生產具有低酒精含量葡萄酒的方法

專利名稱：生產具有低酒精含量葡萄酒的方法
技術領域：
本發明涉及生產具有低酒精含量葡萄酒的方法，包括以葡萄糖氧化酶和葡萄糖異 構酶處理未發酵的葡萄汁。
背景技術：
由于全球變暖，全世界的葡萄包含更多糖。該糖在酒精性發酵中被轉化成酒精，導 致產生具有提高水平酒精的葡萄酒。因為此，當今葡萄酒工業的主要問題之一是高乙醇水平。15-16% (V/V)水平的乙 醇破壞了葡萄酒的感官質量，并且有時將葡萄酒置于比所預期更高的納稅分類中。在過去 十幾年觀察到的提高的乙醇水平是所收獲葡萄中糖水平增加的結果。當今，具有超過16% (V/V)乙醇含量的葡萄酒不再稀有，并且預測糖水平會隨著全球變暖甚至增加更多。當前認為因全球變暖而受負向影響的重要的葡萄酒區是例如Rioja(西班牙)、 Chianti (意大利)、Hunter Valley (澳大利亞)和南加利福尼亞的重要區域。當前的減少乙醇的方法，像反向滲透、旋轉錐或稀釋不能令人滿意。這些方法會對 葡萄酒的感官質量具有不利影響。此外，對于葡萄酒反向滲透的價格高達1美元/加侖，這 對于該方法的廣泛使用而言是主要的限制。US467519KNovo Industri，在丹麥公布，1987)描述了減少葡萄酒中酒精含量的 方法，其包括使用葡萄糖氧化酶。對于所描述的方法，第2欄第25-29行寫到“本發明方法包括在氧存在下以葡萄糖氧化酶處理未發酵的葡萄糖，由此將葡萄 汁中的葡萄糖轉化成葡糖酸并且之后將如此處理的葡萄汁發酵。”該現有技術方法的在此 處的主要相關技術原理示意性地圖解于圖1。

發明內容
本發明待解決的問題是提供減少葡萄酒中酒精含量的方法，其中方法會使葡萄酒 中的酒精明顯更少。此外，方法明顯降低了不期望的酒精發酵停滯。解決方案基于這樣一個事實，即本發明人已經鑒定出，基于本領域的葡萄糖氧化 酶的方法還可以通過包括使用葡萄糖異構酶得以顯著改善。US4675191的方法與本發明方法的示意性比較圖解于圖1。在本文的工作實施例中可以看出，僅使用葡萄糖氧化酶的過程使得總糖減少12% 左右，而額外加入葡萄糖異構酶使該數值明顯增加至19%左右的糖減少。葡萄汁中糖更少 意味著葡萄酒中酒精含量更少。此外，發明人發現額外加入葡萄糖異構酶幫助維持葡萄汁中葡萄糖/果糖比率在 1 1左右，這顯著降低了不期望的酒精發酵停滯的危險。對于進一步的細節見本文的工作 實施例。技術人員已知，如果葡萄汁中葡萄糖/果糖比率明顯不同于1. 1則會停滯酒精發 酵，即酵母沒有將所有的糖發酵，并且將因此得到太甜的葡萄酒。
如技術人員所已知，葡萄糖異構酶的重要的商業化相關應用是將葡萄糖轉化成果 糖，例如為了制造高果糖糖漿(果糖比葡萄糖更甜)。因為此，本發明人真正感到驚訝地是，加入葡萄糖異構酶給出了如此積極的結果 (糖顯著較少= >葡萄酒中酒精較少)。對于此結果的一個原因是葡萄糖異構酶乍看起來 作為可以“去除/轉化”太多的葡萄糖的酶，并且葡萄糖氧化酶將因此具有更少可利用的底 物(葡萄糖氧化酶對果糖無效)。然而，如在本文的工作實施例中所示，加入葡萄糖異構酶給出十分積極的結果。不被理論所限制，據信下面將是關于為何加入葡萄糖異構酶得出十分積極結果的 理論解釋。葡萄糖氧化酶(EC 1. 1.3. 4)在葡萄汁中催化下列反應β -D-葡萄糖 +02< = >D-葡萄糖酸-1，5-內脂 +H2O2在葡萄汁內產生的“D-葡萄糖酸-1，5-內脂”自發轉化成葡糖酸。因此，D-葡萄 糖酸-1，5-內脂被去除，并且因此平衡向右進行= >葡萄糖從葡萄汁中去除。如果酶制劑還具有過氧化氫酶活性，則產生的H2O2也被去除= >則平衡更加向右 側進行= >更多葡萄糖被去除。包含過氧化氫酶活性是本文的優選實施方案-見下面討 論。過氧化氫酶(EC 1. 11. 1.6)催化反應2H202< = >02+2 H2O與本文所述方法有關的是葡萄糖異構酶EC 5. 3. 1. 5 (法定名稱木糖異構酶)。對 于該EC 5.3. 1.5類的法定名稱是木糖異構酶。然而，如技術人員所已知，其還有一個稱作 葡萄糖異構酶的別名。葡萄糖異構酶是在例如該酶類別相關商業產品，例如在本文工作實 施例中使用的商業產品中使用的名稱。在葡萄汁中，本文相關并且眾所周知的在葡萄汁中由葡萄糖異構酶催化的反應是 下列反應D-葡萄糖< =>D_果糖。如技術人員所已知，該酶類還催化反應D-木糖< =>D-木酮糖。該木糖相關反應與本文相關性小。一個理論是，由葡萄糖氧化酶去除葡萄糖導致在葡萄汁中產生一種情況，即葡萄 糖/果糖比率變成低于1 1(得到“太多的果糖”-“太少的葡萄糖”)。因此，葡萄糖異構 酶平衡“強制”向左側進行=> 果糖被轉化成葡萄糖以“恢復” 1 1的葡萄糖/果糖比率 =>葡萄糖氧化酶得到“新”產生的葡萄糖以繼續工作并且因此總體上從葡萄汁中去除更 多的糖(葡萄糖和果糖兩者)。如上所述，維持1 1的葡萄糖/果糖比率還具有明顯減少酒精發酵停滯的危險 的優點。在酵母的酒精發酵之前，O2存在于未發酵葡萄汁中。如技術人員所已知，正常的酵 母發酵一般由兩部分組成部分1需氧生長(存在氧)
這是最初的快速生長過程，在其中酵母細胞數量大約每4小時翻倍。(通常24-72 小時)部分2厭氧發酵(不存在氧)較慢的活性和酵母使糖(葡萄糖和果糖兩者)發酵，將其轉化成酒精(糖=> 2乙 醇+2C02)，而不是增加酵母細胞的數量。(取決于酵母和方法該過程可發生數天至數周)。因此，在酵母發酵過程中，O2將遲早消失。葡萄糖氧化酶的活性需要02。然而，葡 萄糖異構酶在有或者無O2存在下是有活性的。因此，在實際的酵母酒精發酵過程中，葡萄 糖異構酶還可以幫助維持11的葡萄糖/果糖比率。因此，本發明的一個方面涉及生產具有低酒精含量葡萄酒的方法，其包括下列步驟(1)以有效量的下列兩種酶處理未發酵的葡萄汁(a)葡萄糖氧化酶，在氧存在下處理一段足以將葡萄汁中至少部分葡萄糖轉化成 葡糖酸的時間；和(b)葡萄糖異構酶處理一段足以將葡萄汁中至少部分果糖轉化成葡萄糖的時間；和隨后，(2)將具有減少量葡萄糖和果糖的如此處理的葡萄汁發酵，以生產具有低酒精含 量的葡萄酒。定義本文相關術語的所有定義與本文相關技術背景相關技術人員的理解一致。與根據第一個方面的方法生產的葡萄酒有關的術語“低酒精含量”在本文中指，與 在相同條件下但沒有用第一個方面的步驟(1)的兩種酶處理所生產的葡萄酒相比，葡萄酒 中的酒精含量較低。事實上，該術語可以看作是與使用有效量的兩種酶直接相關。如果使用有效量的葡萄糖氧化酶，則至少部分葡萄糖將從葡萄汁中去除，并且因 此葡萄酒中的酒精更少。類似地，對于有效量的葡萄糖異構酶，其將葡萄汁中的至少部分果 糖轉化成葡萄糖=>這樣產生的葡萄糖然后被葡萄糖氧化酶去除=>因此葡萄酒中的酒 精更少。本發明的實施方案僅通過實施例的方式在下描述。


Sl :US4675191方法與本發明方法的示意性圖解/比較。
具體實施例方式降低/減少酒精量實際上，本文所述的方法可以用于制造具有實際上任何預期低酒精含量的葡萄酒。例如，起可以是具有6-7%左右酒精含量的所謂的輕度酒。如上所述，由于全球變暖的緣故，全球的葡萄包含更多的糖，導致葡萄酒具有增加 水平的酒精。由于不同的原因，如差的口感或不同的納稅類別，這將是不期望的。因此，在優選的實施方案中，如本文所述生產的具有低酒精含量葡萄酒實際上具 有據認為對于當今的紅/白葡萄酒而言為正常的酒精含量-例如12-14%。
換句話說，如果相同的葡萄酒沒有經過本文所述的處理而制造的話，則其將具有 高的多的酒精百分數(例如15-17% )。葡萄酒可以是任何相關類型的葡萄酒，例如白葡萄酒、紅葡萄酒、無氣葡萄酒或含 汽葡萄酒。葡糖酸以葡萄糖氧化酶處理未發酵的葡萄汁產生葡糖酸，其不可被酵母發酵并且因此葡 糖酸出現在葡萄酒中。如技術人員所已知，葡糖酸會使葡萄酒具有令人不愉快的感官特性。因此，第一個方面方法的實施方案包括去除至少部分葡糖酸的任選步驟(3)以得 到具有滿意感官特性的葡萄酒。在一個實施方案中，葡糖酸通過加入形成葡糖酸微溶鹽的物質，優選碳酸鈣的中 和手段被去除。碳酸鈣是廉價的，并且已經用作葡萄酒的化學脫酸劑，并且沉淀的葡糖酸 鹽，主要是葡糖酸鈣，可以通過過濾容易地去除。由于葡萄酒無論如何也要過濾，所以該中 和作用沒有向葡萄酒制造過程中引入任何額外的過濾步驟。如技術人員所已知，具有高酒精含量的葡萄酒常常缺乏酸度。這意味著，對于此類 葡萄酒實際上可以優選不去除葡糖酸。如在本文所述方法中待使用的葡萄糖氧化酶和葡萄糖異構酶可以從多種不同適 宜來源，如相關的商業可得的酶產品中得到。如技術人員所已知，在酶市場上存在在正常葡萄酒制造條件下工作(例如相關pH 值、溫度等)的眾多不同商業可得的葡萄糖氧化酶/異構酶產品。在下面的工作實施例中，使用了下列商業可得到的酶產品葡萄糖氧化酶Hyderase (來自Amano)葡萄糖異構酶來自Sigma的產品(目錄號G4166_50g)-見本文的工作實施例。Hyderase 產品的一個優點是其還包括過氧化氫酶活性。過氧化氫酶活性如上所述，在本文所述方法中使用具有過氧化氫酶活性的酶制劑還導致去除由葡 萄糖氧化酶所產生的H202。過氧化氫(H2O2)會產生令人討厭的葡萄酒顏色，并且因此不是葡萄酒中的合意成份。此外，如上所述，通過去除H2O2，可以使葡萄糖氧化酶平衡甚至進一步地移向左邊 = >更多的葡萄糖被去除。因此，在第一個方面的步驟(1)的優選實施方案中，葡萄汁還以具有過氧化氫酶 活性的有效量制劑處理一段足以將葡萄汁中的至少部分H2O2轉化成02+H20的時間。優選的生產參數_第一個方面的步驟1如技術人員所已知，葡萄酒制造過程中的變化改變了葡萄酒產品的感官特性。因 此，在通常的葡萄酒制造過程與本文所述方法的實踐之間的緊密配合是優選的。在盡可能 的范圍內，通過實施本發明而無須做什么來改變葡萄酒的口味和香味。酶催化的過程通常在酶的最適pH內開展。本發明的優選實施是處理沒有調節其 PH的未發酵葡萄汁。幸運地是，如本文所使用的、商業可得到的適宜相關酶產品在未發酵葡 萄汁的通常PH3-4的范圍內表現出足夠的活性和穩定性。
應當理解的是，本文所述的任何酶可以用于本發明方法中，只要其在葡萄酒生產 方法過程中普遍使用的PH和溫度下表現出適當的相關活性和穩定性即可。因此，縱使可溶 性的酶制劑通常是優選的，但是可以使用可溶性和固定化的酶制劑。本領域技術人員容易地確定對于給定的葡萄汁和預期糖轉化需要多少給定類型 的酶。例如，依賴于治療時間和溫度的細節(i)大致在約1，000和50，000, 000國際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖氧化酶活 性將是適當的；和(ii)大致在約100和5，000, 000國際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖異構酶活性
將是適當的。如技術人員所已知，國際單位定義為每分鐘催化1 μ M底物轉化的酶的量。條件也 必須詳細說明。如技術人員所已知，人們通常采用30°C的溫度和得到最大底物轉化率的ρΗ 值和底物濃度。在此，國際單位如上面所述并且根據本領域定義，即在30°C的溫度下和得到最大 底物轉化率的PH值和底物濃度下確定。如技術人員所已知，對技術人員而言如本文所述確定酶的國際單位是常規工作， 并且可以在本文的相對小的不確定性之內確定。例如，如技術人員所已知，最適pH值和最適底物濃度會隨著特定的目的酶(例如 特定的葡萄糖氧化酶)改變。然而，可以容易鑒定這種最適PH和底物濃度，因為例如其通 常在相關的商業可得酶產品的產品文件中給出。此外，對于特定的目的酶，鑒定參數如最適 PH和底物濃度通常是常規工作。在優選實施方案中，使用下列(i)大致在約15，000和5，000, 000國際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖氧化酶活 性；和(ii)大致在約5，000和500，000國際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖異構酶活性。在優選的實施方案中，在第一個方面的步驟(1)過程中的溫度在1和35°C之間，優 選在3和30°C之間。通常，在酶反應中，如果溫度從例如25°C左右提高至40°C，總反應速率 將隨著溫度的提高而增加。然而，在該情況下，如果溫度從25°C提高至40°C，更多的氧將從 液體中釋放，并且因此在此種情況下總反應速率將降低。在40°C下的延長的更長處理也有 害于葡萄汁的質量。總的來說，優選地，在葡萄酒制作機制中所做的唯一變化意味著未發酵的葡萄汁 的短期儲存，與此同時(充氣的)葡萄汁以葡萄糖氧化酶、異構酶和任選的本文所述其他酶 處理。在這一點上，應該注意的是，控制參數是處理時間，而不是酶活性。例如，應采用足 夠的葡萄糖氧化酶以便在適當處理時間內轉化預期比例的葡萄糖，其中時間通常不超過72 小時，并且多數時間不超過48小時。即使在未發酵的葡萄汁中存在一些酵母，發現在最初 48小時過程中發酵不會啟動達到任何可感知的程度，并且因此去除相關量的糖是可能的。至于第一個方面的步驟1，應該注意的是，轉化程度非常容易控制，因為通過切斷 氧供應從葡萄糖至葡糖酸的反應幾乎立即停止。該發明的實施還考慮了這樣的情況，即自步驟1的糖減少的葡萄汁持續作為酸供
7應(酸儲存)并且與缺乏酸的葡萄汁混合以改善所得到的葡萄酒的感官特性。應當理解，葡糖酸的去除可以在任何時間開展，例如在發酵步驟之后。備選地，可以在加入如本文所述的葡萄糖氧化酶之前，通過加入例如碳酸鈣進行 葡糖酸的去除。這樣做的優點是葡萄汁中的PH增加，并且這通常改善葡萄糖氧化酶的活 性，由于葡萄糖氧化酶通常在PH中性左右具有最適pH。在優選實施方案中，相關酶制劑是固體的水溶性制劑，優選非粉化制劑。固體制劑 的儲存穩定性優于液體制劑的儲存穩定性，并且也沒有必要加入任何保存試劑。推薦使用 者在即將使用之前將固體形式試劑溶解在少量水中。在本文所述的方法的優選實施方案中，在第一個方面的步驟1過程中持續向葡萄 汁供應氧。氧供應尤其對葡萄糖氧化酶的酶促反應的反應速率具有非常大的影響。因此， 持續引入氧保證了高的反應速率。希望氧通過空氣泵供應，空氣泵是向葡萄汁中引入氧最 有效的手段。在根據本發明方法的優選實施方案中，在步驟1中加入的葡萄糖氧化酶/異構酶 制劑的量足以在不超過72小時左右的時間段內產生所希望的糖濃度降低。如已經指出的 那樣，即使葡萄汁中存在一些酵母，在最初的48小時期間發酵也不會進展至任何可感知的 程度，并且因此在葡萄糖向葡糖酸的酶促轉化期間也沒有可感知量的葡萄糖/果糖被同時 發酵成酒精。在優選實施方案中，在步驟(1)過程中對于葡萄糖氧化酶/異構酶兩種酶的有效 量和一段時間是這樣的，以致于㈧葡萄汁中的糖含量減少至少10%，更優選至少14%并且甚至更優選至少17%。如上所述，在本文的工作實施例中，糖含量(葡萄糖和果糖兩者)減少19%。在根據本發明方法的優選實施方案中，不控制步驟1中的pH值。該實施方案在更 長處理時間，例如一直到72小時左右是可行的并且被采用的情況下，是特別優選的。由于葡萄酒的香氣、口味和香味是極端敏感的特性這一事實，將不能預測根據本 發明生產的較低酒精的葡萄酒是否會擁有希望的特性，由于根據本發明以可溶性葡萄糖氧 化酶/異構酶制劑生產的較低酒精的葡萄酒會包含痕量無活性葡萄糖氧化酶/異構酶并且 在其他組份的濃度方面也可能不同于常規葡萄酒。然而，已經發現，根據本發明生產的較低 酒精的葡萄酒擁有葡萄酒的全部正常特性，包括口味和香味，當然與酒精濃度直接相關的 特性排除在外。優選的生產參數_第一個方面的步驟2開展第一個方面的步驟2，即所處理葡萄汁的發酵是本發明方法的必須步驟。然 而，在此無需提供對發酵步驟的詳細討論，因為明確考慮了開展常規葡萄酒制造實踐并且 這些實踐對葡萄酒釀造學(釀酒學)領域技術人員而言是眾所周知的。在本文中已經強調 了，在本發明的優選實踐中避免對葡萄酒制造過程機制的強加任何不必要的改變。如上所述，在酵母發酵過程中，O2遲早會消失。葡萄糖氧化酶需要O2才能工作。然 而，葡萄糖異構酶可以在存在或不存在O2情況下工作。因此，葡萄糖異構酶還可以幫助維 持實際的酵母酒精發酵過程中葡萄糖/果糖比率為1 1。實際上，這通常將在如本文所述的方法中發生。在步驟(1)過程中加入至未發酵 葡萄汁中的葡萄糖異構酶正常情況下在步驟(2)的酵母酒精發酵過程中仍然是有活性的。
然而，任選地，可以在步驟(2)的酵母酒精發酵過程中加入額外的葡萄糖異構酶。因此，在第一個方面的本發明實施方案中，在酵母酒精發酵步驟(2)過程中加入 額外的葡萄糖異構酶。實施例實施例1 葡萄汁中的酶催化糖減少_第一個方面的步驟(1)實例減少葡萄酒中最終酒精含量的一個可能的方法是在酒精發酵之前減少葡萄汁中 的糖濃度。因此，開展葡萄汁的酶性處理以減少總糖含量。開展三個獨立的實驗，在每一情況中使用兩個重復。在每一樣品中，200ml葡萄汁 (Pinot Blanc 2007，德國，經巴氏滅菌的)加入至玻璃燒瓶中并且使用磁力攪拌器連續混 合。在整個實驗過程中均將樣品充氣。IOOmg 葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano, > 15，000u/g)或者 IOOmg 葡萄糖氧化酶 和Ig葡萄糖異構酶(Sigma，G4166-50g, > 350u/g)加入至燒瓶中。在室溫下保溫3天。在即將加入酶之前和加入后的3天取出樣品。使用由BoehringerMarmheim/ R-biopharm(目錄號10 139 106 035)供應的商業化的基于UV的測定法并按照制造商提供 的實驗方案分析樣品中葡萄糖和果糖的存在。該實驗的結果總結于下表I。表I 葡萄汁中的酶促糖(葡萄糖和果糖)減少，GOX =葡萄糖氧化酶天數處理總糖(g/1)總、
0GOX2300
GOX+異構酶2350
3GOX20212
GOX+異構酶19019結論該實施例1的這些結果顯示，僅使用葡萄糖氧化酶的過程得到12%左右的總糖減 少，額外加入葡萄糖異構酶使該數值明顯提高至19%左右的糖減少。葡萄汁中糖更少意味 著葡萄酒中酒精含量更低。實施例2 所處理葡萄汁的酵母發酵_第一個方面的步驟(1)和步驟(2)的實施例在實驗室規模開展了對普通葡萄酒制造過程的完全模擬。在該實驗中顯示酶處理 的確對最終酒精水平具有影響，而沒有負面影響主要的葡萄酒的生產參數，如酒精發酵或 蘋果酸乳酸發酵。在近似22°C的室溫下開展完整的實驗。開展6個實驗，每一實驗在發酵瓶中使用 4升葡萄汁(Pinot Blanc 2007，德國，經巴氏滅菌的)。不調節葡萄汁的pH并且不加入除 該實施例中所述酶之外的物質。如下所述將葡萄汁與酶預孵育三天，然后開展11天的酒精發酵和10天的蘋果酸 乳酸發酵。酶處理6個燒瓶分成三個組，每組兩個燒瓶。在組1中的葡萄汁與0. 5g/l葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano，> 15，000u/g)預孵 育三天，在組2中葡萄汁與0. 5g/l葡萄糖氧化酶和2g/l葡萄糖異構酶(Sigma，G4166_50g，> 350u/g)預孵育三天，并且在對照組中葡萄汁不用酶處理。在加入酶之后，將燒瓶在酶存 在下強力充氣三天，之后開始酒精發酵。充氣是重要的，因為氧是葡萄糖氧化酶介導的酶轉 化所需要的。酒精發酵通過接種再水化的冷凍干燥葡萄酒酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) Merit. Ferm, Chr. Hansen, 0. lg/1)至9E+05CFU/ml的終濃度開始酒精發酵。再水化是在室 溫在胨水(15g/l 胰蛋白胨、0xoidL42，9g/l NaClU. 14g/l 2%消泡劑 1510、BHD 63215) 中開展10分鐘。在此時停止充氣并且在隨后的幾天內由于酵母代謝導致氧消耗光。將酒精發酵在 室溫運行11天，導致將所有糖幾乎完全轉化成酒精。蘋果酸乳酸發酵在酒精發酵之后，開始蘋果酸乳酸發酵。該部分過程的目標是將蘋果酸轉化成產 生更愉悅感官感覺的乳酸，并且因此是葡萄酒生產過程的重要部分。蘋果酸乳酸發酵主要 通過細菌酒酒球菌(Oenococcus oeni)實現。如果酒酒球菌的生長被葡萄汁的酶處理損害， 則將是非常不期望的。在開始酒精發酵11天后，通過向發酵過的葡萄汁加入酒酒球菌(Viniflora，Chr. Hansen.批號2711097)開始蘋果酸乳酸發酵。冷凍干燥的酒酒球菌(0. 7g的8. 2E+11CFU/ g)在 IOOml 胨水(15g/l 胰蛋白胨、Oxoid L 42. 9g/l NaClU. 14g/l 2%消泡劑 1510、 BHD 63215)中再水化10分鐘。向4000ml發酵過的葡萄汁中加入3ml，導致最終濃度為 4. 3X 106CFU/ml。在室溫下再放置10天。結果酶處理對酒精水平的影響使用由Boehringer Mannheim/R_biopharm(目錄號 10 139 106 035)供應的商業 化的基于UV的測定系統并按照制造商提供的實驗方案分析樣品中葡萄糖和果糖水平。表II，在酒精發酵開始和結束時的糖水平 在酒精發酵過程中的不同天數時，使用如文獻(Bestimmung desalkoholgehalts nach Dr. Rebelein.由 C Schliesmann Kellerie-Chemie GmbH& Co. KG, Auwiesenstrasse 5，74523 SchwSbische Hall出版(2001))中所述的Dr. Rebelein滴定方法測量酒精。在 未處理的葡萄汁中，發酵幾乎完全，在發酵過程結束時達到12. 7%的最終酒精水平。當葡萄 汁用葡萄糖氧化酶和葡萄糖異構酶預處理時，糖發酵完全，但是酒精的最終水平顯著更低 (11. 8% )。當葡萄汁僅用葡萄糖氧化酶預處理時發現酒精為低水平，這是不完全發酵的結果。在該實驗中，葡萄糖氧化酶處理的葡萄汁在正常葡萄酒制造中不可使用，因為在發酵結 束時剩余的糖，特別是果糖水平高(表II)。因此，額外加入葡萄糖異構酶幫助維持葡萄汁中的葡萄糖/果糖比率在1 1左 右，這明顯降低了如僅使用GOX時所示的不期望的酒精發酵停滯的危險。此外，使用異構酶的實驗去除了所有糖，而在對照(未處理的葡萄汁)中仍存在一 些果糖(8g/l)。這證明異構酶實質防止了發酵停滯。表III，在發酵過程中的酒精水平。在第11天開始蘋果酸乳酸發酵。在葡萄糖氧 化酶(GOX)預處理樣品中的酒精水平用斜體字表示以表明這些數值是酒精發酵嚴重延緩 的結果。Nd:不能確定 結論該實施例2的結果顯示，與對照的12. 7%相比，GOX+異構酶明顯降低酒精百分數 至 11. 8%。此外，額外加入葡萄糖異構酶幫助維持葡萄汁中的葡萄糖/果糖比率在1 1左 右，這明顯降低了與僅使用GOX相比時的不期望的酒精發酵停滯的危險。當葡萄汁僅用葡萄糖氧化酶預處理時發現酒精水平低(9.3% )，這是不完全發 酵，換句話說是不期望的酒精發酵停滯的結果。在該實驗中葡萄糖氧化酶處理的葡萄汁不 能用于正常的葡萄酒制造，因為在發酵結束時剩余糖，特別是果糖水平高(表II)。此外，使用異構酶的實驗去除了所有糖，而在對照(未處理的葡萄汁)中仍存在一 些果糖(8g/l)。這證明異構酶本身防止了發酵停滯。實施例3 酒精發酵過程中的酵母生長_異構酶的加入
明顯降低了酒精發酵停滯。技術人員已知，當果糖濃度比葡萄糖濃度高相當多時，有代表性的出現發酵停滯。 在酒精發酵開始時為1/1的葡萄糖/果糖比率，在酒精發酵過程中會變成負值，導致發酵延 遲。在該實施例3中，通過僅以葡萄糖氧化酶處理未發酵的葡萄汁誘導延緩的(停滯 的)發酵。為了研究葡萄糖異構酶對在酒精發酵過程中酵母生長和存活能力的影響，如本文 實施例2中所述開展模擬葡萄酒生產。如下所述，葡萄汁與酶預孵育三天，然后進行11天 的酒精發酵和10天的蘋果酸乳酸發酵。開展三個獨立的實驗，在每一實驗中使用兩個重復。在每一樣品中，200ml葡萄汁 (Pinot Blanc 2007，德國，經巴氏滅菌的)加入至玻璃燒瓶中并且使用磁力攪拌器連續混 合。在整個實驗過程中均將樣品充氣。IOOmg 葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano, > 15，000u/g)或者 IOOmg 葡萄糖氧化酶 和Ig葡萄糖異構酶(Sigma，G4166-50g, > 350u/g)加入至燒瓶中。在室溫下保溫3天。 在該時間點之后，通過接種再水化的冷凍干燥的葡萄酒酵母(釀酒酵母Merit. Ferm, Chr. Hansen, 0. lg/1)至9E+05CFU/ml的終濃度開始酒精發酵。再水化是于室溫下在胨水(15g/ 1 胰蛋白胨、Oxoid L42. 9g/l NaClU. 14g/l 2%消泡劑 1510、BHD 63215)中開展 10 分 鐘。在開始酒精發酵11天后，通過向發酵過的葡萄汁加入酒酒球菌(Viniflora，Chr. Hansen.批號2711097)開始蘋果酸乳酸發酵。冷凍干燥的酒酒球菌(0. 7g的8. 2E+11CFU/ g)在 IOOml 胨水(15g/l 胰蛋白胨、Oxoid L 42. 9g/l NaClU. 14g/l 2%消泡劑 1510、 BHD 63215)中再水化10分鐘。向4000ml發酵過的葡萄汁中加入3ml，獲得終濃度為 4. 3X 106CFU/ml。在室溫下再放置10天。釀酒酵母菌落形成單位數如下確定，即在不同時間點從發酵的葡萄汁取出樣品并 將系列稀釋液涂布于YGC固體培養基瓊脂平板上，然后在30°C孵育過夜。使用由Boehringer Mannheim/R-biopha rm(目錄號 10 139 106 035)供應的商 業化的基于UV的測定系統并按照制造商提供的實驗方案確定糖水平。結果異構酶對酒精發酵停滯的影響在酒精發酵過程中，葡萄汁中的糖被釀酒酵母轉化成乙醇。僅以葡萄糖氧化酶處理顯示，由于釀酒酵母生長的延緩導致酒精發酵延緩(停滯 發酵)(如表IV中所示)。在以葡萄糖氧化酶預處理的未發酵葡萄汁中，酵母的生長在酒精 發酵的前幾天非常差。CFU數在酒精發酵第一天時低于檢測限，并且在第二天時低于近似 31og單位。這清楚地表明發酵停滯。糖分析支持該結果。在未處理的未發酵葡萄汁中，在酵母發酵3天后，近似60 %的 糖被發酵，而在GOX預處理的未發酵葡萄汁中少于10%的糖被發酵。然而，當在預處理和酒精發酵過程中存在葡萄糖異構酶時，發酵過程的行為幾乎 與未處理的葡萄汁的發酵相同。剩余的糖水平和釀酒酵母CFU數(表IV)可與未處理的葡 萄汁相當。換句話說，葡萄糖異構酶能夠克服由GOX處理所造成的發酵停滯。表IV，在酒精發酵過程中的活釀酒酵母細胞計數。葡萄汁已經如上所述預處理3 結論
如該實施例3中所示，僅使用GOX將引起明顯的不期望的發酵停滯。該實施例3的結果顯示，異構酶的加入可幫助克服GOX的加入對通常用于葡萄酒 生產的釀酒酵母生長的負面影響。參考文獻l.US4675191(Novo Industri，在丹麥公布的，1987)
權利要求
生產具有低酒精含量的葡萄酒的方法，其包括下列步驟(1)以有效量的下列兩種酶處理未發酵的葡萄汁(a)在氧存在下以葡萄糖氧化酶處理一段足以將葡萄汁中的至少部分葡萄糖轉化成葡糖酸的時間；和(b)以葡萄糖異構酶處理一段足以將葡萄汁中的至少部分果糖轉化成葡萄糖的時間；和此后，(2)具有減少量的葡萄糖和果糖的如此處理的葡萄汁被發酵以生產具有低酒精含量的葡萄酒。
2.權利要求1的方法，其中權利要求1步驟(2)所生產的具有低酒精含量的葡萄酒具 有被認為對于紅/白葡萄糖而言是正常的(12-14%左右)的酒精含量，并且其中如果葡萄 酒在沒有權利要求1的步驟(1)的酶處理情況下制造的話將具有過高的酒精百分數(例如 15-17% )。
3.權利要求1或2的方法，其中權利要求1的方法包括去除至少部分葡糖酸以得到具 有令人滿意的感官特性的葡萄酒的額外步驟(3)；并且其中葡糖酸通過加入形成葡糖酸微 溶鹽的物質，優選碳酸鈣進行中和的方法去除。
4.前述權利要求任一項的方法，其中在步驟(1)過程中對于葡萄糖氧化酶/異構酶兩 種酶的所述有效量和所述的一段時間是這樣的，以致于(A)葡萄汁中的糖含量減少至少10%。
5.權利要求4的方法，其中葡萄汁中的糖含量減少至少17%。
6.權利要求4或5的方法，其中-所述的一段時間不超過72小時；并且-對于葡萄糖氧化酶/異構酶兩種酶的有效量為(i)在1，000和50，000,000國際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖氧化酶活性；和(ii)在100和5，000,000國際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖異構酶活性；和-在權利要求1步驟(1)過程中的溫度在1和35°C之間，優選在3和30°C之間。
7.前述權利要求任一項的方法，其中在權利要求1步驟1過程中向葡萄汁持續供應氧， 優選地用空氣泵供應氧。
8.前述權利要求任一項的方法，其中在權利要求1的步驟(1)中葡萄汁還以有效量的 具有過氧化氫酶活性的制劑處理一段足以將葡萄汁中的至少部分H2O2轉化成02+H20的時 間。
9.前述權利要求任一項的方法，其中在權利要求1的步驟(2)的酵母酒精發酵過程中 加入額外的葡萄糖異構酶。
10.前述權利要求任一項的方法，其中葡萄酒是白葡萄酒、紅葡萄酒、無氣葡萄酒或含 汽葡萄酒。
全文摘要
生產具有低酒精含量葡萄酒的方法，包括以葡萄糖氧化酶和葡萄糖異構酶處理未發酵的未發酵的葡萄汁。
文檔編號C12G3/08GK101932691SQ200880125845
公開日2010年12月29日 申請日期2008年12月22日 優先權日2008年1月29日
發明者克里斯廷·彼耶爾, 約翰尼斯·馬滕·范丹布林克 申請人:科.漢森有限公司