能夠與肝素結合性表皮生長因子樣生長因子結合的單克隆抗體的制作方法

文檔序號：571422閱讀：429來源：國知局

專利名稱：能夠與肝素結合性表皮生長因子樣生長因子結合的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞膜結合型肝素結合性表皮生長因子樣生長因子(在后文稱為 “HB-EGF”)、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF結合的單克隆抗體或其抗體片段。
背景技術：
HB-EGF由東山(Higashiyama)等在1992年從巨噬細胞分化的人巨噬細胞樣細胞系U-937的培養上清液中分離和純化(非專利文獻1)。HB-EGF帶有在表皮生長因子(EGF) 家族中共同保守的6個半胱氨酸殘基，并屬于EGF家族，與屬于EGF家族的其他蛋白情況相似，被合成為I型膜蛋白(非專利文獻1和2)。膜型HB-EGF被金屬蛋白酶轉化成14到22 千道爾頓(在后文中稱為“kDa”)的分泌型HB-EGF，該金屬蛋白酶由多種生理刺激例如由熱或滲透壓導致的應激、生長因子、細胞因子和作為G蛋白偶聯受體(GPCR)的溶血磷脂酸 (LPA)所激活(非專利文獻1到3)。分泌型HG-EGF結合EGF受體(EGFR/ErbBl)(非專利文獻1)、ErbB4 (非專利文獻4)和N-精氨酸二鹽基轉化酶(非專利文獻5)，并對成纖維細胞和平滑肌細胞(非專利文獻1)、角質細胞(非專利文獻6)、肝細胞(非專利文獻7)和系膜細胞(非專利文獻8)具有生長加速活性。此外，也已知道，HB-EGF與例如心臟瓣膜的器官發生(非專利文獻28、29和31)、傷口愈合(非專利文獻9和10)、動脈粥樣硬化引起的平滑肌細胞增生(非專利文獻11)、再狹窄(非專利文獻12和13)、肺動脈高血壓(非專利文獻14)、肝再生(非專利文獻15)、腦病(非專利文獻16)和癌癥(非專利文獻28到35) 有關。另一方面，已報道在細胞表面上表達的相當量的膜型HB-EGF沒有被消化成其分泌型(非專利文獻17)。已知膜型HB-EGF與⑶9等四次跨膜蛋白或整合蛋白α 3 β 1在細胞表面上形成復合物，并且也已報道它作為近分泌生長因子與鄰近的細胞相互作用(非專利文獻17到22)。此外，Naglich等已報道，膜型HB-EGF起到白喉毒素受體的作用，與白喉毒素進入細胞的內化作用有關(非專利文獻23)。當目加田等通過制備HB-EGF敲除(KO)小鼠來分析HB-EGF的生理功能時，HB-EGF KO小鼠顯示出心室擴張、心功能降低和心臟瓣膜肥大癥狀，超過一半的動物在出生后幾天內死亡。該事實顯示，HB-EGF是心臟發育和功能維持所必需的蛋白(非專利文獻24)。接下來，目加田等制備了兩個HB-EGF的基因，一個HB-EGF由于在蛋白酶消化位點中引入突變而變得不能轉變成分泌型(在后文中稱為“HBue”)，另一個HB-EGF缺乏跨膜區，能夠被分泌，并且其分泌不依賴于蛋白酶消化(在后文中稱為“ΗΒΔ ηι”)。通過制備表達相應HB-EGF突變體的轉基因小鼠，分析了膜型和分泌型HB-EGF的生理功能(非專利文獻25)。結果，因為表達HBue的小鼠顯示出與HB-EGF KO小鼠類似的癥狀，因此認為分泌型 HB-EGF起到活性型蛋白的作用。大多數表達ΗΒΔΛ的小鼠在新生期之前或新生期死亡。此外，在其中只在一個等位基因中引入了突變的表達ΗΒΔΛΑ的小鼠中，發現了角質細胞增生和心室肥大。這些癥狀是與HB-EGF KO小鼠和HBue小鼠直接相反的表現型。已知為白喉毒
4素突變體的CRM197 (非專利文獻26)，特異性抑制HB-EGF的細胞生長加速活性，并且不透過細胞膜。因為該CRM197抑制了作為表達HB"tm小鼠的表現型的增生和心室肥大，因此認為在表達HBAtm的小鼠中形成的HBAtm，不通過在其分泌前與其細胞內受體結合而起作用，而是通過在分泌到細胞外后與細胞表面上的受體結合而起作用。因此，活體中膜型HB-EGF與分泌型HB-EGF之間的定量平衡，是維持正常生理功能所必需的，并認為，從HB-EGF的膜型轉化成分泌型的過程，在活體中是受控的。東山等發現，在通過縮窄胸主動脈誘導了心臟肥大的小鼠心臟中，心臟中的分泌型HB-EGF蛋白增加。已報道，當向該小鼠施用能夠抑制將膜型HB-EGF轉化為分泌型HB-EGF 的蛋白酶的低分子量化合物時，由于在心臟中抑制膜型HB-EGF向分泌型轉化，從而抑制了心臟肥大(非專利文獻27)。到目前為止，已報道與正常組織相比，HB-EGF在多種癌癥例如乳腺癌、肝癌、胰腺癌和膀胱癌中以高水平表達(非專利文獻28到31)。此外，最近已發現，HB-EGF是癌癥增殖的重要因子(非專利文獻32和33)。目加田(Mekada)等已經發現，當HB-EGF的小干擾 RNA(siRNA)被導入到癌細胞系中時，或在人卵巢癌細胞系移植到裸鼠的模型系統中，向移植了癌細胞系的小鼠施用CRM197時，識別到了明顯的腫瘤生長抑制效應。東山等也已發現，在轉入了 HB-EGF基因的膀胱癌細胞系中，體外的細胞生長、集落形成能力、血管內皮生長因子(VEGF)表達和周期蛋白Dl的表達等增加。此外，已經報道，在體內也發現了致瘤性的增加和腫瘤血管生成的增加。這樣的生長刺激活性只有當膜型HB-EGF基因或分泌型 HB-EGF基因表達時才能發現，但是當強制表達蛋白酶抗性的膜型HB-EGF基因時不能發現。因此，提示了這樣的可能性，即分泌型HB-EGF是與卵巢癌和膀胱癌的腫瘤生長相關的重要因子。關于HB-EGF在臨床患者中的表達，目加田等已經分析了卵巢癌患者的腫瘤組織和腹水中HB-EGF mRNA的表達量和分泌型HB-EGF的濃度，并報道了在EGF家族中只有HB-EGF 被表達(非專利文獻32)。此外，宮本等已經報道，在腫瘤的HB-EGF mRNA高表達的卵巢癌患者，其預后比低表達的患者差(非專利文獻34)。上述結果顯示，至少在卵巢癌中，癌癥產生的分泌型HB-EGF通過自分泌或旁分泌機制與癌癥生長相關聯(非專利文獻35)。作為與分泌型HB-EGF結合并抑制其活性的抗體，已知的有一些多克隆抗體和一種單克隆抗體(均由R&D制造)。已經報道，抗HB-EGF山羊多克隆抗體(由R&D制造)與C0S-7細胞中表達的細胞表面膜型HB-EGF結合(非專利文獻3)。眾所周知，當膜蛋白呈遞在細胞例如癌細胞的表面上時，與該蛋白結合的單克隆抗體可以變成抑制該細胞生長的治療劑(非專利文獻 36)。已經知道，一般來說，當向人施用非人類動物抗體例如小鼠抗體時，它被識別作外來物質，從而在人體中誘導了針對小鼠抗體的人抗體[人抗小鼠抗體(HAMA)]。已知HAMA 與施用的小鼠抗體反應，由此誘導了副作用(非專利文獻37到40)，增加了小鼠抗體從體內的消除(非專利文獻38、41和42)，并降低了小鼠抗體的治療效果(非專利文獻43和44)。為了解決這些問題，已經嘗試了使用基因重組技術從非人抗體制備重組抗體，例如人嵌合抗體或人源化抗體。在臨床應用中，人嵌合抗體和人源化抗體與非人抗體例如小鼠抗體相比，在施用于人類方面具有多種優點。例如，已經報道，在使用猴的試驗中，與小鼠抗體相比，其免疫原性降低，在血液中的半衰期延長(非專利文獻45和46)。也就是說，因為人嵌合抗體和人源化抗體與非人抗體相比，在人類中引起更少的副作用，因此預計其治療效果持續更長時間。此外，因為人嵌合抗體和人源化抗體使用基因重組技術制備，因此它可以制備成各種不同形式的分子。例如，當使用Yl亞類作為人抗體的重鏈(在后文中稱為“H鏈”) 恒定區(在后文中稱為“C區”)(H鏈C區被稱為“CH”)時，可以制備具有高的效應子功能、例如抗體依賴的細胞的細胞毒性(在后文中稱為“ADCC活性”)的人嵌合抗體和人源化抗體(非專利文獻14)，并可以預期它在血液中的半衰期與小鼠抗體相比延長了(非專利文獻46)。特別是，在進行治療以減少表達膜型HB-EGF的細胞或在其細胞膜表面上結合有分泌型HB-EGF的細胞的情況下，細胞毒性活性、例如經抗體Fc區域(抗體重鏈鉸鏈區后的區域)的補體依賴性細胞毒性(在后文中稱為“CDC活性)和ADCC活性的程度，對于其療效是重要的。在人類治療中，為了執行細胞毒性活性，優選使用人嵌合抗體、人源化抗體或人抗體(非專利文獻47和48)。此外，由于蛋白質工程和遺傳工程的最新進展，也可以將人嵌合抗體或人源化抗體制備成低分子量抗體片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(在后文中稱為“scFv”) (非專利文獻49)、二聚化的V區片段(在后文中稱為“雙抗體”)(非專利文獻51)、二硫鍵穩定的V區片段(在后文中稱為“dsFv”)(非專利文獻52)、或含有互補性決定區(在后文中稱為“⑶R”)的肽(非專利文獻50)，這些抗體片段與完整抗體分子相比，具有更出色的向靶組織遷移的能力(非專利文獻53)。上述事實顯示，作為在臨床情況下應用于人的抗體，人嵌合抗體或人源化抗體比非人類動物抗體例如小鼠抗體更為優選。非專利文獻1 =Science, Vol. 251，936，1991非專利文獻2 J. Biol. Chem. 267 (1992) 6205-6212非專利文獻3 =Nature, Vol. 402，884，1999非專利文獻4 =EMBO J. 16 (1997) 1268-1278非專利文獻5 =EMBO J. 20(2001)3342-3350非專利文獻6 J. Biol. Chem. 269 (1994) 20060-20066非專利文獻7 =Biochem Biophys. Res. Commun. 198 (1994) 25-31非專利文獻8 J.Pathol. 189(1999)431-438非專利文獻9 :Proc. Natl. Acad. Sci. US. Α. 90 (1993) 3889-3893非專利文獻10 :J. Cell Biol. 151 (2000) 209-219非專利文獻11 :J. Clin. Invest.，95，404，1995非專利文獻12 =Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16 (1996) 1524-1531非專利文獻13 J. Biol. Chem. 277 (2002) 37487-37491非專利文獻14 :Am. J Pathol. 143 (1993) 784-793非專利文獻15 =Hepatology 22(1995) 1584-1590非專利文獻16 =Brain Res. 827 (1999) 130-138非專利文獻17 =Biochem. Biophys. Acta.，Vol. 1333，F179,1997非專利文獻18 :J. Cell Biol. 128(1995)929-938非專利文獻19 :J. Cell Biol. 129 (1995) 1691-1705非專利文獻20 =Cytokine Growth Factor Rev.，Vol. 11，335，2000
6非專利文獻21 非專利文獻22 非專利文獻23 非專利文獻24 非專利文獻25 非專利文獻26 非專利文獻27 非專利文獻28 非專利文獻29 非專利文獻30 非專利文獻31 非專利文獻32 非專利文獻33 非專利文獻34 非專利文獻35 非專利文獻36 非專利文獻37 非專利文獻38 非專利文獻39 非專利文獻40 非專利文獻41 非專利文獻42 非專利文獻43 非專利文獻44 非專利文獻45 非專利文獻46 非專利文獻47 非專利文獻48 非專利文獻49 非專利文獻50 非專利文獻51 非專利文獻52
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非專利文獻53 發明的公開內容本發明擬解決的問題
治療與HB-EGF相關的疾病的藥物是有需求的。解決問題的手段本發明涉及下面(1)到(28)
(1) 一種單克隆抗體或其抗體片段，其與細胞膜結合型肝素的結合性表皮生長因
7子樣生長因子、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF結合；(2)根據(1)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與細胞膜結合型HB-EGF、膜型 HB-EGF和分泌型HB-EGF的表皮生長因子樣結構域(EGF樣結構域)結合；(3)根據(1)或(2)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其抑制分泌型HB-EGF與 HB-EGF受體的結合；(4)根據(1)到(3)任一項所述的單克隆抗體或其抗體片段，其對分泌型HB-EGF 具有中和活性；(5)根據(1)到(4)任一項所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與分泌型HB-EGF 和HB-EGF受體或HB-EGF和白喉毒素的結合區結合；(6)根據(1)到(5)任一項所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中第133、135和147位氨基酸的至少一個的表位結合；(7)根據(6)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列中第133、135和147位氨基酸的表位結合；(8)根據(1)到(5)任一項所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中第141位氨基酸的表位結合；(9)根據⑴到(3)、(5)和⑶任一項所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與雜交瘤KM3579 (FERM BP-10491)產生的單克隆抗體結合的表位相結合；(10)根據(1)到(7)所述任一項的單克隆抗體或其抗體片段，其與雜交瘤 KM3567 (FERM BP-10573)產生的單克隆抗體結合的表位相結合；(11)根據(1)到(7)任一項所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與雜交瘤 KM3566 (FERM BP-10490)產生的單克隆抗體結合的表位相結合；(12)根據(1)到(11)任一項所述的單克隆抗體或其抗體片段，其中單克隆抗體是重組抗體；(13)根據(12)所述的抗體或其抗體片段，其中重組抗體選自人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體；(14)根據(13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的重鏈可變區(后文中稱為“VH”)的CDR(互補性決定區，后文中稱為“CDR”) UCDR2和CDR3分別含有SEQ ID NOs 12、13和14顯示的氨基酸序列，和抗體的輕鏈可變區(后文中稱為“VL”)的⑶R1、⑶R2和 CDR3分別含有SEQ ID NOs :15、16和17顯示的氨基酸序列；(15)根據(13)所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其中人嵌合抗體的VH含有SEQ ID NO 9顯示的氨基酸序列，和人嵌合抗體的VL含有SEQID NO 11顯示的氨基酸序列；(16)根據(13)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有SEQ ID NO :22顯示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO :22顯示的氨基酸序列中導入至少一個修飾的氨基酸序列，所述修飾選自Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的 Thr, Lys取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的 Arg, Ala取代68位的Val、Leu取代70位的lie、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val ；并且其中人源化抗體的VL含有SEQ ID NO :23顯示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO: 23顯示的氨基酸序列中導入至少一個修飾的氨基酸序列，所述修飾選自Val取代15位的 Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu ；(17)根據(13)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有在SEQ ID NO :22顯示的氨基酸序列中導入氨基酸修飾中的至少一個修飾的氨基酸序列，所述氨基酸修飾選自Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68 位的Val、Leu取代70位的lie、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val ；并且其中人源化抗體的VL含有在SEQ ID NO :23顯示的氨基酸序列中導入至少一個修飾的氨基酸序列，所述修飾選自Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu ；(18)根據(13)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列，人源化抗體的VL含有SEQID NO 43顯示的氨基酸序列；(19)根據(13)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有SEQ ID NO 42顯示的氨基酸序列，人源化抗體的VL含有SEQID NO 23顯示的氨基酸序列；(20)根據(13)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有SEQ ID NO 42顯示的氨基酸序列，人源化抗體的VL含有SEQID NO 43顯示的氨基酸序列；(21)根據(1)到(20)任一項所述的抗體片段，其選自Fab、Fab，、F(ab，)2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定的V區(dsFv)和含有6個CDRs的肽；(22) 一種DNA，其編碼(1)到(21)任一項的抗體或其抗體片段；(23) 一種重組載體，其含有(22)的DNA ；(24) 一種轉化體，其能通過將(23)的重組載體導入宿主細胞而獲得；(25) 一種用于生產(1)到(21)任一項的抗體或其抗體片段的方法，所述方法包括將(24)的轉化體在培養基中培養，以在培養物中形成和積累(1)到(21)任一項的抗體或其抗體片段，以及從培養物中回收抗體或抗體片段；(26) 一種藥物組合物，其含有(1)到(21)任一項的抗體或其抗體片段作為活性成分；(27) 一種用于治療與HB-EGF相關的疾病的藥劑，其含有(1)到(21)任一項的抗體或其抗體片段作為活性成分；以及(28)根據(27)所述的藥劑，其中與HB-EGF相關的疾病是癌癥。發明的效果本發明提供了與細胞膜結合型肝素結合性表皮生長因子樣生長因子、膜型HB-EGF 和分泌型HB-EGF結合的單克隆抗體或其抗體片段。

[圖1A]它通過結合ELISA顯示了各種抗HB-EGF單克隆抗體的反應性。上圖顯示了對人HB-EGF的結合ELISA結果，下圖顯示了對作為陰性對照的牛血清白蛋白(BSA)的結合ELISA結果。橫坐標顯示每種抗體的濃度，縱坐標顯示每種抗體的結合活性。顯示單克隆抗體KM511，■顯示單克隆抗體KM3566，Δ顯示單克隆抗體ΚΜ3567，▲顯示單克隆抗體 ΚΜ3579，〇顯示單克隆抗體ΜΑΒ259。[圖 1Β]它顯示抗 HB-EGF 單克隆抗體 ΚΜ3566、ΚΜ3567、ΚΜ3579 和 ΜΑΒ259 的 HB-EGF-EGFR結合抑制活性。橫坐標顯示每種抗體的濃度，縱坐標顯示通過熒光強度顯示的生物素標記的HB-EGF的結合。橫向實線顯示當加入生物素標記的HB-EGF時和沒有加入抗體時的熒光強度，橫向虛線顯示當沒有加入生物素標記的HB-EGF和沒有加入抗體時的熒光強度。Δ顯示單克隆抗體KM3566，X顯示單克隆抗體ΚΜ3567，顯示單克隆抗體ΚΜ3579， ■顯示單克隆抗體ΜΑΒ259。[圖2Α]它顯示各種抗HB-EGF單克隆抗體的HB-EGF中和活性。橫坐標顯示每種抗體的濃度，縱坐標顯示生長抑制率(％)。分別是，顯示單克隆抗體ΚΜ511，·顯示單克隆抗體ΚΜ3566，▲顯示單克隆抗體ΚΜ3579，〇顯示單克隆抗體ΜΑΒ259。[圖2Β]它顯示各種抗HB-EGF單克隆抗體的HB-EGF中和活性。橫坐標顯示每種抗體的濃度，縱坐標顯示細胞生長。HB-EGF(+)顯示當加入HB-EGF并且未加入抗體時的細胞生長，HB-EGF(-)顯示當不加入HB-EGF并且未加入抗體時的細胞生長。□顯示單克隆抗體MAB259，■顯示單克隆抗體KM3567，▲顯示單克隆抗體KM3566。[圖3]它通過FCM分析顯示各種抗HB-EGF單克隆抗體的反應性。橫坐標顯示每種抗體的濃度，縱坐標顯示平均熒光強度。X顯示單克隆抗體KM511，Δ顯示單克隆抗體 ΚΜ3566，□顯示單克隆抗體ΚΜ3579，〇顯示單克隆抗體ΜΑΒ259。虛線顯示不含抗體的陰性對照(當加入抗HB-EGF單克隆抗體并且未加入FITC-標記的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)多克隆抗體時)的平均熒光強度MFI值。[圖4]它通過FCM分析顯示各種抗HB-EGF單克隆抗體對MDA-MB-231細胞的反應性。在每個直方圖中，左側峰顯示陰性對照抗體KM511，右側峰顯示每種抗HB-EGF抗體。 (a)、(b)、(c)和(d)分別顯示 MAB529、KM3566、KM3567 和 KM3579。[圖5]它顯示抗HB-EGF嵌合抗體表達載體pKANTEX3566的構建步驟。[圖6]它顯示純化的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的SDS-PAGE (使用5到20%的梯度凝膠)電泳圖形。第1道顯示分子量標志，第2和3道分別顯示還原條件和非還原條件下的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966。[圖7]它通過流式細胞術顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對人實體癌細胞系的反應性。在圖中，縱坐標顯示細胞數量，橫坐標顯示熒光強度。[圖8]它通過流式細胞術顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對重組HB-EGF處理過的人實體癌細胞系的反應性。在圖中，縱坐標顯示細胞數量，橫坐標顯示熒光強度。[圖9]它顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對人HB-EGF的中和活性。在圖中，縱坐標顯示代表活細胞數量的OD 450nm處的吸光度值，橫坐標顯示抗體的濃度。■顯示陰性對照抗體人IgG，□顯示KM3966。HB-EGF (-)表示未添加HB-EGF，HB-EGF (+)表示添加了 HB-EGF。[圖10]它顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對人實體癌細胞系的抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC活性)。在圖中，縱坐標顯示細胞毒性率(％ )，橫坐標顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的抗體濃度。橫向直線顯示在沒有加入抗體時的細胞毒性。[圖11]它顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966在早期癌癥模型中的抗腫瘤活性。在圖中，縱坐標顯示腫瘤體積，橫坐標顯示癌細胞移植后的天數。顯示PBS給藥組，〇顯示 10mg/kg KM3966給藥組。棒表示標準偏差。[圖12]它顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966在晚期癌癥模型中的抗腫瘤活性。在圖中，縱坐標顯示腫瘤體積，橫坐標顯示癌細胞移植后的天數。顯示PBS給藥組，〇顯示10mg/kg KM3966給藥組。棒表示標準偏差。[圖13]它通過流式細胞術顯示抗HB-EGF小鼠抗體KM3566對人血癌細胞系的反應性。在圖中，縱坐標顯示細胞數量，橫坐標顯示熒光強度。“A”表示急性骨髓性白血病細胞系，“B”表示T細胞白血病細胞系。[圖14]它顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對人血癌細胞系的抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC活性)。在圖中，縱坐標顯示細胞毒性率(％ )，橫坐標顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的抗體濃度。橫向直線顯示在沒有加入抗體時的細胞毒性。[圖15]它顯示抗HB-EGF抗體對人卵巢癌細胞系MCAS的反應性。在圖中，縱坐標顯示細胞數量，橫坐標顯示熒光強度。[圖16]它顯示抗HB-EGF抗體對人胃癌細胞系MKN-28的中和活性。在圖中，縱坐標顯示細胞增殖，橫坐標顯示添加的重組人HB-EGF和添加的抗HB-EGF抗體的蛋白濃度。[圖17]它顯示抗HB-EGF人源化抗體對血液癌細胞系的抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC活性)的測量結果。縱坐標顯示細胞毒性活性(％)，橫坐標顯示抗體濃度。保持穩定的實線顯示了未加入抗體時的細胞毒性活性。[圖18]它顯示抗HB-EGF單克隆抗體KM3566和KM3579以及嵌合抗體KM3966對突變HB-EGF表達細胞的反應性。在圖中，縱坐標顯示每種抗體的反應性(％)，橫坐標顯示突變HB-EGF的種類。本發明的最佳實施方式在本發明中，膜型HB-EGF是通過跨細胞膜結構域與細胞膜結合型HB-EGF，并由信號序列、前區、肝素結合結構域、EGF樣結構域、近膜結構域和細胞質結構域構成。具體來說，它包括含有SEQ ID NO :2顯示的氨基酸序列的多肽。此外，在本發明中，分泌型HB-EGF是含有EGF樣結構域的細胞外結構域，其中膜型HB-EGF的膜結合區被蛋白酶等切開。具體來說，它包括含有SEQ ID NO :3顯示的氨基酸序列的多肽。細胞膜結合型HB-EGF是其中分泌型HB-EGF通過其肝素結合活性、靜電結合活性等與細胞膜的表面結合的HB-EGF。與細胞膜上的分泌型HB-EGF結合的物質可以是任何物質，只要它能夠結合細胞膜上的分泌型HB-EGF即可。具體來說，它包括多糖，優選為糖胺聚糖，更優選為硫酸乙酰肝
οHB-EGF具有與白喉毒素或EGF受體ErbBl或ErbB4結合的活性。膜型HB-EGF包括下面(a)、(b)和(c)等的蛋白:(a)含有SEQ ID NO 2顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)由SEQ ID NO 2顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列構成、并具有與白喉毒素結合的活性的蛋白；(c)由與SEQ ID NO :2顯示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列構成、并具有與白喉毒素結合的活性的蛋白。此外，分泌型HB-EGF包括下面(a)、(b)和(C)等的蛋白(a)含有SEQ ID NO :3、4或5顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)由SEQ ID NO :3、4或5顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列構成、并具有與EGF受體ErbBl或ErbB4結合的活性的蛋白；(c)由與SEQ ID NO :3、4或5顯示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序
11列構成、并具有與EGF受體ErbBl或ErbB4結合的活性的蛋白。在本發明中，由SEQ ID NO :2、3、4或5任何一個顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列構成、并具有與白喉毒素或EGF受體ErbBl或ErbB4結合的活性的蛋白，是指通過例如將位點定向誘變引入所編碼的蛋白具有SEQ ID NO :2、3、4或5任何一個顯示的氨基酸序列的DNA中而獲得的蛋白，其中位點定向誘變描述在《分子克隆》(第二版)(Molecular Cloning, Second Edition)、《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology (1987-1997))、Nucleic Acids Research, 10,6487 (1982) > Proc. Natl. Acad Sci. , USA, 79,6409 (1982) > Gene,M' 315(1985) > Nucleic Acids Research,13,4431 (1985) > Proc.Natl. Acad. Sci USA,82, 488(1985)等中。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸殘基的數量是一個或多個，并且沒有具體限制，但是它在通過已知的方法例如上面描述的位點定向誘變有可能進行缺失、取代、插入或添加的范圍內。適合的數量是1到幾十個，優選為1到20個，更優選為1到10 個，最優選為1到5個。此外，與SEQ ID NO :2、3、4或5顯示的氨基酸序列具有80%以上同源性、并具有與白喉毒素或EGF受體ErbBl或ErbB4結合的活性的蛋白，是與SEQ ID N0:2、3、4或5任何一個顯示的氨基酸序列具有至少80%以上的同源性、優選85%以上的同源性、更優選90% 以上的同源性、更優選95%以上的同源性、特別優選97%以上的同源性、最優選99%以上的同源性、并具有與白喉毒素或EGF受體ErbBl或ErbB4結合的活性的蛋白。除非另有指明，否則本發明中描述的同源性數值可以是通過使用已知的同源性搜索程序計算出的已知數值。對于核苷酸序列來說，該數值可以通過在BLAST[J. Mol. Biol. ,215,403(1990)]等中使用缺省參數來計算，對于氨基酸序列來說，該數值可以通過在 BLAST2[Nucleic Acids Res. ,25,3389 (1997)], Genome Res.，7，649 (1997)或 http:// www, ncbi. nlm. nih. Rov/Education/BLASTinfo/information3. html 由使用缺省參數來計算。作為缺省參數，G(開放間隙的罰分(cost to open gap))對于核苷酸序列來說是5，對于氨基酸序列來說是11 ；-E(擴展間隙的罰分(cost to extend gap))對于核苷酸序列來說是2，對于氨基酸序列來說是1 ；-q(核苷酸錯配的罰分(penalty for nucleotide mismatch)) ^ -3 ；—r ( —IZSffi的 1厲力(reward for nucleotide match)) ^ 1 ；_θ( 頁期值(expect value))是10 ；-W(字長(wordsize))對于核苷酸序列來說是11個殘基，對于氨基酸序列來說是3個殘基；-y (blast延伸的減少(X)的位數(dropoff (X) for blast extensions in bits))對于blastn來說是20，對于blastn之外的程序來說是25 (http // www, ncbi. nlm. nih. Rov/blast/html/blastcRihelp. html)。此夕卜,用于氨基酸序列的分析軟件包括 FASTA [Methods in Enzymology, 183,63 (1990)]等。本發明的抗體包括與細胞膜結合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF結合，并且能夠與細胞膜結合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF的表皮生長因子樣結構域 (EGF樣結構域)結合的單克隆抗體。EGF樣結構域包括例如含有SEQ ID NO :4或5等顯示的氨基酸序列的多肽。與EGF樣結構域結合的單克隆抗體包括抑制分泌型HB-EGF與HB-EGF受體結合的單克隆抗體。抑制分泌型HB-EGF與HB-EGF受體結合的單克隆抗體，包括與分泌型HB-EGF與
12HB-EGF受體或白喉毒素等的結合區域結合的單克隆抗體。本發明的抗體包括對分泌型HB-EGF具有中和活性的抗體。在本發明中，中和活性是抑制分泌型HB-EGF的生物學活性的活性，包括例如抑制表達HB-EGF受體的細胞的細胞生長的活性，等等。本發明的抗體的例子包括，與含有具有SEQ ID NO :2顯示的氨基酸序列的多肽中第115位到147位氨基酸中的至少一個氨基酸的表位結合的單克隆抗體，優選與含有第133 位到147位氨基酸中的至少一個氨基酸的表位結合的單克隆抗體，更優選與含有第115、 122、124、125、127、129、133、135、141和147位氨基酸中的至少一個氨基酸的表位結合的單克隆抗體，更加優選與含有第133、135和147位氨基酸中的至少第133和135位氨基酸的表位結合的單克隆抗體，最優選與含有第133、135和147位氨基酸的表位結合的單克隆抗體，等等。此外，本發明的抗體的例子包括與雜交瘤KM3566(FERM BP-10490)產生的單克隆抗體、雜交瘤KM3567(FERM BP-10573)產生的單克隆抗體或雜交瘤KM3579 (FERM BP-10491) 產生的單克隆抗體所結合的表位結合的單克隆抗體。具有中和活性的抗體的例子包括與含有具有SEQ ID NO :2顯示的氨基酸序列的多肽中第133、135和147位氨基酸的表位結合的單克隆抗體。單克隆抗體是由單一克隆的抗體產生細胞分泌的抗體，只識別一種表位(也稱為抗原決定簇)，并具有統一的氨基酸序列(一級結構)。本發明的單克隆抗體包括由雜交瘤產生的抗體、重組抗體等。表位包括被單克隆抗體識別并結合的單一氨基酸序列、由氨基酸序列構成的構象結構、結合糖鏈的氨基酸序列、由結合糖鏈的氨基酸序列構成的構象結構等。表位的例子包括含有SEQ ID NO 2顯示的氨基酸序列的第115位到147位氨基酸中的至少一個氨基酸的表位，優選為含有序列號2顯示的氨基酸序列的多肽中第133位到147位氨基酸中的至少一個氨基酸的表位，更優選為含有第115、122、124、125、127、129、 133、135、141和147位氨基酸中的至少一個氨基酸的表位，更優選為含有第133、135和147 位氨基酸中的至少第133和135位氨基酸的表位，最優選為含有第133、135和147位氨基酸的表位，等等序列號。雜交瘤是產生具有所需免疫特異性的單克隆抗體的細胞，通過將用抗原免疫非人類哺乳動物所獲得的B細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合而得到。重組抗體包括通過基因重組生產的抗體，例如人嵌合抗體、人源化抗體、人抗體及其抗體片段。在重組抗體中，作為治療劑，優選的是具有與單克隆抗體相同的特征、低免疫原性和延長的血液半衰期的重組抗體。本發明的重組抗體的例子包括這樣的重組抗體，其中抗體的VH的⑶R1、⑶R2和 CDR3分別含有SEQ ID NO :12、13和14顯示的氨基酸序列，抗體的VL的CDRUCDR2和CDR3 分別含有SEQ ID NO :15、16和17顯示的氨基酸序列。人嵌合抗體是含有非人類動物的抗體的VH和VL以及人抗體的重鏈恒定區(在后文中稱為“CH”)和輕鏈恒定區(在后文中稱為“CL”)的抗體。本發明的人嵌合抗體可以如下產生。首先，從產生與細胞膜結合型HB-EGF、分泌型 HB-EGF和膜型HB-EGF結合的單克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH和VL的cDNA。將所得到的cDNA插入到用于動物細胞的、含有人抗體的CH和CL的編碼基因的表達載體中，從而構建人嵌合抗體表達載體，將人嵌合抗體表達載體導入到動物細胞中從而表達人嵌合抗體，然后就可以生產人嵌合抗體。對于人嵌合抗體的CH來說，可以使用任何CH，只要它屬于人免疫球蛋白(在后文中稱為“hlg”)即可，優選屬于hlgG類別的，并且可以使用屬于hlgG類別的任何一個亞類，例如hlgGl、hIgG2、hIgG3和hIgG4。對于人嵌合抗體的CL來說，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類別即可，并可以使用屬于κ類別或λ類別的。本發明的人嵌合抗體包括，例如，其中抗體的VH含有SEQ ID NO :9顯示的氨基酸序列和抗體的VL含有SEQ ID NO 11顯示的氨基酸序列的人嵌合抗體，人嵌合抗體ΚΜ3966寸。人源化抗體是其中源自非人類動物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人抗體的VH和VL的適當位置中的抗體，也被稱為⑶R移植抗體、重構抗體 (reshaped-antibody)等。本發明的人源化抗體可以如下產生。首先，構建編碼V區的cDNA，其中源自于非人類動物的、與細胞膜結合型HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF結合的單克隆抗體的 VH和VL的CDR的氨基酸序列，被移植到任何人抗體的VH和VL的構架中(在后文中稱為 “FR”)。將構建的cDNA分別插入到用于動物細胞的、含有人抗體的CH和CL的編碼基因的表達載體中，從而構建人源化抗體表達載體。接下來，將構建的人源化抗體表達載體導入到動物細胞中以表達人源化抗體，并可以生產人源化抗體。對于人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列來說，可以使用任何氨基酸序列，只要它們分別是源自于人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列即可。例子包括在數據庫例如蛋白數據庫(Protein Data Bank)中登記的人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列、在例如美國衛生與人類服務部(D印t. Health and Human Services)的《免疫學重要的蛋白序列》 (Sequences of Proteins of Immunological Interest) (1991)中描述的人抗體的 VH 禾口 VL的每個亞組FR的共有氨基酸序列，等等。對于人源化抗體的CH來說，可以使用任何CH，只要它屬于hlg即可，優選的是 hlgG類別的，并可以使用屬于hlgG類別的任何一個亞類，例如hlgGl、hIgG2、hIgG3和 hIgG4。對于人⑶R移植抗體的CL來說，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類別即可，并可以使用屬于κ類別或λ類別的。本發明的人源化抗體包括例如這樣的人源化抗體，其中抗體的VH含有SEQ ID Ν0: 22顯示的氨基酸序列或其中選自SEQ ID N0:22顯示的氨基酸序列中的9位的Ala、20位的Val、30位的Thr、38位的Arg、41位的Pro、48位的Met、67位的Arg、68位的Val、70位的Ile、95位的Tyr和118位的Val的至少一個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列，和/或抗體的VL含有SEQ ID NO :23顯示的氨基酸序列或其中選自SEQ ID NO 23 顯示的氨基酸序列中的15位的Leu、19位的Ala、21位的Ile、49位的Pro和84位的Leu 的至少一個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列，等等。這些被導入的修飾的數量沒有具體限制。人源化抗體的例子顯示如下。例如，對于抗體的VH的氨基酸序列來說，例子包括
人源化抗體，其中抗體的VH含有其中在SEQ ID NO :22顯示的氨基酸序列中20位的Val、30位的Thr、38位的Arg、48位的Met、67位的Arg、68位的Val、70位的Ile、95位的Tyr和118位的Val被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列，優選抗體的VH含有其中20位的Val,30位的Thr,48位的Met,68位的Val,70位的lie,95位的Tyr和118位的Val被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列；優選的人源化抗體，其中抗體的VH含有其中30位的Thr、48位的Met、68位的Val、 70位的Ile和95位的Tyr被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列；優選30位的Thr、48位的Met、68位的Val和70位的Ile被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列；優選的人源化抗體，其中抗體的VH含有其中30位的Thr、68位的Val、70位的Ile 和95位的Tyr被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列；優選的人源化抗體，其中抗體的VH含有其中30位的Thr、68位的Val和70位的
Ile被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列；優選的人源化抗體，其中抗體的VH含有其中30位的Thr和70位的Ile被其他氨
基酸殘基取代的氨基酸序列；等等。通過上面的氨基酸修飾獲得的抗體的VH的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中導入了至少一個修飾的氨基酸序列，所述修飾選自Thr取代9位的Ala、 Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、 Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的lie、 Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val。導入了 11個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中進行下面修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30 位的Thr、Lys取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的lie、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118 位的Val。導入了 10個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中進行下面修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30 位的Thr、Lys取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67 位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，等等。導入了 9個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO :22顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys 取代38位的Arg、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu 取代70位的lie、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val，等等。導入8個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO :22顯示的氨基酸序列中
進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile 取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的lie、Phe 取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys 取代38位的Arg、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的lie、Phe 取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val，等等。導入7個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO :22顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile 取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu 取代118位的Val，等等。導入6個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile 取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，等寸。導入5個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala 取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，等等。導入4個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala 取代68位的Val和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ala 取代68位的Val和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Ala
16取代68位的Val和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro、Ala 取代68位的Val和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Lys取代67位的Arg、Ala 取代68位的Val和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val、Leu 取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val、Leu 取代70位的Ile和Leu取代118位的Val，等等。導入3個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val和Leu 取代70位的lie,進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr和Leu 取代70位的lie,進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val,Arg取代30位的Thr和Leu 取代70位的lie,進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg和Leu 取代70位的lie,進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro和Leu 取代70位的lie,進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met和Leu 取代70位的lie,進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Lys取代67位的Arg和Leu 取代70位的lie,進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Leu取代70位的Ile和Phe 取代95位的Tyr，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr、Leu取代70位的Ile和Leu 取代118位的Val，等等。導入2個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Lys取代38位的Arg和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代41位的Pro和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Ile取代48位的Met和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Lys取代67位的Arg和Leu取代70位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Ala取代68位的Val和Leu取代70位的lie，
進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代70位的Ile和Leu取代118位的Val，進行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位的Ala和Arg取代30位的Thr，進行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位的Val和Arg取代30位的Thr，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr和Lys取代38位的Arg，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr和Thr取代41位的Pro，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr和Ile取代48位的Met，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr和Lys取代67位的Arg，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr和Ala取代68位的Val，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr和Phe取代95位的Tyr，進行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位的Thr和Leu取代118位的Val，等寸。導入1個修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 22顯示的氨基酸序列中用Thr取代9位的Ala的氨基酸序列，用Leu取代20位的Val的氨基酸序列，用Arg取代30位的Thr的氨基酸序列，
用Lys取代38位的Arg的氨基酸序列，用Thr取代41位的Pro的氨基酸序列，用Ile取代48位的Met的氨基酸序列，用Lys取代67位的Arg的氨基酸序列，用Ala取代68位的Val的氨基酸序列，用Leu取代70位的Ile的氨基酸序列，用Phe取代95位的Tyr的氨基酸序列，以及用Leu取代118位的Val的氨基酸序列。抗體的VL包括，例如，在SEQ ID NO :23顯示的氨基酸序列中15位的Leu、19位的 Ala、21位的Ile和84位的Leu被取代的氨基酸序列。其中19位的Ala、21位的Ile和84位的Leu被取代的氨基酸序列是優選的。通過上面的氨基酸修飾獲得的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO :23顯示的氨基酸序列中導入了至少一個修飾的氨基酸序列，所述修飾選自Val取代15位的Leu、Val取代19 位的Ala、Met取代21位的lie、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu。其中導入5個修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID N0:23顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的lie、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，等等。其中導入4個修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID N0:23顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met 取代21位的Ile和Ser取代49位的Pro，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met
18取代21位的Ile和Val取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Ser 取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu、Met取代21位的lie、Ser 取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代19位的Ala、Met取代21位的lie、Ser 取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，等等。其中導入3個修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO 23顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala和Met 取代21位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列取代49位的Pro，進行下面的修飾的氨基酸序列取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列取代49位的Pro，進行下面的修飾的氨基酸序列取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列取代49位的Pro，進行下面的修飾的氨基酸序列取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列取代84位的Leu，等等。其中導入2個修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID N0:23顯示的氨基酸序列中進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu和Val取代19位的Ala，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu和Met取代21位的lie,進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu和Ser取代49位的Pro，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位的Leu和Val取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代19位的Ala和Met取代21位的lie，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代19位的Ala和Ser取代49位的Pro，進行下面的修飾的氨基酸序列Val取代19位的Ala和Val取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列Met取代21位的Ile和Ser取代49位的Pro，
:Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala和Ser :Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala和Val :Val取代15位的Leu、Met取代21位的Ile和Ser :Val取代15位的Leu、Met取代21位的Ile和Val :Val取代15位的Leu、Ser取代49位的Pro和Val ；Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile和Ser ；Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile和Val ；Val取代19位的Ala、Ser取代49位的Pro和Val :Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val
進行下面的修飾的氨基酸序列Met取代21位的Ile和Val取代84位的Leu，進行下面的修飾的氨基酸序列Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，等寸。其中導入1個修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID N0:23顯示的氨基酸序列中用Val取代15位的Leu的氨基酸序列，用Val取代19位的Ala的氨基酸序列，用Met取代21位的Ile的氨基酸序列，用Ser取代49位的Pro的氨基酸序列，用Val取代84位的Leu的氨基酸序列，等等。本發明的人源化抗體的具體例子，包括其中可變區的H鏈包含SEQ ID N0:22顯示的氨基酸序列和/或可變區的L鏈包含SEQ ID NO :23顯示的氨基酸序列的人源化抗體；其中可變區的H鏈包含SEQ IDNO :22顯示的氨基酸序列和/或可變區的L鏈包含SEQ ID NO: 43顯示的氨基酸序列的人源化抗體；其中可變區的H鏈包含SEQ ID NO 42顯示的氨基酸序列和/或可變區的L鏈包含SEQ ID NO :23顯示的氨基酸序列的人源化抗體；其中可變區的H鏈包含SEQ ID NO :42顯示的氨基酸序列和/或可變區的L鏈包含SEQ ID NO :43顯示的氨基酸序列的人源化抗體；等等。人抗體原來是人體中天然存在的抗體，但是它也包括從基于遺傳工程、細胞工程和發育工程技術的最新進展制備的人抗體噬菌體文庫或產生人抗體的轉基因動物獲得的抗體。人體中存在的抗體可以例如如下制備分離人外周血淋巴細胞，通過用EB病毒等感染使其永生化，然后對它進行克隆，從而獲得能夠生產抗體的淋巴細胞，對這樣獲得的淋巴細胞進行培養，并從培養上清液中純化抗體。人抗體噬菌體文庫，是其中通過將從人B細胞制備的編碼抗體的基因插入到噬菌體基因中，而在噬菌體表面上表達抗體片段例如Fab和 scFv的文庫。表達具有所需抗原結合活性的抗體片段的噬菌體，可以利用它與固定有抗原的基質的結合活性作為指標，從文庫中回收。抗體片段可以通過遺傳工程技術進一步轉變為含有兩條完整的H鏈和兩條完整的L鏈的人抗體分子。產生人抗體的轉基因動物是其中人抗體基因被整合到細胞中的動物。具體來說，產生人抗體的轉基因動物可以如下制備將編碼人抗體的基因導入到小鼠ES細胞中，將ES細胞移植到另一只小鼠的早期胚胎中，然后使其發育。人抗體可以從產生人抗體的轉基因非人類動物如下制備通過通常在非人類哺乳動物中進行的雜交瘤制備方法獲得產生人抗體的雜交瘤，將獲得的雜交瘤進行培養，并在培養上清液中形成和積累人抗體。在構成上述的抗體或抗體片段的氨基酸序列中，其中一個或多個氨基酸被缺失、取代、插入或添加、但仍與上述抗體或其抗體片段具有相似活性的抗體或其抗體片段，也包括在本發明的抗體或其抗體片段中。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸數量是一個或多個，沒有具體的限制，但是它在通過已知方法例如位點定向誘變有可能進行缺失、取代、或添加的范圍內，位點定向誘變描述在《分子克隆》(第二版)(Molecular Cloning, Second Edition)、《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology (1987-1997))、Nucleic Acids Research, 10,6487(1982) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) 、Gene,M'315(1985) 、Nucleic Acids Research,13, 4431 (1985) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488(1985)等中。例如，數量為1到幾十個，優選為1到20個，更優選為1到10個，最優選為1到5個。上述抗體的氨基酸序列中“一個或多個氨基酸被缺失、取代、插入或添加”的表述意義如下。即，它意味著在該序列和一個或多個氨基酸序列中的任選位置上，存在著一個或多個氨基酸的缺失、取代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同時發生，被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然類型或非天然類型的。天然類型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、 L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸等。可互相取代的氨基酸的優選例子顯示在下面。同樣組中的氨基酸可以互相取代。A組亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，0-甲基絲氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，環己基丙氨酸B組天冬氨酸，谷氨酸，異天冬氨酸，異谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸C組天冬酰胺，谷氨酰胺D組賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸，2,4- 二氨基丁酸，2，3_ 二氨基丙酸E組脯氨酸，3-羥基脯氨酸，4-羥基脯氨酸F組絲氨酸，蘇氨酸，高絲氨酸G組苯丙氨酸，酪氨酸本發明的抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2、scFv、雙抗體、dsFv、包含6個CDR 的肽等。Fab是通過用蛋白酶——木瓜蛋白酶處理IgG抗體分子獲得的。這是具有大約 50, 000的分子量并具有抗原結合活性的抗體片段，其中在木瓜蛋白酶(在H鏈的224位切開氨基酸殘基)獲得的片段中，H鏈的大約一半N-端側和整個L鏈通過二硫鍵結合在一起。本發明的Fab可以通過用蛋白酶——木瓜蛋白酶處理抗體來生產。此外，本發明的Fab也可以通過將編碼抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，并將載體導入到原核生物或真核細胞中以表達Fab來生產。F(ab' )2是具有抗原結合活性的抗體片段，分子量為大約100，000，在用蛋白酶——胃蛋白酶(在H鏈的234位氨基酸殘基處切開)處理IgG抗體而獲得的片段中，比通過鉸鏈區中的二硫鍵連接在一起的Fab略大。本發明的F(ab' )2可以通過用蛋白酶——胃蛋白酶處理抗體來生產。此外，本發明的F(ab' )2也可以通過用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產。Fab'是其中上述F(ab' )2的鉸鏈區中的二硫鍵被切開后具有抗體結合活性的抗體片段，分子量為大約50，000。本發明的Fab'可以通過F(ab' )2使用還原劑二硫蘇糖醇來生產。此外，本發明的Fab'也可以通過將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，并將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab ‘，來生產。scFv是具有抗原結合活性的抗體片段，是VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中使用了適當的肽接頭(在后文中稱為“P”)將一條VH鏈和一條VL鏈連接在一起。本發明的scFv可
21以通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼scFv的DNA，將編碼抗體的scFv的DNA 插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然后將表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv，來進行生產。雙抗體是具有二價抗原結合活性的抗體片段，其中scFvs被二聚化。二價抗原結合可以是彼此相同或不同的。本發明的雙抗體可以通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼scFv的DNA使得P的氨基酸序列長度是8個殘基以下，將DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然后將表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙鏈抗體，來進行生產。dsFv是通過將其中VH和VL中的各一個氨基酸殘基用半胱氨酸殘基取代的多肽，通過半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接在一起而獲得的。用半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基，可以按照Reiter等(Protein Engineering, 7,697-704(1994))所示的方法，根據抗體的三維結構評估進行選擇。本發明的dsFv可以通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然后將表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv，來進行生產。含有本發明中使用的⑶R的肽，可以通過構建與HB-EGF特異性結合的抗體的VH 和VL的⑶R的編碼cDNA，將cDNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然后將表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達肽，來進行生產。含有⑶R的肽也可以通過化學合成方法例如Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等來生產。在本發明中，可以使用其中放射性同位素、蛋白或藥劑被結合到上述抗體或其抗體片段上的抗體衍生物。本發明的抗體衍生物可以通過將藥劑化學結合到與細胞膜結合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF結合的抗體或其抗體片段的H鏈或L鏈的N-端側或C-端側、抗體的適合的取代基或側鏈、或抗體中的糖鏈上來生產[《抗體工程手冊》(Antibody Engineering Handbook), Osamu Kanemitsu 主編，Chijin Shokan 出版(1994)]。此外，抗體衍生物也可以如下通過遺傳手法生產將與細胞膜結合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF結合的抗體或其抗體片段的編碼DNA與編碼待結合藥劑例如蛋白的其它DNA連接在一起，將DNA插入到表達載體中，并將表達載體導入到宿主細胞中。藥劑包括化療劑、治療性抗體、免疫刺激劑、具有高分子量的藥劑等。蛋白包括細胞因子、生長因子、毒性蛋白等。此外，待連接到抗體或其抗體片段上的藥劑可以是藥物前體的形式。本發明中的藥物前體受到腫瘤環境中存在的酶的化學修飾、并被轉化成具有損害腫瘤細胞的活性的物質的藥劑。化療劑包括任何化療劑，例如烷基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗癌性抗生素物質、來源于植物的生物堿、拓撲異構酶抑制劑、激素療法藥劑、激素拮抗劑、芳香化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉬復合物衍生物、M期抑制劑和激酶抑制劑。化療劑的例子包括阿米福汀(Ethyol)、順鉬、達卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、氮芥(氮芥子氣)、鏈脲佐菌素、環磷酰胺、異環磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(亞德里亞霉素)、多柔比星脂質體(Doxyl)、表柔比星、吉西他濱(Gemsal)、柔紅霉素、柔紅霉素脂質體(Daunozome)、丙卡巴胼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春花堿、長春新堿、博來霉素、道諾霉素、培洛霉素、雌氮芥、紫杉醇(泰素)、多烯紫衫醇(泰素帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉬、奧沙利鉬、奈達鉬、克拉曲濱、喜樹堿、CPT-11U0-羥基-7-乙基喜樹堿(SN38)、5_氟尿苷、氟達拉濱、羥基脲、異環磷酰胺、伊達比星、美司那、伊立替康、鹽酸拓撲替康、米托蒽醌、拓撲替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、羥基脲、普卡霉素、米托坦、培門冬酶、戊制菌素、哌泊溴烷、鏈脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睪內酯、硫鳥嘌呤、硫替哌、尿嘧啶氮芥、長春瑞賓、苯丁酸氦芥、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奧沙利鉬、吉非替尼(易瑞沙)、伊馬替尼(STI 571)、埃羅替尼、Flt3抑制劑、血管內皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑(易瑞沙，特羅凱)、根赤殼菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素、雷帕霉素、安丫啶、全反式視黃酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、來曲唑、依西美坦、硫代蘋果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環孢霉素、雷帕霉素、氫化可的松、蓓薩羅丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地塞米松、孕激素物質、雌激素物質、阿那曲唑 (瑞寧得)、來普隆、阿司匹林、吲哚美辛、塞來考昔、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代蘋果酸金、馬來酸氯苯吡胺、氯苯那敏、氯馬斯汀、維A酸、蓓薩羅丁、砷、voltezomib、別嘌呤醇、吉妥單抗、替伊莫單抗、131托西莫單抗、塔革雷汀、0ΝΤΑΚ、奧唑米星、克拉霉素、甲酰四氫葉酸、異環磷酰胺、酮康唑、氨魯米特、蘇拉明、氨甲蝶呤、maytansinoid及其衍生物等。將化療劑與抗體結合的方法包括其中化療劑與抗體的氨基通過戊二醛結合的方法，其中化療劑的氨基與抗體的羧基通過水溶性碳二亞胺連接的方法，等等。治療性抗體包括針對通過結合抗體誘導凋亡的抗原的抗體、針對參與腫瘤的病態形成例如腫瘤細胞的生長或轉移的抗原的抗體、調節免疫功能的抗體、以及抑制病變部位中血管生成的抗體。與抗體的結合誘導了凋亡的抗原包括分化簇(在后文中稱為“⑶”)19、⑶20、 CD21、CD22、CD23、CD24, CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75, CDw76, CD77、CDw78, CD79a、 CD79b、CD80(B7. 1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86 (B7. 2) ,11 類人白細胞抗原(HLA)、 EGFR，等等。與腫瘤病理狀況的形成相關或調節免疫功能的抗體的抗原包括⑶4、⑶40、⑶40 配體、B7 家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7 家族分子的配體 (CD28、CTLA-4、IC0S、PD-1、BTLA)、0X-40、0X_40 配體、CD137、腫瘤壞死因子(TNF)受體家族分子(DR4、DR5、TNFR1、TNFR2)、誘導TNF相關的凋亡的配體受體(TRAIL)家族分子、TRAIL 家族分子的受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子 κ B 配體(RANK) 的受體激活劑、RANK配體、CD25、葉酸受體4、細胞因子[白介素-Ia (后文中白介素稱為 "IL"), IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長因子(TGF) β、TNF α，等等]、這些細胞因子的受體、趨化因子(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、CTACK等)以及這些趨化因子的受體。在病變部位抑制血管生成的抗體的抗原包括血管內皮生長因子(VEGF)、促血管生成素、成纖維細胞生長因子(FGF)、EGF、血小板衍生的生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子 (IGF)、促紅細胞生成素(EPO)、TGF3、IL-8、印hilin、SDF-1 等。免疫刺激劑可以是任何被稱為免疫佐劑的天然產物。增強免疫原的藥劑的例子包括β (1 — 3)葡聚糖(香菇多糖，裂裥菌素)、α -半乳糖苷神經酰胺(KRN7000)、菌體粉末 (picibanil, BCG)和菌體提取物(云芝多糖)。具有高分子量的藥劑包括聚乙二醇(在后文中稱為“PEG”)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯-馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羥丙基甲基丙烯酰胺等。通過將這些具有高分子量的化合物與抗體或抗體片段結合，預期發生下列效應(1)改進對抗多種化學、物理或生物因子的穩定性，(2)顯著延長在血液中的半衰期，(3)免疫原性消失、抑制抗體生產等[生物結合藥物，廣川書店(1993)]。例如，PEG結合抗體的方法，包括使抗體與PEG修飾試劑進行反應的方法[生物結合藥物，廣川書店(1993)]。PEG修飾試劑包括賴氨酸的ε-氨基的修飾劑(特開昭61-178926)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修飾劑(特開昭56-23587)、精氨酸的胍基的修飾劑(特開平2-117920)等。細胞因子或生長因子可以是任何細胞因子或生長因子，只要它增強了細胞例如NK 細胞、巨噬細胞和嗜中性細胞即可。例子包括干擾素(在后文中稱為“INF”)-a、INF-β、 INF- γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)等。毒性蛋白包括篦麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，還包括在蛋白中導入突變以便控制毒性的毒性蛋白。放射性同位素包括mI、125I、9°Y、64CU、99Tc、77LU、211At等。放射性同位素可以通過氯胺-T法直接與抗體相連。此外，也可以將螯合放射性同位素的物質與抗體結合。螯合劑包括甲基苯甲基二亞乙基-三胺五乙酸(MX-DTPA)等。在本發明中，用于本發明的抗體可以與一種或多種其他藥劑組合給藥，并也可以組合使用放射性輻照。其它的藥劑包括上面描述的化療劑、治療性抗體、免疫刺激劑、細胞因子、生長因子等。放射性輻照包括光子(電磁)輻照例如X-射線或Y-射線、粒子輻照例如電子束、質子束或重粒子束，等等。在組合給藥的方法中，藥劑可以與本發明中使用的抗體同時給藥，或者藥劑可以在本發明中使用的抗體給藥之前或之后給藥。下面將對本發明進行詳細描述。1.生產重組抗體組合物的方法(1)抗原的制備含有編碼分泌型HB-EGF或分泌型HB-EGF的部分長度(在后文中簡稱為分泌型 HB-EGF)的cDNA的表達載體，被導入到大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等中進行表達，以獲得分泌型HB-EGF或分泌型HB-EGF的部分片段。此外，可以通過蛋白酶處理從表達 HB-EGF的細胞純化細胞外區域中的HB-EGF。分泌型HB-EGF能夠從表達大量分泌型HB-EGF 的多種人腫瘤培養細胞、人組織等中純化。此外，可以制備具有分泌型HB-EGF的部分序列的合成的肽并用作抗原。具體來說，在本發明中使用的分泌型HB-EGF可以通過例如將編碼它的DNA在宿主細胞中表達來生產，使用在《分子克隆實驗指南》(第二版)(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)> 《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley &
24Sons (1987-1997)等中描述的方法如下進行。首先，通過將全長cDNA插入到適合的表達載體的啟動子下游而產生重組載體。這時，如果需要，可以制備具有適當的長度、含有基于全長cDNA的多肽的編碼區域的DNA片段，該DNA片段可以代替上述的全長cDNA使用。接下來，通過將重組載體導入適合表達載體的宿主細胞，可以獲得產生HB-EGF的轉化體。宿主細胞可以是任何細胞，只要它能夠表達目的基因即可，包括大腸桿菌、動物細胞等。表達載體包括能夠在供使用的宿主細胞中自主復制的載體，或者能夠整合到含有適當啟動子的染色體中使得編碼分泌型HB-EGF的DNA能夠被轉錄的位置的載體。當使用原核生物例如大腸桿菌作為宿主細胞時，優選含有編碼本發明中使用的 HB-EGF的DNA的重組載體在原核生物中可以自主復制，并含有啟動子、核糖體結合序列、在本發明中使用的DNA以及轉錄終止序列。重組載體還可以含有調控啟動子的基因。表達載體包括例如pBTrp2、pBTacl、pBTac2 (都由 Roche Diagnostics 制造)、 PKK233-2 (Pharmacia 制造)、pSE280 (Invitrogen 制造)、pGEMEX-1 (Promega 制造)、 pQE-8 (QIAGEN 制造)、pKYP10(特開昭 58-110600)、pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry,48'669(1984)]、pLSAl[Agric. Biol. Chem. ,53, 277(1989) ]、pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,4306 (1985) ], pBluescript II SK (-) (Stratagene 制造)、pTrs30[從大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]、pTrs32 [從大腸桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)制備]、pGHA2 [從大腸桿菌 IGHA2 (FERM BP-400)制備，特開昭 60-221091]、 pGKA2 [從大腸桿菌 IGKA2 (FERM BP-6798)中制備，特開昭 60-221091]、pTerm2 (US4686191、 US4939094、US5160735)、pSupex、ρUB 110、pTP5、pC194、pEG400 [J. Bacteriol.，172， 2392 (1990) ]、pGEX (Pharmacia 制造)、pET 系統(Novagen 制造)、pME18SFL3,等等。任何啟動子都可以使用，只要它能夠在供使用的宿主細胞中起作用即可。例子包括源自于大腸桿菌、噬菌體等的啟動子，例如trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR 啟動子和T7啟動子。此外，人工設計和修飾的啟動子也可以使用，例如其中兩個Ptrp串聯連接的串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子和IetI啟動子。此外，上述的重組載體優選為質粒，其中作為核糖體結合序列的 (Shine-Dalgarno)序列與起始密碼子之間的間距被調整到適當的距離(例如6到18個核苷酸)。在本發明所用的分泌型HB-EGF的編碼DNA的核苷酸序列中，能夠適當地安排核苷酸，以獲得適合在宿主中表達的密碼子，使得目的分泌型HB-EGF的生產率可以提高。此外，上述重組載體中的轉錄終止序列對于表達基因來說不是必需的。但是，優選將轉錄終止序列安排在緊鄰結構基因的下游。用作宿主細胞的原核生物包括屬于大腸桿菌屬的原核生物，例子包括大腸桿菌 XLl-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DHl、大腸桿菌DH5 α、大腸桿菌BL21 (DE3)、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌ΚΥ3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌ΗΒ101、大腸桿菌 No. 49、大腸桿菌13110、大腸桿菌附49，等等。任何導入重組載體的方法都可以使用，只要它是用于將DNA導入到上述的宿主細胞中的方法即可，例子包括在Proc. Natl. Acad. Sci. USA，型，2110 (1972)、Gene, 17, 107(1982) ,Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)中描述的使用鈣離子的方法，
當動物細胞被用作宿主細胞時，表達載體包括例如pcDNAI、pcDM8 (從Funakoshi 獲得)、pAGE107[特開 5F 3-22979 ；Cytotechnology, 3,133 (1990) ], pAS3-3 ( # 開平 2-227075)、dCDM8「Nature, 329, 840, (1987) ]、pcDNAI/Amp (Invitrogen 制造)、 pREP4(Invitrogen 制造)、dAGE103「.T· Biochemistry, 101,1307 (1987) 1、dAGE210、 PME18SFL3，等等。任何啟動子都可以使用，只要它能夠在動物細胞中起作用即可。例子包括細胞肥大病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的啟動子、SV40早期啟動子、逆轉錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRa啟動子等。此外，人CMV的IE基因的增強子可以與啟動子一起使用。宿主細胞包括人Namalwa細胞、猴COS細胞、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、 HST5637 (特開昭 63-299)，等等。任何導入重組載體的方法都可以使用，只要它是用于將DNA導入到動物細胞中的方法即可，例子包括電穿孔[CytOtechnOlOgy，2，133(1990)]、磷酸鈣方法(特開平 2-227075)、脂轉染方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，M，7413 (1987)]，等等。作為基因的表達方法，除了直接表達之外，還可以按照《分子克隆實驗指南》(第二版)(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中的描述進行分泌生產、融合蛋白表達等。當在真核生物來源的細胞中進行表達時，可以獲得添加有糖或糖鏈的分泌型HB-EGF。在本發明中使用的分泌型HB-EGF可以通過將如此獲得的轉化體在培養基中進行培養以在培養基中形成和積累分泌型HB-EGF、并從培養物中回收它來生產。在培養基中培養轉化體的方法按照在宿主培養中常用的方法來進行。當用含有可誘導的啟動子作為啟動子的重組載體轉化的微生物進行培養時，如果需要，可以在培養基中加入誘導劑。例如，當對使用Iac啟動子的重組載體轉化的微生物進行培養時，可以在培養基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，或者當對使用trp啟動子的重組載體轉化的微生物進行培養時，可以在其中加入吲哚丙烯酸等。當使用動物細胞作為宿主細胞獲得的轉化體進行培養時，培養基包括常用的RPMI 1640 培養基[The Journal of the American Medical Association, 199，519 (1967)]、 Eagle 的 MEM 培養基[Science, 122, 501 (1952) ]、Dulbecco 修飾的 MEM 培養基[Virology, 8,396(1959)]以及 199 培養基[Proceeding of the Society for Experimental Biology and Medicine，！^，1(1950)]、添加了胎牛血清等的培養基，等等。培養一般在存在5% CO2 的情況下，在PH 6到8和30到40°C下進行1到7天。如果必要，在培養過程中可以向培養基添加抗生素例如卡那霉素或青霉素。因此，在本發明中使用的分泌型HB-EGF，可以通過按照通用的培養方法，對源自于微生物、動物細胞等的轉化體進行培養，所述轉化體包含其中插入了本發明使用的分泌型 HB-EGF的編碼DNA的重組載體，從而形成和積累多肽，然后從培養液中回收分泌型HB-EGF，來進行生產。對于基因的表達方法來說，除了直接表達之外，還可以按照《分子克隆實驗指南》 (第二片反)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition)，Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)中描述的方法進行分泌生產、融合蛋白表達等。生產分泌型HB-EGF的方法包括在宿主細胞中進行細胞內表達的方法、從宿主細胞進行細胞外分泌的方法、在宿主細胞外膜上生產的方法，等等。適合的方法可以通過改變使用的宿主細胞和產生的分泌型HB-EGF的結構來選擇。當在宿主細胞中或宿主細胞外膜上生產分泌型HB-EGF時，按照Paulson等的方法[J. Biol. Chem. ,264,17619(1989)1、Lowe 等的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 8227(1989)，Genes Develop.，4，1288 (1990)]、特開平 05-336963 和 W094/23021 中描述的方法等，可以將基因產物主動分泌到細胞外。此外，按照特開平2-27075中描述的方法，利用使用二氫葉酸還原酶基因的基因擴增系統，能夠增加產量。分泌型HB-EGF可以例如如下所述從上述培養物中分離和純化。當分泌型HB-EGF以溶解狀態在細胞內表達時，細胞在培養后通過離心回收，懸浮在水性緩沖液中，然后使用超聲波破碎器、French壓力器、Manton Gaulin勻漿器、珠磨機等進行破碎，以獲得無細胞的提取物。將無細胞的提取物進行離心以獲得上清液，并通過對上清液使用通用的酶分離和純化技術來獲得純化的制備物，這些技術例如溶劑抽提，使用硫酸銨等進行鹽析，脫鹽，用有機溶劑沉淀，使用樹脂例如二乙氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、 DIAION HPA-75(三菱化學社制造)進行陰離子交換層析，使用樹脂例如S-瓊脂糖凝膠 FF (Pharmacia制造)進行陽離子交換層析，使用樹脂例如丁基_瓊脂糖凝膠或苯基_瓊脂糖凝膠進行疏水層析，使用分子篩進行凝膠過濾，親和層析，層析聚焦，電泳例如等點聚焦，等等，它們可以單獨或組合使用。當分泌型HB-EGF通過形成包含體在細胞內表達時，細胞以同樣的方式回收、破碎和離心，分泌型HB-EGF的包含體作為沉淀級份被回收。將回收的蛋白包含體用蛋白變性劑進行溶解。通過對溶解的溶液進行稀釋或透析，使蛋白成為正常的三維結構，然后通過與上述相同的分離純化方法獲得分泌型HB-EGF的純化產品。當分泌型HB-EGF或衍生物例如糖基化產物被分泌到細胞外時，可以從培養上清液中回收分泌型HB-EGF或衍生物例如糖基化產物。即，通過例如離心的方法、以與上述相同的方式來處理培養物，得到除去了固形物的培養上清液，從培養上清液中通過與上述相同的分離純化方法，可以獲得多肽的純化產品。此外，在本發明中使用的分泌型HB-EGF可以通過化學合成法來生產，例如Fmoc(芴基甲氧基羰基)法或tBoc(叔丁氧基羰基)法。此夕卜，可以使用由 Advanced ChemTech> Perkin-Elmer> Pharmacia、Protein Technology Instrument、Synthecell-Vega、PerS印tive、島津制作所等制造的肽合成儀來化學合成它。(2)動物的免疫和抗體產生細胞的制備使用上面制備的抗原免疫3到20周齡的小鼠、大鼠或倉鼠，然后從動物的脾臟、淋巴結或外周血收集抗體產生細胞。此外，當在上述動物中發現由于低的免疫原性而導致足夠的滴度增加時，可以使用HB-EGF敲除的小鼠作為供免疫的動物。免疫通過給動物皮下、靜脈內或腹膜內注射施用抗原連同適合的佐劑(例如完全弗氏佐劑，氫氧化鋁凝膠與百日咳菌苗的組合等)來進行。當抗原是部分肽時，用載體蛋白例如BSA(牛血清白蛋白)、KLH(匙孔血藍蛋白)等產生結合物，將其用作抗原。在第一次施用后，每一周或每兩周施用抗原，進行5到10次。在每次施用后的第三到第七天，從眼底收集血液樣品，通過例如酶免疫分析[《抗體實驗指南》(Antibodies-ALaboratory Manual) ,Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等IlJi式ifili青與抗原的反應性。在其血清中顯示出針對免疫抗原的足夠的抗體滴度的小鼠、大鼠或倉鼠，被用作抗體產生細胞的供應源。在抗體產生細胞和骨髓瘤細胞的融合中，在最后施用抗原后的第三到第七天，摘出免疫接種的小鼠、大鼠或倉鼠的含有抗體產生細胞的組織例如脾臟，以收集抗體產生細胞。當使用脾臟細胞時，將切下來的脾臟置于MEM培養基中(日水制藥社制造)，用鑷子打散，并離心(1200rpm，5分鐘)。然后，丟棄上清液，加入Tris-氯化銨緩沖液(pH 7. 65) 1到 2分鐘以除去紅細胞。在用MEM培養基洗3次后，提供了用于融合的抗體產生細胞。(3)骨髓瘤細胞的制備從小鼠獲得的已建立的細胞系被用作骨髓瘤細胞。例子包括8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠(源自于BALB/c小鼠)的骨髓瘤細胞系P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1-7 (1978) ] > P3-NSl/l-Ag41 (NS-I) [European J.Immunology,旦，511-519(1976)]、 SP2/0_Agl4(SP-2) 「Nature,276,269-270(1978)1、 P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology, 123,1548-1550 (1979) 1、P3_X63_Ag8 (X63) [Nature, 畠，495-497 (1975)]，等等。將這些細胞系在8-氮雜鳥嘌呤培養基中傳代培養[該培養基是將谷氨酰胺(1. 5mM)、2_巰基乙醇(5X 10_5M)、慶大霉素(10 μ g/ml)和胎牛血清(FCS)加入到RPMI-1640培養基(在后文中稱為“正常培養基”)中，并再加入8-氮雜鳥嘌呤(15μ g/ ml)]，并且在細胞融合之前將它們在正常培養基中傳代培養3或4天，以確保在進行融合的當天細胞數量達到2X IO7個以上。(4)細胞融合將上述的抗體產生細胞和骨髓瘤細胞用MEM培養基或PBS(1. 83g磷酸氫二鈉， 0.21g磷酸二氫鉀，7.65g氯化鈉，1升蒸餾水，pH 7.2)進行充分清洗和混合，使抗體產生細胞骨髓瘤細胞的比率=5-10 1，然后離心(1200rpm，5分鐘)。然后丟棄上清液，將沉淀的細胞群充分打散。向IO8個抗體產生細胞中，在37°C、攪拌下加入2g聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、2mL MEM和0. 7mL 二甲亞砜的混合物溶液0. 2到ImL,每1或2分鐘加入1到2mL MEM培養基數次，并加入MEM培養基使得總量為50mL。離心(900rpm，5分鐘) 后，將上清液丟棄，輕輕地將細胞打散，通過使用吸量管吹吸，將細胞輕柔地懸浮在IOOmL HAT培養基中[該培養基是添加了次黃嘌呤(I(T4M)、胸腺嘧啶(1.5X I(T5M)和氨基蝶呤 (4 X IO-7M)的正常培養基]。將懸浮液以IOOyL/孔分配到96孔培養板上，在5%C02的培養箱中在37°C培養7到14天。培養后，將部分培養上清液作為樣品，通過下面描述的結合分析方法篩選生產對所有的細胞膜結合型HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF均有反應性的單克隆抗體的雜交瘤或純化的抗體。然后，通過有限稀釋方法將進行兩次克隆[第一次使用HT培養基(除去了氨基蝶呤的HAT培養基)，第二次使用正常培養基]，選擇顯示出穩定的高抗體滴度的雜交瘤作為生產單克隆抗體的雜交瘤。(5)單克隆抗體的制備將在⑷中獲得的產生抗HB-EGF單克隆抗體的雜交瘤細胞，以2X IO6到5X IO7 個細胞/動物的劑量通過腹膜內注射施用于8到10周齡的降植烷處理過的小鼠或裸鼠中(0.5ml 2，6，10，14-四甲基十五烷(降植烷)腹膜內注射，然后飼養2周)。雜交瘤在10 到21天內產生腹水腫瘤。從小鼠收集腹水液，離心(3，000rpm，5分鐘)以除去固形物，用 40到50%飽和的硫酸銨進行鹽析，然后用辛酸沉淀，通過DEAE-瓊脂糖凝膠柱、蛋白A柱或凝膠過濾柱，收集IgG或IgM級份作為純化的單克隆抗體。抗體的亞類可以使用亞類分型試劑盒通過酶免疫分析來確定。蛋白的量可以通過 Lowry方法或從280nm處的吸光度來測定。(6)結合分析導入了基因的細胞或通過(1)中的方法將含有本發明使用的HB-EGF的編碼cDNA 的表達載體導入到大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等中而獲得的重組蛋白、或從人組織獲得的純化的HB-EGF或部分肽，被用作抗原。當抗原是部分肽時，使用載體蛋白例如 BSA(牛血清白蛋白)或KLH(匙孔血藍蛋白)制備結合物，并使用。在這些抗原中，將其中細胞結合有分泌型HB-EGF和HB-EGF的細胞系分配到96孔板中并固相化，然后分配作為第一抗體的免疫動物的血清、產生單克隆抗體的雜交瘤的培養上清液、或純化的抗體，并進行反應。在用PBS或PBS-0.05% Tween充分清洗后，分配作為第二抗體的用酶、化學發光物質、放射性物質等標記的抗免疫球蛋白抗體，并進行反應。在用PBS-Tween充分清洗后，根據第二抗體中的標記物質進行反應。按照上面描述的方法，可以篩選出能夠生產對所有的細胞膜結合型HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF具有反應性的單克隆抗體的雜交瘤或純化的抗體。在獲得的單克隆抗體中，具有分泌型HB-EGF與HB-EGF受體的結合抑制活性的抗體，包括雜交瘤細胞系KM3566產生的單克隆抗體KM3566、雜交瘤細胞系KM3567產生的單克隆抗體KM3567，以及由雜交瘤KM3579產生的單克隆抗體。雜交瘤KM3579已經根據布達佩斯條約于平成18年1月24日作為FERM BP-10491保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地中央第6)。此外，能夠與本發明的抗HB-EGF單克隆抗體競爭與HB-EGF的結合的單克隆抗體，可以通過向上述結合分析系統加入待檢測抗體、然后進行反應來獲得。即，能夠與獲得的單克隆抗體競爭與HB-EGF的結合的抗體，可以通過篩選在加入待檢測抗體時抑制了單克隆抗體的結合的抗體，來獲得。此外，其結合的表位與本發明的抗HB-EGF單克隆抗體所識別的表位相同的抗體，可以通過鑒定在上述結合分析中獲得的抗體的表位，制備模擬表位的構象結構的部分合成肽、合成肽等，然后進行免疫，來獲得。(7)中和活性此外，獲得的單克隆抗體對分泌型HB-EGF是否具有中和活性，可以通過使用 HB-EGF依賴性細胞進行細胞生長抑制分析來證實。用于細胞生長抑制分析的細胞可以是任何細胞，只要該細胞具有能夠與分泌型 HB-EGF結合的受體即可。例子包括通過將EGF受體基因導入到小鼠骨髓衍生的細胞系32D clone 3 (ATCC No. CRL-11346)等中獲得的細胞系。在使獲得的單克隆抗體與分泌型HB-EGF在板上反應后，向其中加入上述的細胞系，然后進行培養。作為對照，將上述的細胞系同樣加入到添加了分泌型HB-EGF但是沒有加入單克隆抗體的板以及既沒有加入分泌型HB-EGF也沒有加入單克隆抗體的板中，然后進行培養。通過測量每個板上的細胞數量，可以測定細胞生長抑制比率。可以將具有高細胞生長抑制比率的單克隆抗體選作具有中和活性的單克隆抗體。本發明中具有中和活性的單克隆抗體的例子包括由雜交瘤細胞系KM3566產生的單克隆抗體KM3566和由雜交瘤細胞系KM3567產生的單克隆抗體KM3567。雜交瘤細胞系 KM3566和KM3567已經根據布達佩斯條約分別于平成18年1月24日和平成18年3月23 日作為FERM BP-10490和FERM BP-10573保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地中央第6)。2.重組抗體的制備(1)表達人源化抗體的載體的構建表達重組抗體的載體可以是任何用于動物細胞的表達載體，只要是插入了編碼人抗體的CH和/或CL的基因即可。表達人源化抗體的載體可以通過將每個編碼人抗體的CH 和CL的基因克隆到動物細胞表達載體中來構建。人抗體的C區可以是任何人抗體的CH和CL。例子包括人抗體中H鏈的IgGl亞類的C區(在后文中稱為“he γ 1”)、人抗體中L鏈的K類的C區(在后文中稱為“hCK ”)，等等。對于編碼人抗體的CH和CL的基因來說，可以使用含有外顯子和內含子或cDNA的染色體DNA，cDNA也可以使用。對于動物細胞的表達載體來說，可以使用任何表達載體，只要其中能夠插入并表達編碼人抗體的C區的基因即可。例子包括pAGE107[Cytotechnol. ,3,133-140(1990)], pAGE103[J. Biochem. ,101,1307-1310 (1987) ]、pHSG274 [Gene,27,223-232 (1984)]、 pKCR[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,78, 1527-1531 (1981) ]、pSGl β d2-4 [Cytotechnol. ,4,173-180(1990)]，等等。用于動物細胞表達載體的啟動子和增強子的例子包括SV40早期啟動子和增強子[J. Biochem.，101，1307-1310 (1987) 1、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR啟動子和增強子 [Biochem. Biophys. Res. Commun.，149，960-968 (1987) 1、免疫球蛋白 H 鏈啟動子[Cel 1，紅， 479-487(1985)]和增強子[Cell，^，717-728 (1983)]，等等。用于重組抗體表達的載體可以是抗體的H鏈和L鏈存在于分開的載體上的類型，或它們存在于同一個載體上的類型(在后文中稱為“串聯類型”)。對于構建用于人嵌合抗體和人源化抗體表達的載體的容易性、導入動物細胞的容易性、以及動物細胞中抗體H鏈和L鏈的表達量之間的平衡來說，串聯類型的表達人源化抗體的載體是優選的[Journal of Immunological Methods, 167, 271-278 (1994) ] 0串聯類型的用于表達人源化抗體的載體的例子包括 pKANTEX93 (W0 97/10354)、pEE18 [Hybridoma, 17, 559-567 (1998)]，等等。(2)非人類動物抗體V區的編碼cDNA的獲得及氨基酸序列分析編碼非人類動物抗體例如小鼠抗體的VH和VL的cDNA可以按照下面的方式獲得。從雜交瘤提取mRNA用于合成cDNA。將合成的cDNA克隆到載體例如噬菌體或質粒中以獲得cDNA文庫。通過使用編碼小鼠抗體的C區和V區的cDNA作為探針，從文庫中分離了各個含有編碼VH的cDNA的重組噬菌體或重組質粒和含有編碼VL的cDNA的重組噬菌體或重組質粒。測定了重組噬菌體或重組質粒上目的小鼠抗體的VH和VL的全長核苷酸序列，并從核苷酸序列推導出VH和VL的全長氨基酸序列。對于非人類動物來說，可以使用任何動物，只要能夠從該動物制備雜交瘤細胞即
30可，例如小鼠、大鼠、倉鼠和兔子。從雜交瘤制備總RNA的方法包括硫氰酸胍_三氟乙酸銫法 [Methods in Enzymology, 154,3-28(1987)1,從總 RNA制備mRNA 的方法包括寡聚(dT)固定化的纖維素柱方法[《分子克隆實驗指南》(Molecular Cloning, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York (1989)]，等等。用于從雜交瘤制備 mRNA 的試劑盒的例子包括Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)和Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)，等等。用于合成cDNA和制備cDNA文庫的方法包括常規的方法[《分子克隆實驗指南》(Molecular Cloning, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York(1989)，《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，附錄1-34]，使用可商購試劑盒，例如用于cDNA合成和質粒克隆的superscript 質粒系統 (GIBCO BRL制造)和ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene制造)的方法，等等。在cDNA文庫制備中，對使用從雜交瘤提取的mRNA作為模板合成的cDNA進行整合的載體可以是任何載體，只要cDNA可以整合即可。適合的載體的例子包括ZAP Express[Strategies,5,58-61(1992)]>pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17,9494(1989)], λ ZAPII (Stratagene 制造)、λ gtlO、λ gtll[《DNA 克隆實用方法》 (DNA Cloning :A Practical Approach), 1,49(1985) ] > Lambda BlueMid(Clontech M it)、 AExCelU pT7T3 18U (Pharmacia ^[Jit) > pcD2 [Molecular &Cellular Biology,3, 280-289 (1983) ]、pUC18 [Gene, 33,103-119 (1985)]，等等。對于導入用噬菌體或質粒載體構建的cDNA文庫的大腸桿菌來說，可以使用任何大腸桿菌，只要cDNA文庫可以被導入、表達和維持即可。例子包括XLl-Blue MRF' [Journal of Biotechnology, 23, 271-289 (1992) ]、C600 [Genetics, 59,177-190 (1968) ]、Y1088、 Y1090「Science, 222，778-782 (1983) 1、NM522「Journal of Molecular Biology,遲， 1-19(1983) ]、K802[Journal of Molecular Biology,16,118-133(1966)],JM105[Gene 38, 275-276 (1985)]，等等。從cDNA文庫中篩選編碼非人類動物來源的抗體的VH和VL的cDNA克隆的方法包括使用同位素或熒光標記的探針進行菌落雜交或噬斑雜交[《分子克隆實驗指南》 (Molecular Cloning， A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor Laboratory Press New York (1989)]。通過制備引物并使用cDNA或cDNA文庫作為模板進行聚合酶鏈反應(在后文中稱為“PCR”)[《分子克隆實驗指南》(Molecular Cloning, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press New York(1989)，《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，附錄 1_34]來制備編碼 VH和 VL 的 cDNA，也是可能的。通過上述方法篩選的cDNA的核苷酸序列可以如下確定用適合的限制性酶切開cDNA，將片段克隆到質粒例如pBluescript SK(-) (Stratagene制造)中，然后通過通用的核苷酸序列分析方法例如雙脫氧方法[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，li，5463-5467 (1977)]或通過使用核苷酸序列分析儀例如ABI PRISM 377 DNA測序儀(ABI制造)來分析序列。從測定的核苷酸序列推導出VH和VL的全長氨基酸序列，并與已知抗體的VH和 VL的全長氨基酸序列進行比較[《免疫重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美國衛生與人類服務部(1991)]，由此可以證實獲得的cDNA編
31碼了完整含有包括分泌信號序列的抗體的VH和VL的氨基酸序列。將含有信號序列的抗體的VH和VL的全長氨基酸序列與已知抗體的VH和VL的全長氨基酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美國衛生與人類月艮務部(1991)]進行比較，由此推導出信號序列的長度和N-末端氨基酸序列，并且可以知道它們所屬的亞類。此外，VH和VL的每個CDR的氨基酸序列可以通過將其與已知抗體的VH 和VL的每個⑶R的氨基酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美國衛生與人類服務部(US Dept. Health and Human Service) (1991)]進行比較來發現。通過使用VH和VL的全長氨基酸序列，使用任何數據庫例如SWISS-PR0T或 PIR-Protein進行序列同源性搜索、例如BLAST方法[Journal of Molecular Biology,215, 403-410 (1990)]，可以研究序列的新穎性。(3)人嵌合抗體表達載體的構建將編碼非人類動物抗體的VH和VL的cDNA，克隆到表達人源化抗體的載體中編碼人抗體的CH和CL的基因上游，從而構建了人嵌合抗體表達載體，在所述表達人源化抗體的載體中按照本部分上面(2)_1中所述插入了編碼人抗體的CH和CL的DNA。例如，將每個編碼非人類動物的抗體的VH和VL的cDNA，與含有非人類動物抗體的VH和VL的3 ‘-末端的核苷酸序列和人抗體的CH和CL的5'-末端的核苷酸序列并在兩端具有適當的限制性酶的識別序列的合成DNA進行連接和克隆，以便每個cDNA都以適當的形式在表達抗體的載體中編碼人抗體的CH和CL的基因的上游表達，從而構建了人嵌合抗體表達載體，在所述表達抗體的載體中按照本部分上面(2)_1中所述插入了編碼人抗體的CH和CL的DNA。此外，使用含有編碼非人類動物抗體的VH和VL的cDNA的質粒作為探針，使用在5’ -末端具有適當的限制性酶的識別序列的引物，通過PCR擴增了編碼VH和VL的cDNA，并將它們各克隆到本部分上面(2)-1中描述的表達人源化抗體的載體中編碼CH和CL的基因的上游，以便它可以以適當的形式表達，從而構建了人嵌合抗體表達載體。(4)人源化抗體(CDR移植抗體)的V區的編碼cDNA的構建編碼人源化抗體的VH或VL的cDNAs可以如下獲得。首先，選擇人抗體的VH或VL 中FR的氨基酸序列，在該序列中移植非人類動物的靶抗體的VH或VL中CDR的氨基酸序列。可以使用人抗體的VH或VL中FR的任何氨基酸序列，只要它們源自于人抗體即可。例子包括在數據庫例如蛋白數據庫(Protein Data Bank)中登記的人抗體的VH或VL中FR 的氨基酸序列、在人抗體的VH或VL中FR亞類共有的氨基酸序列[《免疫重要的蛋白序列》 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美國衛生與人類服務部(1991)]，等等。其中，為了生產具有強活性的人源化抗體，優選選擇與非人類動物的靶抗體的VH或 VL中FR的氨基酸序列具有高度同源性(至少60%以上)的氨基酸序列。然后，將非人類動物的靶抗體的VH或VL中CDR的氨基酸序列分別移植到人抗體的VH或VL中FR的選定氨基酸序列中，以設計人源化抗體的VH或VL的每個氨基酸序列。通過考慮在抗體基因的核苷酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美國衛生與人類服務部(1991)]中發現的密碼子使用頻率，將設計的氨基酸序列轉化成DNA序列，并設計了編碼人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。根據設計的DNA序列，合成幾個長度大約150個核苷酸的合成DNA，使用它們進行PCR。在這種情況下，鑒于反應的效率和可以合成的DNA的長度，優選對于每個VH和VL設計4個合成的 DNA。此外，通過在兩端上存在的合成的DNA的5’ -末端引入適當的限制性酶的識別序列，可以將它容易地克隆到在本部分上述(2)_1中構建的用于人源化抗體的表達載體中。在PCR后，將每個擴增產物克隆到質粒例如pBluescript SK(-) (Stratagene制造)中，按照在本部分上述2 (2)中描述的方法測定核苷酸序列，從而獲得了具有所需人源化抗體的 VH或VL的氨基酸序列的質粒。(5)人源化抗體的V區的氨基酸序列的修飾已經知道，當通過僅僅將非人類動物的靶抗體的VH和VL中的⑶R簡單地移植到人抗體的VH和VL的FR中來生產人源化抗體時，它的抗原結合活性比來自非人類動物的原始抗體的抗原結合活性低[BI0/TECHN0L0GY，1 266-271 (1991)]。因此認為，不僅在⑶R而且在FR中的幾個氨基酸殘基，與非人類動物的原始抗體的VH和VL中的抗原結合活性直接或間接相關，并且作為CDR移植的結果，這些氨基酸殘基被改變成了人抗體的VH和VL中FR 的不同氨基酸殘基。為了在人源化抗體中解決這個問題，在人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列中，鑒定了直接與結合抗原相關的氨基酸殘基、或通過與CDR中的氨基酸殘基相互作用或通過維持抗體的三維結構間接地與結合抗原相關的氨基酸殘基，并將其修改成在非人類動物的原始抗體中發現的氨基酸殘基，從而使已經降低的抗原結合活性增加[BIO/ TECHNOLOGY, 9, 266-271 (1991) ] 0在人源化抗體的生產中，最重要的是如何有效地鑒定FR 中與抗原結合活性有關的氨基酸殘基，以便通過X-射線晶體學[Journal of Molecular Biology,，112, 535-542 (1977)]、計算機模擬[Protein Engineering, 7,1501-1507 (1994)] 等構建并分析抗體的三維結構。盡管抗體三維結構的信息在人源化抗體的生產中是有用的，但還沒有建立起能夠適用于任何抗體的生產人⑶R移植抗體的方法。因此，現在必須需要進行各種不同的嘗試，例如，生產每種抗體的幾種修飾的抗體，并檢驗每種修飾的抗體與其抗體結合活性之間的相關性。人抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列的修改可以使用用于修飾的各種合成DNA，按照本部分上面2(4)中描述的PCR來進行。對于通過PCR獲得的擴增產物來說，核苷酸序列按照本部分2(2)中描述的方法來測定，以便驗證目的修飾是否已經發生。(6)人源化抗體表達載體的構建通過將在本部分上述2 (4)和2 (5)中描述的構建的人源化抗體的VH或VL的每個編碼cDNA，克隆到在本部分上述2 (1)中描述的用于表達抗體的載體中人抗體的CH或CL 的每個編碼基因的上游中，可以構建人源化抗體表達載體。例如，當在本部分上述2 (4)和 2(5)中構建人源化抗體的VH或VL中使用的合成DNA中，兩端位置的合成DNA的5，-末端中引入適當的限制性酶的識別序列時，克隆能夠進行，以便它們在本部分上述2(1)中描述的用于表達抗體的載體中，在編碼人抗體的CH或CL的每個基因的上游中以適當的形式表達。(7)重組抗體的瞬時表達為了有效評估產生的多種人源化抗體的抗原結合活性，可以使用在本部分上述 2(3)和2(6)中描述的人源化抗體表達載體或通過修改它而獲得的表達載體來瞬時表達人源化抗體。任何細胞都可以用作導入表達載體的宿主細胞，只要宿主細胞能夠表達人源
33化抗體即可。一般來說使用C0S-7細胞(ATCC CRL1651)，因為它的表達量高[Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press，283 (1991)]。將表達載體導入C0S-7 細胞的方法的例子包括DEAE-葡聚糖方法[Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press，283 (1991)]、月旨轉染方法[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,M' 7413-7417 (1987)]，等等。導入表達載體之后，在培養上清液中人源化抗體的表達量和抗原結合活性可以通過 ELISA[《抗體實驗指南》(Antibodies :A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory,第 14 章(1988)；《單克隆抗體原理和實踐》(Monoclonal Antibodies Principles and Practice)，Academic Press Limited (1996)]等來測定。(8)重組抗體的穩定表達穩定表達人源化抗體的轉化體細胞可以通過將本部分上述2 (3)和2(6)中描述的人源化抗體表達載體導入到適合的宿主細胞中來獲得。將表達載體導入宿主細胞的方法的例子包括電穿孔[Cytotechnology, 3,133-140 (1990)]等。對于其中導入人源化抗體表達載體的宿主細胞來說，可以使用任何細胞，只要它是能夠表達人源化抗體的宿主細胞即可。例子包括小鼠SP2/0-Agl4細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63_Ag8. 653細胞(ATCC CRL1580)、其中二氫葉酸還原酶基因(在后文中稱為"dhfr")缺陷的CHO細胞[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，77，4216-4220 (1980)]、大鼠 YB2/3HL.P2. Gil. 16Ag. 20 細胞(ATCC CRL1662，在后文中稱為"YB2/0細胞")，等等。在導入表達載體之后，按照在特開平2-57891中公開的方法，通過在含有藥劑例如G418硫酸化物(在后文中稱為"G418")等的用于動物細胞培養的培養基中進行培養，來篩選穩定地表達重組抗體的轉化體。培養動物細胞的培養基的例子包括RPMI1640培養基(日水制藥社制造)、GIT培養基(日本制藥社制造)、EX-CELL301培養基(JRH制造)、 IMDM培養基(GIBC0 BRL)制造、雜交瘤-SFM培養基(GIBC0 BRL制造)、通過在這些培養基中加入各種添加物例如FBS而獲得的培養基，等等。通過將選出的轉化體細胞在培養基中進行培養，重組抗體可以表達并積累在培養上清液中。培養上清液中重組抗體的表達量和抗原結合活性可以通過ELISA測定。此外，在轉化體細胞中，可以按照特開平2-57891中公開的方法，通過使用DHFR擴增系統等來增加重組抗體的表達量。可以通過使用蛋白A柱，從轉化體細胞的培養上清液中純化重組抗體[《抗體實驗指南》(Antibodies :A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 第 8 章(1988)；《單克隆抗體原理和實踐》(Monoclonal Antibodies principles and Practice), Academic Press Limited(1996)]。除此之外，也可以使用任何用于蛋白純化的其他常規方法。例如，人源化抗體可以通過凝膠過濾、離子交換層析、超濾等的組合來純化。人源化抗體的H鏈或L鏈或完整抗體分子的分子量可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(在后文中稱為"PAGE" )「Nature，227，680-685 (1970)1、Western印跡「《抗體實驗指南》 (Antibodies :A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory,第 12 章(1988)；《單克隆抗體原理和實踐》(Monoclonal Antibodies principles and Practice)， Academic Press Limited (1996)]等來測定。(9)重組抗體與抗原的結合活性的評估
人源化抗體與抗原的結合活性可以按照上面的描述通過ELISA來評估。3.抗體片段的制備抗體片段可以在上面的第1和2部分中描述的抗體的基礎上，按照遺傳工程方法或蛋白質化學方法來制備。遺傳工程方法包括這樣的方法，其中構建編碼目的抗體片段的基因，并使用適當的宿主例如動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌等進行表達并純化。蛋白質化學方法包括這樣的方法，其中使用蛋白酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶進行部分特異性裂解、純化等。下面具體描述抗體片段包括Fab、F(ab' )2、Fab'、scFv、雙抗體、dsFv和包含6 個⑶R的肽的生產方法。(I)Fab 的制備Fab可以使用蛋白質化學方法通過用蛋白酶一一木瓜蛋白酶處理IgG來制備。在用木瓜蛋白酶處理后，如果原始抗體是對蛋白A具有結合性質的IgG亞類，則可以通過過蛋白A柱將IgG分子與Fc片段分離開，收集到均一的Fab[《單克隆抗體原理和實踐》 (Monoclonal Antibodies =Principles and Practice),HH (1995)]。胃0A、L 結合活性的IgG亞類抗體的情況下，可以通過離子交換層析在低鹽濃度下洗脫的級份中收集Fab [《單克隆抗體原理和實踐》(Monoclonal Antibodies principles and Practice), 第三版(1995)]。此外，Fab通常也可以通過遺傳工程方法使用大腸桿菌來制備，并可以使用昆蟲細胞、動物細胞等來制備。例如，將本部分2(2)、2 (4)和(5)中提到的抗體的V區的編碼DNA克隆到用于表達Fab的載體中，從而制備Fab表達載體。任何表達Fab的載體都可以使用，只要Fab的DNA可以被插入和表達即可。例子包括pIT 106「Science，240， 1041-1043(1988)]等。將Fab表達載體導入到適合的大腸桿菌中，從而在包含體或周質空間中生產和積累Fab。從包含體中，可以通過通常用于蛋白的重新折疊方法獲得具有活性的Fab，而當在周質空間中表達時，具有活性的Fab泄漏到培養上清液中。在重新折疊后或從培養上清液中，可以使用結合抗原的柱子來純化均一的Fab[《抗體工程實用指南》 (Antibody Engineering,A Practical Guide), W.H.Freeman and Company(1992)]。(2)F(ab' )2 的制備F(ab' ) 2可以使用蛋白質化學方法通過用蛋白酶胃——蛋白酶處理IgG來制備。在用胃蛋白酶處理后，按照與Fab相同的方式，通過純化操作回收到均一的F(ab' )2[《單克隆抗體原理和實踐》(Monoclonal Antibodies principles and Practice)，第三版， Academic Press (1995)]。它也可以通過下面3 (3)中提到的將Fab ‘用馬來酰亞胺例如o-PDM或雙馬來酰亞胺處理以形成硫醚鍵的方法、或用DTNB[5，5' -二巰基雙(2-硝基苯甲酸)]處理以形成S-S鍵的方法[《抗體工程實用方法》(AntibodyEngineering，A Practical Approach), IRL Press (1996)]來制備。(3) Fab'的制備Fab'可以通過將上面3 (2)中描述的F (ab ‘ ) 2用還原劑例如二硫蘇糖醇進行處理來制備。此外，Fab ‘也可以通過遺傳工程的大腸桿菌來制備。此外，它也可以使用昆蟲細胞、動物細胞等來制備。例如，將本部分2(2)、2 (4)和(5)中提到的抗體的V區的編碼DNA 克隆到用于表達Fab'的載體中，從而制備Fab'表達載體。對于用于表達Fab'的載體來說，可以使用任何的載體，只要Fab'的DNA可以被插入和表達即可。例子包括pAK19[Bio/ Technology，！^，163-167 (1992)]等。將Fab'表達載體導入到適合的大腸桿菌中，從而在包含體或周質空間中生產和積累Fab'。從包含體中，可以通過通常用于蛋白的重新折疊方法獲得具有活性的Fab'，當Fab'在周質空間中表達時，可以通過用例如溶菌酶部分消化、滲透壓沖擊和超聲進行處理來破碎細胞，從而對其進行細胞外回收。在重新折疊后或從破碎細胞溶液中，可以使用蛋白G柱子等來純化均一的Fab'[《抗體工程實用方法》 (Antibody Engineering,A Practical Approach),IRL Press (1996)]。(4) scFv 的制備scFv可以使用噬菌體、大腸桿菌、昆蟲細胞、動物細胞等通過遺傳工程方法來制備。例如，將2(2)、2(4)和2(5)中提到的抗體V區的編碼DNA克隆到用于表達scFv的載體中，從而制備scFv表達載體。任何用于表達scFv的載體都可以使用，只要scFv的DNA 可以被插入和表達即可。例子包括pCANTAB5E (Pharmacia制造)、pHFA[Human Antibodies & Hybridomasj，48-56 (1994)]等。當scFv表達載體被導入到適合的大腸桿菌中并用輔助噬菌體進行感染時，可以獲得在噬菌體表面上以與噬菌體的表面蛋白融合的形式表達scFv 的噬菌體。此外，scFv也可以在其中導入了 scFv表達載體的大腸桿菌的周質空間或包含體中生產并積累。從包含體中，可以通過通常用于蛋白的重新折疊方法獲得具有活性的scFv，當scFv在周質空間中表達時，可以通過用例如溶菌酶部分消化、滲透壓沖擊和超聲進行處理來破碎細胞，對其進行細胞外回收。在重新折疊后或從破碎的細胞的溶液中，可以使用陽離子交換層析等來純化均一的scFv[《抗體工程實用方法》(Antibody Engineering, A Practical Approach),IRL Press (1996)]。(5)雙抗體的制備雙抗體通常可以使用大腸桿菌或昆蟲細胞、動物細胞等通過遺傳工程方法來制備。例如，制備了其中連接了本部分2(2)、2(4)和2(5)中描述的抗體的VH和VL、致使由其接頭編碼的氨基酸殘基是8個殘基以下的DNA，并將其克隆到用于表達雙抗體的載體中，從而制備雙抗體表達載體。任何用于表達雙抗體的載體都可以使用，只要雙抗體的DNA可以被插入和表達即可。例子包括pCANTAB5E(Pharmacia制造)、pHFA[Human Antibodies Hybridomas,5,48(1994)]等。雙抗體可以在其中導入了雙抗體表達載體的大腸桿菌的周質空間或包含體中生產并積累。從包含體中，可以通過通常用于蛋白的重新折疊方法獲得具有活性的雙抗體，當雙鏈抗體在周質空間中表達時，可以通過用例如溶菌酶部分消化、滲透壓沖擊和超聲進行處理來破碎細胞，對其進行細胞外回收。在重新折疊后或從破碎的細胞的溶液中，可以使用陽離子交換層析等來純化均一的雙抗體[《抗體工程實用方法》 (Antibody Engineering,A Practical Approach), IRL Press(1996)]。(6) dsFv 的制備dsFv通常可以使用大腸桿菌或昆蟲細胞、動物細胞等通過遺傳工程方法來制備。首先，將突變導入到本部分上述2(2)、2(4)和2(5)中提到的抗體的VH和VL的編碼DNA 的適當位置中，以制備其中被編碼的氨基酸殘基被半胱氨酸代替的DNA。將制備的每個 DNA克隆到用于表達dsFv的載體中，從而制備VH和VL的表達載體。任何用于表達dsFv 的載體都可以使用，只要dsFv的DNA可以被插入和表達即可。例子包括pULI 9 [Protein Engineering,!, 697-704 (1994)]等。將VH和VL的表達載體導入到適當的大腸桿菌中，dsFv在包含體或周質空間中形成并積累。將從包含體或周質空間獲得VH或VL混合并進行通常用于蛋白的重新折疊方法，從而獲得具有活性的dsFv。在重新折疊后，它可以通過離子交換層析、凝膠過濾等來進一步純化[Protein Engineering，！，697-704 (1994)]。(7)含有6個⑶R的肽的制備含有6個⑶R的肽可以通過化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來制備。此外，制備含有CDR的肽的編碼DNA，并將得到的DNA克隆到適合的表達載體中，由此可以制備含有CDR的肽的表達載體。對于表達載體來說，可以使用任何載體，只要編碼含有CDR的肽的DNA可以插入和表達即可。例子包括pLEX(由Invitrogen制造)、pAX4a+(由Invitrogen 制造)等。將表達載體導入適合的大腸桿菌，在包含體或周質空間中形成并積累。從包含體或周質空間獲得含有CDR的肽，并可以通過離子交換層析、凝膠過濾等進行純化[Protein Engineering,7,697(1994)]。4.本發明中的藥物和治療劑含有本發明的單克隆抗體作為活性成分的藥劑可用于治療各種與HB-EGF有關的疾病。與HB-EGF有關的疾病包括癌癥、心臟病、動脈粥樣硬化等。癌癥包括實體癌例如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌和卵巢生殖細胞腫瘤。此外，它包括伴隨任何實體癌的由連續性轉移、血行性轉移或淋巴細胞性轉移導致的轉移癌、腹膜播散等。此外，它包括了其他癌癥，例如源自于造血細胞的癌癥(血液癌或血癌)，包括白血病(急性骨髓性白血病、T細胞性白血病等)、淋巴瘤、骨髓瘤等。含有本發明的抗體或抗體片段作為活性成分的藥劑，優選被供應成通過在制藥技術領域中眾所周知的適合的方法，將其與一種或多種可藥用載體相混合而生產的藥物制劑。優選選擇在治療中最有效的給藥途徑。例子包括口服給藥和腸胃外給藥，例如頰、氣管、直腸、皮下、肌肉內或靜脈內給藥。在抗體或肽制劑的情況下，優選靜脈內給藥。劑型包括噴霧劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖漿、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、膠帶劑等。適合于經口給藥的藥物制劑包括乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等。液體制劑例如乳劑和糖漿劑可以使用下述作為添加劑來生產水，糖類如蔗糖、山梨糖醇和果糖，二醇例如聚乙二醇和丙二醇，油例如芝麻油、橄欖油和大豆油，抗菌劑例如對羥基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和胡椒薄荷等。膠囊、片劑、散劑、顆粒劑等可以使用下述作為添加劑來生產賦形劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇，崩解劑例如淀粉和藻酸鈉，潤滑劑例如硬脂酸鎂和滑石粉，粘合劑例如聚乙烯醇、羥丙基纖維素和明膠，表面活性劑例如脂肪酸酯，增塑劑例如甘油等。適合腸胃外給藥的藥物制劑包括注射劑、栓劑、噴霧劑等。注射劑可以使用載體例如鹽溶液、葡萄糖溶液或其二者的混合物來制備。栓劑可以使用載體例如可可脂、氫化脂肪或羧酸來制備。噴霧劑可以使用抗體或抗體片段本身、或將其與不刺激患者的口腔或氣道粘膜并能通過將化合物分散成細小粒子而促進其吸收的載體一起使用來制備。載體包括乳糖、甘油等。根據抗體和載體的性質，生產藥物制劑例如氣溶膠或干粉是可能的。此外，成分例如用于經口制劑的添加劑也可以添加到腸胃外制劑中。盡管給藥的劑量或頻率根據目標療效、給藥方法、治療時間、年齡、體重等而變化，
37但它通常為每個成年人每天10 μ g/kg 30mg/kg。下面將在實施例的基礎上對本發明進行詳細的解釋；但是，實施例是對本發明的說明，本發明不限于這些實施例。實施例1抗HB-EGF單克隆抗體的制備(1)免疫原的制備將R&D System制造的重組分泌型人HB-EGF凍干制劑(目錄號259-HE/CF)溶解在Dulbecco磷酸鹽緩沖液中(磷酸鹽緩沖的鹽水PBS)，并用作免疫原。(2)動物的免疫和抗體產生細胞的制備對HB-EGF缺陷小鼠[從大阪大學微生物疾病研究所細胞生物學部獲得，PNAS, Vol. 100，No. 100，3221-3226 (2003)]，施用在實施例1(1)中制備的25μ g重組分泌型人 HB-EGF、以及2mg氫氧化鋁佐劑(《抗體實驗指南》(Antibodies-A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, p. 99，1988)和 1 X IO9 個細胞的百日咳疫苗(千葉血清研究所)。在施用2周后，每周施用一次單獨的25 μ g HB-EGF，共4次。從眼底的靜脈叢部分收集血液，通過下面顯示的酶免疫分析檢測其血清抗體滴度，在最后免疫后3天，從顯示出足夠抗體滴度的小鼠摘出脾臟。將脾臟在MEM(最小必需培養基)培養基(日水制藥社制造)中切成小片，使用一副鑷子將細胞分開并離心(l，200rpm，5分鐘)。將這樣獲得的沉淀級份用Tris-氯化銨緩沖液(pH 7. 6)處理1到2分鐘以除去紅細胞。將這樣獲得的沉淀級份(細胞級份)用MEM清洗3次，并用于細胞融合。(3)酶法免疫分析(結合ELISA)將實施例1 (1)中的重組人HB-EGF以0. 5 μ g/ml和50 μ 1/孔分配在用于ELISA 的96孔板中(Greiner制造)，在4°C放置過夜進行吸附，并用于分析中。在洗板后，以 50μ 1/孔向其中加入牛血清白蛋白(BSA)-PBS，在室溫放置1小時以阻斷剩余的活性基團。在將板放置之后，棄去BSA-PBS，將作為第一抗體的被免疫的小鼠的抗血清或雜交瘤培養上清液以50μ1/孔分配到板中，放置2小時。在用0.05%聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單月桂酸酯[(ICI商標Tween 20的相當品，由和光純藥社制造)]/PBS (在后文中稱為 “Tween-PBS")洗板后，加入50 μ 1/孔過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgGy鏈(Kirkegarrd & Perry Laboratories制造)作為第二抗體，在室溫放置1小時。在用Tween-PBS洗板后，加入ABTS [2，2-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)銨]底物溶液[lmmol/1 ABTS/0. Imo 1/ 1檸檬酸緩沖液(pH 4. 2)，0. H2O2]進行顯色，使用讀板器(Emax ；molecular Devices制造)測定OD 415nm的吸光度。(4)小鼠骨髓瘤細胞的制備將8-氮雜鳥嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤細胞系P3X63Ag8U. 1 (P3-U1，從ATCC購買)培養在添加了 10%胎牛血清的RPMI 1640中(Invitrogen制造)，確保在細胞融合的當天有 2xl07個以上的細胞，作為親本細胞系用于細胞融合。(5)雜交瘤的制備將實施例1 (2)中獲得的小鼠脾細胞和實施例1 (4)中獲得的骨髓瘤細胞以10 1 的比率混合，然后離心(l，200rpm，5*#)。將這樣獲得的沉淀級份的細胞群完全打散，在 37°C下一邊攪拌一邊以每IO8個小鼠脾細胞0. 5ml的量加入Ig聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、
38Iml MEM培養基和0. 35ml 二甲基亞楓的混合溶液，以1到2分鐘的時間間隔在懸浮液中數次加入Iml MEM培養基，然后通過加入MEM培養基將總體積調整到50ml。將懸浮液離心 (900rpm，5分鐘)，將如此獲得的沉淀級份的細胞輕輕打散，然后通過用吸管輕柔地吹吸，將細胞懸浮在100ml HAT培養基中[通過將HAT培養基添加物(Invitrogen制造)加入到添加了 10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中制備的培養基]。將懸浮液以200 μ 1/孔分配到96孔培養板中，然后在5% CO2培養箱中在37°C培養10到14天。培養后，通過用實施例 1 (3)中描述的酶免疫吸附檢測培養濾液，篩選出對重組人HB-EGF有反應的孔，將從中獲得的細胞通過有限稀釋方法重復克隆兩次，從而建立了產生抗HB-EGF單克隆抗體的雜交瘤細胞系 KM3566、KM3567 和 KM3579。(6)單克隆抗體的純化將每個在實施例1(5)中獲得的雜交瘤細胞系以5到20X 106個細胞/動物的劑量腹膜內注射到降植烷處理的8周齡雌性裸鼠中。在此后的10到21天，從每只由于雜交瘤的腹水腫瘤而引起腹水液積累的小鼠中收集腹水液(1到8ml/動物)。將腹水液離心 (3，000rpm，5分鐘)以除去固形物。按照辛酸沉淀法(《抗體實驗指南》(Antibodies-A Laboratory Manual) ,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)進行純化以獲得純化的 IgG 單克隆抗體。每個單克隆抗體的亞類使用亞類分型試劑盒通過ELISA來確定。單克隆抗體 KM3566的亞類是IgG 1，單克隆抗體KM3567的亞類是IgGl，單克隆抗體KM3579的亞類是 IgG2b。實施例2
抗HB-EGF單克隆抗體對HB-EGF的反應性(1)通過結合ELISA分析與HB-EGF的反應性本實驗按照實施例1(3)中顯示的方法進行。將抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、 KM3567、KM3579的各種純化抗體以及可商購的抗HB-EGF單克隆抗體MAB259 (R&D制造)和陰性對照抗體KM511 (抗G-CSF衍生物的單克隆抗體)，從10 μ g/ml開始通過5倍連續稀釋進行逐級稀釋，并用作第一抗體。結果顯示在圖IA中。抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、KM3567、KM3579和MAB259中的每一種都與重組人 HB-EGF反應，但是不與BSA反應。(2)通過Western印跡分析與HB-EGF的反應性每道20ng重組人HB-EGF (R&D制造)通過SDS聚丙烯酰胺電泳進行分級，電泳后將凝膠轉移到PVDF膜上。在用10% BSA-PBS阻斷膜后，使用10% BSA-PBS將抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、KM3567、KM3579、MAB259的每種純化抗體和陰性對照抗體KM511稀釋到 1 μ g/ml，將它們在室溫反應2小時。在用Tween-PBS徹底清洗膜之后，將過氧化物酶標記的抗小鼠免疫球蛋白抗體(Zymed Laboratory制造)稀釋，并在室溫反應1小時。將膜用 Tween-PBS徹底清洗，使用ECL Western印跡檢測試劑(Amersham Pharmacia制造)來檢測條帶。從每種抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、KM3567、KM3579和MAB259中都檢測到了相當于重組分泌型人HB-EGF分子量的約15到30千道爾頓(在后文中稱為“kDa”)的條帶。(3)抗HB-EGF單克隆抗體的HB-EGF-EGFR結合抑制活性的評估使用32D/EGFR細胞和生物素標記的HB-EGF，檢測抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、KM3567、KM3579 和 MAB259 的 HB-EGF-EGFR 結合抑制活性。重組分泌型人HB-EGF以通常的方式使用EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(Pierce制造)進行生物素標記。KM3566、KM3567、KM3579和MAB259各從10 μ g/ml開始通過5倍連續稀釋進行逐級稀釋，以50 μ 1/孔分配到96孔板中。然后，以1 X IO4細胞/50 μ 1/孔分配32D/EGFR細胞。此外，生物素標記的HB-EGF和Alexa 647標記的鏈親和素被稀釋到最適的濃度，分別以10 μ 1/孔和50 μ 1/孔分配，在混合后，令混合物在暗處室溫下反應3小時。使用8200 細胞檢測系統(Applied Biosystems制造)，測定由633nm He/Ne激光輻照激發的650nm到 685nm的波長。結果顯示在圖IB中，所有的KM3566、KM3567、KM3579和MAB259抗體都濃度依賴性地抑制生物素化的HB-EGF與EGFR的結合。因此，發現所有抗HB-EGF單克隆抗體都抑制 HB-EGF與EGFR的結合。實施例3抗HB-EGF單克隆抗體對HB-EGF的中和活性的檢測通過使用HB-EGF依賴性細胞的細胞生長抑制分析，檢測了抗HB-EGF單克隆抗體 KM3566、KM3567、KM3579和MAB259的中和活性。將32D/EGFR用作HB-EGF依賴性細胞。將抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、KM3567、KM3579和MAB259的每種純化抗體和陰性對照抗體 KM511，從20 μ g/ml開始以3到4倍的稀釋率進行連續稀釋，并以50 μ 1/孔分配到96孔板中。接下來，以10 μ 1/孔分配0. 1 μ g/ml的重組人HB-EGF (R&D制造)，在混合后，將混合物在冰上反應2小時。然后，將32D/EGFR細胞以1 X IO4細胞/40 μ 1/孔的細胞數量接種，然后培養36小時。以10 μ 1/孔的量加入活細胞測量試劑(Nacalai Tesque制造)，2小時后，使用讀板器(Emax ；Molecular Devices制造)測量OD 450nm的吸光度。通過把只加入HB-EGF的孔的吸光度作為0%抑制率，沒有加入HB-EGF和抗體的孔的吸光度作為100%抑制率，計算每個孔的細胞生長抑制率，結果顯示在圖2A中。結果， KM3566顯示出對細胞系32D/EGFR的HB-EGF依賴性細胞生長抑制活性，與MAB259的水平相似。因此，發現了這兩種抗體具有相似的HB-EGF中和活性水平。另一方面，因為KM3579不抑制細胞系32D/EGFR的生長，發現它不具有HB-EGF中和活性。此外，以同樣的方式進行的KM3567的中和活性的檢測結果顯示在圖2B中。結果，盡管KM3567的活性與KM3566相比較弱，但它仍具有抑制HB-EGF依賴性細胞生長的活性。實施例4抗HB-EGF單克隆抗體對膜型HB-EGF的反應性的檢測將抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、KM3567、KM3579、MAB259和陰性對照抗體 KM511各用0. BSA-PBS稀釋到多種濃度，加入到1到5x IO5個細胞的人胃癌細胞系 MKN-28 (HSRRB JCRB 0253)、人卵巢癌細胞系ES_2 (ATCC CRL-1978)或人乳腺癌細胞系 MDA-MB-231 (ATCC HTB-26)中，在混合后，將總體積調整到50 μ 1。使這些細胞懸浮液每一種在冰上反應40分鐘，然后用0. 1 % BSA-PBS洗3次。向細胞加入通過用0. 1 % BSA-PBS稀釋制備的50 μ 1 FITC標記的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)多克隆抗體(Kirkegaard & Perry Laboratories制造)，使混合物在冰上反應40分鐘。細胞用0. 1 % BSA-PBS清洗，然后懸浮在0.1% BSA-PBS中，并使用流式細胞儀(Coulter制造)測量熒光強度。
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圖3顯示了平均熒光強度(MFI值)，其中每種上面提到的單克隆抗體從20 μ g/ml 開始被稀釋2倍，并與MKN-28和ES-2反應。圖4顯示了每種抗體反應性的直方圖，其中將 20 μ g/ml的每種上述單克隆抗體與人乳腺癌細胞系MDA-MB-231反應。結果，對于MKN-28 來說，發現了 KM3566和KM3579的結合活性。此外，在ES-2的情況下，發現結合活性的次序是KM3566 > KM3579。此外，在MDA-MB-231的情況下，發現結合活性的次序是KM3566 > KM3567 ^ KM3579。此外，在所有細胞中，MAB259的MFI值與陰性對照抗體KM511和未加入抗體的陰性對照相似，并且MAB259基本上不與細胞結合。從上述結果，發現單克隆抗體 KM3566、KM3567和KM3579與癌細胞系的膜型和細胞膜結合型HB-EGF結合。實施例5編碼抗HB-EGF單克隆抗體可變區的cDNA的分離和分析(1)從產生抗HB-EGF單克隆抗體的雜交瘤細胞制備mRNA從實施例1中描述的雜交瘤KM3566的5xl07個雜交瘤細胞中，使用RNAeasy Maxi 試劑盒(QIAGEN制造)和01igotexTM-dt30<super>mRNA純化試劑盒(Takara制造)，并按照其隨附的說明書制備了大于4. 8yg mRNA。(2)抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的H鏈和L鏈可變區的DNA克隆使用BD SMART RACE cDNA擴增試劑盒(BD Biosciences制造)，按照其隨附的說明書，從實施例5⑴中獲得的抗HB-EGF單克隆抗體KM3566 Wlyg mRNA,獲得了在5，末端具有試劑盒隨附的BDSMART II A寡核苷酸序列的cDNA。使用該cDNA作為模板，使用試劑盒隨附的通用引物Amix以及具有SEQ ID NO :6顯示的核苷酸序列的小鼠Ig( γ )特異性引物進行PCR，擴增VH的cDNA片段。此外，通過使用具有SEQ ID NO :7顯示的核苷酸序列的小鼠Ig( κ )特異性引物代替Ig( Y )特異性引物進行PCR，擴增VL的cDNA片段。在94°C 加熱5分鐘后，通過5個由94°C 30秒和72°C 3分鐘反應組成的循環，5個由94°C 30秒、 700C 30秒和72°C 3分鐘反應組成的循環，和30個由94°C 30秒、68°C 30秒和72°C 3分鐘反應組成的循環，然后在72°C反應10秒來進行PCR。PCR使用PTC-200DNA Engine (Bio-Rad 制造)來進行。為了克隆這樣獲得的PCR產物并確定它們的核苷酸序列，通過瓊脂糖凝膠電泳將它們分離，并使用凝膠提取試劑盒(Gel Extraction Kit，QIAGEN制造)提取各具有大約600bp的H鏈和L鏈的PCR產物。使用Ligation High (東洋紡織社制造)將每個這樣獲得的提取片段連接到SmaI-消化的pBluescript II SK(-)載體中，然后通過Cohen等的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]轉化大腸桿菌菌株DH5 α。使用自動質粒提取裝置(KURAB0制造)從獲得的轉化體中提取質粒，使用BigDye終止物循環測序 FS 快速反應試齊[J盒(BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit，PE Biosystems制造)、按照隨附的說明書進行反應，然后使用同一公司的測序儀ABI PRISM 3700分析克隆到的PCR產物的核苷酸序列。結果，獲得了含有完整長度的H鏈cDNA的質粒 KM3566VH10G2和含有L鏈cDNA的質粒KM3566VL10K2，其中被認為是起始密碼子的ATG序列存在于cDNA的5'末端中。(3)抗HB-EGF單克隆抗體V區的氨基酸序列的分析質粒KM3566VH10G2中包含的VH的完整核苷酸序列顯示在SEQID NO :8中，從該序列推導的含有信號序列的VH的完整氨基酸序列顯示在SEQ ID N0:9中，質粒KM3566VL10K2中包含的VL的完整核苷酸序列顯示在SEQ ID NO :10中，從序列推導的含有信號序列的VL 的氨基酸序列顯示在SEQ ID N0:11中。根據與小鼠抗體的已知序列數據[《免疫重要的蛋白的序列》(SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest)，美國衛生與人類服務部(1991)]的比較，和與使用蛋白測序儀(Shimadzu Corp.制造，PPSQ-10)分析純化的抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的H鏈和L鏈的N-末端氨基酸序列的結果比較，發現分離到的相應cDNA是編碼含有分泌信號序列的抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的全長cDNA，并且在SEQ ID NO :9顯示的氨基酸序列中1到19位的氨基酸序列是H鏈的分泌信號序列，而在 SEQ ID NO=Il顯示的氨基酸序列中1到20位的氨基酸序列是L鏈的分泌信號序列。接下來，檢測了抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的VH和VL的新穎性。使用GCG程序包(9. GlGenetic Computer Group制造)作為序列分析系統，通過BLASTP方法[Nucleic Acids Res. ,25,3389(1997)]檢索了現有的蛋白氨基酸序列數據庫。結果，對于VH和VL沒有發現完全一致的氨基酸序列，因此證實了抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的VH和VL具有新的氨基酸序列。此外，通過與已知抗體的氨基酸序列進行比較，鑒定了抗HB-EGF單克隆抗體 KM3566的VH和VL的CDR。抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別顯示在SEQID NOs :12、13和14中，VL的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NOs :15、16禾口 17中。實施例6抗HB-EGF嵌合抗體的制備(1)抗HB-EGF嵌合抗體表達載體pKANTEX3566的構建使用在WO 97/10354中描述的人源化抗體表達載體pKANTEX93和實施例5 (2)中獲得的質粒KM3566VH10G2和KM3566VL10K2，通過下述的方法構建了抗HB-EGF嵌合抗體表達載體 PKANTEX3566。使用IOOng質粒KM3566VH10G2作為模板，將總體積100 μ 1的溶液，其由10 μ 1 10XK0D 緩沖液、10 μ 1 2mmol/l dNTP、2yl 25mmol/l 氯化鎂、1 μ 1 10μπιο1/1 的每種具有SEQ ID N0s:18和19中描述的核苷酸序列的引物以及1 μ 1 KOD聚合酶(東洋紡織社制造)組成，在96°C加熱3分鐘，然后進行25個由94°C 1分鐘、55°C 1分鐘和72°C 1分鐘反應組成的循環，然后進一步在72。C反應8分鐘。通過該反應，合成了編碼KM3566的VH的 cDNA，其含有用于插入到pKANTEX93中的限制性酶識別序列。通過同樣的方式，將總體積為 100 μ 1的溶液，其由作為模板的IOOng質粒KM3566VL10K2、10y 1 10XK0D緩沖液、10 μ 1 2mmol/l dNTP、2yl 25mmol/l 氯化鎂、1 μ 1 10 μ mol/1 的每種具有 SEQ ID NOs :20 禾口 21 顯示的核苷酸序列的引物以及1 μ 1 KOD聚合酶(東洋紡織社制造)組成，在96°C加熱3分鐘，然后進行25個由94°C 1分鐘、55°C 1分鐘和72°C 1分鐘反應組成的循環，然后進一步在72°C反應8分鐘。通過該反應，合成了編碼KM3566的VL的cDNA，其中含有用于插入到 PKANTEX93中的限制性酶識別序列。通過用乙醇沉淀，純化和濃縮各PCR產物，并將其克隆到SmaI消化的pBluescript II SK(-)中，獲得了含有編碼KM3566的VH的核苷酸序列的質粒pKM3566VH和含有編碼KM3566的VL的核苷酸序列的質粒pKM3566VL。接下來，在上面獲得的每種載體pKANTEX93和pKM3566VL中加入限制性酶 BsiffI (New England Biolabs制造)，在55 °C反應1小時，然后向其中加入限制性酶EcoRI (Takara制造)，之后在37°C反應1小時。將該反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN制造)回收大約12. 8kb的pKANTEX93EcoRI_BsiWI 片段和大約0. 43kb的VL EcoRI-BsiffI片段。使用Ligation High (東洋紡織社制造)按照隨附的說明書將所獲得的兩個片段連接，使用這樣獲得的重組質粒DNA溶液轉化大腸桿菌DH5ci (東洋紡織社制造)。通過從轉化體的克隆制備每種質粒DNA并通過限制性酶處理進行證實，獲得了含有大約0. 43kb的目的EcoRI-BsiWI片段的質粒pKANTEX3566VL。接下來，在上面獲得的每個pKANTEX3566VL和pKM3566VH中加入限制性酶 ApaI(Takara制造)，在37 °C反應1小時，然后向其中加入限制性酶NotI (New England Biolabs制造)，之后在37°C反應1小時。該反應溶液通過瓊脂糖凝膠電泳進行分級以回收ApaI-NotI片段，分別回收到了大約13. 2kb的pKANTEX3566VL和大約0. 47kb的VH。使用Ligation High(東洋紡織社制造)按照隨附的說明書將這樣獲得的兩個片段連接，使用這樣獲得的重組質粒DNA溶液轉化大腸桿菌DH5 α (東洋紡織社制造)。通過從轉化體的克隆制備每種質粒DNA并通過限制性酶處理進行證實，獲得了含有大約0. 47kb的目的 ApaI-NotI片段的質粒pKANTEX3566。對于質粒來說，使用BigDye終止物循環測序FS快速反應試劑盒(PE Biosystems制造)，按照隨附的說明書進行反應后，使用同一公司的測序儀ABI PRISM 3700分析核苷酸序列。結果，獲得了克隆有編碼KM3566的VH的目的cDNA 和編碼其VL的cDNA的抗HB-EGF嵌合抗體表達載體pKANTEX3566。載體結構的示意圖顯示在圖5中。(2)抗HB-EGF嵌合抗體在動物細胞中的表達使用在上面提到的(1)中獲得的抗HB-EGF嵌合抗體表達載體pKANTEX3566，通過常用的方法[《抗體工程實用指南》(AntibodyEngineering, A Practical Guide), W. H. Freeman and Company (1992)]將抗HB-EGF嵌合抗體表達在動物細胞中，獲得產生抗 HB-EGF嵌合抗體的轉化體KM3966。(3)純化的嵌合抗體的制備在通過通常培養方法對上面提到的(2)中獲得的轉化體KM3966進行培養后，將細胞懸浮液回收并在3，OOOrpm和4°C下離心10分鐘，然后將如此回收的上清液通過孔徑為0. 22 μ m的Millex GV濾器(Millipore制造)進行過濾除菌。使用蛋白A高容量樹脂 (Protein A High-capacity resin, Millipore制造)柱，按照隨附的說明書，從如此獲得的培養上清液中純化抗HB-EGF嵌合抗體KM3966。使用梯度凝膠(ΑΤΤ0制造，E-T520L)按照隨附的說明書通過SDS-PAGE證實了純度和分子量。結果顯示在圖6中。對于純化的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的分子量來說，在非還原條件下發現是大約150到200kDa的單一條帶，在還原條件下發現是大約50kDa和大約25kDa的兩條條帶。這些分子量與報道一致，在報道中指出，IgG類的抗體在非還原條件下具有大約150kDa的分子量，但是由于切開了分子間的S-S鍵，被降解成具有大約50kDa 的分子量的H鏈和具有大約25kDa的分子量的L鏈[《抗體實驗指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory, 14 (1988)，((-^- Jfi 體原理與應用》(MonoclonalAntibodies-Principals and Practice), Academic Press Limited(1996)]。因此，證實了抗HB-EGF嵌合抗體KM3966被表達成具有正確結構的抗體分子。
實施例7抗HB-EGF嵌合抗體的活性評估(1)對人實體癌細胞系的結合活性為了評估在實施例6中獲得的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的結合活性，以下面的方式通過熒光抗體技術對它進行了檢測。將人卵巢癌細胞系MCAS (JCRB 0240)、RMG-I (JCRB IF 050315)和 ES-2 (CRL 1978)、人乳腺癌細胞系 MDA-MB-231 (ATCC HTB-26)、T47D (HTB-133)、SK-BR-3 (ATCC HTB-30)和 ZR-75-1 (ATCC CRL-1500)以及人胃癌細胞系 MKN-28 (HSRRB JCRB 0253)的每種細胞系用0.02%-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剝離并用PBS清洗，然后以1 2 X IO5細胞/50 μ 1/孔分配到96孔U型底的板中(FALCON制造)。以50 μ 1/孔分配用 BSA-PBS制備到20 μ g/ml的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966溶液，然后使用板混合器攪拌，將板在冰上放置30分鐘。在用PBS清洗兩次后，以50 μ 1/孔向其中加入稀釋100倍的第二抗體 FITC 結合的 AffinityPure F (ab ‘ ) 2 片段兔抗人 IgG (H+L) (Jackson Laboratories 制造)，然后使用板混合器攪拌，將板在暗處在冰上放置30分鐘。在用PBS清洗兩次后，使用流式細胞儀EPICS XL系統II v. 3.0 (BECKMAN COULTER制造)測量熒光強度。使用抗 FGF-8嵌合抗體KM3034(US 2004-0253234)作為陰性對照抗體。結果顯示在圖7中。抗HB-EGF嵌合抗體KM3966與所有人實體癌細胞系的膜型和細胞膜結合型HB-EGF結合。(2)測量抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對人HB-EGF的結合活性為了分析小鼠抗體KM3566和嵌合抗體KM3966對人HB-EGF在反應動力學上的結合活性，使用Biacore進行結合活性測量。所有下面的操作都使用Biacore T-100 (Biacore 制造)來進行。通過胺偶聯法，將使用HBS-EP緩沖液(Biacore制造)制備成5 μ g/ml的人HB-EGF (R&D制造)固定化在CM 5傳感器芯片上(Biacore制造)，水平為80RU(共振單位)。然后，使每種從9nmol/l稀釋5倍的抗體以10 μ 1/分鐘的速度在芯片上流動，通過分析每種濃度下的傳感器圖，計算每種抗體對人HB-EGF的結合速率常數和解離速率常數。結果發現，在兩種抗體的情況下，在抗體濃度范圍內，抗體與人HB-EGF結合后幾乎沒有發現解離反應，使得解離速率常數不能計算。另一方面，結合速率常數可以計算，結果顯示在表1中。根據結果，證實了這兩種抗體對人HB-EGF具有幾乎相同的結合活性。表 權利要求
一種單克隆抗體或其抗體片段，其與細胞膜結合型肝素結合性表皮生長因子樣生長因子(在后文中稱為“HB EGF”)、膜型HB EGF和分泌型HB EGF結合。
2.權利要求1的單克隆抗體或其抗體片段，其與細胞膜結合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF的表皮生長因子樣結構域(EGF樣結構域)結合。
3.權利要求1或2的單克隆抗體或其抗體片段，其抑制分泌型HB-EGF與HB-EGF受體的結合。
4.權利要求1到3任一項的單克隆抗體或其抗體片段，其對分泌型HB-EGF具有中和活性。
5.權利要求1到4任一項的單克隆抗體或其抗體片段，其與分泌型HB-EGF和HB-EGF 受體或HB-EGF和白喉毒素的結合區結合。
6.權利要求1到5任一項的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQID N0:2所示的氨基酸序列中第133、135和147位的至少一個氨基酸的表位結合。
7.權利要求6的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQID NO :2所示的氨基酸序列中第133、135和147位的氨基酸的表位結合。
8.權利要求1到5任一項的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQID N0:2所示的氨基酸序列中第141位的氨基酸的表位結合。
9.權利要求1到3、5和8任一項的單克隆抗體或其抗體片段，其與雜交瘤KM3579(FERM BP-10491)產生的單克隆抗體結合的表位結合。
10.權利要求1到7任一項的單克隆抗體或其抗體片段，其與雜交瘤KM3567(FERM BP-10573)產生的單克隆抗體結合的表位結合。
11.權利要求1到7任一項的單克隆抗體或其抗體片段，其與雜交瘤KM3566(FERM BP-10490)產生的單克隆抗體結合的表位結合。
12.權利要求1到11任一項的抗體或其抗體片段，其中單克隆抗體是重組抗體。
13.權利要求12的抗體或其抗體片段，其中重組抗體選自人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。
14.權利要求13的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的重鏈可變區(后文中稱為 “VH”)的CDR(互補性決定區，后文中稱為“CDR”)1、CDR2和CDR3分別含有SEQ ID NOs 12、13和14所示的氨基酸序列，和抗體的輕鏈可變區(后文中稱為“VL”)的CDR1、CDR2和 CDR3分別含有SEQ ID NOs :15、16和17所示的氨基酸序列。
15.權利要求13的人嵌合抗體或其抗體片段，其中人嵌合抗體的VH含有SEQID NO 9所示的氨基酸序列，和人嵌合抗體的VL含有SEQID NO 11所示的氨基酸序列。
16.權利要求13的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有SEQID NO 22所示的氨基酸序列或在SEQ ID NO :22所示的氨基酸序列中導入至少一個修飾的氨基酸序列，所述修飾選自Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys 取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala 取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val ；并且其中人源化抗體的VL含有SEQ ID NO 23所示的氨基酸序列或在SEQ ID NO 23所示的氨基酸序列中導入至少一個修飾的氨基酸序列，所述修飾選自Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的lie、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu。
17.權利要求13的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有在SEQID NO 22所示的氨基酸序列導入氨基酸修飾中的至少一個修飾的氨基酸序列，所述氨基酸修飾是 Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、 Leu取代70位的lie、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val ；并且其中人源化抗體的VL含有在SEQ ID NO :23所示的氨基酸序列導入氨基酸修飾中的至少一個修飾的氨基酸序列，所述氨基酸修飾是Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的 lie、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu。
18.權利要求13的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有SEQID NO 22所示的氨基酸序列，和人源化抗體的VL含有SEQ ID NO :43所示的氨基酸序列。
19.權利要求13的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有SEQID NO 42所示的氨基酸序列，和人源化抗體的VL含有SEQ ID NO :23所示的氨基酸序列。
20.權利要求13的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含有SEQID NO 42所示的氨基酸序列，和人源化抗體的VL含有SEQ ID NO :43所示的氨基酸序列。
21.權利要求1到20任一項的抗體片段，其選自Fab、Fab，、F(ab，)2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和含有6個CDR的肽。
22.—種DNA，其編碼權利要求1到21任一項的抗體或其抗體片段。
23.一種重組載體，其含有權利要求22的DNA。
24.一種轉化體，其能通過將權利要求23的重組載體導入宿主細胞而獲得。
25.一種用于生產權利要求1到21任一項的抗體或其抗體片段的方法，所述方法包括將權利要求24的轉化體在培養基中培養，以在培養物中形成和積累權利要求1到21任一項的抗體或其抗體片段，以及從培養物中回收所述抗體或抗體片段。
26.—種藥物組合物，其含有權利要求1到21任一項的抗體或其抗體片段作為活性成分。
27.一種用于治療與HB-EGF相關的疾病的藥劑，所述藥劑含有權利要求1到21任一項的抗體或其抗體片段作為活性成分。
28.權利要求27的藥劑，其中與HB-EGF相關的疾病是癌癥。
全文摘要
對于治療以HB-EGF水平增加為特征的疾病的藥物一直有需求。因此，本發明公開了一種能夠與細胞膜結合型HB-EGF、膜錨定型HB-EGF和分泌型HB-EGF結合的單克隆抗體，或所述單克隆抗體的片段。
文檔編號C12N1/21GK101978054SQ200880126268
公開日2011年2月16日申請日期2008年12月5日優先權日2007年12月5日
發明者中村和靖, 佐佐木由香, 古谷安希子, 安藤博司, 宮本新吾, 巖本亮, 桝田和宏, 目加田英輔, 設樂研也, 高橋久美子申請人:協和發酵麒麟株式會社

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