經修飾葡萄糖脫氫酶基因的制作方法

專利名稱：經修飾葡萄糖脫氫酶基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶，催化葡萄糖1位的羥基脫氫 (氧化)反應的FAD綴合型葡萄糖脫氫酶(GLD)。更具體的涉及具有改良的底物特異性的經修飾GLD多肽、及編碼經修飾GLD的多核苷酸、所述酶的制備方法、葡萄糖的測定方法，其特征是使用所述酶、葡萄糖測定試劑組合物、及葡萄糖測定用生物傳感器等。此外，在本說明書中若無特別說明，葡萄糖等單糖均指D-型。
背景技術：
血中葡萄糖濃度是糖尿病的重要指標。以往，使用葡萄糖氧化酶來測定血中葡萄 糖濃度，但葡萄糖氧化酶受到溶解氧濃度的影響，計算值會產生誤差，因此近年來不受氧影 響的葡萄糖脫氫酶也被廣泛使用。作為不受氧影響的市售葡萄糖脫氫酶，已知有以吡咯喹啉醌(PQQ)為輔酶的葡萄 糖脫氫酶(PQQ-GDH)，但以往的PQQ-GDH存在對麥芽糖或半乳糖等葡萄糖以外的糖也反應 的缺點。對此，本發明人，以FAD作為輔酶，從土曲霉菌(Aspergillus terreus)FERM BP-08578株中發現了新的可溶性GLD(專利文獻1)，成功對基因克隆(專利文獻2)。這些 GLD具有如不受溶解氧的影響，氧化葡萄糖1位上的羥基，對麥芽糖或半乳糖作用性(酶活 性)低的至今所沒有的優點。此夕卜，專利文獻3中所示的源于淡紫刺糙青霉菌 (Penicilliumlilacinoechinulatum) NBRC6231、意大利青霉菌(Penicillium i tali cum) NBRC32032及米曲霉菌(Aspergillus oryzae) TI株的葡萄糖脫氫酶或專利文獻4中公開的 源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)BB-56株的葡萄糖脫氫酶也顯示出對麥芽糖或半乳糖 作用性低。但是，這些以往的GLD存在底物特異性尚未改進的問題。專利文獻1 國際公開第2004/058958號單行本專利文獻2 國際公開第2006/101239號單行本專利文獻3 國際公開第2007/116710號單行本專利文獻4 國際公開第2007/139013號單行本

發明內容
發明擬解決的技術課題以往所知的GLD存在對木糖作用的缺點，對于進行木糖吸收實驗的患者來說，顯
3示比實際血糖值高的值，故被建議不要使用。因此，對葡萄糖具有較高特異性的GLD存在需求，而提供該GLD是本發明應解決的課題。本發明的目的是提供解決上述課題，編碼具有對葡萄糖反應性及底物識別能力強，同時對麥芽糖及半 乳糖，特別是木糖作用性低等特點的經修飾GLD的新基因(多核苷酸)；使用經該基因重組的轉化細胞制備該酶的方法；并且葡萄糖的測定方法，其特征是使用所得到的酶；葡萄糖測定試劑組合物；及葡萄糖測定用生物傳感器等。解決課題的技術方案本發明涉及以下各種實施方式。實施方式1經修飾葡萄糖脫氫酶(GLD)，其 在SEQ ID NO :1所示的野生型FAD綴合型葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列中包含選 自下列位的氨基酸的至少1個氨基酸殘基的置換:37、69、72、73、76、78、102、217、228、240、 356、407、424、437、527 和 530 位的氨基酸；且 木糖作用性/葡萄糖作用性相比野生型GLD降低。實施方式2實施方式1的經修飾葡萄糖脫氫酶，其中所述木糖作用性/葡萄糖 作用性相比野生型GLD降低至0. 85倍以下。實施方式3實施方式1或2的經修飾葡萄糖脫氫酶，其中氨基酸置換選自· D72A、G73D、G73A、G73S、G73C、G73Q、G73W、G73Y、G73E、G73H、R102H、Y228H、 V356A 及 P527L ；且· S37V、S37G、T69I、L76F、F78L、R102V、N217S、P240I、P240L、Q407A、Q407S、Y424S、 A437I 及 T530A。實施方式4經修飾葡萄糖脫氫酶，其在SEQID NO=I所示的野生型FAD綴合型 葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列中具有選自下列的氨基酸置換· N64D+R102H+L250Q、G73D、Y228H+A589T、K374Q+P527L、V356A、D72A+G210S、 G73A、P527L、D72A、Y228H、G73C、G73H、R102H、D72A+G73D、G73S、G73Q、G73W、G73Y 及 G73E ； 且· S37V、S37G、T69I、L76F、F78L、R102V、N217S、P240I、P240L、Q407A、Q407S、Y424S、 A437I 及 T530A。實施方式5多核苷酸，其編碼實施方式1 4中任一項的經修飾葡萄糖脫氫酶。實施方式6實施方式5的多核苷酸，編碼SEQID NO=I所示的野生型FAD綴合 型葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列的多核苷酸具有SEQ ID NO :2所示的堿基序列。實施方式7重組載體，其具有實施方式5或6的多核苷酸。實施方式8經轉化細胞，其通過用實施方式7的重組載體來制備。實施方式9實施方式8的經轉化細胞，其為大腸桿菌或米曲霉菌。實施方式10經修飾GLD的制備方法，其特征在于，培養實施方式8或9的經轉 化細胞，并從所得到的培養物收獲經修飾GLD。
實施方式11葡萄糖測定方法，其特征在于使用 實施方式1 4中任一項的經修飾GLD，或 通過實施方式10的制備方法得到的經修飾GLD。實施方式12葡萄糖測定試劑組合物，其特征在于含 實施方式1 4中任一項的經修飾GLD，或 通過實施方式10的制備方法得到的經修飾GLD。實施方式13葡萄糖測定用生物傳感器，其特征在于使用 實施方式1 4中任一項的經修飾GLD，或 通過實施方式10的制備方法得到的經修飾GLD。發明效果通過利用本發明的多核苷酸，可采用如基因重組技術，制備均質且大量的，具有如 對葡萄糖底物識別性高，且對麥芽糖或木糖作用性低的優點的經修飾GLD。附圖簡述

圖1示使用本發明的經修飾GLD繪制的測定葡萄糖用的標準曲線。實施方式本發明的經修飾GLD的特征在于，其 在下示表1 (氨基酸單字符表示)的SEQ ID N0:1(含信號肽)所示的野生型 FAD綴合型葡萄糖脫氫酶(GLD)的氨基酸序列中包含選自下列位的氨基酸的至少1個氨基 酸殘基的置換:37、69、72、73、76、78、102、217、228、240、356、407、424、437、527 和 530 位的
氨基酸；且 木糖作用性/葡萄糖作用性相比野生型GLD降低。作為上述氨基酸殘基置換中的代表例，可例舉選自下列的氨基酸置換D72A、 G73D、G73A、G73S、G73C、G73Q、G73W、G73Y、G73E、G73H、R102H、Y228H、V356A 及 P527L ；且 S37V、S37G、T69I、L76F、F78L、R102V、N217S、P240I、P240L、Q407A、Q407S、Y424S、A437I 及 T530A。本發明的經修飾GLD是具有本說明書中定義的“木糖作用性/葡萄糖作用性” (％) 相比野生型GLD降低至顯著的值(例如，至少為0. 85倍以下，優選0.5倍以下，更優選為0.3 倍以下，更優選為0.2倍以下)的木糖作用性的經修飾GLD。此外，由于木糖作用性/葡萄 糖作用性根據轉化體的培養條件及酶活性測定條件等的不同而會有所變化，因此，有必要 在同一條件下對野生型GLD與經修飾GLD的木糖作用性/葡萄糖作用性(％ )進行測定比 較。此外，本發明的經修飾GLD是具有以下優良特點的經修飾GLD，S卩，當對D-葡萄糖 的酶活性值為100%時，對麥芽糖酶活性值(也稱為“麥芽糖作用性/葡萄糖作用性”)優 選為5%，更優選為3%以下；對D-半乳糖的酶活性值(也稱為“半乳糖作用性/葡萄糖作 用性”)優選為5%以下，更優選為3%以下。并且，本發明的經修飾GLD在上述氨基酸置換基礎上，也可以在SEQ ID N0:1所示 的氨基酸序列中再置換、缺失或添加一個 幾個氨基酸，只要能夠像上述那樣相比野生型 GLD木糖作用性/葡萄糖作用性降低即可。作為本發明的經修飾GLD的適宜例，如實施例中具體記載的那樣，是在SEQ IDNO :1所示的野生型GLD的氨基酸序列中具有選自下列的氨基酸置換及下列氨基酸置換 之任意組合的經修飾 GLD :N64D+R102H+L250Q、G73D、Y228H+A589T、K374Q+P527L、V356A、 D72A+G210S、G73A、P527L、D72A、Y228H、G73C、G73H、R102H、D72A+G73D、G73S、G73Q、G73W、 G73Y 及 G73E ；且 S37V、S37G、T69I、L76F、F78L、R102V、N217S、P240I、P240L、Q407A、Q407S、 Y424S、A437I 及 T530A。作為編碼本發明的經修飾GLD的多核苷酸的一例，可例舉作為編碼SEQ ID NO 1(表1)中所示野生型GLD的氨基酸序列的多核苷酸，具有SEQ ID N0:2(表2)中所示的 堿基序列的多核苷酸。另外，只要是編碼同一氨基酸，也可使用其他密碼子。如，可以根據 待轉化宿主細胞的種類等來適當優化使用密碼子。表1MLGKLSFLSALSLAVAAPLSNSTSAKYDYIVIGGGTSGLAVANRLSEDPNVNVLILEAGGSVWNNPNVTNVDGYGLAFGSDIDWQYQSVNQPYGGNLSQVLRAGKALGGTST
INGMAYTRAEDVQIDAWETIGNTGWTWKNLFPYYRKSENFTVPTKSQTSLGASYEAGAHGHEGPLDVAFTQIESNNLTTYLNRTFQGMGLPWTEDVNGGKMRGFNLYPSTVNLEEYVREDAARAYYffPYKSRPNLHVLLNTFANRIVffDGEAHDGHITASGVEITSRNGTVRVINAEKEVIVSAGALKSPAILELSGIGNPSVLDKHNIPVKVNLPTVGENLQDQVNSHMDASGNTSISGTKAVSYPDVYDVF⑶EAESVAKQIRANLKQYAADTAKANGNIMKAADLERLFEVQYDLIFKGRVPIAEVLNYPGSATSVFAEFWALLPFARGSVHIGSSNPAEFPVINPNYFMLDWDAKSYVAVAKYIRRSFESYPLSSIVKESTPGYDVIPRNASEQSWKEWVFDKNYRSNFHPVGTAAMMPREIGGVVDERLNVYGTTNVRVVDASVLPFQVCGHLVSTLYAVAERAADLIKADAGRR(592AA)表2atgttgggaaagctctccttcctcagtgccctgtccctggcagtggcggcacctttgtccaactccacg tccgccaaatatgattatatcgttattggaggcggtactagcggtttggccgtcgcaaaccgtctatcggaggatccaaacgt gaacgtactcattctggaggccggtggctcggtctggaacaatcccaatgtcacaaacgtggatggctacgggcttgcttttgg gtctgacattgactggcaataccagtccgtcaaccagccatatggaggcaaccttagtcaagtgcttcgtgccggcaaggccc ttggtggtactagtactatcaatggcatggcctatacgcgcgccgaggatgtccagatcgacgcctgggaaaccattggcaac acaggatggacgtggaagaatctgttcccttactatcggaagagcgagaactttactgtccctaccaaatcgcagacctctc ttggagcgtcgtatgaagctggagcccacggccacgagggtccccttgacgttgccttcactcagatcgagtcgaacaacctga ccacttacctcaaccgtaccttccagggcatgggactcccatggacggaggacgtcaatggcggaaagatgcgcggctttaact tatacccctccaccgtgaatcttgaggagtatgtgcgcgaagacgccgctcgtgcatactactggccctacaagtcccgtccc
6aacttgcatgtcctgctcaacacttttgccaaccggattgtgtgggacggcgaagcccatgacggccacatcactgccagtggt gtcgagatcacttccaggaacggcactgttcgtgttatcaatgcggagaaggaagtcattgtctctgccggtgccttgaagtcc ccggctatccttgaactttctggaattggcaaccctagcgttcttgacaagcacaacatccccgtcaaggtcaacctcccgact gtcggcgagaaccttcaggaccaagtgaacagccacatggatgcatcgggcaacacttccatctctggaaccaaggcagtctcc taccccgatgtctatgacgtcttcggtgacgaagccgagtcggtcgccaaacagatccgtgccaacctgaagcaatacgccgc cgacaccgccaaggccaacggaaacattatgaaggccgccgatctggagcgtctcttcgaggtccagtatgaccttattttc aagggcagagttccaatcgctgaagtcctgaactatccgggcagcgcgacgtccgtgtttgcagaattctgggccctccttcc cttcgctcgtggaagtgttcacatcggttcttcaaacccggccgagttccctgtcatcaaccccaactatttcatgctcgactgg gacgcgaagagctacgttgccgttgcgaagtatatccgccgttcgttcgagagctaccctctcagcagtatcgtgaaggagtcta cccctggctatgatgttatcccccggaacgcttctgagcagagctggaaagaatgggtctttgataagaactatcgttctaactt ccatcccgtcggcacggctgccatgatgcctcgtgagattggtggtgtcgtggacgagcgtctgaatgtctatggcactacgaa tgtcagagttgtagatgcttcggtccttccattccaggtctgcggccatttggtgagcacactatacgctgtggccgaacggg cggcggatctcatcaaggccgatgctggtcgtcgttag(1779bp)此外，在本發明中，所謂“多核苷酸”是指由嘌呤或嘧啶與糖以β-N-糖苷鍵鍵合 形成的核苷的磷酸酯(ATP (三磷酸腺苷)、GTP (三磷酸鳥苷)、CTP (三磷酸胞苷)、UTP (三 磷酸尿苷)；或dATP(三磷酸脫氧腺苷)、dGTP(三磷酸脫氧鳥苷)、dCTP(三磷酸脫氧胞 苷)、dTTP (三磷酸脫氧胸苷))鍵合100個以上而成的分子，具體包括編碼本發明的經修 飾GLD的染色體DNA(含內含子的DNA)、從染色體DNA轉錄的mRNA、由mRNA合成的cDNA及 以它們為模板經PCR擴增得到的多核苷酸。“寡核苷酸”是指核苷酸連接2 99個而成的 分子。此外，所謂“多肽”是指由通過酰胺鍵(肽鍵)或非天然殘基連接互相鍵合的30個以 上的氨基酸殘基構成的分子，還包括它們上附加糖鏈的分子或經人工化學修飾的分子等。 此外，本發明的多核苷酸中也可以根據轉化細胞的種類等適當包含編碼經修飾GLD的信號 序列的堿基序列。本發明的多核苷酸可以采用本領域技術人員公知的任意方法輕松制備。例如，如 本說明書實施例中具體記載，從含有具有SEQ ID NO :2所示堿基序列的多核苷酸的質粒中 分離野生型GLD基因，并以此為基礎，通過利用使用了適當的寡核苷酸引物(探針)組的本
7領域技術人員公知的各種PCR法導入隨機突變或位點特異性突變，能夠制備出編碼本發明 的經修飾GLD的多核苷酸。此夕卜，通過如文獻(例如，Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47 411-418 ；Adams (1983)J. Am. Chem. Soc. 105 661 ；Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25 3440-3444 ；Frenkel(1995)Free Radic.Biol. Med. 19 373-380 ；Blommers(1994) Biochemistry 337886-7896 ；Narang (1979)Meth. Enzymol. 68 90 ；Broen (1979)Meth. Enzymo 1. 68 109 ；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22 1859 ；美國專利第 4458066 號)記載的 眾所周知的化學合成技術，可以在體外合成本發明的多核苷酸。本發明的重組載體(為克隆載體或表達載體)可根據作為插入子的多核苷酸種類 或使用目的等使用適宜的載體，并通過本領域技術人員公知的任意方法制備。例如，當以 cDNA或其ORF區域作為插入子來生產本發明的經修飾GLD時，可以使用體外轉錄用表達載 體，或者適于下列細胞中的每一種的表達載體原核細胞(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等)、絲 狀菌(酵母、霉菌等)、真核細胞(昆蟲細胞、哺乳動物細胞等)。作為本發明的轉化細胞，可以使用例如原核細胞(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等) 或真核細胞(酵母、霉菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等)等。這些細胞，可根據要、不要經修飾 GLD的糖鏈及其他肽修飾的必要性來選擇適宜的宿主。這些轉化細胞可以通過電穿孔法、磷 酸鈣法、脂質體法、DEAE葡聚糖法等本領域技術人員公知的任意方法，將重組載體導入到細 胞中制備得到。作為重組載體及轉化細胞的具體例，可舉例下述實施例中所示重組載體及 由所述載體的轉化大腸桿菌及轉化霉菌。將本發明的經修飾GLD用大腸桿菌等微生物表達DNA而制備時，制備在具有可在 微生物中復制的復制起點、啟動子、核糖體結合位點、DNA克隆位點、終止子序列等的表達載 體中重組了上述多核苷酸的表達載體；用該表達載體轉化宿主細胞；之后培養得到的轉化 體，就可以用微生物大量制備經修飾GLD。此時，在任意的翻譯區域前后添加起始密碼子和 終止密碼子，并使其表達，就可得到含有任意區域的經修飾GLD片段。或者，也可作為與其 他蛋白的融合蛋白來表達。也可通過將該融合蛋白用適當的蛋白酶剪切來得到目的經修飾 GLD。作為大腸桿菌用表達載體，可例示pUC系、pBluescriptII、pET表達系統、pGEX表達 系統、pCold表達系統等。或者，當將本發明的經修飾GLD在真核細胞中表達制備時，將上述多核苷酸插入 到具有啟動子、剪接區域、多聚(A)添加位點等的真核細胞用表達載體中來制備重組載體 而導入真核細胞內，就可在真核細胞內生產經修飾GLD。也可以如質粒的狀態在細胞內維 持，也可通過整合入染色體中來維持。作為表達載體，可例示pKAl、pCDM8、pSVK3、pSVL、 pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 載體、pRS、pYE82 等。此外，如果使用 pIND/V5_His、pFLAG-CMV-2、 pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達載體，也可作為添加了 His標簽、FLAG標簽、GFP等各種標 簽的融合蛋白而表達FAD綴合型葡萄糖脫氫酶多肽。作為真核細胞，一般使用猴腎臟細胞 C0S-7、中國倉鼠卵巢細胞CHO等哺乳動物培養細胞、釀酒酵母、裂殖酵母、霉菌、蠶細胞、非 洲爪蟾卵母細胞等，但只要是能夠表達本發明的經修飾GLD，可為任何真核細胞。將表達載 體導入到真核細胞可以采用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體法、DEAE葡聚糖法等公知的方法。用具有編碼本發明經修飾GLD的多核苷酸的源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)的重組載體轉化了適當的米曲霉菌株的克隆特別適合。
將本發明的經修飾GLD用原核細胞或真核細胞表達后，從培養物(含菌體或分泌 到菌體外的酶的培養液、培養基組合物等)中提取目的蛋白，即，為分離純化，可以組合公 知的分離操作。可例舉，例如由尿素等變性劑或表面活性劑的處理、熱處理、pH處理、超聲 波處理、酶消化、鹽析或溶劑沉淀法、透析、離心分離、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電點電 泳、離子交換層析、疏水性層析、反相層析、親和層析(也包括利用標簽序列的方法及使用 特異于經修飾GLD的多克隆抗體、單克隆抗體的方法)等。用這樣的方法可以大量制備本 發明的經修飾GLD。此外，本發明的經修飾GLD，可以通過從具有本發明多核苷酸(cDNA或其翻譯區 域)的載體通過體外轉錄制備RNA，并以此為模板進行體外翻譯來體外制備。將經修飾GLD在體外表達制備時，將上述多核苷酸插入到具有可結合RNA聚合酶 的啟動子的載體中制備重組載體，如果將該載體添加到含有與啟動子對應的RNA聚合酶的 兔網狀紅細胞裂解物或小麥胚芽提取物等體外翻譯系中，就可以在體外生產經修飾GLD。作 為能結合RNA聚合酶能的啟動子，可例示T3、T7、SP6等。作為含有這些啟動子的載體，可 例示pKAl、pCDM8、pT3/T718、pT7/319、pBluescriptII 等。由于可用以上記載的方法制備的本發明的經修飾GLD是在電子受體存在下，催化 葡萄糖脫氫反應的酶，只要是能夠利用該反應所致的變化的用途，就無特別限制。例如，可 以應用于測定含活體物質的樣品中的葡萄糖及應用于測定用試劑、消除用試劑等醫療領 域、臨床領域，也可應用于使用輔酶綴合型葡萄糖脫氫酶的物質生產中。本發明的葡萄糖測定試劑組合物，可以全部混合成單一試劑，在存在相互干擾的 成分時，也可將各成分以可適當組合的方式拆分。此外，可將這些制成溶液狀或粉末狀試 劑，還可使這些含于濾紙或膜等合適的支持物中制成試紙或分析用膜。再者，也可添加高氯 酸等除蛋白劑或含有葡萄糖定量的標準試劑。本組合物中酶的量優選每份試劑約0. 1 50 單位。用于定量葡萄糖的檢體，可舉例血漿、血清、脊液、唾液、尿等。本發明的生物傳感器，是在反應層中使用本發明的經修飾GLD作為酶，測定樣品 液中葡萄糖濃度的葡萄糖傳感器。例如，可如下制造通過絲網印刷等方法在絕緣基板上形 成由工作電極、對電極及參比電極組成的電極系統，并與該電極系統接觸著形成含有親水 性高分子和氧化還原酶及電子受體的酶反應層。在該生物傳感器的酶反應層上滴下含有底 物的樣品液，則酶反應層溶解，伴隨著酶與底物反應，電子受體被還原。酶反應結束后，電化 學氧化被還原的電子受體，此時，該生物傳感器就可從得到的氧化電流值測定樣品液中的 底物濃度。此外，也可構建檢測發光強度或PH變化等方式的生物傳感器。作為生物傳感器的電子受體，可以使用接受電子的能力強的化學物質。所謂接受 電子的能力強的化學物質一般指被稱為“電子傳遞體”、“介質”、或“氧化還原介質”的化學 物質，作為所述這些化學物質，也可以使用如特表2002-526759中所列舉的電子傳遞體或 氧化還原介質等。具體可舉例鋨化合物、醌化合物、鐵氰化物等。GLD活性測定中，將該酶適當稀釋至優選終濃度為0. 1 1. 0個單位/mL而使用。 其中該酶酶活性單位(unit)是指1分鐘氧化1 μ mol葡萄糖的酶活性。GLD酶活性可按以 下方法測定。酶活性測定法將0. IM 磷酸鉀緩沖液(ρΗ7. 0) 1. OmLU. OM D-葡萄糖 1. 0mL、3mM 2,6- 二氯酚靛
9酚(以下簡稱DCIP)0. 14mL、3mM 1-甲氧基_5_甲基吩嗪硫酸甲酯0. 2mL、水0. 61mL添加到 3mL石英比色皿(Icm)中，置于帶有恒溫比色皿座的分光光度計中，于37°C溫育10分鐘后， 添加0. 05mL酶溶液后，測定600nm下DCIP的吸光度變化(Δ ABS/分鐘)。DCIP在pH7. 0 下摩爾吸光系數作為16. 3X 10WM"1,1分鐘1 μ mol DCIP被還原的酶活性基本上等價于 該酶活性1個單位，因此，通過吸光度變化，按照下式可以求出該酶活性。數1
酶活性(單位/ml) = -AABS χ _3,0_ χ 酶的稀釋度
16.30.05如上述順序一樣，1分鐘氧化1 μ mol的木糖、麥芽糖及半乳糖的酶活性，代替D-葡 萄糖，可以各用同濃度的D-木糖(SIGMA制)、麥芽糖水合物(NACALAI TESQUE社制)及 D-半乳糖(和光純藥工業會社制)進行測定。此外，將氧化葡萄糖的酶活性(U)設為100%時，氧化木糖的酶活性(相對活性) 定義為“木糖作用性/葡萄糖作用性” (% )。同樣，將氧化葡萄糖的酶活性(U)設為100%時，氧化麥芽糖或半乳糖的酶活性 (相對活性)定義為“麥芽糖作用性/葡萄糖作用性”(％ )及“半乳糖作用性/葡萄糖作 用性”(％)。其中，活性測定可以使用平板讀取儀。此時，使用與上述相同組成的反應試劑與 經適當稀釋的酶測定600nm下的吸光度變化，將其按照使用上述石英比色皿的活性測定步 驟，與已知酶活性的酶溶液的吸光度變化之間進行比例換算，從而可算出酶溶液的酶活性。關于所述酶的蛋白濃度測定，該酶優適當稀釋至優選終濃度為0. 2 0. 9mg/mL而 使用。本發明中的蛋白濃度，根據使用可從日本Bio-Rad(株)購買的蛋白濃度測定試劑盒 Bio-Rad Protein Assay，按使用說明，以牛血清白蛋白(BSA，和光純藥工業(株)制，生物 化學用)為標準物而繪制的標準曲線經換算而求出。此外，為實施本發明所采用的各種技術，除了特別明示出處的技術外，基于公知的 文獻等，只要是本領域技術人員就可容易且確實實施。如基因工程學及分子生物學技術可
Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-Α Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989 ；Ausubel,F. Μ. et al·,Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons，New York, N. Y，1995 等中記載的方法或其中引 用的文獻所記載的方法或與它們實質相同的方法或改良法實施。且本發明中的用語使用基 本基于IUPAC生物化學命名委員會的規定的用語或為在該領域慣用用語。以下，通過實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明的技術范圍并不限于這 些記載。此外，本發明書中引用的文獻中記載的內容作為本發明書的一部分構成本發明公 開內容。
實施例實施例1 (野生型GLD基因的獲得)從大腸桿菌(Eschelichiacoli) JM109/pCGLD(FERM BP-10243)中分離含有專利
10文獻2中公開了全堿基序列的野生型GLD基因(SEQID NO 2)的質粒pCGLD。其也可如下 獲得，將專利文獻1中公開的源于土曲霉菌(Aspergillus terreus)FERM BP-08578株的 GLD基因采用常規方法分離，以去除了編碼信號序列(SEQ ID NO 1中第1 第19的氨基 酸序列)的部位的形式，插入到從TAKARA-BI0市售的質粒載體pColdIII的多克隆位點中 的 KpnI-PstI 位點。實施例2 (攜帶導入隨機突變的經修飾GLD基因的轉化體的獲得)為了向GLD基因導入隨機突變，設計、合成了如下所述的寡核苷酸。其中，引物 DNA(F)具有限制酶KpnI酶切位點，引物DNA(R)具有限制酶PstI酶切位點。弓丨物 DNA(F) :5，cgtcatggtacctccaactccacgtccgccaa 3，(SEQ IDNO 3)弓丨物 DNA(R) :5，agtgtactgcagctaacgacgaccagcatcgg 3，(SEQ IDNO 4)用含有由實施例1獲得的野生型GLD基因(SEQ ID NO 2)的質粒pCGLD、由實施 例2合成的SEQ ID NO 3中記載的引物DNA(F)及SEQ ID NO 4中記載的引物DNA(R)，用 GeneMorph II隨機誘變試劑盒(STRATAGENE社制)，按照試劑盒中附帶的實驗步驟獲得導 入了隨機突變的質粒。作為宿主轉化大腸桿菌JM109感受態細胞(Bio-Rad社制)后，接種 到含有篩選標記物氨芐西林鈉(和光純藥社制)50 μ g/mL濃度的LB瓊脂平板中，37°C培養 一晚，獲得轉化體。實施例3 (攜帶導入隨機突變的經修飾GLD基因的轉化體的GLD酶活性評價)將含胰蛋白胨(BD社制)1.2% (w/v)、酵母提取物(BD社制)2.4% (w/v)、甘油 (NACALAI TESQUE社制)5% (w/v)和水的溶液A經121 °C高壓滅菌15分鐘處理來制備；將 含磷酸二氫鉀(NACALAI TESQUE 社制)2. 3%、磷酸氫二鉀(NACALAI TESQUE 社制)12. 5% 及水的溶液B用0. 45 μ m濾膜(ADVANTEC公司制)過濾來制備。將上述溶液A與溶液B在 無菌環境下混合至A B = 9 1，配制TB培養基。向96孔板(Nunc社制)的各孔分別注入150 μ L的TB培養基，再各接種1個菌落 的實施例2中得到的轉化體。于37°C，1，OOOrpm震蕩培養5小時后，將培養溫度設為15°C，以1，OOOrpm震蕩30 分鐘后，加入25 μ L異丙基- β -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷(Sigma-Aldrich Japan社制) 至終濃度為0. ImM，再次于15°C，1，OOOrpm震蕩培養13小時。將培養后的轉化體通過離心集菌、用蒸餾水洗凈后，向再次離心分離得到的菌體 中以每孔50 μ L的量加入CelLytic B Cellysis Reagent (SIGMA社制)起，于25°C靜置30 分鐘后，離心回收上清，作為了無細胞提取液。按照上述酶活性測定法，測定無細胞提取液的GLD酶活性。篩選以D-葡萄糖為底 物時的每毫升培養液的GLD酶活性(U/mL-b)與野生株相比不降低到1/10以下，并且木糖 作用性/葡萄糖作用性(Xyl/Glc)相比野生株大幅降低的突變株，進行基因分析結果如表 3所示。表3No.基因突變位置氨基酸突變位置GLD酵活性 (U/mL-b )XyhGlc (%)Xyl/Glc 之比 (設野生型GLD為1)Wt未突變未突變0.7513.61Rl 4A190G+G305A+ T749A+T849AN64D+R102H+L250 Q1.204.460.33R25G218AG73D0.435.090.37R29T498C+T682C+G 1765AY228H+A589T0.5210.60.78R30A1120C+C1580TK3740+P527L0.428.490.62R31T537A+T1067CV356A0.717.220.53R44A215C+G628A+ C1407TD72A+G210S0.6710.80.79實施例4 (攜帶導入位點特異性置換突變的經修飾GLD基因的轉化體的獲得之一)為了向GLD基因中導入位點特異性置換突變，設計、合成了如下所述寡核苷酸。弓丨物 DNA(G73A) :5，gtcacaaacgtggatgcctacgggcttgctttt 3，(SEQ ID NO 5)弓丨物 DNA(P527L) :5，gttctaacttccatctcgtcggcacggctgc 3，(SEQ ID NO 6)弓丨物 DNA(D72A) :5，atgtcacaaacgtggctggctacgggcttgc 3，(SEQ ID NO 7)弓丨物 DNA(Y228H) :5，cgtgaatcttgaggagcatgtgcgcgaagacgc 3，(SEQ ID NO 8)弓丨物 DNA(G73C) :5，tcccaatgtcacaaacgtggattgctacgggcttg 3，(SEQ ID NO 9)弓丨物 DNA(G73H) :5，caatgtcacaaacgtggatcactacgggcttgcttttggg3，(SQ ID NO: 10)引物 DNA(R102H) :5，tagtcaagtgcttcatgccggcaaggccc 3，(SEQ ID NO 11)弓丨物 DNA(D72A+G73D) :5，ccaatgtcacaaacgtggctgactacgggcttgcttttgg 3，(SEQ ID NO 12)弓丨物 DNA(G73S) :5，tcccaatgtcacaaacgtggatagctacgggcttg 3，(SEQ ID NO 13)弓丨物 DNA(G73Q) :5，aacaatcccaatgtcacaaacgtggatcagtacgggcttgctttt 3，(SEQ ID NO 14)弓丨物DNA(G73W) :5，cccaatgtcacaaacgtggattggtacgggcttgct 3，(SEQ ID NO 15)弓丨 物 DNA(G73Y) :5， ggaacaatcccaatgtcacaaacgtggattattacgggcttgcttttg 3，(SEQID NO 16)弓丨物 DNA(G73E) :5，atgtcacaaacgtggatgagtacgggcttgcttttggg 3，(SEQ ID NO: 17)實施例5 用含有由實施例1獲得的野生型GLD基因的質粒pCGLD、實施例4中合成的SEQ
12ID NO 5中記載的引物DNA(G73A)及與引物DNA互補的合成寡核苷酸，使用QuikChangeII 位點特異性誘變試劑盒(STRATAGENE社制)，按照試劑盒中附帶的實驗步驟獲得了導入了 置換突變的質粒。作為宿主轉化大腸桿菌JM109感受態細胞(Bio-Rad社制)后，接種到含 有篩選標記物氨芐西林鈉(和光純藥社制)50 μ g/mL的LB瓊脂(BD社制)平板中，于37°C 培養一晚，獲得了具有編碼經修飾GLD的經修飾GLD基因的轉化體，該經修飾GLD是野生型 GLD的氨基酸序列的第73位的甘氨酸被置換為丙氨酸的經修飾GLD。與上述方法同樣，用含有野生型GLD基因的質粒pCGLD、實施例4中合成的SEQ ID N0:6 17中記載的各引物DNA及與各引物DNA互補的合成寡核苷酸，獲得了各種導入了 置換突變的質粒。轉化也如上述同樣進行，獲得了具有編碼野生型GLD的氨基酸序列中的 一部分被置換的各種經修飾GLD的經修飾GLD基因的轉化體。實施例6 (攜帶導入位點特異性置換突變的經修飾GLD基因的轉化體的GLD酶活性評價 之一)對由實施例5得到的轉化體，與實施例3記載的順序同樣培養，測定評價了無細胞 提取液的GLD酶活性。篩選以D-葡萄糖為底物時每毫升培養液的GLD酶活性(U/mL_b)與 野生株GLD相比維持在1/10以上，并且木糖作用性/葡萄糖作用性(Xyl/Glc)相比野生株 大幅降低的突變株，進行基因分析結果如表4所示。表4
權利要求
經修飾葡萄糖脫氫酶(GLD)，其●在SEQ ID NO1所示的野生型FAD綴合型葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列中包含選自下列位的氨基酸的至少1個氨基酸殘基的置換37、69、72、73、76、78、102、217、228、240、356、407、424、437、527和530位的氨基酸；且●木糖作用性/葡萄糖作用性相比野生型GLD降低。
2.權利要求1的經修飾葡萄糖脫氫酶，其中所述木糖作用性/葡萄糖作用性相比野生 型GLD降低至0. 85倍以下。
3.權利要求1或2的經修飾葡萄糖脫氫酶，其中氨基酸置換選自 D72A、G73D、G73A、G73S、G73C、G73Q、G73W、G73Y、G73E、G73H、R102H、Y228H、V356A 及P527L ；且 S37V、S37G、T69I、L76F、F78L、R102V、N217S、P240I、P240L、Q407A、Q407S、Y424S、 A437I 及 T530A。
4.經修飾葡萄糖脫氫酶，其在SEQID NO :1所示的野生型FAD綴合型葡萄糖脫氫酶的 氨基酸序列中具有選自下列的氨基酸置換 N64D+R102H+L250Q、G73D、Y228H+A589T、K374Q+P527L、V356A、D72A+G210S、G73A、 P527L、D72A、Y228H、G73C、G73H、R102H、D72A+G73D、G73S、G73Q、G73W、G73Y 及 G73E ；且 S37V、S37G、T69I、L76F、F78L、R102V、N217S、P240I、P240L、Q407A、Q407S、Y424S、 A437I 及 T530A。
5.多核苷酸，其編碼權利要求1 4中任一項的經修飾葡萄糖脫氫酶。
6.權利要求5的多核苷酸，編碼SEQID NO :1所示的野生型FAD綴合型葡萄糖脫氫酶 的氨基酸序列的多核苷酸具有SEQ ID NO :2所示的堿基序列。
7.重組載體，其具有權利要求5或6的多核苷酸。
8.經轉化細胞，其通過用權利要求7的重組載體來制備。
9.權利要求8的經轉化細胞，其為大腸桿菌或米曲霉菌。
10.經修飾GLD的制備方法，其特征在于，培養權利要求8或9的經轉化細胞，并從所得 到的培養物收獲經修飾GLD。
11.葡萄糖測定方法，其特征在于使用 權利要求1 4中任一項的經修飾GLD，或 通過權利要求10的制備方法得到的經修飾GLD。
12.葡萄糖測定試劑組合物，其特征在于含 權利要求1 4中任一項的經修飾GLD，或 通過權利要求10的制備方法得到的經修飾GLD。
13.葡萄糖測定用生物傳感器，其特征在于使用 權利要求1 4中任一項的經修飾GLD，或 通過權利要求10的制備方法得到的經修飾GLD。
全文摘要
課題提供一種對葡萄糖具有高特異性的FAD綴合型葡萄糖脫氫酶。解決手段在SEQ ID NO1所示的野生型FAD綴合型葡萄糖脫氫酶(GLD)的氨基酸序列中包含選自下列位的氨基酸的至少1個氨基酸殘基的置換37、69、72、73、76、78、102、217、228、240、356、407、424、437、527和530位的氨基酸；且木糖作用性/葡萄糖作用性相比野生型GLD降低的經修飾GLD；編碼該經修飾GLD的多核苷酸、具有該多核苷酸的重組載體及通過使用該重組載體而制備的轉化細胞等。
文檔編號C12N9/04GK101970656SQ200880126270
公開日2011年2月9日 申請日期2008年12月26日 優先權日2007年12月28日
發明者小林史直, 本田道濟, 竹中涼 申請人:池田食研株式會社