Hf2)的cDNA克隆(H2)。一起含有Hf2編碼區的1.3kb EcoRI/Xho I和0.5kb Xho I片段的32P標記的片段用于探測美國國旗紅花瓣cDNA文庫。詳情見實施例4。縮寫如下Amp＝氨芐青霉素抗性基因；ori＝復制起點；T3＝T3RNA聚合酶的識別序列；T7＝T7RNA聚合酶的識別序列。還標記了限制性酶位點。
圖5是質粒pCGP619的示意圖，pCGP619含有編碼來自P.hybrida的細胞色素P450的651cDNA克隆。1.8kb EcoR I/Xho I片段的32P標記的片段用于探測美國國旗紅花瓣的cDNA文庫。詳情見實施例4。縮寫如下Amp＝氨芐青霉素抗性基因；ori＝復制起點；T3＝T3RNA聚合酶的識別序列；T7＝T7 RNA聚合酶的識別序列。還標記了限制性酶位點。
圖6表示用pCGP1805中包含的OGR-38cDNA克隆的32P標記的片段探測的RNA印跡的放射自顯影照片(見實施例6)。各泳道含有20μg從V23(ht1/ht1)×VR(Ht1/ht1)回交群體植物的花或葉分離的總RNA樣品。在含高水平櫟皮黃酮(Q+)的VR類(Ht1/ht1)花中檢測到1.8kb的轉錄物(泳道9-14)。在含少量或不含櫟皮黃酮(Q-)的V23類(ht1/ht1)花中檢測到水平低得多的相同大小的轉錄物(泳道3-8)。在VR葉(泳道1)和V23花瓣(泳道2)中也檢測到了減少的轉錄物水平。這在實施例5中描述。
圖7是酵母表達質粒pCGP1646的示意圖(見實施例7)。來自pCGP1805的OGR-38cDNA插入片段以“有義”的方向克隆到表達載體pYE22m中的酵母甘油醛-3-磷酸脫氯酶啟動子(PGAP)后。TRP1＝Trp1基因，IR1＝2μm質粒的反應重復，TGAP＝來自酵母甘油醛-3-磷酸脫氫的基因的終止子序列。還標記了限制性酶位點。
圖8是雙元質粒pCGP1867的示意圖(實施例8中所述)。pCGP1805的Ht1 cDNA插入片段(OGR-38)以“有義”的方向克隆到表達載體pCGP293的Mac啟動子后。縮寫如下LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區；npt II＝新霉素磷酸轉移酶II基因；tml 3’＝來自土壤桿菌屬tml基因的終止子區；mas 3’＝來自土壤桿菌屬的甘露堿合成酶基因的終止子區域。ori pRi＝來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；ori Col E1＝來自Colcinin E1質粒的高拷貝復制起點。還標記了限制性酶位點。
圖9是雙元質粒pCGP1810的示意圖，它的構建在實施例13中描述。來自pCGP1807的KC-1cDNA插入片段(見實施例12)以“有義”的取向克隆到表達載體p CGP293的Mac啟動子后。縮寫如下LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區；nptII＝新霉素磷酸轉移酶II基因；tml 3’＝來自土壤桿菌屬tml基因的終止子區域；mas 3’＝來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區域；ori pRi＝來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；ori Col E1＝來自Colcinin E1質粒的高拷貝復制起點。還標記了限制性酶位點。
圖10是雙元質粒pCGP1813的示意圖，其構建在實施例14中描述。來自pCGP1807的KC-1cDNA插入片段(見實施例12)以“有義”方向克隆到mac啟動子和mas終止子之間。MacKC-1mas表達元件隨后克隆到雙元載體pWTT2132中。縮寫如下Tet＝四環素抗性基因；LB＝左側邊界；RB＝右側邊界，sur B＝來自乙酰乳酸合成酶基因的編碼區和終止子序列；35S＝來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區，mas 3’＝來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區；PVS1＝來自綠膿假單胞菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點，pACYCori＝來自大腸桿菌pACYC184的修飾的復制子。還標記了限制性酶位點。
圖11表示用Am 3Ga差異顯示PCR片段的32P標記的片段探測的Southern印跡的放射自顯影照片(如實施例16所述)。各泳道含10μg從N8(Eos+)，K16(eos-)或K16×N8F2群體的植物中分離的EcoRV消化的基因組DNA樣品。在來自產花青素的植物(表示為“+”)的基因組DNA中檢測到雜交帶(泳道1，3，4，5，6，7，9，10，12和15)。在來自不生產花青素的植物(用“-”表示)的基因組DNA樣品中沒有觀察到特異性雜交(泳道2，8，11，13和14)。
圖12表示用Am3Ga差異顯示PCR片段的32P標記的片段探測的RNA印跡的放射自顯影照片。各泳道含10μg從N8(Eos+)×K16(eos-)F2群體植物的花或葉分離的總RNA樣品。在產生化青素的K16×N8F2花(花青素+)(植物#1，#3，#4，#5和#8)中檢測到1.8Kb的轉錄物。在不產生花青素的K16×N8F2花(花青素-)(植物#6，#11，#12)中或在花中產生花青素的K16×N8F2植物的葉樣品(#13L)中沒有檢測到轉錄物。詳情在實施例17中提供。
圖13是雙元質粒pCGP250的示意圖，其構建在實施例20中描述。含來自pCGP246的1至1711位核苷酸(SEQ ID NO5)的sd F3’HcDNA插入片段(見實施例18)以“有義”方向克隆到表達載體pCGP293的Mac啟動子后。縮寫如下LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區；npt II＝新霉素磷酸轉移酶II基因；tml 3’＝來自土壤桿菌屬tml基因的終止子區；mas 3’＝來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區；ori pRi＝來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；oriCol E1＝來自Colcinin E1質粒的高拷貝的復制起。還標記了限制性酶位點。
圖14是雙元質粒pCGP231的示意圖，其構建在實施例20中描述。含來自pCGP246的104至1711位核苷酸(SEQ ID NO5)的sd F3’HcDNA插入片段以“有義”方向克隆到表達載體pCGP293的Mac啟動子后。縮寫如下LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來自花椰菜葉病毒35S基因的啟動子區；nptII＝新霉素磷酸轉移酶II基因；tml 3’＝來自土壤桿菌屬tml基因的終止子區；mas 3’＝來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區域；ori pRi＝來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；ori Col E1＝來自colcinin E1質粒的高拷貝復制起點。還標記了限制性酶位點。
圖15是雙元質粒pBI-Tt 7-2的示意圖。將來自E-5的6.5kb EcoRI/Sal I Tt7基因組片段克隆到EcoRI/Sal I切割的pBI101中，代替原有的GUS基因。所示的Tt7(F3’H)基因的方向(5’至3’)通過DNA測序確定。縮寫如下LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；nos 5’＝來自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的啟動子區；npt II＝新霉素磷酸轉移酶II基因的編碼區；nos 3’＝來自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的終止子區域；npt I＝新霉素磷酸轉移酶I基因的編碼區。還標記了限制性酶位點。
圖16是雙元質粒pCGP2166的示意圖，其構建在實施例26中描述。來自pCGP2158的玫瑰#34cDNA插入片段(見實施例25)以“有義”方向克隆到pCGP293表達載體的Mac啟動子后。縮寫如下LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區；npt II＝新霉素磷酸轉移酶II基因；tml 3’＝來自土壤桿菌屬tml基因的終止子區域；mas 3’＝來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區；ori pBi＝來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；ori Col E1＝來自Colcinin E1質粒的高拷貝復制起點。還標記了限制性酶位點。
圖17是雙元質粒pCGP2169的示意圖，其構建在實施例27中描述。來自pCGP2158的玫瑰#34cDNA插入片段以“有義”方向克隆到CaMV35S啟動子和ocs終止子之間。隨后將35S玫瑰#34ocs表達元件克隆到雙元載體pWTT2132中。縮寫如下Tet＝四環素抗性基因；LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；sur B＝來自乙酰乳酸合成酶基因的主體區域和終止子區域；35S＝來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區域，OSS＝來自土壤桿菌屬章魚堿合成酶基因的終止子區域；pVS1＝來自綠膿假單胞菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點，pACY Cori＝來自大腸桿菌的pACYC184的修飾的復制子。還標記了限制性酶位點。
圖18是雙元質粒pLN85的示意圖，其構建在實施例28中描述。來自pCHRM1的菊RM6i cDNA插入片段以“反義”方向克隆到花椰菜花葉病毒35S基因啟動子(35S)之后。其它縮寫如下LB＝左側邊界；RB＝右側邊界；ocs3’＝來自土壤桿菌屬章魚堿合成酶基因的終止子區域；pnosnptIInos 3’＝含來自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的啟動子區表達元件；新霉素磷酸轉移酶II基因的編碼區和來自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的終止子區；ori T＝復制轉移起點；trf A＊＝順式作用復制功能；ori Col E1＝來自Colcinin E1質粒的高拷貝復制起點；Tn 7SpR/StR＝來自轉座子Tn7的壯觀霉素和鏈霉素抗性基因；ori VRK2＝質粒RK2的廣譜宿主范圍的復制起點。還標記了限制性酶位點。
圖19是酵母表達質粒pYTHT6的示意圖，其構建在實施例30中描述。來自pTHT6的THT6cDNA插入片段以“有義”方向克隆到表達載體pYE22m的酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(PGAP)后。縮寫如下TRP1＝Trp1基因；IR1＝2μm質粒的反向重復；TGAP＝來自酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的終止子序列。還標記了限制性酶位點。
本說明書中使用的氨基酸縮寫在下面表2中顯示。
表2 氨基酸縮寫符號 氨基酸3字母符號單字母符號 L-丙氨酸AlaA L-精氨酸ArgR L-天冬酰胺 AsnN L-天冬氨酸 AspD L-半胱氨酸 CysC L-谷氨酰胺 GlnQ L-谷氨酸GluE L-甘氨酸GlyG L-組氨酸HisH L-異亮氨酸 IleI L-亮氨酸LeuL L-賴氨酸LysK L-甲硫氨酸 MetM L-苯丙氨酸 PheF L-脯氨酸ProP L-絲氨酸SerS L-蘇氨酸ThrT L-色氨酸TrpW L-酪氨酸TyrY L-纈氨酸ValV 表3提供了本文提及的序列指定的SEQ ID NO的總結 表3 序列 物種SEQ ID NO pCGP 1805的cDNA插入片段矮牽牛屬SEQ ID NO1 相應的氨基酸序列 矮牽牛屬SEQ ID NO2 pCGP246的cDNA插入片段 石竹SEQ ID NO3 相應的氨基酸序列 石竹SEQ ID NO4 pCGP246的cDNA插入片段金魚草屬SEQ ID NO5 相應的氨基酸序列 金魚草屬SEQ ID NO6 cDNA部分序列 擬南芥屬SEQ ID NO7 相應的氨基酸序列 擬南芥屬SEQ ID NO8 基因組序列 擬南芥屬SEQ ID NO9 外顯子I的相應的氨基酸序列擬南芥屬SEQ ID NO10 外顯子II的相應氨基酸序列 擬南芥屬SEQ ID NO11 外顯子III的相應氨基酸序列擬南芥屬SEQ ID NO12 外顯子IV的相應氨基酸序列 擬南芥屬SEQ ID NO13 pCGP2158的cDNA插入片段 玫瑰SEQ ID NO14 相應的氨基酸序列 玫瑰SEQ ID NO15 pCHRM1的cDNA插入片段 菊 SEQ ID NO16 相應的氨基酸序列 菊 SEQ ID NO17 THT cDNA序列 蝴蝶草屬SEQ ID NO18 相應的氨基酸序列 蝴蝶草屬SEQ ID NO19 MHT 85cDNA序列 日本牽牛花 SEQ ID NO20 相應的氨基酸序列 日本牽牛花 SEQ ID NO21 GHT13cDNA序列龍膽SEQ ID NO22 相應的氨基酸序列 龍膽SEQ ID NO23 pL3-6的cDNA插入片段 Lisianthus SEQ ID NO24 相應的氨基酸序列 Lisianthus SEQ ID NO25 出自WO 93/20206的cDNA序列矮牽牛屬SEQ ID NO26 寡核苷酸poly T-anch ASEQ IDNO27 寡核苷酸poly T-anch CSEQ ID NO28 寡核苷酸ploy T-anch GSEQ ID NO29 保守的氨基酸引物區 SEQ ID NO30 相應的寡核苷酸序列 SEQ ID NO31 保守的氨基酸引物區 SEQ ID NO32 相應的寡核苷酸序列 SEQ ID NO33 寡核苷酸引物Pet Haem-New SEQ ID NO34 保守的氨基酸引物區 SEQ ID NO35 相應的寡核苷酸序列 SEQ ID NO36 寡核苷酸Snapred Race A SEQ ID NO37 寡核苷酸Snapred Race C SEQ ID NO38 寡核苷酸poly-C RaceSEQ ID NO39 寡核苷酸引物Pet Haem SEQ ID NO40 分別含質粒pCGP 1867，pCGP1810和pCGP231的無毒的微生物根癌土壤桿菌菌株AGL0(Agrobacterium tumefaciens AGL0)于1996年2月23日保存于澳大利亞政府分析實驗室，1 suakin Street，Pymble，New South Wales，2037，澳大利亞，且指定的保藏號分別為96/10967，96/10968和96/10969。
分離類黃酮3’-羥化酶和相關的核酸序列 實施例1植物材料 矮牽牛屬 所用的Petunia hybrida品種在表4中提供。
表4 植物在光強度10,000lux，白晝長度14小時，溫度22℃至26℃的特定生長室中生長。
石竹屬 麝香石竹變種Kortina Chanel的花從Van Wyk和Son FlowerSupply，Victoria獲得。
麝香石竹花在如下限定的發育階段收獲 階段1封閉的花蕾，花瓣不可見。
階段2花蕾張開花瓣尖端可見。
階段3幾乎全部花瓣尖端暴露。“畫筆階段”。
階段4外側花瓣與莖成45角。
階段5花完全張開。
金魚草屬 使用的金魚草株系來自親本株系K16(eos-)和N8(Eos+)。F3’H活性與Eos基因之間有嚴格相關性，已知Eos基因控制黃烷酮，黃烷醇和花青苷的3’羥基化(Forkmann和Stotz，1981)。K16是缺乏F3’H活性的純合隱性突變體，而N8是F3’H活性的野生型。這些品系相似，但不同源。親本株系和來自自交(K16×N8)F1植物的種子從Dr.C.Martin(John Innes Centre，Norwich，UK)處獲得。
擬南芥屬 擬南芥株系Columbia(Tt7)，Landsberg eracta(Tt7)和NW88(tt7)從諾丁漢擬南芥貯存中心(Nottingham ArabidopsisStock Centre)獲得。野生型擬南芥(Tt7)種子具有特征性的棕色。tt7突變體的種子具有淡棕色的種子，其植株的特征在于葉中花青苷含量減小(Koornneef等，1982)。Tt7植物合成花青素，而tt7突變體中積累花葵素，表明Tt7基因控制類黃酮3’-羥基化。
玫瑰 Rosa hybrida變種Kardinal的花從Van Wyk和Son Flower Supply，Victoria獲得。
Rosa hybrida花發育階段限定如下 階段1未沉積色素，緊密關閉的花蕾(10-12mm高；5mm寬)。
階段2沉積有色素，緊密關閉的花蕾(15mm高；9mm寬)。
階段3沉積有色素，關閉的花蕾；萼片剛開始打開(20-25mm高；13-15mm寬) 階段4花蕾開始張開；花瓣著色較重；萼片分離(花蕾25-30mm高且18mm寬)。
階段5萼片完全展開；其中一些卷曲。花瓣著色較重且展開(花蕾30-33mm高且20mm寬)。
菊 菊花發育階段限定如下 階段0未見花蕾。
階段1花蕾可見小花完全被苞片覆蓋。
階段2花蕾張開小花頂端可見。
階段3小花緊緊地重疊。
階段4幾乎所有小花頂端暴露；外側小花開放但不水平。
階段5外側小花水平。
階段6花達到成熟。
實施例2細菌菌株 使用的大腸桿菌菌株是 DH5α supE44，Δ(lacZYA-ArgF)U169，

80lacZΔM15，hsdR17(rk-，mk+)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，deoR(Hanahan，1983和BRL，1986). XL1-Blue MRF′Δ(mcr A)183，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173，endA1，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，lac[F′proAB，lacIqZΔM15，Tn10(Tetr]c(Stratagene) XL1-Blue supE44，hsdR17(rk-，mk+)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，lac[F′proAB，lacIq，lacZΔM15，Tn10(tetr)] SOLR e14-(mcrA)，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171，sbcC，recB，recJ，umuC::Tn5(kanr)，uvrC，lac，gyrA96，thi-1，relA1，[F′proAB，lacIqZΔM15]，Su-非抑制性的(Stratagene) DH10B(Zip)F-mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，

80d lacZΔM15，ΔlacX74，deoR，recA1，araD139，Δ(ara，leu)7697，galU，galK1λ，rspL，nupG Y1090r- ΔlacU169，(Δlon)？，araD139，strA，supF，mcrA，trpC22::Tn10(Tetr)[pMC9 Ampr，Tetr]，mcrB，hsdR 喪失毒性的根癌土壤桿菌菌株AGL0(Lazo等，1991)從R.Ludwig處(加利福利亞大學，生物學系，Santa Cruz，USA)獲得。
克隆載體pBluescript從Stratagene公司獲得。
根據Inoue等(1990)所述的方法進行大腸桿菌菌株DH5α細胞的轉化。
實施例3一般方法 DNA探針的32P標記 使用寡聚核苷酸標記試劑盒(Bresatec)用50μci[α-32P]-dCTP放射性標記DNA片段(50-100ng)。未摻入的[α-32P]-dCTP通過用Sephadex G-50(Fine)柱層析去除。
DNA序列分析 使用來自應用生物系統的PRISMTM Ready反應染色引物循環測序試劑盒進行DNA測序。按照廠商提供的方法進行。使用Perkin ElmerPCR儀(GeneAmp PCR System 9600)進行循環測序反應并在自動373A DNA測序儀(應用生物系統)上走膠。
使用FASTA和TFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)或BLAST程序(Altschul等，1990)進行與Genbank，SWISS-PROT和EMBL數據庫的同源性研究。使用LFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)獲得序列的相似百分數。除非另有說明，在所有情況下核苷酸序列比較使用的缺口值(ktup)為6，氨基酸序列比較使用的缺口值(ktup)為2。
使用在MacVectorTM 6.0(Oxford Molecular Ltd.)中應用的Clustal W程序進行多個序列排列(缺口值為2)。
實施例4從P.hybrida變種國旗紅中分離對應于Ht1基因座的類黃酮3’-羥化酶(F3’H)的cDNA克隆 為了分離連鎖到Ht1基因座且編碼矮牽牛屬類黃酮途徑中的類黃酮3’-羥化酶(F3’H)的cDNA克隆，從階段1至3的矮牽牛屬國旗紅(OGR)花中分離RNA并制備花瓣的cDNA文庫。OGR花含以花青素為基礎的色素且有高水平的類黃酮3’-羥化酶活性。用從已知在類黃酮途徑中包含的3種細胞色素P450cDNA克隆和在酵母中具有類黃酮3’-羥化酶活性的一種細胞色素P450cDNA克隆(651)分離的32P標記片段的混合物篩選OGR cDNA文庫。這些包括一個編碼肉桂酸-4-羥化酶(C4H)的矮牽牛屬cDNA克隆和2個編碼類黃酮3’，5’-羥化酶(F3’5’H)(Holton等，1993)的矮牽牛屬cDNA克隆(由Hf1和Hf2基因座編碼)。
矮牽牛屬變種OGR cDNA文庫的構建 使用Turpen和Griffith(1986)的方法從P.hybrida變種OGR階段1至3的花的花瓣組織分離總RNA。使用oligotex-dTTM(Qiagen)從總RNA篩選Poly(A)+RNA。
用5μg從OGR的1至3階段分離的poly(A)+RNA作模板，使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆試劑盒(stratagene)在λZAP中構建定向花瓣cDNA文庫。獲得的重組子總數為2.46×106。
轉染XL1-Blue MRF’細胞后，包裝的cDNA混合物以每15cm直徑平板50,000pfu涂板。平板在37℃培養8小時，噬菌體在100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl pH8.0，0.01％(W/V)明膠[噬菌體貯存緩沖液(PSB)]中洗脫(Sambrook等，1989)。加入氯仿，并在4℃貯存作為擴增文庫的噬菌體。
轉染XL1-Blue MRF’細胞后，100,000pfu的擴增文庫以每15cm平板10,000pfu的密度在NZY平板上鋪板(Sambrook等，1989)，并在37℃培養8小時。在4℃放置過夜后，取一式二份轉移到Colony/PlaqueScreenTM濾膜(DuPont)上并按廠商建議進行處理。
探針的分離 F3’5’H探針 按Holton等(1993)和美國專利號5,349,125所述分離的對應于Hf1或Hf2基因座的2個類黃酮3’，5’羥化酶在篩選方法中應用。來自矮牽牛屬的C4H cDNA克隆 在用于分離對應于Hf1或Hf2基因座的2個類黃酮3’，5’-羥化酶cDNA克隆的篩選方法中(Holton等，1993；美國專利號5,349,125)分離了許多細胞色素P450cDNA克隆。這些cDNA克隆中一個(F1)(包含于pCGP 161中)(圖2)根據與以前鑒定的來自綠豆的C4H克隆的序列相同性鑒定為編碼肉桂酸4-羥化酶(C4H)(Mizutani等，1993)。序列數據從矮牽牛屬F1cDNA克隆5’端的295個核苷酸產生。在測序的295個核苷酸中與綠豆C4H克隆有83.1％的相似性且在推測的氫基酸序列中有93.9％的相似性。
651cDNA克隆 包含于pCGP619(圖5)中的651cDNA克隆的分離與鑒定在
發明者F·布魯里拉, T·A·霍爾頓, M·Z·米查爾 申請人:國際花卉開發有限公司