自身活化淋巴細胞培養方法

專利名稱：自身活化淋巴細胞培養方法
技術領域：
本發明涉及一種用于惡性腫瘤治療的自身活化淋巴細胞培養方
法，更具體地說，本發明涉及，在白細胞介素2 (IL-2)和抗CD3、 抗CD16、以及抗CD56抗體存在的條件下，培養從人外周血中分離 出的淋巴細胞，增加NK細胞在淋巴細胞中所占的比例，均勻活化 NK細胞、T細胞以及NKT細胞，有效地去除多種多樣癌細胞的培養 方法。
背景技術：
發生于人體的惡性腫瘤的治療方法一般有手術、放射治療以及 化學療法。但是，惡性腫瘤中也可能存在位于難以用這些方法治療的 解剖部位的腫瘤，在這種情況下，必須采用有力的輔助療法，以改善 患者的預后。
在輔助療法中，自身活化免疫細胞的過繼免疫療法(adaptive immunotherapy)是一種將從患者的血液中分離而獲得自然殺傷細胞 (natural killer cell; NK細胞)、樹突狀細胞(De) 、 B細胞、T細 胞等在治癌過程中最重要的免疫細胞，利用多種刺激劑，擴增出具有 高度抗腫瘤活性的免疫細胞，并回輸患者體內的方法，該方法由于使 用患者自己的血液，與傳統的化學療法等治療方法相比副作用少、給 藥簡便，因此，最近被廣泛研究。
韓國專利第0735081號(發明名稱活化CD4 T細胞的方法) 公開了在傳統過繼免疫療法中所用的免疫細胞活化方法。根據上述的 活化CD4 T細胞的方法，從血液等生物試樣分離CD4 T細胞之后， 在含有GM-CSF、 IFN-gamma、 TNF-alpha、 Lectin以及IL-4等細胞 因子的培養基中進行培養，并在試管中活化CD4 T細胞，從而獲得 預防或治療細菌感染的組合物。但是，上述活化CD4 T細胞的方法具有以下技術問題；因為該 方法只能選擇性地激活免疫細胞中參與獲得免疫的T細胞，所以當 使用該方法治療腫瘤時，雖然通過大量被激活的T細胞可以有效地
攻擊或殺傷已被記憶的癌細胞，但是在攻擊未被記憶的各種癌細胞而 治療惡性腫瘤方面，受到了限制。

發明內容
本發明的目的是解決上述現有技術中存在的問題。即，本發明
目的是提供在白細胞介素2(IL-2)和抗CD3、抗CD16、以及抗CD56
抗體存在的條件下，培養從人外周血中分離出的淋巴細胞，增加NK 細胞在淋巴細胞中所占的比例，均勻活化NK細胞、T細胞以及NKT (Natural Killer T)細胞，有效地去除多種多樣的癌細胞的培養方法。
作為為了達到上述目的的技術思想的本發明提供自身活化淋巴 細胞的培養方法，其特征在于，該方法包括從人外周血中分離淋巴 細胞的步驟；在含有白細胞介素2 (IL-2) 、 L-谷氨酰胺(L-glutamin) 以及來源于自身的血漿的培養液中，在抗CD3、抗CD16、以及抗 CD56抗體存在的條件下，培養上述分離出的淋巴細胞的第一培養步 驟；將上述第一培養步驟中所培養完成的培養混合液與含有IL-2、 L-谷氨酰胺以及來源于自身的血漿的培養液混合，在抗CD3、抗 CD16、以及抗CD56抗體存在的條件下進行培養的第二培養步驟。
根據本發明的自身活化淋巴細胞的培養方法，可以大量激活對 不表達MHC (Major Histocompatibility Complex)的大部分癌細胞具 有較強殺傷活性的NK細胞，適用于副作用少、給藥簡便的過繼免疫 療法，為此，具有極大地改善因惡性腫瘤而受痛苦的癌患者的預后的 效果。


圖1為表示根據本發明的培養方法而獲得的活化淋巴細胞表型 變化的示意圖。
圖2為表示根據本發明的培養過程中的免疫細胞數變化的示意圖。
圖3為表示對根據本發明而獲得的活化淋巴細胞進行細胞毒性 分析的結果的示意圖。
圖4為將根據本發明而獲得的活化淋巴細胞適用在老鼠模型中， 并觀察其抗癌效果的照片。
具體實施例方式
本發明是在培養來源于人外周血的淋巴細胞時，添加白細胞介
素2 (IL-2)和抗CD3 (anti-CD3)、抗CD16 (anti-CD16)以及抗 CD56 (anti-CD56)抗體，均勻活化并培養NK細胞、NKT細胞以及 T細胞等免疫細胞，擴增出具有高度抗惡性腫瘤活性的自身活化淋巴 細胞的方法。在詳細說明本發明之前，先探討各種免疫細胞的特征以 及在免疫細胞的擴增以及活化中所使用的上述各種添加物的作用機 制.。
NK細胞是淋巴細胞中的一類細胞，是具有特征性形態的大顆粒 淋巴細胞(LGL， Large granular lymphocytes) 。 NK細胞可以殺傷病 毒感染細胞和腫瘤細胞，但對大部分的正常細胞無殺傷作用。這種 NK細胞在IL-2、 IL-12、干擾素(interferon)等細胞因子的存在下， 能提高細胞溶解(cytolytic)、分泌(secretory)以及增值(proliferative) 等功能，其抗腫瘤效果是由細胞壞死(necrosis)或細胞凋亡 (ap叩tosis)或這兩種作用機制同時發生而產生。人的NK細胞的表 型(phenotype)為CD16 (FcrRIII)與CD56，其細胞表面無TRC (T 細胞受體復合體，T-cell receptor complex)，為此CD16與CD56作 為NK細胞的標志。
眾所周知，這種NK細胞在初期機體防御機構和人體的腫瘤免 疫中起重要的作用。即，NK細胞是一種MHC非限制性殺傷細胞， 即使無致敏(sensitization)過程、也就是說，無由MHC表達而獲得 的免疫過程，也可以殺傷特異性自身細胞、同種細胞以及異種癌細胞， 特別是優先殺傷很少表達或不表達Class 1 MHC的耙細胞。為此， NK細胞不僅可以有效的殺傷不表達MHC的大部分癌細胞，還可以殺傷某些病毒感染細胞和如傷寒沙門菌(salmonella typhi)等細菌。
一般認為NK細胞對癌細胞的作用機制是抗體依賴性細胞介導 的細胞毒性(Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity; ADCC)， 其詳細內容如以下所述。NK細胞表達免疫球蛋白G (IgG)的Fc受 體CD16，通過此受體可以進行MHC非限制性殺傷。即，NK細胞的 ADCC依賴于識別靶細胞的抗體，當抗體和抗原相結合時會暴露其抗 體的Fc區，并且，該暴露出的Fc區與NK細胞上的Fc受體結合形 成一個橋， 一旦此橋形成，根據受體接合時發生的信號傳遞，NK細 胞就產生細胞損傷物質，引起靶細胞的損傷。
但是，這種具有高度殺傷癌細胞功能的NK細胞只占正常外周 血淋巴細胞的5% 15%，特別是在癌患者的情況下，該比例下降到 不足1%，從而導致NK細胞數量不足而不能有效玫擊癌細胞。
若在抗CD16抗體或抗原抗體復合體的存在下，培養淋巴細胞， 則CD16抗原被添加到NK細胞中而引起信號傳遞，NK細胞受到它 們的刺激之后，表達IL-2受體的a鏈等轉鐵蛋白(transferrin)受體 或產生腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor; tnf)或干擾素-y( IFN-7)。
CD56抗原(Leul9/NKH1)是一種分子量為180 200kDa的糖 蛋白，表達于所有NK細胞以及某些T細胞。CD56抗原與廣泛分布 在人體神經組織中的NCAM-1 (神經細胞黏附分子-l， Neural Cell Adhesion Molecule-1)是同一種分子。眾所周知，NCAM-1是一種在 神經和肌組織中參與細胞之間黏附的分子。由此推測，在NK細胞中 表達的CD56也可以起到細胞之間黏附作用。
另一方面，T細胞是指細胞表面具有抗原受體(T cell antigen receptor; TCR)的細胞。TCR與a鏈和卩鏈的二聚體CD3抗原形成 異二聚體。 一部分T細胞(外周血T細胞的5%左右)是由Y鏈和5 鏈的二聚體形成，而不是ap鏈。TCR與CD3抗原(Y、 5、 ￡、；、； 或il)形成復合體，若TCR識別抗原，則CD3抗原向細胞內傳遞其 信號。
一般地，促進癌細胞免疫反應的輔助性T細胞分泌多種細胞因 子，并活化殺傷T細胞、B細胞以及巨噬細胞等。細胞因子的種類繁多，如細胞和細胞之間的信息傳遞物質即白細胞介素1、 2、 3， TNF-a 以及干擾素-y等。根據本發明，在培養液中添加IL-2，活化殺傷T 細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫細胞。
IL-2是當T細胞識別抗原而被活化時產生的、分子量為14 17kDa的糖蛋白(glycoprotein) 。 IL-2被分泌到T細胞外之后，與 產生IL-2的T細胞自身進行反應，促進該T細胞的增殖。IL-2還可 以促進NK細胞的增殖并增強NK細胞的殺傷活性，亦可促進B細胞 的增殖。
NKT細胞是固有免疫的成員，是T細胞的一種，其功能近年來 逐漸被闡明。從名稱可知，它表達T細胞的受體和NK細胞的特異性 細胞表面標志(surface marker) 。 NKT細胞的一種驚人的特征是， 它被潔化之后，能在短時間內分泌IL-4、 IL-IO、 IL-13、 IFN-y、 TNF-a
等多種細胞因子。這種特征暗示著NKT細胞對適應性免疫應答產生 重大影響。
因此，在本發明中，為了均勻活化從人外周血分離出的NK細 胞、T細胞以及NKT細胞，培養時使用了 IL-2和抗CD3、抗CD16 以及抗CD-56單克隆抗體。IL-2對T細胞和NK細胞的增殖起作用； 各單克隆抗體使免疫細胞表達CD3、 CD16、以及CD56而起到抗原 的功能。
以下，具體地說明本發明中的自身活化淋巴細胞培養方法。 本發明中的自身活化淋巴細胞培養方法大體由分離淋巴細胞的 步驟、第一培養步驟、第二培養步驟以及第三培養步驟構成。
分離淋巴細胞的步驟
人淋巴細胞或單核球等單核細胞的比重低于1.077，利用這一特 性，將治療對象患者的血液與比重為1.077的Ficoll-Paque Plus溶液 (淋巴細胞分離液)相混合，并以一定的離心力進行離心，使之沉淀。 根據比重的差異，比重大于1.0777的紅細胞和顆粒細胞沉淀于底層， 比重小于1.0777的單核細胞層和血小板等離心后懸浮于上層液中， 由此獲得包含淋巴細胞的單核細胞層，并從該單核細胞層單離出淋巴 細胞。第一培養步驟
將通過上述分離淋巴細胞的步驟而獲得的淋巴細胞，在添加有
IL-2、 L-谷氨酰胺(L-glutamine)和來源于自身的血漿(plasma)的 培養液中，在抗CD3、抗CD16以及抗CD56的存在下，培養3 4 天。在這些過程中，優選先在添加有IL-2、 L-谷氨酰胺和來源于自身 的血漿的培養液中、在抗CD3存在的條件下，進行培養，然后在分 別存在抗CD16以及抗CD56的環境下，依次進行培養，其具體過程 如下。
首先，將獲得的淋巴細胞混懸在3ml的培養液之后，加入到75 cn^的固相包被抗CD3的培養板中，該培養板中添加有50 100ul含 有17X 106 19X 106 IU(International Unit)/ml的IL-2稀釋液、100 250ul L-谷氨酰胺以及2 4ml來源于自身的血漿以及25 33ml培養 液，然后在37'C的C02培養箱中培養12 18小時。如上所述，首先 將淋巴細胞混懸在少量培養液中，并在添加有IL-2、 L-谷氨酰胺以及 來源于自身的血漿的培養液中培養，這不僅可以減少淋巴細胞的損 失，也可以防止添加量很少的IL-2、 L-谷氨酰胺以及來源于自身的血 漿的損失。
然后，將固相包被抗CD3的培養板中的培養混合液移到75 cm2 固相包被抗CD56的培養板中，置于37"的C02培養箱中，培養12 18小時。接著，再將固相包被抗CD56的培養板中的培養混合液移 到75 cn^固相包被抗CD16的培養板中，置于37'C的C02培養箱中， 培養48 60小時。
第二培養步驟
將在上述第一培養步驟中培養完成的培養混合液加入到添加有 IL-2、 L-谷氨酰胺以及來源于自身的血槳的培養液中，在抗CD3、抗 CD16以及抗CD56存在的條件下，繼續培養2 3天。
第二培養步驟也是像前述的第一培養步驟一樣，將經過第一培 養步驟的培養混合液首先在添加有IL-2、L-谷氨酰胺以及來源于自身 的血漿的培養液中、在抗CD3存在的條件下培養，然后在抗CD16 以及抗CD56分別存在的條件下依次培養，該具體過程如下。首先，將上述第一培養步驟中培養完成的培養混合液加入到225 cm2的固相包被抗CD3的培養板中，該培養板中添加有50 200ul 含有17X 106 19X 106 IU(International Unit)/ml的IL-2稀釋液、l 1.5ml L-谷氨酰胺、5 10ml來源于自身的血漿以及50 67ml培養液， 然后在37'C的C02培養箱中培養8 12小時。
然后，將固相包被抗CD3的培養板中的培養混合液移到225 cm2 固相包被抗CD56的培養板中，置于37"C的C02培養箱中，培養8 12小時。接著，再將固相包被抗CD56的培養板中的培養混合液移 到75cr^固相包被抗CD16的培養板中，置于37°C的C02培養箱中， 培養24 56小時。
在上述第一和第二培養步驟中所用的培養液可以使用含有氨基 酸、維生素、有機化合物和無機化合物以及蛋白質等細胞生長和生存 所必需的.營養成分的多種培養液，優選使用含有800 1200 IU/ml IL-2的培養液。而且，在第一和第二培養步驟中，使用固相包被抗 CD3、抗CD16、抗CD56等單克隆抗體的培養板，在這些各單克隆 抗體的存在下進行培養過程，由此可以調節在最終培養物中使NK細 胞(CD56, CD16) 、 NKT細胞(CD56， CD16)以及T細胞(CD3) 均勻地分布。
第三培養步驟
向上述經過第二培養步驟的培養混合液(86 119ml)中添加來 源于自身的血漿(5 10ml)，把這些新添加了來源于自身的血漿的 培養混合液注入到含有1L培養液的透氣性培養袋中，繼續培養7 9天，使細胞大量增殖。
在第三培養步驟中所用的培養液如前兩個步驟一樣，可以使用 含有氨基酸、維生素、有機化合物和無機化合物以及蛋白質等細胞生 長和生存所必需的營養成分的多種培養液，優選使用含有100 200 IU/ml IL-2的培養液。
經過如上所述的第一、第二和第三培養步驟，NK細胞、T細胞 以及NKT細胞的數量大量增加，而且各細胞的大小也增大。實際培 養實驗的結果表明，從60cc血液中分離淋巴細胞時的總細胞數為2.0X 106 4.0X 107，但是最后增加到2.0X 109 1.0X 1010。
以下，通過具體的實施例進一步詳細說明本發明。但是，下述 實施例僅用于例示本發明，本發明的范圍不受這些實施例的限定。
實施例1:自身活化淋巴細胞的制備
將從患者的60cc外周血中獲得的淋巴細胞混懸在3ml的培養液 之后，混合在添加有70ulIL-2、 200ulL-谷氨酰胺以及3ml來源于自 身的血漿的33ml培養液中，在抗CD3、抗CD16以及抗CD56存在 的條件下，培養4天(第一培養步驟)，然后，混合在添加有100ul IL-2、 lmlL-谷氨酰胺以及7ml來源于自身的血漿的60ml培養液中， 繼續培養3天(第二培養步驟)，接著向經過第二培養步驟的培養混 合液中添加7ml來源于自身的血漿，并注入到含有1L培養液的透氣 性培養袋中，再培養7天(第三培養步驟)。
實施例2:觀察培養前后的表型以及細胞數的變化
圖1為培養前后活化淋巴細胞的表型變化示意圖，Hl區域表示 NK細胞、H4區域表示T細胞、H2區域表示NKT細胞、H3區域表 示其它免疫細胞的分布，圖2為根據本發明培養過程中的免疫細胞數 的變化示意圖。
將采用與實施例1相同的方法進行培養的活化淋巴細胞，利用 流式細胞儀(floweytometry)分析表面抗原，用圖l進行說明其結果， 如圖(a)所示，培養前表面抗原的分布主要在H4區域，而如圖(b) 所示，培養后表面抗原的分布主要在Hl區域，實際計算CD3陽性 (Positive) T細胞和CD16+CD56陽性(positive) NK細胞的比率 的結果，由培養前的53.60%: 12.74%變成培養后的39.74%: 69.03%，從而可以確認NK細胞的比率明顯上升。
另一方面，如圖2所示，在采用與實施例1相同的方法培養活 化淋巴細胞的過程中，每天按細胞種類觀察免疫細胞數的變化的結果 表明，在培養前所占的比率不足20。/o的NK細胞經過12天的培養， 此比率接近50%，超越了T細胞的比率。經過14天的培養之后，最 終獲得的各免疫細胞的比率是NK/NKT細胞為60±10%， T細胞為 40±10%， B細胞為1.5。/。以下。實施例3:對各種癌細胞的細胞毒性(cytotoxicity)分析
圖3為對根據本發明而獲得的活化淋巴細胞進行細胞毒性分析 的結果示意圖。
在將采用實施例1的方法進行培養的活化淋巴細胞用作效應細 胞、將血癌細胞株(K562)用作靶細胞、設定癌細胞對比活化淋巴 細胞的比率為10 : 1時，測定活化淋巴細胞對血癌細胞株的殺傷能力 而進行細胞毒性分析，其結果如圖3所示，活化淋巴細胞的細胞毒性 與從一般血液中分離的淋巴細胞相比增加了 6.8 16.4倍。
實施例4:在老鼠模型中的活化淋巴細胞的抗癌效果實驗
圖4為將根據本發明而獲得的活化淋巴細胞適用在老鼠模型中， 并觀察其抗癌效果的照片。
將.Raji細胞移植于3周齡的BALB/c裸鼠之后，經過2周，從 而構建腫瘤模型，然后將采用實施例1的方法進行培養的活化淋巴細 胞和從一般血液中分離的淋巴細胞分別注入到己準備好的裸鼠腫瘤 模型組中，評價腫塊的縮小效果和生存效果。
在將淋巴細胞注入到裸鼠之后，經過10天，可以以肉眼觀察到 在注入從一般血液中分離的淋巴細胞的情況下，如圖4 (a)所示， 腫塊生長到相當大的大小，另一方面，在注入根據本發明培養的活化 淋巴細胞的情況下，如圖4 (b)所示，腫塊明顯縮小。從而可以確 認，注入到裸鼠的活化淋巴細胞誘導Raji細胞的凋亡(apoptosis)等， 發揮有效的抗癌功能。
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明， 對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本 發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應 包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種自身活化淋巴細胞培養方法，其特征在于，該方法包括從人外周血中分離淋巴細胞的步驟；第一培養步驟，其在添加有白細胞介素2、L-谷氨酰胺以及來源于自身的血漿的培養液中，在抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗體存在的條件下，培養上述分離出的淋巴細胞；以及第二培養步驟，其將上述第一培養步驟中所培養完成的培養混合液與添加有白細胞介素2、L-谷氨酰胺以及來源于自身的血漿的培養液混合，在抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗體存在的條件下進行培養。
2. 如權利要求1所述的自身活化淋巴細胞培養方法，其特征在于，在上述第一培養步驟中，將上述分離出的淋巴細胞，在添加有 白細胞介素2、 L-谷氨酰胺以及來源于自身的血漿的培養液中，首先 在抗CD3抗體存在的條件下進行培養，然后在抗CD16以及抗CD56 抗體分別存在的條件下，依次進行培養。
3. 如權利要求2所述的自身活化淋巴細胞培養方法，其特征在于，在上述第一培養步驟中，將上述分離出的淋巴細胞，在添加有 白細胞介素2、 L-谷氨酰胺以及來源于自身的血漿的培養液的固相包 被抗CD3的培養板中，培養12 18小時，然后，將上述固相包被抗 CD3的培養板中的培養混合液移到固相包被抗CD56的培養板中，培 養12 18小時，接著，再將上述固相包被抗CD56的培養板中的培 養混合液移到固相包被抗CD16的培養板中，培養48 60小時。
4. 如權利要求1所述的自身活化淋巴細胞培養方法，其特征在于，在上述第二培養步驟中，將經過上述第一培養步驟的淋巴細胞，在添加有白細胞介素2、 L-谷氨酰胺以及來源于自身的血漿的培養液 中，首先在抗CD3抗體存在的條件下進行培養，然后在抗CD16以 及抗CD56抗體分別存在的條件下，依次進行培養。
5. 如權利要求4所述的自身活化淋巴細胞培養方法，其特征在于，在上述第二培養步驟中，將經過上述第一培養步驟的培養混合 液，加入到添加有白細胞介素2、 L-谷氨酰胺以及來源于自身的血漿 的培養液的固相包被抗CD3的培養板中，培養8 12小時，然后， 將上述固相包被抗CD3的培養板中的培養混合液移到固相包被抗 CD56的培養板中，培養8 12小時，接著，再將上述固相包被抗CD56 的培養板中的培養混合液移到固相包被抗CD16的培養板中，培養 24 56小曰寸。
6. 如權利要求1所述的自身活化淋巴細胞培養方法，其特征在于，在上述第一和第二培養步驟中所使用的培養液含有800 1200 IU/ml的白細胞介素2。
7. 如權利要求1所述的自身活化淋巴細胞培養方法，其特征在 于，該方法還包括第三培養步驟，其在經過上述第二培養步驟的培養混合液中添 加來源于自身的血衆，并將上述添加有來源于自身的血漿的培養混合 液注入到含有培養液的透氣性培養袋中，進行培養。
8. 如權利要求7所述的自身活化淋巴細胞培養方法，其特征在于，在上述第三培養步驟中所使用的培養液含有100 200 IU/ml的 白細胞介素2。
全文摘要
本發明涉及一種用于惡性腫瘤治療的自身活化淋巴細胞培養方法。根據本發明的自身活化淋巴細胞的培養方法，其特征在于，該方法包括從人外周血中分離淋巴細胞的步驟；在添加有白細胞介素2、L-谷氨酰胺、以及來源于自身的血漿的培養液中，在抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗體存在的條件下，培養上述分離出的淋巴細胞的第一培養步驟；以及將上述第一培養步驟中所培養完成的培養混合液與含有白細胞介素2、L-谷氨酰胺以及來源于自身的血漿的培養液混合，在抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗體存在的條件下，進行培養的第二培養步驟。
文檔編號C12N5/0783GK101603029SQ200910000408
公開日2009年12月16日 申請日期2009年1月6日 優先權日2008年6月10日
發明者崔炳仁, 李東旭, 洪蘚旼 申請人:株式會社Nkbio