產量提高的植物(konue)的制作方法

專利名稱：產量提高的植物(ko nue)的制作方法
產量提高的植物(K0 NUE)本發明總體而言涉及轉化的植物細胞以及植物或其部分，其包含失活或下調的基 因，其導致與例如未經轉化的野生型細胞相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例 如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的生物量產生，本發明還涉及 產生這些植物細胞或者植物或其部分的方法。具體的，本發明涉及被改造成在氮缺乏條件下生長的植物；和/或植物細胞和/或 植物部分，其在非氮缺乏條件下生長時顯示出提高的產量。本發明還涉及對這些植物細胞、植物或植物部分(特別是植物)產生和篩選和育 種的方法。農業生物技術學家還使用指示轉基因對作物產量的可能影響的其他參數的測量 值。對于飼料作物如苜蓿、青貯飼料玉米和干草而言，植物生物量與總產量相關。然而，對于 谷類作物而言，使用其他參數來估計產量，如植物大小，通過植物總干重、地上部分干重、地 上部分鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、花結直徑、葉長度、根長度、根質量、分蘗數和葉數 來衡量。早期發育階段的植物大小一般與發育后期階段的植物大小相關。具有較大葉面積 的較大植物通常比較小的植物吸收較多的光和二氧化碳，因此很可能在相同的時間中獲得 較多的重量。植物大小和生長速率有很強的遺傳成分，因此在一種環境條件下的不同基因 型植物大小很可能與在其他條件下的大小相關。這樣，可以使用標準環境來接近作物在大 田中在不同位置和時間遇到的不同的動態環境。已經表征了與植物中脅迫應答、水利用和/ 或生物量相關的一些基因，但迄今為止在開發產量提高的轉基因作物植物方面取得的成功 十分有限，沒有這樣的植物被商品化。因此，需要鑒定能提高作物植物產量的其他基因。植物營養對于植物的生長和發育十分關鍵，因此也對植物產品的數量和質量十分 關鍵。由于營養攝入效率和營養利用對植物產量和產品質量有重大影響，因此對土壤使用 了大量的肥料來優化植物生長和質量。植物生長主要受限于三種養分——磷、鉀和氮。因此，氮(N)是植物生長所需的 主要營養元素之一，通常是植物生長的限速元素。氮是可見于活細胞中的大量重要化合物 (如氨基酸、蛋白質(如酶)、核酸和葉綠素)的一部分。植物干物質的1.5%至2%和植物 總蛋白的約16%是氮。因此，氮的利用度對氨基酸合成和氨基酸組成、氨基酸累積、蛋白質 合成及累積有重大影響，因此是植物生長和產量的重要限制因素(Frink C. R. ,Proc. Natl. Acad Sci. USA 96,1175(1999))。由于作物植物的高氮需求，氮肥是十分廣泛的農業投資，每年施用八千萬噸氮肥 (硝酸鹽和 / 或銨)(Frink C. R.，Proc. Natl. Acad Sci. USA 96，1175(1999))。在作物生 產中大量使用含氮肥料也有不良的環境后果，因為作物僅保留所施用氮的約三分之二。因 此，大量的肥料投入通過淋洗、氣體喪失和作物清除而導致了大量輸出。接著未吸收的氮可 被淋洗到土壤中并污染水源(Frink C. R.，Proc. Natl. Acad Sci. USA 96,1175(1999))。由 于大量氮從農業生態系淋洗到地表水和地下水中，氮也被認為是一種污染物。氮淋洗(即 作為硝酸鹽從農業田地中淋洗出來)影響飲用水的品質，并導致湖泊和海岸地區的富營養 化。大量使用含氮肥料可進一步導致土壤品質最終惡化、環境污染和衛生危險。
由于對于農業產品而言每年的高氮肥費用及其對環境的有害影響，期望開發出這 樣的方法，以減少氮肥投入和/或優化氮攝入和/或對給定氮利用度的利用，而同時維持光 合作用活性生物(優選栽培植物，如作物)的最佳產量、生產力和品質。還期望獲得“現有” 的作物產量而同時肥料投入較少和/或在類似或甚至較貧瘠的土壤上具有較高的產量。已經在多種生物(包括酵母和植物)中表征了銨攝入系統。釀酒酵母含有用于 銨轉運蛋白的三個MEP基因，它們均受氮控制，在存在易于代謝的氮源(如NH4+)時被抑制 (Marini等，Mol. Cell Biol. 17,4282(1997))。已經通過酵母突變體的回補、數據庫同源性 檢索和異源雜交克隆了編碼銨轉運系統的植物基因(von Wiren N.等，Curr. Opin. Plant Biol.，3，254 (2000))。NH4+轉運蛋白生理功能的實驗性證據主要依賴于銨轉運蛋白表達與 標記的銨的內向通量之間的相關性。在擬南芥和其他植物中，銨轉運蛋白以基因家族存在， 其成員具有不同的表達模式和生理特征，這一事實使得情況變得復雜。DE 43 37 597要求 保護植物銨轉運蛋白的序列及其用于在某些情況下對氮代謝和植物生長進行操作的用途， 但并沒有通過異位表達植物銨轉運蛋白獲得的在某些條件下對氮同化或植物生長的正影 響的任何證據。因此，改造植物的氮同化的文獻證據仍僅限于少數情況，不包括轉運蛋白。然而，仍需要這樣的光合作用活性生物(特別是植物)，其具有提高的產量，特別 是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如能夠更有效地利用氮的植物，從而 獲得相同產量而需要的氮較少或者使用目前的氮利用水平可以獲得較高的產量。此外，仍 需要顯示提高的生物量的光合作用活性生物，特別是植物。因此，本發明的一個目的是開發光合作用活性生物(特別是植物)的廉價方法，其 具有提高的產量(特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率)，例如能夠更有 效地利用氮的植物，從而對于相同的產量所需的氮較少或者使用目前的氮利用水平可以獲 得較高的產量。例如，在本發明方法中包括在光合作用生物中增強氮攝入和/或轉運和/ 或同化和/或利用(其單獨或共同反映為提高的氮利用效率(NUE))和/或例如在氮供應 有限的條件下提高生物量產生和/或產量的方法。我們發現，這一目的通過提供本文所述的方法而得以實現。本發明的另一目的是提供植物細胞和/或植物，其與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物細胞和/或植物相比顯示出提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例如提 高的養分利用效率，例如增強的NUE和/或在有限氮供應條件下顯示出提高的生物量產生 和/或產量。我們發現，這一目的通過提供本文所述的植物細胞和/或植物而得以實現。因此，在一個實施方案中，本發明提供產生與相應野生型植物相比具有提高的產 量的植物的方法，包括至少以下步驟降低、抑制或缺失亞細胞區室和組織中選自本文所述 的以下的一種或多種活性Atlg74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白絲氨酸/蘇氨 酸磷酸酶以及含有SET結構域的蛋白(下文稱為“活性”，例如“所述活性”)。因此，在另一實施方案中，本發明提供在轉基因植物中降低、抑制或缺失本文所述 亞細胞區室和組織中表I所示分離多核苷酸的方法。本發明的轉基因植物與野生型植物變 種相比顯示出改進的產量或提高的產量。術語“改進”或“提高”或“增強”在本文中可互換 使用。本文使用的術語“產量”一般指來自植物(特別是作物)的可測量的生產。產量和
9產量提高(與未經轉化的起始植物或野生型植物相比)可通過多種方式來測量，應該理解， 本領域技術人員能夠根據具體的實施方案、相關的具體作物以及特定的目的或相關應用來 應用正確的含義。就本發明的描述而言，增強或提高的“產量”指選自以下的一個或多個產量參數 生物量、干生物量產量、地上部分干生物量產量、地下部分干生物量產量、鮮重生物量產量、 地上部分鮮重生物量產量、地下部分鮮重生物量產量；提高的可收獲部分產量，其可以是干 重或鮮重或二者皆有，地上部分或地下部分或二者皆有；增加的作物果實產量，其可以是干 重或鮮重或二者皆有，地上部分或地下部分或二者皆有；優選提高的種子產量，其可以是干 重或鮮重或二者皆有，地上部分或地下部分或二者皆有。本文使用的術語“改進的產量”或術語“提高的產量”指任何可測量植物產品(如 籽粒、果實或纖維)的產量提高。根據本發明，不同表型性狀的改變可以提高產量。例如 (但不限于)，諸如以下的參數是提高的產量的合適度量花器發育、根發生、根生物量、種 子數、種子重量、收獲指數、對非生物性環境脅迫的耐性、葉形成、向光性、頂端優勢和果實 發育。任何產量提高都是本發明的改進的產量。例如，產量的改進可包括任何可測量參數 提高 0. 1%,0. 5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%,90% 或更多。例如，來自作物的大豆或玉米(包括表I的核苷酸和多肽為轉基因的植物)的蒲 式耳/英畝產量與相同條件下培養的未處理大豆或玉米的蒲式耳/英畝產量相比的提高就 是本發明的改進產量。提高或改進的產量可在有或無脅迫的條件下實現。例如，本發明提供產生轉基因植物細胞或植物的方法，所述轉基因植物細胞或植 物可通過提高或產生上述一種或多種所述活性而顯示出與相應(例如未經轉化的)野生型 或起始植物相比提高的產量相關性狀，例如提高的環境脅迫耐性和/或提高的固有產量和 /或生物量產生。在一個實施方案中，產量提高指提高或改進的作物產量或可收獲產量。作物產量在本文中定義為每英畝收獲的相關農產品(如籽粒、飼料或種子)的蒲 式耳數。作物產量受非生物性環境脅迫(如干旱、熱、鹽和寒冷脅迫)和植物大小(生物 量)的影響。傳統植物育種策略相對緩慢，并一般不能成功地賦予提高的非生物性環境脅 迫抗性。常規育種獲得的籽粒產量改進在玉米中已經達到了平臺期。因此，植物的產量可取決于每一種具體情況下具體的目的植物/作物以及預期的 目的應用(如食物生產、飼料生產、加工食品生產、生物燃料、沼氣或醇生產等)。因此，在一 個實施方案中，產量以收獲指數(表示為相應可收獲部分的重量除以總生物量的比值)、每 單位面積(英畝、平方米等)的可收獲部分的重量等計算。玉米的收獲指數(即收獲時產 量生物量與總累積生物量的比值)在過去數百年中在對籽粒產量進行的選擇性育種中基 本保持不變。因此，最近玉米中出現的產量提高是由于每單位土地面積上總生物量產生的 提高。這種提高的總生物量是通過提高植物密度實現的，這導致了適應性的表型改變，例如 葉角減少(這可減少對下層葉的遮蔽)和花穗大小(這可提高收獲指數)。收獲指數在許 多環境條件下相對穩定，因此植物大小與籽粒產量之間可存在強相關性。植物大小與籽粒 產量之間存在固有的聯系，因為大部分籽粒生物量取決于植物的葉和莖的當前或存儲的光 合作用生產力。對于非生物性環境脅迫耐性，在培養箱或溫室中的標準條件下測量早期發 育階段的植物大小是測量存在轉基因所賦予的潛在產量優勢的標準實踐。
例如，產量指生物量產量，例如干重生物量產量和/或鮮重生物量產量。生物量產 量指植物的地上部分或地下部分，這取決于具體的情況(測試條件、特定的目的作物、目的 應用等)。在一個實施方案中，生物量產量指地上部分和地下部分。也可以基于鮮重、干重 或水分調整的基礎來計算生物量產量。生物量產量可基于每株植物計算，或者相對于特定 面積來計算(例如每英畝/平方米的生物量產量等)。在另一實施方案中，“產量”指種子產量，其可通過以下一種或多種參數來測量 種子數或飽滿種子數(每株植物或每單位面積(英畝/平方米等))、種子飽滿率(飽滿種 子數與種子總數的比值)、每植物的花數、種子生物量或種子總重(每株植物或每單位面積 (英畝/平方米等))、千粒重(TKW，由計數的飽滿種子數及其總重來外推，TKff的提高可由 種子大小提高、種子重量提高、胚大小提高和/或胚乳提高所致)。允許測量種子產量的其 他參數為本領域已知。種子產量可基于干重或鮮重來計算，或者一般基于經濕度調整的基 礎(如15. 5%濕度)來計算。在一個實施方案中，術語“提高的產量”指光合作用活性生物(特別是植物)與相 應野生型光合作用活性生物相比顯示出在非生物性環境脅迫條件下提高的生長速率。提高的生長速率可反映為(或賦予)提高的完整植物生物量產生，或者提高的植 物地上部分生物量產生，或者提高的植物地下部分生物量產生，或者提高的植物部分(如 莖、葉、花、果實和/或種子)生物量產生。在一個實施方案中，提高的產量包括較高的果實產量、較高的種子產量、較高的鮮 物質產生和/或較高的干物質產生。在另一實施方案中，術語“提高的產量”指該光合作用活性生物(優選植物)與相 應(例如未經轉化的)野生型光合作用活性生物相比，顯示出在非生物性環境脅迫條件下 延長的生長。延長的生長包括在未經轉化的野生型光合作用活性生物顯示可見的缺乏癥狀 和/或死亡時，該光合作用活性生物(優選植物)存活和/或繼續生長。例如，在一個實施方案中，用于本發明方法中的植物是玉米植物。在一個實施方案 中，提高的玉米植物產量指提高的種子產量，特別是對于用于飼料或食品的玉米品種而言。 在一個實施方案中，提高的玉米種子產量指提高的籽粒大小或重量、提高的每莢籽粒數或 提高的每株植物莢數。此外，在一個實施方案中，提高了穗軸產量，這在用于育種的玉米植 物品種中特別有用。此外，例如提高穗軸的長度或大小。在一個實施方案中，提高的玉米植 物產量涉及提高穗軸與籽粒的比值。例如，在一個實施方案中，用于本發明方法的植物是大豆植物。在一個實施方案 中，提高的大豆植物產量指提高的種子產量，特別是對于用于飼料或食品的大豆品種而言。 在一個實施方案中，提高的大豆種子產量指提高的籽粒大小或重量、提高的每莢籽粒數或 提高的每株植物莢數。例如，在一個實施方案中，用于本發明方法的植物是油菜(oil seedrape, 0SR)植 物。在一個實施方案中，提高的OSR植物產量指提高的種子產量，特別是對于用于飼料或食 品的OSR品種而言。在一個實施方案中，提高的OSR種子產量指提高的籽粒大小或重量、提 高的每莢籽粒數或提高的每株植物莢數。例如，在一個實施方案中，用于本發明方法的植物是棉花植物。在一個實施方案 中，提高的棉花植物產量指提高的棉絨產量。在一個實施方案中，提高的棉花產量指提高的
在一個實施方案中，提高的玉米種子產量指提高的籽粒大小或重量、提高的每莢 籽粒數或提高的每株植物莢數。所述本發明提高的產量通常可通過與原始或野生型植物相比增強或改進植物的 一種或多種產量相關性狀來實現。這些植物的產量相關性狀(其改進導致產量的提高)，包 括但不僅限于提高的植物固有生產能力、改進的營養利用效率和/或提高的脅迫耐性，特 別是提高的非生物性環境脅迫耐性。根據本發明，通過改進本文所述一種或多種產量相關性狀來提高產量植物的固有生產能力可表現為例如改進特定(固有)種子產量(例如提高種子/ 籽粒大小、提高穗數、提高每穗種子數、改進種子飽滿率、改進種子組成、胚和/或胚乳改進 等)；修飾和改進植物的固有生長和發育機制(如植物高度、植物生長速率、莢數、莢在植物 上的位置、節間數、莢破裂率、結瘤和氮固定的效率、碳同化的效率、苗萌發勢/早期萌發勢 的改進、增強的萌發效率(在脅迫或非脅迫條件下)、改進植物結構、細胞周期修飾、光合作 用修飾、多種信號途徑修飾、轉錄調節修飾、翻譯調節修飾、酶活性修飾等)；等等。植物脅迫耐性的改進或提高可以表現為例如改進或提高植物針對脅迫(特別是 非生物性環境脅迫)的耐性。在本申請中，非生物性環境脅迫一般指植物通常會面對的 非生物性環境條件，包括通常稱為“非生物性環境脅迫”條件的條件，包括但不僅限于干旱 (對干旱的耐性可通過改進水利用效率而獲得)、熱、低溫和寒冷條件(例如嚴寒和冰凍條 件)、鹽度、滲透壓、遮蔽、高植物密度、機械脅迫、氧化脅迫等。提高的植物產量還可通過提高“植物的養分利用效率”來介導，例如改進養分(包 括但不僅限于磷、鉀和氮)利用效率。例如，需要能更有效地利用氮的植物，以使得生長所 需的氮較少，從而導致在氮缺乏條件下改進的產量水平。此外，可通過當前或標準的氮利用 水平來獲得較高的產量。在本發明的一個實施方案中，通過與相應(例如未經轉化的)野生型植物相比增 強植物中的氮利用(=氮利用效率(NUE))的方法來獲得這些性狀。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)生物量產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)干生物量產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型光合植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或 環境，包括氮肥)地上干生物量產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)地下干生物量產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)鮮重生物量產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)地上部分鮮重生物量產量。在其另一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)地下部分鮮重生物量產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)植物可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)植物干可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)植物地上部分干可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)植物地下部分干可收獲部分產量。在其另一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)植物鮮重可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)植物地上部分鮮重可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)植物地下部分鮮重可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)作物果實產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)鮮作物果實產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)干作物果實產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物(類似于 Reynolds，Μ. P.，Ortiz-Monasterio J. J.和 McNab A. (eds.) ,2001,"Application of Physiology in Whaet Breeding, Mexico, D. E. :CIMMYT，其通過引用并 入本文)相比，顯示出增強的每單位提供的氮籽粒干重產量。在其另一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)種子產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)鮮重種子產量。在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該植物與相應的(例如未經轉化的) 野生型植物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該植物所生長的周圍培養基、土壤或環境， 包括氮肥)干種子產量。在本發明的另一實施方案中，這些性狀通過與相應的(例如未經轉化的)野生型 植物相比，在植物中提高在氮供應有限條件下的生物量產生和/或產量的方法來實現。在其一個實施方案中，術語“提高的生物量產生”指該植物與相應的野生型植物相 比，顯示出在氮供應有限條件下提高的生長速率。提高的生長速率可特別反映為提高的完 整植物生物量產生，或者提高的植物地上部分生物量產生，或者提高的植物地下部分生物 量產生，或者提高的植物部分(如莖、葉、花、果實、種子)生物量產生。在其一個實施方案中，提高的生物量產生包括較高的果實產量、較高的種子產量、 較高的鮮物質產生和/或較高的干物質產生。在另一實施方案中，術語“提高的生物量產生”指該植物與相應的(例如未經轉化 的)野生型植物相比，顯示出在氮供應有限條件下延長的生長。延長的生長包括在未經轉 化的野生型植物顯示可見的缺乏癥狀和/或死亡時，該植物存活和/或繼續生長。因此，本發明涉及產生與相應(例如未經轉化的)野生型植物相比具有提高的產 量，特別是提高的產量相關性狀，如提高的養分利用效率(例如增強的氮利用效率)和/或 提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生)的轉基因植物的方法，包括以下步驟(a)降低、抑制或缺失植物細胞、植物或植物部分中選自以下的一種或多種活性 Atlg74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和含有SET結構域 的蛋白，和(b)產生與相應(例如未經轉化的)野生型植物相比具有提高的產量(特別是提 高的產量相關性狀，例如氮利用效率和/或提高的生物量產生)的轉化植物，并在允許該植 物發育的條件下進行培養。在一個實施方案中，所述轉基因植物顯示出改進的產量相關性狀。例如，本發明的轉基因植物顯示出增強的氮利用效率。在另一實施方案中，轉基因植物顯示在有限氮供應條件下提高的生物量產生和/ 或產量。例如，氮利用效率可通過實施例中所述方法來測定。因此，在一個實施方案中，本 發明涉及提高產量的方法，其包括以下步驟(a)測量土壤中的氮含量，和(b)確定該土壤中的氮含量對于原始或野生型植物(如作物)的生長而言是最優的還是并非最優的，和(Cl)如果所述氮含量對于原始或野生型植物的生長而言是并非最優的，則在所述 土壤中培養本發明的植物，或者(c2)如果所述氮含量對于原始或野生型植物而言是最優的，則在所述土壤中培養 本發明的植物，并將產量與標準原始或野生型植物的產量進行比較，選擇和培養顯示出最
高產量的植物。在本發明的又一個實施方案中，通過提高植物的脅迫耐性來提高植物產量。一般 地，術語“提高的脅迫耐性”可定義為在脅迫條件下與未經轉化的的野生型或起始植物相 比，植物的存活和/或較高的產量生產力例如，本發明的植物或根據本發明的方法生產的 植物更好地適應脅迫條件。在其生活周期中，植物通常要面對多種環境條件。任何可能在某些情況下影響植 物產量的這種條件在本文中稱為“脅迫”條件。環境脅迫一般可分為生物性及非生物性(環 境)脅迫。不利的營養條件有時也稱作“環境脅迫”。本發明還涉及對這類環境脅迫的解決 方法，例如賦予提高的營養利用效率。例如，通過提高植物的非生物性環境脅迫耐性來提高植物產量。為了描述本發明， 術語“增強的非生物性環境脅迫耐性”、“增強的非生物性環境脅迫抗性”、“增強的環境脅迫 耐性”、“對環境脅迫提高的適應”和其他變形和具有相似含義的表述，可互換使用，并表示 (但不僅限于)與相應原始或野生型植物或其部分相比，對一種或多種本文所述非生物性 環境脅迫的耐性提高。術語非生物性環境脅迫耐性是指例如低溫耐性、干旱耐性或提高的水利用效率 (WUE)，熱耐性、鹽脅迫耐性以及其他。還使用植物對脫水、滲透壓休克和極端溫度應答的研 究來測定植物對非生物性環境脅迫的耐性或抗性。植物的脅迫耐性(如低溫、干旱、熱和鹽脅迫耐性)對植物生長具有共同的重要主 題，即水的利用度。植物通常在其生活周期中接觸環境含水量減少的條件。保護策略與寒 冷耐性的策略相似。因此，產量相關性狀指本發明植物提高的水利用效率和/或本發明植物提高的干 旱條件耐性。水利用效率(WUE)是經常與干旱耐性有關的參數。低供水量條件下生物量的 提高可能是由于生長效率相對提高或者水消耗減少。在選擇用于改進作物的性狀時，降低 水利用而不改變生長將在水輸入費用較高的農業灌溉系統中特別有益處。生長提高而水利 用不相應升高將可適用于所有農業系統。在水供應無限制的許多農業系統中，生長的提高 (即便以水利用提高為代價)也提高產量。當土壤水耗盡或者在干旱期間無水可用時，作物產量受到限制。如果葉的蒸騰作 用超過了根的水供應，就會發生植物缺水。可用的水供應與土壤中保持的水量以及植物以 其根系獲得該水的能力有關。水從葉的蒸騰作用與葉孔通過光合作用固定二氧化碳有關。 這兩個過程正相關，因此光合作用的高二氧化碳流入與蒸騰作用的失水密切相關。隨著水 從葉中蒸騰出去，葉的水勢降低，葉孔通常在水力過程中關閉，限制光合作用的量。由于作 物產量取決于光合作用中的二氧化碳固定，因此水攝入和蒸騰作用是作物產量的作用因 子。在許多農業系統中，能利用較少的水固定等量二氧化碳或者能在較低水勢下發揮正常 功能的植物有可能進行較多的光合作用，因此產生較多的生物量和經濟產量。
干旱脅迫表示導致植物缺水或對植物供水減少的任何環境脅迫，包括低溫和/或 鹽的繼發脅迫，和/或干旱或炎熱的原發脅迫，如脫水等。例如，可以根據以下方法來測定和定量提高的干旱條件耐性將本發明的植物單 個培養在培養室(York IndUStriekMte GmbH，Mannheim，德國)中的盆中。誘導萌發。在 植物為擬南芥的情況下，將播種后的種子保持在黑暗中于4°C下保持3天，從而誘導萌發。 其后將條件改變為20°C /6°C的日夜溫度和16/8小時150 μ E/m2S的晝夜循環，保持3天。 然后將植物在標準培養條件下培養。在植物為擬南芥的情況下，標準培養條件為16小時 光照和8小時黑暗的光周期、20°C、60%相對濕度和200 μ E的光子通量密度。培養并栽培 植物直至長出葉。在植物為擬南芥的情況下，每天澆水直至約為3周齡。這時開始通過斷 水施加干旱。在野生型植物顯示可見損傷癥狀之后，開始進行評估，在連續的5至6天中， 根據與野生型和臨近植物相比的干旱癥狀和生物量產生對植物進行評分。在一個實施方案 中，根據實施例中所述方法測定干旱耐性，例如對周期性干旱的耐性。干旱耐性可以是對周期性干旱的耐性。因此，在一個實施方案中，本發明涉及提高產量的方法其包括以下步驟(a)測定用于栽種的地區的水供應對于原始或野生型植物(例如作物)的生長來 說是否最優或并非最優，和/或測定用于栽種的地區中植物生長的可視損傷癥狀；以及(bl)如果水供應對于原始或野生型植物的生長來說并非最優的話，或者，在該地 區生長的標準、原始或野生型植物中可發現干旱的可視癥狀的話，在所述土壤中培育本發 明的植物，或者(b2)如果水供應對于原始或野生型植物來說最優的話，在所述土壤中培育本發明 的植物，將產量與標準、原始或野生型植物的產量相比，選擇和培育顯示最高產量的植物。可視損傷癥狀表示下述特征之一或其中兩種、三種或更多種的任何組合a)萎蔫，b)葉變成褐色，c)失去膨壓，導致葉或針葉莖和花下垂，d)葉或針葉下垂和/或脫落，e)葉為綠色，但葉面角與對照相比稍朝向地面，f)葉片開始內卷(卷曲)，g)葉或針葉過早衰老，h)葉或針葉中喪失葉綠素和/或變黃。本發明植物的所述產量相關性狀可以是所述植物提高的對熱條件的耐性。在本發明的另一個實施方案中，本發明植物的所述產量相關性狀是所述植物提高 的低溫耐性，例如包括嚴寒耐性和/或冰凍耐性。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，光合活性生物(優選是植物)較之相應(例如未經轉化 的)野生型光合活性生物(如植物)而言展示出增強的干生物量產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的地上部分干生物量產量。
在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的地下部分干生物量產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的鮮重生物量產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的地上部分鮮重生物量產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的地下部分鮮重生物量產量。在其另一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性” 指當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經 轉化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的植物可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的植物干可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的植物地上部分干可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的植物地下部分干可收獲部分產量。在其另一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性” 指當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經 轉化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的植物鮮重可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的植物地上部分鮮重可收獲部分產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的植物地下部分鮮重可收獲部分產量。在另一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的作物果實產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的鮮作物果實產量。
17
在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的干作物果實產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的籽粒干重。在另一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的種子產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的鮮重種子產量。在其一個實施方案中，術語在光合活性生物中“增強的非生物性環境脅迫耐性”指 當遭遇非生物性環境脅迫條件時，所述光合活性生物(優選植物)較之相應(例如未經轉 化的)野生型光合活性生物而言展示出增強的干種子產量。然而，例如生物所面對的非生 物性環境脅迫條件可以是本文提到的任何非生物性環境脅迫。在一個實施方案中，提高所產生的玉米的氮利用效率涉及提高玉米種子的蛋白質 含量，特別是用作飼料的玉米種子。在另一實施方案中，提高的氮利用效率涉及提高的籽粒 大小或數目。在一個實施方案中，提高所產生玉米的水利用效率涉及提高的籽粒大小和數 目。此外，在一個實施方案中，提高的低溫耐性涉及早期萌發勢，并允許對本發明方法所產 生的玉米植物較早地進行種植和播種。在一個實施方案中，提高所產生的大豆植物的氮利用效率涉及提高大豆種子的蛋 白質含量，特別是用作飼料的大豆種子。在另一實施方案中，提高的氮利用效率涉及提高的 籽粒大小或數目。在一個實施方案中，提高所產生大豆植物的水利用效率涉及提高的籽粒 大小和數目。此外，在一個實施方案中，提高的低溫耐性涉及早期萌發勢，并允許對本發明 方法所產生的大豆植物較早地進行種植和播種。在一個實施方案中，提高所產生的OSR植物的氮利用效率涉及提高OSR種子的蛋 白質含量，特別是用作飼料的OSR種子。在另一實施方案中，提高的氮利用效率涉及提高的 籽粒大小或數目。在一個實施方案中，提高所產生的OSR植物的水利用效率涉及提高的籽 粒大小和數目。此外，在一個實施方案中，提高的低溫耐性涉及早期萌發勢，并允許對本發 明方法所產生的油菜植物較早地進行種植和播種。在一個實施方案中，本發明涉及產生耐 寒油菜(具有耐寒性的0SR)的方法，包括在本發明上述方法中使用耐寒油菜植物。在一個實施方案中，提高所產生的棉花植物的氮利用效率涉及提高棉籽的蛋白質 含量，特別是用作飼料的棉籽。在另一實施方案中，提高的氮利用效率涉及提高的籽粒大小 或數目。在一個實施方案中，提高所產生的棉花的水利用效率涉及提高的籽粒大小和數目。 此外，在一個實施方案中，提高的低溫耐性涉及早期萌發勢，并允許對本發明方法所產生棉 花植物較早地進行種植和播種。因此，在本發明的另一實施方案中，提供了用于產生轉基因植物、來自這些植物的 后代、種子和/或花粉或者用于產生這些植物的方法；每一植物還可顯示出與相應的(例如未經轉化的)野生型植物細胞或植物相比提高的低溫耐性，特別是寒冷耐性，這通過降低、 抑制或缺失所述植物中本文所述亞細胞區室和組織中的一種或多種所述“活性”來實現。因此，在本發明的另一實施方案中，提供了用于產生轉基因植物、來自這些植物的 后代、種子和/或花粉或者用于產生這些植物的方法；每一植物還可顯示出與相應的(例如 未經轉化的)野生型植物細胞或植物相比提高的水利用效率，或提高的干旱耐性，這通過 降低、抑制或缺失所述植物中本文所述亞細胞區室和組織中的一種或多種所述“活性”來實 現。因此，在本發明的另一實施方案中，提供了用于產生轉基因植物、來自這些植物的 后代、種子和/或花粉或者用于產生這些植物的方法；每一植物還可顯示出與相應的(例如 未經轉化的)野生型植物細胞或植物相比提高的氮利用效率(NUE)，還顯示提高的低溫耐 性和/或提高的固有產量和/或干旱耐性，特別是寒冷耐性，和干旱耐性，這通過降低、抑制 或缺失所述植物中本文所述亞細胞區室和組織中的一種或多種所述“活性”來實現。因此，在本發明的另一實施方案中，提供了用于產生轉基因植物、來自這些植物的 后代、種子和/或花粉或者用于產生這些植物的方法；每一植物還可顯示出與相應的(例如 未經轉化的)野生型植物細胞或植物相比提高的氮利用效率(NUE)以及低溫耐性或提高的 干旱耐性或提高的固有產量，特別是寒冷耐性，和干旱耐性和增加的生物量，這通過降低、 抑制或缺失所述植物中本文所述亞細胞區室和組織中的一種或多種所述“活性”來實現。因此，在本發明的另一實施方案中，提供了用于產生轉基因植物、來自這些植物的 后代、種子和/或花粉或者用于產生這些植物的方法；每一植物還可顯示出與相應的(例如 未經轉化的)野生型植物細胞或植物相比提高的氮利用效率(NUE)和低溫耐性，和提高的 干旱耐性和提高的固有產量，特別是寒冷耐性，和干旱耐性和增加的生物量，這通過降低、 抑制或缺失所述植物中本文所述亞細胞區室和組織中的一種或多種所述“活性”來實現。此外，在一個實施方案中，本發明提供轉基因植物，其與相應的(例如未經轉化 的)原始或野生型植物細胞或植物相比顯示出一種或多種提高的產量相關性狀，這通過降 低、抑制或缺失所述植物中本文所述亞細胞區室和組織中的一種或多種所述“活性”來實 現。因此，在本發明的另一實施方案中，提供了用于產生轉基因植物、來自這些植物的 后代、種子和/或花粉或者用于產生這些植物的方法；每一植物顯示出與相應的(例如未經 轉化的)野生型植物細胞或植物相比提高的低溫耐性和氮利用效率(NUE)，這通過降低、抑 制或缺失一種或多種所述“活性”來實現。因此，在本發明的另一實施方案中，提供了用于產生轉基因植物、來自這些植物的 后代、種子和/或花粉或者用于產生這些植物的方法；每一植物顯示出與相應的(例如未經 轉化的)野生型植物細胞或植物相比提高的NUE和提高的周期性干旱耐性，這通過降低、抑 制或缺失一種或多種所述“活性”來實現。因此，在本發明的另一實施方案中，提供了用于產生轉基因植物、來自這些植物的 后代、種子和/或花粉或者用于產生這些植物的方法；每一植物顯示出與相應的(例如未經 轉化的)野生型植物細胞或植物相比提高的NUE和提高的固有產量，這通過降低、抑制或缺 失一種或多種所述“活性”來實現。在一個實施方案中，降低、抑制或缺失細胞的一種或多種特定區室中的所述活性，并賦予提高的產量，例如所述植物顯示出提高或改進的所述產量相關性狀。例如，在表I或 II第6列所示細胞的質體中降低、抑制或缺失所述活性，并提高相應植物的產量。此外，在另一實施方案中，本發明涉及用于產生轉基因植物的方法，所述轉基因植 物與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比具有提高的產量，特別是提高的產量相關 性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或 提高的生物量產生，所述方法包括以下步驟(a)降低、抑制或缺失植物細胞、植物或植物部分中的以下活性(i)分別包含表II或表IV第5或7列所示多肽、共有序列或至少一個多肽基序的 多肽；或(ii)包含表I第5或7列所示多核苷酸的核酸分子的表達產物，(iii)或者⑴或(ii)的功能等同物；和(b)產生轉化植物，所述轉化植物與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比具 有提高產量，特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效 率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生，并在允許該植物發育的條件下進 行培養。優選地，本發明的方法還包括降低、減少或缺失至少一種核酸分子的表達或活性， 所述核酸分子具有或編碼表I第5列申請號1所示核酸分子中至少一種核酸分子的活性， 并包含選自以下的核酸分子(a)編碼表II第5或7列申請號1所示多肽的分離的核酸分子；(b)表I第5或7列申請號1所示分離的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其由于遺傳密碼的簡并性而衍生自表II第5或7列申請號 1所示多肽序列；(d)分離的核酸分子，其與包含表I第5或7列申請號1所示核酸分子之多核苷酸 的核酸分子序列具有至少30%同一性；(e)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽 的氨基酸序列具有至少30%同一性，優選至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、 90%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%同一性，并具有包含表I第5列申請號1所示多 核苷酸的核酸分子的活性；(f)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽可借助于針對(a)至(e)的核酸分子 之一所編碼多肽而產生的單克隆抗體或多克隆抗體來分離，并具有包含表I第5列申請號 1所示多核苷酸的核酸分子的活性；(g)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列申請號1所示共有序 列或者一種或多種多肽基序，并優選具有包含表II或IV第5列申請號1所示多核苷酸的 核酸分子的活性；(h)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽具有表II第5列申請號1所示蛋白質 的活性；(i)包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸通過用表III第7列申請號1 所示引物擴增cDNA文庫或基因組文庫而獲得(不從核苷酸5’端的ATA開始)，并優選具有 包含表II或表IV第5列申請號1所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(j)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽通過在(a)至(d)的核酸分子所編碼多 肽的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸而產生；和(k)分離的核酸分子，其可通過在嚴格雜交條件下篩選合適的核酸文庫而獲得，其 中使用包含(a)或(b)核酸分子之互補序列的探針或其片段，其具有與(a)至(d)中所表 征核酸分子序列互補的核酸分子的至少15nt，優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt、500nt、 750nt或lOOOnt，并編碼多肽，所述多肽具有包含表II第5列申請號1所示多肽的蛋白質 的活性；或者包含與其互補的序列。優選地，本發明的方法還包括降低、抑制、減少或缺失包含上文(a)至(j)所示核 酸分子的核酸分子的表達產物，例如包含表II第5或7列申請號1所示多肽的多肽，或者 所述核酸分子所編碼的蛋白質。優選地，本發明方法還包括降低植物或其部分中多肽的活性或表達，所述多肽包 含上文表征核酸分子所編碼的多肽。優選地，本發明的方法還包括選自以下的至少一個步驟(a)引入編碼核糖核酸序列的核酸分子，所述核糖核酸序列能形成雙鏈核糖核 酸分子，其中所述雙鏈核糖核酸分子的至少17nt的片段與選自以下的核酸分子具有至少 50%、優選 60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99% 的同源性(i)上文表征的分離的核酸分子；(ii)分離的核酸分子，其如表I第5或7列申請號1所示，或者編碼如表II第5 或7列申請號1所示的多肽，和(iii)分離的核酸分子，其編碼具有表II第5列申請號1所示多肽之活性的多肽， 或者編碼包含表I第5或7列申請號1所示核酸分子之多核苷酸的表達產物；(b)引入 RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反義 核酸分子，其中所述RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反義 核酸分子包含與選自本段(a)部分所定義組的核酸分子具有至少50%、優選60%、70%、 80%、90%、95%、97%、98%、99% 同源性的至少 17nt 的片段；(c)引入核酶，其特異性切割選自本段(a)部分所定義組的核酸分子；(d)引入(b)中表征的 RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、 核酶或反義核酸分子以及(c)中表征的核酶；(e)引入有義核酸分子，以誘導內源表達產物的共阻抑，所述有義核酸分子賦予核 酸分子表達，其包含選自本文上文所定義的組或者上文(a) ( )或(a) (iii)部分所定義的 組的核酸分子，或者編碼多肽的核酸分子，所述多肽與(a)至(c)部分所述核酸分子所編碼 多肽的氨基酸序列具有至少50%同一性，并具有包含表II第5列申請號1所示多肽之蛋白 質的活性，(f)引入賦予蛋白質顯性負突變體表達的核酸分子，所述蛋白質具有表II第5或 7列申請號1所示蛋白質的活性，或者包含由本文上文所表征核酸分子編碼的多肽；(g)引入編碼因子的核酸分子，所述因子與這樣的核酸分子結合，該核酸分子包含 選自本文上文所定義的組或者本段(a) (ii)或(a) (iii)部分所定義的組的核酸分子，其賦 予蛋白質表達，所述蛋白質具有本文上文所表征核酸分子所編碼蛋白質的活性；
(h)弓I入賦予RNA分子降低的病毒核酸分子，所述RNA分子包含選自本文上文所定 義的組或者本段(a) (ii)或(a) (iii)部分所定義的組的核酸分子，其賦予蛋白質表達，所 述蛋白質由本文上文所表征核酸分子所編碼；(i)引入能與內源基因重組并使其活性沉默、失活、抑制或降低的核酸構建體，所 述內源基因包含選自本文上文所定義的組或者本段(a) ( )或(a) (iii)部分所定義的組 的核酸分子，其賦予蛋白質表達，所述蛋白質由本文上文所表征核酸分子所編碼；(j)在內源基因中引入非沉默突變，所述內源基因包含選自本文上文所定義的組 或者本段(a) ( )或(a) (iii)部分所定義的組的核酸分子；(k)引入表達構建體，其賦予(a)至(i)中任一項所表征核酸分子的表達。優選地，在本發明方法中，包含選自本文上文所定義的組或者上文(a) (ii)或(a) (iii)部分所定義組之核酸分子的序列的至少17bp的3’或5’核酸序列片段(其具有至 少 50%、優選 60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5% 的同 一性)被用于降低上文所表征核酸分子或所述核酸分子所編碼的多肽。優選地，在本發明方法中，所述降低或缺失是由于應用非人生物的化合物而導致 的。優選地，在本發明的方法中，植物選自漆樹科(Anacardiaceae)、菊科 (Asteraceae)、傘形禾斗(Apiaceae)、樺木禾斗(Betulaceae)、紫草禾斗(Boraginaceae)、 十字花禾斗(Brassicaceae)、鳳梨禾斗(Bromeliaceae)、番木瓜禾斗(Caricaceae)、大
禾4" (Cannabaceae) > JiE ^ffi (Convolvulaceae)、胃禾4" (Chenopodiaceae)、^I P 禾4" (Cucurbitaceae)、古月 _ 〒禾4" (Elaeagnaceae) >(Ericaceae) >
(Euphorbiaceae)、豆禾斗(Fabaceae)、姚牛兒苗禾斗(Gentianaceae)、禾本禾斗(Gramineae)、古月 桃禾斗(Juglandaceae)、棒禾斗(Lauraceae)、豆禾斗(Leguminosae)、亞麻禾斗(Linaceae)、多年生 草本、飼用作物、蔬菜和觀賞植物。優選地，本發明的方法還包括引入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta_siRNA、 共阻抑分子、核酶、抗體和/或反義核酸的步驟，其被設計成靶向基因的表達產物(所述基 因包含本文上文所表征的核酸分子)，以誘導所述目的基因的mRNA斷裂，由此使基因表達 沉默，或者引入確保前者表達的表達盒。此外，在另一實施方案中，本發明涉及分離的核酸分子，其包含選自以下的核酸分 子(a)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽包含表II B第5或7列申請號1所示 多肽；(b)分離的核酸分子，其包含表I B第5或7列，申請號1所示的多核苷酸；(c)包含核酸序列的分離的核酸分子，所述核酸序列由于遺傳密碼的簡并性而衍 生自表II B第5或7列所示多肽序列，并具有表II第5列申請號1所示蛋白質的活性；(d)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽與(a)或(C)的核酸分子所編碼多肽 的氨基酸序列具有至少50%同一性，優選至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%,97%,98%,99%,99. 5%同一性，并具有表II第5列申請號1所示多蛋白質的活性；(e)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽可借助于針對(a)至(C)核酸分子之一 所編碼多肽而產生的單克隆抗體來分離，并具有表II第5列申請號1所示蛋白質的活性；
(f)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列所示共有序列或多肽 基序，并具有表II第5列所示蛋白質的生物活性；(g)編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽具有表II第5列申請號1所示蛋白質 的活性；(h)包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸可通過使用表III第7列申請 號1所示引物擴增cDNA文庫或基因組文庫而獲得(不從核苷酸5’端的ATA開始)；和(i)分離的核酸分子，其可通過在嚴格雜交條件下篩選合適的文庫而獲得，其中使 用包含(a)至(c)核酸分子序列之一的探針或，或使用具有(a)至(h)任一項所表征核酸 分子的至少17nt的片段，并編碼多肽，所述多肽具有表II第5列申請號1所示蛋白質的活 性；或者包含與其互補的序列；其中(a)至(i)的核酸分子至少在一個或多個核苷酸上與表I A第5或7列，申 請號ι所示序列不同，并優選地編碼至少在一個或多個氨基酸上與表II A第5或7列，申 請號1所示蛋白質序列不同的蛋白質。此外，在另一實施方案中，本發明涉及RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗體或反義核酸分子，其用于降低上文表征的活性，或者降低 本文上文所表征核酸分子或所述核酸分子所編碼多肽的活性或表達。優選地，本發明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶 或反義核酸分子包含本文上文所定義核酸分子的至少17nt的片段。此外，在另一實施方案中，本發明涉及雙鏈RNA (dsRNA)、RNAi、snRNA、siRNA、 miRNA、反義或ta-siRNA或核酶，其能夠形成雙鏈核糖核酸分子，其中所述雙鏈核糖核酸分 子的至少17nt片段與選自以下的核酸分子具有至少50%，優選60%、70%、75%、80%、 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%的同源性(aa)上文表征的分離的核酸分子；(ab)分離的核酸分子，其如表I第5或7列，申請號1所示，或者編碼如表II第5 或7列申請號1所示的多肽，和(ac)分離的核酸分子，其編碼具有表II第5或7列，申請號1所示多肽之活性的 多肽，或者編碼包含表I第5或7列申請號1所示核酸分子之多核苷酸的表達產物；優選地，在本發明的dsRNA分子中，有義鏈和反義鏈彼此共價結合，并且反義鏈與 “有義” RNA鏈基本互補。此外，在另一實施方案中，本發明涉及賦予RNA分子降低的病毒核酸分子，所述 RNA分子賦予具有上文所表征活性的蛋白質表達，或者本文所表征核酸分子的活性或表達， 或者所述核酸分子所編碼多肽的活性或表達。此外，在另一實施方案中，本發明涉及用于鑒定基因敲除的TILLING引物，所述基 因包含表I第5或7列申請號1中任一項所示核酸分子的核酸序列。此外，在另一實施方案中，本發明涉及多肽的顯性負突變體，所述多肽包含表II 第5或7列，申請號1所示多肽。此外，在另一實施方案中，本發明涉及編碼上文所定義顯性負突變體的核酸分子。此外，在另一實施方案中，本發明涉及賦予以下表達的核酸構建體本發明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta_siRNA、共阻抑分子、核酶、抗體或反義核酸分子，本發 明的病毒核酸分子或者本發明的核酸分子。此外，在另一實施方案中，本發明涉及核酸構建體，其包含本發明的分離的核酸分 子或者本發明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta_siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核 酸分子或者本發明的病毒核酸分子其中所示核酸分子與一個或多個調節信號功能性連接。此外，在另一實施方案中，本發明涉及載體，其包含本發明的核酸分子或者本發明 的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta_siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核酸分子或者本 發明的病毒核酸分子或者本發明的核酸構建體。優選地，在本發明載體中，所述核酸分子與用于在植物宿主中表達的調節序列有 效連接。此外，在另一實施方案中，本發明涉及轉基因植物宿主細胞，其穩定轉染或瞬時轉 染了本發明的載體或者本發明的核酸分子或者本發明的核酸構建體。此外，在另一實施方案中，本發明涉及植物細胞、植物或其部分，其中包含表II申 請號1 (優選表II B申請號1或者表IV申請號1)第5或7列所示多肽、共有序列或多肽 基序的蛋白質的活性被降低，或者包含表I申請號1(優選表I B申請號1)第5或7列所 示核酸分子的核酸分子被降低。此外，在另一個實施方案中，本發明涉及用于產生本發明核酸序列所編碼多肽的 方法，所述多肽在本發明植物細胞、植物或其部分中表達。優選地，在用于生產本發明多肽的方法中或在本發明的宿主細胞中，宿主細胞是 選自以下的植物細胞漆樹科、菊科、傘形科、樺木科、紫草科、十字花科、鳳梨科、番木瓜科、 大麻科、旋花科、藜科、葫蘆科、胡頹子科、杜鵑花科、大戟科、豆科、櫳牛兒苗科、禾本科、胡 桃科、樟科、豆科、亞麻科、多年生草本、飼用作物、蔬菜和觀賞植物，或者是上文定義的微生 物。此外，在另一實施方案中，本發明涉及分離的多肽，其由本發明核酸分子編碼，或 者包含表II B第7列申請號1所示多肽。此外，在另一實施方案中，本發明涉及與本發明多肽特異性結合的抗體。此外，在另一實施方案中，本發明涉及包含本發明植物細胞的植物組織、植物、可 收獲植物材料或植物繁殖材料。此外，在另一實施方案中，本發明涉及篩選本發明上述方法中所表征活性或本發 明上述方法所表征核酸分子所編碼多肽之活性的拮抗劑的方法(a)將表達該多肽的生物、其細胞、組織或部分與化合物或含有多種化合物的樣品 在允許降低或缺失編碼該蛋白之活性的核酸分子的表達或者在允許降低或缺失該蛋白質 之活性的條件下相接觸；(b)測定所述植物、其細胞、組織或部分中蛋白質的活性水平或者多肽的表達水 平，其中所述植物、其細胞、組織或部分被培養或維持；和(c)通過將測得的蛋白質活性水平或多肽表達水平與不存在所述化合物或包含所 述多種化合物的樣品的情況下的標準蛋白質活性水平或多肽表達水平進行比較而鑒定拮 抗劑，其中與標準相比降低的水平表示所述化合物或者包含所述多種化合物的樣品是拮抗 劑。
此外，在另一實施方案中，本發明涉及鑒定在植物中賦予與相應的(例如未經轉 化的)野生型植物相比提高的產量(特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效 率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生)的化合 物的方法，其包括以下步驟(a)培養或維持植物、植物細胞或其組織或其部分，其表達具有上文本發明方法所 表征活性的多肽，或者由上文本發明方法所表征核酸分子所編碼的多肽，或者編碼所述多 肽的多核苷酸，以及能與所述多肽在合適條件下相互作用的讀出系統，所述條件允許該多 肽與此讀出系統在化合物或含有多種化合物的樣品存在下相互作用，并且所述讀出系統能 夠應答于化合物與所述多肽在允許抑制所述讀出系統及所述多肽的條件下的結合而提供 可檢測信號；和(b)通過檢測所述讀出系統所產生的信號的存在與否或者下降或提高來鑒定該化 合物是否是有效的拮抗劑。此外，在另一實施方案中，本發明涉及用于產生農用組合物的方法，其包括鑒定在 植物、植物細胞或其部分中賦予與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比提高的產量 (特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提 高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生)之化合物的方法的步驟，以及將所述化合物 配制成可用于農業應用的形式。此外，在另一實施方案中，本發明涉及組合物，其包含本發明蛋白質、本發明核酸 分子、本發明核酸構建體、本發明載體、根據用于鑒定本發明拮抗劑的本發明方法所鑒定的 拮抗劑、本發明抗體、本發明宿主細胞、本發明方法所表征核酸分子、本發明RNAi、snRNA、 dsRNA、siRNA、miRNA, ta_siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核酸分子以及任選的農業可接受 載體。此外，在另一實施方案中，本發明涉及食品或飼料，其包含本發明蛋白質、本發明 核酸分子、本發明核酸構建體、本發明載體、根據本發明用于鑒定拮抗劑的方法所鑒定的 拮抗劑、本發明抗體、本發明宿主細胞、本發明方法所表征核酸分子、本發明RNAi、snRNA、 dsRNA、siRNA、miRNA, ta_siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核酸分子、本發明植物、植物組織、 可收獲植物材料或植物繁殖材料。此外，在另一實施方案中，本發明涉及本發明蛋白質、本發明核酸分子、本發明核 酸構建體、本發明載體、根據本發明用于鑒定拮抗劑的方法所鑒定的拮抗劑、本發明抗體、 本發明宿主細胞、本發明方法所表征核酸分子、本發明RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核酸分子用于產生轉基因植物的用途，所述轉基因植物 與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比具有提高的產量，特別是提高的產量相關性 狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提 高的生物量產生表I顯示相關多核苷酸的SEQ ID NO。表II顯示相關多肽的SEQ IDN0。表IV顯 示相關共有序列和相關多肽基序的SEQ ID NO。在所有這些表格中，均使用縮寫“A. th. ”來 代表“擬南芥”生物。在下文中，術語“表II或表IV所示多肽”還涉及包含表IV所示共有序列或至少 一個多肽基序的多肽。
要在本發明方法中降低活性以提供與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比 具有提高的產量(特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮 利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生)的分子(例如下文I、II 和/或III的分子)在下文中為“要在本發明方法中降低活性的分子”。所述分子可以為例 如多肽或核酸分子。因此，換言之，本發明涉及產生轉基因植物的方法，所述轉基因植物與相應的(例 如未經轉化的)野生型植物相比具有提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例如提高 的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量 產生，該方法包括以下步驟(a)在植物或其部分中降低、抑制或缺失以下的活性(I)至少一種多肽，其包含選自SEQ ID NO :28、61、95、133和172或表II第7列申 請號ι所示(優選如表II B申請號1所示)其同源物的多肽，或者包含表IV申請號1的 共有序列或至少一個多肽基序，或者(II)至少一種核酸分子的表達產物，所述核酸分子包含選自SEQ IDNO 27、60、 94、132和171或表I第7列申請號1所示(優選如表I B第5或7列，申請號1所示)其 同源物的多核苷酸，(III)或者(I)或(II)的功能等同物；和(b)產生與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比具有提高的產量(特別是 提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環 境脅迫耐性和/或提高的生物量產生)的轉化植物，并在允許該植物發育的條件下進行培養。在一個實施方案中，本發明涉及產生與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相 比具有提高的產量(特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的 氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生)的轉基因植物的方法， 其包括以下步驟(a)在植物或其部分中降低、抑制或缺失以下的活性(I)至少一種多肽，其包含選自SEQ ID NO :28、61、95、133和172或表II第7列申 請號ι所示(優選如表II B申請號1所示)其同源物的多肽，或者包含表IV申請號1的 共有序列或至少一個多肽基序，或者(II)至少一種核酸分子的表達產物，所述核酸分子包含選自SEQ IDNO 27、60、 94、132和171或表I第7列申請號1所示(優選如表I B第5或7列，申請號1所示)其 同源物的多核苷酸，(III)或者(I)或(II)的功能等同物；和(b)產生與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比具有提高的產量(特別是 提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環 境脅迫耐性和/或提高的生物量產生)的轉化植物，并在允許該植物發育的條件下進行培 養；(c)在有限氮供應的條件下，(d)在未經轉化的野生型顯示可見缺乏癥狀和/或死 亡后，選擇與相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比具有提高的產量(特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫 耐性和/或提高的生物量產生)的植物。意想不到的是，觀察到在擬南芥中敲除以下至少一種基因賦予了經轉化的植物與 相應的(例如未經轉化的)野生型植物相比增強的NUE和/或提高的生物量產生賦予選 自At lg74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶以及含有SET結 構域之蛋白的活性的基因，以及包含表I第5列申請號1所述核酸序列的基因。具體地，觀察到在擬南芥中敲除包含SEQ ID NO. 27核酸序列的基因賦予了與野生 型對照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強 的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生。還觀察到在擬南芥中缺失、抑制或降低具有“Atlg74730蛋白”(由包含SEQ ID NO. 27核酸序列的基因編碼)的活性的基因產物的活性賦予了與野生型對照相比增加的產 量，例如NUE和/或提高的生物量產生，特別是提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例 如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的 生物量。具體地，觀察到在擬南芥中敲除包含SEQ ID NO. 60核酸序列的基因賦予了與野生 型對照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強 的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生。還觀察到在擬南芥中缺失、抑制或降低具有“含有SET結構域的蛋白”(由包含SEQ ID NO. 60核酸序列的基因編碼)之活性的基因產物的活性賦予了與野生型對照相比增加 的產量，例如NUE和/或提高的生物量產生，特別是提高的產量，特別是提高的產量相關性 狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提 高的生物量。具體地，觀察到在擬南芥中敲除包含SEQ ID NO. 94核酸序列的基因賦予了與野生 型對照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強 的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生。還觀察到在擬南芥中缺失、抑制或降低具有“At3g63270蛋白”(由包含SEQ ID N0. 94核酸序列的基因編碼)之活性的基因產物的活性賦予了與野生型對照相比增加的產 量，例如NUE和/或提高的生物量產生，特別是提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例 如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的 生物量。具體地，觀察到在擬南芥中敲除包含SEQ ID N0. 132核酸序列的基因賦予了與野 生型對照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增 強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生。還觀察到在擬南芥中缺失、抑制或降低具有(由包含SEQ ID N0. 132核酸序列的 基因編碼的)“蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶”之活性的基因產物的活性賦予了與野生型對 照相比增加的產量，例如NUE和/或提高的生物量產生，特別是提高的產量，特別是提高的 產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫 耐性和/或提高的生物量。具體地，觀察到在擬南芥中敲除包含SEQ ID N0. 171核酸序列的基因賦予了與野生型對照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增 強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生。還觀察到在擬南芥中缺失、抑制或降低具有(由包含SEQ ID NO. 171核酸序列的 基因編碼的)“蛋白激酶”之活性的基因產物的活性賦予了與野生型對照相比增加的產量， 例如NUE和/或提高的生物量產生，特別是提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例如 提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生 物量。因此，根據本發明用于提高的產量(特別是提高的產量相關性狀，例如提高的養 分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生) 的方法，可以在植物細胞、植物或者其部分中獲得與對照或者野生型相比提高的產量，特別 是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的 環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生。因此，在一個實施方案中，對于降低分別包含核酸SEQ ID NO. 27或多肽SEQ ID NO. 28的擬南芥核酸分子或多肽之活性的情況，或者對于在其他生物中缺失、抑制或降低所 述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情況，例如，如果在植物細胞、植物或其部分中降 低分別包含在表I、II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID NO. 27或多肽 SEQID NO. 28同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者 降低“Atlg74730蛋白”的活性，則優選在所述植物細胞、植物或其部分中賦予了與野生型對 照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，如提高的養分利用效率(例如增強的氮 利用效率)和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生，特別是增強的NUE，或者 提高的生物量產生，或者增強的NUE和提高的生物量產生。如果降低分別包含核酸分子SEQ ID N0. 27或多肽SEQ ID N0. 28的擬南芥核酸分 子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物 的活性，例如如果在植物細胞、植物或其部分中降低分別包含表I、II或IV第7列申請號1 中所示分別與核酸分子SEQ ID Ν0. 27或多肽SEQ ID N0. 28同一行的核酸或多肽或共有序 列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“Atlg74730蛋白”的活性，則賦予了與 相應的未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相比提高的養分利用效率。在一個實施方案 中，賦予了提高的氮利用效率。例如，在氮缺乏的條件下，賦予了與相應未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相 比提高為1. 05倍至1. 20倍的產量，例如加上其至少100%的產量提高。因此，在一個實施方案中，對于降低分別包含核酸分子SEQ ID N0. 60或多肽SEQ ID N0. 61的擬南芥核酸分子或多肽之活性的情況，或者對于在其他生物中缺失、抑制或降 低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情況，例如，如果在植物細胞、植物或其部分 中降低分別包含表I、II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID Ν0. 60或多 肽SEQID N0. 61同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或 者降低“含有SET結構域的蛋白”的活性，則優選在所述植物細胞、植物或其部分中賦予了 與野生型對照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，如提高的養分利用效率(例 如增強的氮利用效率)和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生，特別是增強 的NUE，或者提高的生物量產生，或者增強的NUE和提高的生物量產生。
在另一實施方案中，如果降低分別包含核酸分子SEQ ID NO. 60或多肽SEQ ID NO. 61的擬南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子 或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物細胞、植物或其部分中降低分別包含表I、II 或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID NO. 60或多肽SEQ ID NO. 61同一行 的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“含有SET結構 域的蛋白”的活性，則賦予了與相應的未修飾(如未經轉化的)的野生型植物細胞、植物或 其部分相比提高的養分利用效率。在一個實施方案中，賦予了提高的氮利用效率。例如，在氮缺乏的條件下，賦予了與相應未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相 比提高為1. 05倍至1. 11倍的產量，例如加上其至少100%的產量提高。因此，在一個實施方案中，對于降低分別包含核酸分子SEQ ID NO. 94或多肽SEQ ID N0. 95的擬南芥核酸分子或多肽之活性的情況，或者對于在其他生物中缺失、抑制或降 低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情況，例如，如果在植物細胞、植物或其部分 中降低分別包含表I、II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID Ν0. 94或多 肽SEQID N0. 95同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或 者降低“At3g63270蛋白”的活性，則優選在所述植物細胞、植物或其部分中賦予了與野生型 對照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，如提高的養分利用效率(例如增強的 氮利用效率)和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生，特別是增強的NUE，或 者提高的生物量產生，或者增強的NUE和提高的生物量產生。在另一實施方案中，如果降低分別包含核酸分子SEQ ID N0. 94或多肽SEQ ID N0. 95的擬南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子 或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物細胞、植物或其部分中降低分別包含表I、II 或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID N0. 94或多肽SEQ ID N0. 95同一行的 核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“At3g63270蛋白” 的活性，則賦予了與相應的未修飾(如未經轉化的)的野生型植物細胞、植物或其部分相比 提高的養分利用效率。在一個實施方案中，賦予了提高的氮利用效率。例如，在氮缺乏的條件下，賦予了與相應未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相 比提高為1. 05倍至1. 23倍的產量，例如加上其至少100%的產量提高。因此，在一個實施方案中，對于降低分別包含核酸分子SEQ ID N0. 132或多肽SEQ ID N0. 133的擬南芥核酸分子或多肽之活性的情況，或者對于在其他生物中缺失、抑制或降 低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情況，例如，如果在植物細胞、植物或其部分 中降低分別包含表I、II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID Ν0. 132或多 肽SEQ ID N0. 133同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性， 或者降低“蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶”的活性，則優選在所述植物細胞、植物或其部分中 賦予了與野生型對照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，如提高的養分利用效 率(例如增強的氮利用效率)和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生，特別 是增強的NUE，或者提高的生物量產生，或者增強的NUE和提高的生物量產生。在另一實施方案中，如果降低分別包含核酸分子SEQ ID N0. 132或多肽SEQ ID N0. 133的擬南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分 子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物細胞、植物或其部分中降低分別包含表I、
29II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID NO. 132或多肽SEQ ID NO. 133同一 行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白絲氨酸/ 蘇氨酸磷酸酶”的活性，則賦予了與相應的未修飾(如未經轉化的)的野生型植物細胞、植 物或其部分相比提高的養分利用效率。在一個實施方案中，賦予了提高的氮利用效率。例如，在氮缺乏的條件下，賦予了與相應未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相 比提高為1. 05倍至1. 10倍的產量，例如加上其至少100%的產量提高。因此，在一個實施方案中，對于降低分別包含核酸分子SEQ ID NO. 171或多肽SEQ ID NO. 172的擬南芥核酸分子或多肽之活性的情況，或者對于在其他生物中缺失、抑制或降 低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情況，例如，如果在植物細胞、植物或其部分 中降低分別包含表I、II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID NO. 171或多 肽SEQ ID N0. 172同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性， 或者降低“蛋白激酶”的活性，則優選在所述植物細胞、植物或其部分中賦予了與野生型對 照相比提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，如提高的養分利用效率(例如增強的氮 利用效率)和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的生物量產生，特別是增強的NUE，或者 提高的生物量產生，或者增強的NUE和提高的生物量產生。在另一實施方案中，如果降低分別包含核酸分子SEQ ID N0. 171或多肽SEQ ID N0. 172的擬南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分 子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物細胞、植物或其部分中降低分別包含表I、 II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID N0. 171或多肽SEQ ID N0. 172同 一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白激酶” 的活性，則賦予了與相應的未修飾(如未經轉化的)的野生型植物細胞、植物或其部分相比 提高的養分利用效率。在一個實施方案中，賦予了提高的氮利用效率。例如，在氮缺乏的條件下，賦予了與相應未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相 比提高為1. 05倍至1. 30倍的產量，例如加上其至少100%的產量提高。在另一實施方案中，如果降低分別包含核酸分子SEQ ID N0. 171或多肽SEQ ID N0. 172的擬南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分 子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物細胞、植物或其部分中降低分別包含表I、 II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID N0. 171或多肽SEQ ID N0. 172同 一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白激酶” 的活性，則賦予了與相應的未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相比提高的非生物環境 脅迫耐性，特別是提高的低溫耐性。例如，賦予了與相應未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相比在低溫條件下提 高為1. 1倍至1. 15倍，或者例如加上其至少20%或至少100%的產量提高。在另一實施方案中，如果降低分別包含核酸分子SEQ ID N0. 171或多肽SEQ ID N0. 172的擬南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分 子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物細胞、植物或其部分中降低分別包含表I、 II或IV第7列申請號1中所示分別與核酸分子SEQ ID N0. 171或多肽SEQ ID N0. 172同 一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白激酶” 的活性，則賦予了與相應的未修飾(如未經轉化的)的野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的固有產量。在一個實施方案中，賦予了在標準條件下，例如無氮缺乏和無脅迫條件下提高的產量。例如，賦予了與相應未修飾(如未經轉化的)的野生型植物相比在標準條件下 (如無氮缺乏和無脅迫條件下)提高為1. 05倍至1. 19倍，例如加上其至少20 %或至少 100%的產量提高。上述比值具體指實際以提高的生物量(特別是地上部分鮮重生物量)衡量的提高
的產量。在一個實施方案中，在本發明方法中利用對由表Va所示核酸分子或表I所示其同 源物或包含所述核酸分子之基因的表達產物所賦予的活性進行降低或缺失來提高與野生 型對照相比的養分利用效率，例如提高氮利用效率。在一個實施方案中，在本發明方法中利用對由表Vb所示核酸分子或表I所示其同 源物或包含所示核酸分子之基因的表達產物所賦予的活性進行降低或缺失來提高與野生 型對照相比的脅迫耐性，例如提高低溫耐性。核對無⑶數據提供在一個實施方案中，在本發明方法中利用對由表Vd所示核酸分子或表I所示其同 源物或包含所示核酸分子之基因的表達產物所賦予的活性進行降低或缺失來提高與野生 型對照相比植物的固有產量，例如提高在標準條件下的產量，例如提高在無缺乏或無脅迫 條件下的生物量。就本發明的目的而言，原則上復數指代也表示包括單數指代，反之亦然。除非另外指明，否則術語“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互換使用。 除非另外指明，否則術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用。術語“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白質，這取決于使用術 語“序列”的上下文。本文使用的術語“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或 “核酸分子”指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)聚合形式。該術語僅涉 及分子的一級結構。因此，本文使用的術語“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分 子”包括雙鏈或單鏈的DNA和/或RNA。它們還包括已知類型的修飾，例如甲基化、“加帽”、 將一個或多個天然核苷酸取代為類似物。優選地，所述DNA或RNA序列包含編碼本文所述 多肽的編碼序列。“編碼序列”是核苷酸序列，其轉錄成RNA，例如調節性RNA (例如miRNA、ta-siRNA、 共阻抑分子、RNAi、核酶等)，或者轉錄成mRNA，其在置于適當調節序列控制下時翻譯成多 肽。編碼序列的邊界由5’端的翻譯起始密碼子和3’端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列 可包括但不僅限于mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或基因組DNA，在某些情況下也可存在內含子。本文使用的“核酸分子”還可包括位于編碼基因區3’和5’末端的非翻譯序列，例 如編碼區5’末端上游的至少500個、優選200個、特別優選100個核苷酸的序列，以及編碼 基因區3’末端下游至少100個、優選50個、特別優選20個核苷酸的序列。對于例如使用 反義、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶等技術的情況，可以有利地使用編碼區以及5’和/或3’區。然而，僅選擇編碼區用于克隆和表達目的經常是有利的。“多肽”指氨基酸的多聚體(氨基酸序列)，不涉及該分子的具體長度。因此，肽和 寡肽包括在多肽的定義之內。該術語還包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸 化等。該定義包括例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括如非天然氨基酸)的多肽、具 有取代鍵以及本領域已知的其他修飾(天然或非天然的)的多肽。本申請文件中使用術語“表I”用來指代表I A和表I B的內容。術語“表II”在 本申請文件中用來指代表π A和表II B的內容。術語“表I A”在本申請文件中用來指代 表I A的內容。術語“表I B”在本申請文件中用來指代表I B的內容。術語“表II A”在 本申請文件中用來指代表II A的內容。術語“表II B”在本申請文件中用來指代表II B 的內容。在一種優選的實施方案中，術語“表I”指表I B。在一種優選的實施方案中，術語 “表II”指表II B。在本說明書中使用時，術語“包含”或“包括”和其語法變化應理解為指存在所述 特征、整數、步驟或組分或其組，但不排除存在或添加一種或多種其他特征、整數、步驟、組 分或其組。根據本發明，術語“生物”在本文中理解為總是指非人生物，尤其是植物生物，其整 個生物、組織、器官或細胞。三聯體taa、tga和tag代表可互換的(常見)終止密碼子。術語“減少”、“抑制”、“降低”或“缺失”是指生物、生物部分(例如組織、種子、根、 塊莖、果實、葉、花等)或細胞中相應的特性改變。“特性的改變”應理解為特定體積中或者特 定蛋白質量中基因產物或代謝內容物的活性、表達水平或量相對于相應體積或量的對照、 參照或野生型的蛋白質發生改變。優選地，在減少、降低或缺失與基因產物活性的減少、降 低或缺失相關的情況下，體積中的總活性是減少、降低或缺失的，無論基因產物的量或者基 因產物的比活性或二者同時是否減少、降低或缺失，或者編碼該基因產物的核酸序列或基 因的量、穩定性或翻譯效率是否減少、降低或缺失。術語“減少”、“抑制”、“降低”或“缺失”包括所述特性僅在本發明受試者的一部分 中改變，例如，修飾可見于細胞區室(如細胞器)中或植物的一部分(包括但不限于組織、 種子、根、葉、塊莖、果實、花等)中，但在測試整體受試者(即完整的細胞或植物)時則檢測 不到。優選地，發現“減少”、“抑制”、“降低”或“缺失”是細胞性的，因此術語“活性的減少、 降低或缺失”或“代謝內容物的減少、降低或缺失”涉及與野生型細胞相比的細胞減少、降 低或缺失。另外，術語“減少”、“抑制”、“降低，，或“缺失”包括所述特性僅在本發明方法使 用的生物的不同生長時期期間改變，例如減少、抑制、降低或缺失僅在種子生長期間或開花 期間發生。另外，所述術語包括瞬時的減少、降低或缺失，例如因為使用的方法(例如反義、 RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta_siRNA、共抑制分子或核酶未被穩定整合在生物的基 因組中)，或者所述減少、降低、抑制或缺失處于調節元件或誘導元件(例如化學或其他誘 導型啟動子)的控制下，因此僅具有瞬時效應。因此，術語“減少”、“抑制”、“降低”或“缺失”表示特定體積中基因產物、酶或其他 蛋白質或調節RNA的比活性以及化合物或(例如多肽、核酸分子或編碼mRNA或DNA的)代 謝產物的量可以被減少、降低或缺失。術語“減少”、“抑制”、“降低”或“缺失”包括所述“減少”、“抑制”、“降低”或“缺失”的原因可以是被施用給生物或其部分的化合物。在本申請文件通篇中，表達產物(例如表II中所示蛋白質)活性或表達的缺失表 示活性的完全喪失。術語“減少”、“抑制”或“降低”是可互換的。除非另有說明，術語“減 少”應當包括術語“抑制”、“降低”或“缺失”。本文使用的術語“減少”、“抑制”、“降低”或“缺失”也包括術語“貶低”、“缺乏”、 “消除”或“使......降低”。減少還理解為表示可以例如通過kcat/Km值表述的底物特異性的修飾。在本文 中，功能或活性(例如酶活性或“生物活性”)與對照、參照或野生型相比被減少至少10%， 有利地減少20 %，優選30 %，特別優選40 %、50 %或60 %，更特別70 %、80 %、85 %或90 % 或更多，非常特別優選95 %，更優選99 %或更多。最優選活性量的減少、降低或缺失基本為 100%。因此，一個尤其有利的實施方式是化合物(例如多肽或核酸分子)功能的失活。表達水平或活性的減少、抑制或缺失導致在轉基因植物與參照或野生型相比顯示 提高的產量，尤其是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效 率和/或提高的對環境脅迫的耐性和/或生物量產生時，所表達的與相應的(例如未經轉 化的)野生型植物相比10%、20%、30%、40%、50%、100%、150%或200%或更多，優選 250 %或300 %或更多，特別優選350 %或400 %或更多，最特別優選500 %或600 % w/w的提 高的產量，尤其是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率 和/或提高的對環境脅迫的耐性和/或生物量產生。術語化合物的“活性”是指化合物在生物系統例如細胞、器官或生物中的功能。例 如，術語化合物的“活性”是指酶功能、調節功能或其作為化合物的結合配偶體、轉運蛋白、 調節子或運載體等等的功能。在一個實施方案中，根據相應的上下文，術語“生物活性”是指選自Atlg74730蛋 白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶以及含有SET結構域的蛋白的 活性。術語“增強”、“提高”、“降低”、“抑制”或“減少”或類似的術語包括僅在本發明受
試者的一個或一些部分中以及所有部分中所述特性的改變或調節。例如，修飾可見于細胞 區室(如細胞器)中或優選植物的一部分(如組織、種子、根、葉、果實、塊莖、花等)中，但 在測試整體受試者(即完整的細胞或植物)時則檢測不到。更優選下述發現所述特性的改變或調節見于生物(特別是植物)的多于一個的 部分中。因此，在一個實施方案中，所述特性的改變或調節見于根據本發明的方法生產植 物的的組織、種子、根、果實、塊莖、葉和/或花中。然而，本文使用的術語“增強”、“提高”、“降低”、“抑制”或“減少”或類似的術語還
包括所述特性在所提到的整個生物中的改變或調節。術語“增強的”或“提高”表示與相應(例如未經轉化的)野生型植物相比10%、 20 %、30 %、40 %或50 %或更高，優選至少60 %、70 %、80 %、90 %或100 %或更高，更優選 150%、200%、300%、400%或500%或更高的提高的產量，特別是提高的產量相關性狀，例 如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的環境脅迫耐性和/或提高的 生物量產生。在一個實施方案中，提高如實施例中所示計算。
33
在本發明的一個實施方案中，根據以下方法對增強的NUE進行測定和定量在培 養室(SvaWf Weibull，Sval6v, Sweden)中的盆中培養經轉化的植物。在植物為擬南芥 的情況下，將其種子種在盆中，其中含有營養缺乏土(( "Einheitserde Typ 0”，30%粘土， Tantau，Wansdorf德國))和沙子的1 1 (ν ν)混合物。通過黑暗中4°C下的4天時間 來誘導萌發。隨后將植物在標準培養條件下培養。在植物為擬南芥的情況下，標準培養條 件為16小時光照和8小時黑暗的光周期、20°C、60%相對濕度和200 μ E的光子通量密度。 培養并栽培植物。在植物為擬南芥的情況下，每隔一天用N缺乏的營養液澆水。N缺乏營養 液例如在水中含有以下物質，但不含其他含氮的鹽
權利要求
與相應野生型植物相比提高植物產量的方法，所述方法包括降低植物或其部分中選自以下的一種或多種活性At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶以及含有SET結構域的蛋白。
2.產生與相應未經轉化的野生型植物細胞、植物或其部分相比具有提高的產量的轉基 因植物細胞、植物或其部分的方法，所述方法包括以下步驟(a)降低、抑制或缺失植物細胞、植物或植物部分中選自以下的一種或多種活性 Atlg74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和含有SET結構域 的蛋白；和(b)產生與相應未經轉化的野生型植物細胞、植物或其部分相比具有增強的NUE和/或 提高的生物量產生之轉化植物細胞、植物或其部分，并在允許該植物細胞、植物或其部分發 育的條件下進行培養。
3.用于產生與相應未經轉化的野生型植物相比具有提高的產量的轉基因植物細胞、植 物或其部分的方法，所述方法包括以下步驟(a)降低、抑制或缺失植物細胞、植物或其部分中的以下活性(i)分別包含表II或表IV第5或7列所示多肽、共有序列或至少一種多肽基序的多 肽；或( )包含表I第5或7列所示多核苷酸的核酸分子的表達產物，(iii)或者⑴或( )的功能等同物；和(b)產生與相應的未經轉化的野生型植物細胞、植物或其部分相比具有增強的NUE和/ 或提高的生物量產生的轉化植物，并在允許該植物發育的條件下進行培養。
4.權利要求1到3中任一項所述的方法，所述方法包括降低、減少或缺失至少一種下述 核酸分子的表達或活性，所述核酸分子具有或編碼表I第5列所示核酸分子的至少一種核 酸分子的活性，并包含選自以下的或者包含與下述內容互補的序列的核酸分子(a)編碼表II第5或7列所示多肽的核酸分子；(b)表I第5或7列所示核酸分子；(c)核酸分子，其由于遺傳密碼的簡并性而能夠衍生自表II第5或7列所示多肽序列；(d)核酸分子，其與包含表I第5或7列所示核酸分子之多核苷酸的核酸分子序列具有 至少30%同一性；(e)編碼多肽的核酸分子，所述多肽與(a)至(c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具 有至少30%同一性，并具有包含表I第5列所示多核苷酸的核酸分子的活性；(f)編碼多肽的核酸分子，所述多肽能夠借助于針對(a)至(e)核酸分子之一所編碼多 肽而產生的單克隆抗體或多克隆抗體來分離，并具有包含表I第5列所示多核苷酸的核酸 分子的活性；(g)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列所示共有序列或者一種或多種多 肽基序，并優選具有包含表II或IV第5列所示多核苷酸的核酸分子的活性；(h)編碼多肽的核酸分子，所述多肽具有表II第5列所示蛋白質的活性；(i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過用表III第7列的引物擴增cDNA文 庫或基因組文庫而獲得，并優選具有包含表II或表IV第5列所示多核苷酸的核酸分子的 活性，所述引物在其5’端不以核苷酸ATA開始；(j)編碼多肽的核酸分子，所述多肽通過在(a)至(d)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序 列中取代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸而產生；和(k)核酸分子，其能夠通過在嚴格雜交條件下篩選合適的核酸文庫而獲得，其中使用包 含(a)或(b)核酸分子之互補序列的探針或其片段，所述探針或其片段具有與(a)至(d)所 表征的核酸分子序列互補的核酸分子的至少15nt，優選20nt，30nt，50nt，lOOnt，200nt或 500nt，并編碼下述多肽，所述多肽具有包含表II第5列所示多肽的蛋白質的活性；或者降低、抑制、減少或缺失包含(a)至(k)所示核酸分子的核酸分子的表達產物，例 如包含表II第5或7列所示多肽的多肽；或者所述核酸分子所編碼的蛋白質的表達產物。
5.權利要求1到4中任一項的方法，包括降低植物細胞、植物或其部分中下述多肽的活 性或表達，所述多肽包含權利要求3所表征的核酸分子所編碼的多肽。
6.權利要求1到5中任一項的方法，其中所述方法包括至少一個選自以下的步驟(a)引入編碼核糖核酸序列的核酸分子，所述核糖核酸序列能形成雙鏈核糖核酸分子， 其中所述雙鏈核糖核酸分子的至少17nt片段與選自以下的核酸分子具有至少50%的同源 性(i)權利要求1到3中任一項表征的核酸分子；( )核酸分子，其如表I第5或7列所示，或者編碼如表II第5或7列所示的多肽，和(iii)核酸分子，其編碼具有表II第5列所示多肽之活性的多肽，或者編碼包含表I第 5或7列所示核酸分子之多核苷酸的表達產物；(b)引入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核酸分 子，其中所述RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta_siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核酸分 子包含與選自本權利要求(a)部分所定義的核酸分子具有至少50%同源性的至少17nt的 片段；(c)引入核酶，其特異性切割選自本權利要求(a)部分所定義的核酸分子；(d)引入(b)中表征的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶 或反義核酸分子以及(c)中表征的核酶；(e)引入有義核酸分子，以誘導內源表達產物的共抑制，所述有義核酸分子賦予下述核 酸分子表達，所述核酸分子包含選自權利要求2到3任一項中定義組的或本權利要求(a) ( )或(a) (iii)部分所定義的核酸分子，或是編碼下述多肽的核酸分子，所述多肽與權利 要求3(a)至(c)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50%同一性，并具有包含表 II第5列所示多肽之蛋白質的活性，(f)引入賦予蛋白質顯性負突變體表達的核酸分子，所述蛋白質具有表II第5或7列 所示蛋白質的活性，或者包含由權利要求2到3中任一項表征的核酸分子編碼的多肽；(g)引入編碼下述因子的核酸分子，所述因子與核酸分子結合，所述核酸分子包含選自 權利要求2到3中任一項定義的或者本權利要求(a) (ii)或(a) (iii)部分所定義的核酸 分子，其賦予蛋白質表達，所述蛋白質具有權利要求2到3中任一項表征的核酸分子所編碼 的蛋白質的活性；(h)引入賦予RNA分子降低的病毒核酸分子，所述RNA分子包含選自權利要求2到3中 任一項定義的或者本權利要求(a) ( )或(a) (iii)部分所定義的核酸分子，其賦予蛋白質 表達，所述蛋白質由權利要求2到3中任一項表征的核酸分子所編碼；(i)引入能與內源基因重組并使其活性沉默、失活、抑制或降低的核酸構建體，所述內 源基因包含選自權利要求2到3中任一項定義的或者本權利要求(a) (ii)或(a) (iii)部 分所定義的核酸分子，其賦予蛋白質表達，所述蛋白質由權利要求2到3中任一項表征的核 酸分子所編碼；(j)在內源基因中引入非沉默突變，所述內源基因包含權利要求2到3中任一項中定義 的或者本權利要求(a) (ii)或(a) (iii)部分所定義的核酸分子；(k)引入表達構建體，其賦予(a)至(i)中任一項所表征核酸分子的表達。
7.權利要求1到6中任一項所述的方法，其中包含下述核酸分子的序列之至少17bp且 具有至少50%同一性的3’或5’核酸序列片段被用于減少權利要求2到3中任一項表征的 核酸分子或所述核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子選自權利要求2到3中任一項定義的 組或由本權利要求(a) (ii)或(a) (iii)部分所定義。
8.權利要求1到7中任一項所述的方法，其中所述植物選自漆樹科、菊科、傘形科、樺木 科、紫草科、十字花科、鳳梨科、番木瓜科、大麻科、旋花科、藜科、葫蘆科、胡頹子科、杜鵑花 科、大戟科、豆科、櫳牛兒苗科、禾本科、胡桃科、樟科、豆科、亞麻科、多年生草本、飼用作物、 蔬菜和觀賞植物。
9.權利要求1到8中任一項的方法，包括引入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗體和/或反義核酸的步驟，其被設計成靶向基因的表達產 物以誘導所述目的基因mRNA斷裂，由此使基因表達沉默，或者引入確保前者表達的表達 盒，所述基因包含權利要求2到3任一項中表征的核酸分子。
10.分離的核酸分子，其包含選自以下的核酸分子(a)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含表IIB第5或7列所示多肽；(b)核酸分子，其包含表IB第5或7列所示多核苷酸；(c)包含下述核酸序列的核酸分子，所述核酸序列由于遺傳密碼的簡并性而能夠衍生 自表II B第5或7列所示多肽序列，并具有表II第5列所示蛋白質的活性；(d)編碼多肽的核酸分子，所述多肽與(a)或(c)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列 具有至少50%同一性，并具有表II第5列所示蛋白質的活性；(e)編碼多肽的核酸分子，所述多肽借助于針對(a)至(c)核酸分子之一所編碼多肽而 產生的單克隆抗體來分離，并具有表II第5列所示蛋白質的活性；(f)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列所示共有序列或多肽基序，并具有 表II第5列所示蛋白質的生物活性；(g)編碼多肽的核酸分子，所述多肽具有表II第5列所示蛋白質的活性；(h)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用表III第7列所示引物擴增 cDNA文庫或基因組文庫而獲得，所述引物在其5’端不以核苷酸ATA開始；和(i)核酸分子，其可通過在嚴格雜交條件下篩選合適的文庫而獲得，并編碼多肽，所述 多肽具有表II第5列所示蛋白質的活性，所述篩選中使用包含(a)到(c)核酸分子序列之 一的探針或使用(a)至(h)任一項所表征核酸分子的至少17nt的片段；或者包含與其互補的序列；其中(a)至(i)的核酸分子至少在一個或多個核苷酸上與表I A第5或7列所示序列 不同，并優選地編碼至少在一個或多個氨基酸上與表II A第5或7列所示蛋白質序列不同的蛋白質。
11.RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗體或反義核酸分 子，其用于降低權利要求1表征的活性，或者降低權利要求2到10任一項中表征的核酸分 子或所述核酸分子編碼的多肽的活性或表達。
12.權利要求的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反義 核酸分子，其包含權利要求10的核酸分子的至少17nt的片段。
13.雙鏈RNA(dsRNA)、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、反義或 ta-siRNA 分子或核酶，其能 夠形成雙鏈核糖核酸分子，其中所述雙鏈核糖核酸分子的至少17nt的片段與選自以下的 核酸分子具有至少50%的同源性(i)權利要求2到3中任一項表征的核酸分子；( )核酸分子，其如表I第5或7列所示，或者編碼如表II第5或7列所示的多肽，和(iii)核酸分子，其編碼具有表II第5或7列所示多肽之活性的多肽，或者編碼包含表 I第5或7列所示核酸分子之多核苷酸的表達產物。
14.權利要求10到13中任一項的dsRNA分子，其中所述有義鏈和反義鏈彼此共價結 合，并且反義鏈與“有義” RNA鏈基本互補。
15.賦予RNA分子降低的病毒核酸分子，所述RNA分子賦予具有權利要求1表征的活性 的蛋白質表達，或者權利要求2到10中任一項表征的核酸分子的活性或表達，或者所述核 酸分子所編碼多肽的活性或表達。
16.用于鑒定基因敲除的tilling引物，所述基因包含表I第5或7列中任一項所示核 酸分子的核酸序列。
17.多肽的顯性負突變體，所示多肽包含表II第5或7列所示多肽。
18.編碼權利要求17的顯性負突變體的核酸分子。
19.權利要求16的tilling引物，其包含表I第5列或第7列中所示核酸序列的片段 或其互補片段。
20.賦予以下表達的核酸構建體權利要求11到14中任一項的RNAi、snRNA、dsRNA、 siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗體或反義核酸分子，權利要求15的病毒核酸 分子或者權利要求10的核酸分子。
21.核酸構建體，其包含權利要求10所述的分離的核酸分子，或權利要求11到14中任 一項的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA,miRNA, ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核酸分子，或 權利要求15的病毒核酸分子，其中所述核酸分子與一個或多個調節信號功能性連接。
22.載體，其包含權利要求10所述的核酸分子，或權利要求11到14中任一項的RNAi、 snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反義核酸分子，或權利要求15 的病毒核酸分子，或權利要求21中所述核酸構建體。
23.權利要求22中所述載體，其中所述核酸分子與用于在植物細胞、植物或其部分中 表達的調節序列有效連接。
24.轉基因植物細胞、植物或其部分，其穩定轉染或瞬時轉染了權利要求22或23中所 述載體，或權利要求10所述核酸分子，或權利要求20或21中所述核酸構建體。
25.轉基因植物細胞、植物或其部分，其中包含表II第5或7列、優選表IIB第5或7 列，或者表IV第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的蛋白質的活性被降低，或者包含表I第5或7列、優選表I B第5或7列所示核酸分子的核酸分子被降低。
26.權利要求24或25的來自于單子葉植物的轉基因植物細胞、植物或其部分。
27.權利要求24或25的來自于雙子葉植物的轉基因植物細胞、植物或其部分。
28.權利要求24或25的轉基因植物細胞、植物或其部分，其中所述植物選自玉米(玉 蜀黍)，小麥，黑麥，燕麥，黑小麥，稻，大麥，大豆，花生，棉花，油菜(包括蕓苔和冬季油菜)， 木薯，胡椒，向日葵，亞麻，琉璃苣，紅花，亞麻子，報春花，油菜，蕪青，萬壽菊，茄科植物，馬 鈴薯，煙草，茄子，西紅柿，蠶豆屬物種，豌豆，苜蓿，咖啡，可可，茶，柳屬物種，油棕，椰子，多 年生草本植物，飼料作物和擬南芥。
29.權利要求24或25的轉基因植物細胞、植物或其部分，其中所述植物選自玉米、大 豆、油菜(包括蕓苔和冬季油菜)、棉花、小麥和稻。
30.分離的多肽，其由權利要求10所述核酸分子編碼或者包含表IIB第7列所示多肽。
31.與權利要求31所述多肽特異性結合的抗體。
32.包含權利要求24或25所述植物細胞的植物組織、植物、收獲的植物材料或繁殖材料。
33.用于生產由權利要求10所述核酸序列編碼的多肽的方法，所述多肽在權利要求24 或25所述的宿主細胞中表達。
34.權利要求24或25的轉基因植物細胞、植物或其部分，其在對于未經轉化的的野生 型植物細胞、植物或其部分的生長而言氮有限的條件下具有提高的產量。
35.篩選權利要求1表征的活性或權利要求2到3中任一項表征的核酸分子所編碼多 肽之活性的拮抗劑的方法i)將表達該多肽的生物、其細胞、組織或部分與化合物或含有多種化合物的樣品在下 述條件下相接觸，該條件允許降低或缺失編碼該蛋白之活性的核酸分子的表達或者允許降 低或缺失該蛋白之活性； )測定所述植物、其細胞、組織或部分中蛋白質的活性水平或者多肽的表達水平；和 iii)通過將測得的蛋白質活性水平或多肽表達水平與下述條件下測得的標準蛋白質 活性水平或多肽表達水平進行比較而鑒定拮抗劑，該條件無所述化合物或包含所述多種化 合物的樣品，其中與標準相比降低的水平表示所述化合物或者包含所述多種化合物的樣品 是拮抗劑。
36.用于鑒定賦予植物中與相應未經轉化的野生型植物相比提高產量的化合物和/或 的方法；所述方法包括步驟(i)培養或維持植物或其部分，其表達具有權利要求1表征的活性的多肽，或者由權利 要求2或3中任一項表征的核酸分子所編碼的多肽，或者編碼所述多肽的多核苷酸，以及能 與所述多肽在合適條件下相互作用的讀出系統，所述條件允許該多肽與此讀出系統在化合 物或含有多種化合物的樣品存在下相互作用，并且所述讀出系統能夠應答于化合物與所述 多肽在允許抑制所述讀出系統及所述多肽的條件下的結合而提供可檢測信號；和( )通過檢測所述讀出系統所產生的信號的存在與否或者下降或提高來鑒定該化合 物是否是有效的拮抗劑。
37.組合物，其包含根據權利要求30的蛋白質，權利要求10的核酸分子，權利要求20或21的核酸構建體，權利要求22或23的載體，根據權利要求35鑒定的拮抗劑，權利要求 31的抗體，權利要求24到29中任一項的植物，權利要求2到3中任一項表征的核酸分子， 權利要求 11 到 14 中任一項的 RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta-siRNA、共阻抑分子、 核酶或反義核酸分子，以及任選的農業可接受運載體。
38.食物或飼料組合物，其包含根據權利要求30的蛋白質，權利要求10的核酸分子，權 利要求20或21的核酸構建體，權利要求22或23的載體，根據權利要求35鑒定的拮抗劑， 權利要求31的抗體，權利要求24到29中任一項的植物，權利要求2到3中任一項表征的 核酸分子，權利要求 11 到 14 中任一項的 RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA, ta-siRNA、共 阻抑分子、核酶或反義核酸分子，權利要求32或36的植物的植物、植物組織、收獲的植物材 料或繁殖材料。
39.i)權利要求11到14中任一項的核酸分子，權利要求15的病毒核酸分子或權利要 求10的核酸分子，或ii)根據權利要求20或21的核酸構建體，或iii)權利要求22或23的載體；用于制備與相應未經轉化的野生型植物細胞、植物或植物部分相比具有增強的NUE和 /或提高的生物量產生的植物細胞的用途。
40.用于測定受試土壤氮含量的方法，所述方法包括以下步驟a)任選地，在無氮缺乏的土壤中培養包含權利要求11到14中任一項的核酸分子的植 物，比較產量并測定所述植物與所述土壤中培養的對照植物產量的產量差異，優選地與野 生型植物比較，并且在所述植物與對照植物相比不顯示提高的產量時選擇所述植物；b)將包含權利要求11到14中任一項的核酸分子的所述植物在要測試的土壤中培養，c)比較產量，并測定所述植物生產的產量與相同條件下在所述土壤中培養的對照植物 的產量的差異，優選地與野生型植物相比，其中與所述對照植物相比所述植物提高的產量表明土壤的氮缺乏。
全文摘要
本發明總體而言涉及轉化的植物細胞以及植物或其部分，其包含失活或下調的基因，其導致與例如未經轉化的野生型細胞相比提高的產量，尤其是提高的產量相關性狀，例如提高的養分利用效率，例如增強的氮利用效率和/或提高的生物量產生，本發明還涉及產生這些植物細胞或者植物或其部分的方法。
文檔編號C12N15/82GK101952444SQ200880127271
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月19日 優先權日2007年12月21日
發明者O·布萊辛, O·蒂姆, P·普齊奧 申請人:巴斯夫植物科學有限公司