抗hiv單克隆抗體的制作方法

專利名稱：抗hiv單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有中和人免疫缺陷病毒(HIV)的活性的單克隆抗體。
背景技術：
獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome ;AIDS)是由名 為人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus ；HIV)的慢病毒的慢性感染引起的病 態。近年來，人們開發了抑制HIV增殖的抗病毒藥，可以阻止AIDS發病。但是，即使使用強 效的抗病毒藥，也難以驅逐HIV，抗病毒治療必須持續一生。另一方面，因長期使用抗病毒藥 而出現的耐藥性病毒或慢性毒性等問題也已明確，目前的抗病毒療法依然處于不充分的狀 態。另外，抗病毒藥昂貴，在發展中國家實質上不可能長期使用。鑒于上述情況，開發阻止 感染的疫苗是世界性課題，而且人們還要求開發無副作用的新的治療藥。關于中和HIV感染的單克隆抗體，有人報道了各種抗體(Burton，DR.等人， Nat. Immunol. 5，第 233-236 頁，2004 ；Zolla-Pazner, S.等人，Nat. Rev. Immunol. 4，第 199-210 頁，2004 ;Eda，Y.等人，J. Virol. 80 :5552-5562, 2006) 這些靶分子大致分為 抗外被膜蛋白gpl20的V1/V2、V3等可變區的抗體；抗⑶4結合位點(⑶4bs)的抗體；抗 ⑶4i (⑶4-gpl20結合后出現的表位)的抗體。另一方面，有人還發表了與跨膜蛋白、gp41 ^ MPR(membrane proximal region，近膜區)反應的抗體的中和活性。其中，顯示交叉反應 的抗體有V3抗體中的447-52D和KD-247 ；CD4bs抗體中的bl2 ；gp41_MPR抗體中的2F5和 4E10 ；作為抗糖鏈抗體的2G12。在V3抗體中雖然確認到交叉反應性，但能夠反應的病毒株 受限，這是問題之所在。另一方面，gp41-MI^R抗體在多個臨床分離株中確認到交叉反應，因 此近年來受到關注，但最近發現它們與宿主細胞的淋巴脂質進行交叉反應，實際上是自身 抗體與HIV的gp41進行交叉反應。此外，bl2的⑶3也長達18個氨基酸，暗示其與自身抗 原的交叉反應性(Haynes，BF 等人，kience 308，第 1906-1908 頁，2005)。非專利文獻1 =Burton, DR.等人，Nat. Immunol. 5，第 233-236 頁，2004非專利文獻2 =Zolla-Pazner, S.等人，Nat. Rev. Immunol. 4，第 199-210 頁，2004非專利文獻3 :Eda, Y.等人，J. Virol. 80 :5552-5562, 2006非專利文獻4 =Haynes, BF 等人，Science 308，第 1906-1908 頁，200
發明內容
發明所要解決的課題本發明應解決的課題在于提供對廣范圍的HIV株具有中和活性的單克隆抗體。解決課題的方法尚未開發出阻止HIV感染的疫苗的原因之一在于尚未明確有效的中和抗體。另 一方面，在雖然感染HIV但長期未見進展的長期非進展病例中，存在對廣范圍的病毒株顯 示出中和活性、控制病毒增殖的病例。本發明人等為了研究在感染HIV但長期未見進展的 長期非進展病例中是哪一種中和抗體在起作用，將末消血的B細胞用EB病毒進行無限增殖，通過克隆制成單克隆抗體產生株。根據對所得單克隆抗體的性質進行研究，不僅可以明 確該單克隆抗體在長期非進展病例中的有效的抗病毒反應，還可以將其用于開發疫苗或新 的治療藥。即，根據本發明，提供以下發明。(1)單克隆抗體，其是選自以下任一種抗體的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20 的V3環的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 1記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :4記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列。(2)單克隆抗體，其是選自以下任一種抗體的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20 的CD4結合位點的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 5記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :6記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 7記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :8記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列；(c)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 9記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO: 10記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列。(3)單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體是具有保藏號FERMBP-11021或保藏號 FERM BP-11060的細胞產生的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的V3環的單克隆抗體。(4)單克隆抗體，該單克隆抗體是具有保藏號FERM BP-11020、保藏號FERM BP-11022或保藏號FERM BP-11023的細胞產生的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的CD4 結合位點的單克隆抗體。(5) (1) 中任一項所述的抗體，該抗體是由下述細胞產生的所述細胞由根 據與gpl20的結合性篩選長期非進展病例的HIV感染患者的B細胞，并選擇產生gpl20結 合抗體的B細胞而來。(6) (1) (5)中任一項所述的抗體的制造方法，該方法包括以下步驟根據與 gpl20的結合性篩選長期非進展病例的HIV感染患者的B細胞，并選擇產生gpl20結合抗體 的B細胞，之后采集所選擇的B細胞產生的抗體。(7)細胞，其是具有保藏號FERM BP-11021或保藏號FERMBP-11060的產生(1)所 述的抗體的細胞。(8)細胞，其是具有保藏號FERM BP-11020、保藏號FERMBP-11022或保藏號FERM BP-11023的產生⑵所述的抗體的細胞。(9) HIV感染癥的預防和/或治療藥，其中含有(1) (5)所述的至少一種以上的 單克隆抗體。(IO)HIV感染癥的預防和/或治療藥，其中含有⑴或(3)所述的單克隆抗體與 (2)或(4)所述的單克隆抗體的組合。發明效果本發明的單克隆抗體可用作AIDS/HIV-1感染癥的預防、治療藥。此外，本發明的單克隆抗體還可用作開發中和抗體誘導型HIV疫苗的研究試劑。


圖1顯示通過gpl20_捕捉ELISA進行的單克隆抗體的反應性的分析。圖2顯示與HIV-IJR-FL慢性感染細胞(PM1/JR-FL)表面的結合活性的FACS分析。圖3顯示中和單克隆抗體對4種包膜假病毒的交叉中和活性。圖4顯示0. 5d(3D6)顯著增強V3抗體與gpl20的反應性。圖5顯示0. 5g (1C10)與0. 5d(3D6)的組合對抑制HIV-1JR-FL的協同效果。圖6顯示本發明的單克隆抗體0.5Y (1C10)的抗原結合位點的核苷酸序列和預測 的氨基酸序列。圖7顯示本發明的單克隆抗體5G2的抗原結合位點的核苷酸序列和預測的氨基酸 序列。圖8顯示本發明的單克隆抗體0. 5 δ (3D6)的抗原結合位點的核苷酸序列和預測 的氨基酸序列。圖9顯示本發明的單克隆抗體42F9的抗原結合位點的核苷酸序列和預測的氨基 酸序列。圖10顯示本發明的單克隆抗體49G2的抗原結合位點的核苷酸序列和預測的氨基 酸序列。圖11顯示本發明的抗體對各種病毒株的中和活性。圖12顯示CCR5抑制劑與本發明的抗體結合使用時的協同抑制效果。
具體實施例方式以下，對本發明的實施方式和實施方法進行說明。1.本發明的單克隆抗體本發明的單克隆抗體的第一例為選自以下任一種抗體的識別AIDS病毒的包膜 糖蛋白gpl20的V3環的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ ID NO=I記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 3記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :4記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列。上述抗體的具體例子有具有保藏號FERM BP-11021或保藏號FERM BP-11060的 細胞產生的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的V3環的單克隆抗體或其片段。本發明的單克隆抗體的第二例為選自以下任一種抗體的識別AIDS病毒的包膜 糖蛋白gpl20的CD4結合位點的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 5記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :6記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 7記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨 基酸序列和具有SEQ ID NO :8記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列；(c)抗體，該抗體具有SEQ ID NO 9記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 10記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列。上述抗體的具體例子有具有保藏號FERM BP-11020、保藏號FERM BP-11022或保 藏號FERM BP-11023的細胞產生的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的⑶4結合位點的 單克隆抗體。本說明書的實施例中記載的產生單克隆抗體3D6(0. 5 δ )、5G2、42F9和49G2的細 胞分別以保藏號FERM BP-11020、保藏號FERMBP-11021、保藏號FERM BP-11022和保藏號 FERM BP-11023于2008年(平成20年)9月17日保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究 所專利生物寄托中心(日本國茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6)，本說明書的實 施例中記載的產生單克隆抗體IClO (0. 5 γ)的細胞以保藏號FERM BP-11060 (認收號FERM ABP-11060)于2008年(平成20年)11月7日保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專 利生物寄托中心(日本國茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6)。在本說明書中，當談及抗體時，以不僅包含全長抗體還包含抗體片段的含義使用。 抗體片段優選為功能性的片段，例如F(ab，)2、Fab，等。F(ab' )2、Fab，是指用蛋白分解酶 (例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)處理免疫球蛋白而制得的、在存在于鉸鏈區中的2條H鏈 間的二硫鍵的前后消化而生成的抗體片段。并且，當談及抗體片段時，還包含含有來自編碼 該抗體的基因的抗原結合位點的蛋白。例如，用木瓜蛋白酶處理IgGl時，在存在于鉸鏈區中的2條H鏈間的二硫鍵的上 游將其切斷，可以制造由VL(L鏈可變區)和CL(L鏈恒定區)形成的L鏈、以及由VH(H鏈 可變區)和CHY1(H鏈恒定區中的Yl區)形成的H鏈片段在C末端區通過二硫鍵結合的 相同的兩個抗體片段。這兩個相同的抗體片段分別稱作Fab’。另外，用胃蛋白酶處理IgG 時，在存在于鉸鏈區中的2條H鏈間的二硫鍵的下游將其切斷，可以制造比上述兩個Fab’ 通過鉸鏈區連接而成的片段稍大的抗體片段。該抗體片段稱作F(ab’)2。本發明的單克隆抗體，可以以固定在固相載體等不溶性載體上的固定化抗體的形 式使用、或者以用標記物標記的標記抗體的形式使用。這樣的固定化抗體或標記抗體均包 括在本發明范圍內。固定化抗體是指處于通過物理吸附或化學結合等擔載在不溶性載體上的狀態的 抗體。這些固定化抗體可用于檢測、定量、分離或純化試樣(例如血漿等體液試樣、培養上 清或離心上清等)中所含的抗原。作為可用于固定抗體的不溶性載體，例如有(1)由包 含聚苯乙烯樹脂、聚碳酸酯樹脂、硅酮樹脂或尼龍樹脂等的塑料或玻璃等所代表的不溶于 水的物質形成的板、試管或管等具有內容積的載體、珠粒、球、濾紙或膜等；以及( 纖維素 系載體、瓊脂糖系載體、聚丙烯酰胺系載體、葡聚糖系載體、聚苯乙烯系載體、聚乙烯醇系載 體、聚氨基酸系載體或多孔性二氧化硅系載體等用于親和層析的不溶性載體。標記抗體是指用標記物標記的抗體，這些標記抗體可用于檢測或定量試樣(例如 血漿等體液試樣、培養上清或離心上清等)中所含的抗原。對本發明中可以使用的標記物 沒有特別限定，只要是通過物理結合或化學結合等與抗體結合，從而可以檢測它們的存在 的標記物即可。標記物的具體例子有酶、熒光物質、化學發光物質、生物素、抗生物素蛋白 或放射性同位素等，更具體有過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、 葡糖-6-磷酸脫氫酶、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、青霉素酶、過氧化氫酶、脫輔基葡糖氧化 酶、脲酶、螢光素酶或乙酰膽堿酯酶等酶；異硫氰酸熒光素、藻膽蛋白、稀土金屬螯合物、丹磺酰氯或四甲基異硫氰酸羅達明等熒光物質；3H、14C、125I或131I等放射性同位素；生物素、 抗生物素蛋白或化學發光物質。標記物與抗體的結合方法可以采用戊二醛法、馬來酰亞胺 法、吡啶二硫化物法或過碘酸法等公知的方法。其中，放射性同位素和熒光物質可以單獨產生能夠檢測的信號，而酶、化學發光物 質、生物素和抗生物素蛋白則無法單獨產生能夠檢測的信號，所以通過進一步與1種以上 的其他物質反應而產生能夠檢測的信號。例如，當為酶時，至少需要底物，根據測定酶活性 的方法(比色法、熒光法、生物發光法或化學發光法等)而使用各種底物。當為生物素時， 通常至少與抗生物素蛋白或酶修飾抗生物素蛋白反應。根據需要，進一步使用依賴于該底 物的各種顯色物質。2.產牛本發明的單克降抗體的細胞本發明還涉及產生上述本發明的單克隆抗體的細胞。本發明的單克隆抗體可以使 用該細胞來制造。以下，說明產生本發明的單克隆抗體的細胞的取得方法。利用通常的比重離心法等，從HIV患者的末梢血液中回收含有B淋巴細胞的淋巴 細胞，之后利用EBV進行轉化，以從該淋巴細胞中得到安定地產生抗體、且持續進行無限增 殖的細胞株。EBV是使人正常B淋巴細胞轉化成增殖型細胞株的病毒(Nature，第269卷，第 410頁(1973))。作為含有EBV的材料，可以使用狨細胞B95-8株(Proc. Natl. Acad. Sci., USA，第87卷，第3333 3337頁(1990))。首先，從對廣泛的HIV株具有中和活性的長期 非進展病例患者中采集末梢血到含有肝素的采血管內，利用比重離心法等采集末梢血單核 細胞(peripheral blood mononuclear cell ；PBMC)部分。利用 Dynabeads、免疫磁體(4 Λ 7 y才、y卜)從所得的PBMC中除去⑶8陽性細胞。將⑶8-缺失的PBMC懸浮于含有 50% EB病毒產生株B95-8 (ATCC)的培養上清的培養基(15%胎牛血清；含FCS的RPMI1640) 中，移至24孔培養皿(Linbro, ICN)中，在37°C、含5% CO2的培養箱內培養12 18小時 左右。在此期間，用EB病毒感染末梢血中的B細胞，可以以該IO4個細胞中得到1株的比 例得到無限增殖細胞。回收增殖的細胞的培養上清，通過gpl20-捕捉試驗進行篩選，對于 通過反復篩選判斷為陽性的克隆，以對正常人的PBMC照射X射線而得到的細胞作為飼養細 胞，利用極限稀釋法進行克隆，可以分離具有抗gpl20活性的抗體產生細胞。根據需要，重 復進行篩選的程序。通過培養上述得到的EBV轉化細胞株，可以產生本發明的目標單克隆抗體。培養 液中的抗體的純化，例如根據需要，可以通過適當組合DEAE陰離子交換層析、親和層析、硫 酸銨分餾法、PEG分餾法、乙醇分餾法等公知的方法來進行。3.本發明抗體的基因編碼本發明抗體的基因可如下獲得使用來源于產生上述本發明的單克隆抗體的 EBV轉化人細胞的mRNA制作cDNA文庫，從中分離含有編碼本發明單克隆抗體的cDNA的質 粒，即可獲得基因。mRNA可以通過培養EBV轉化細胞，之后用異硫氰酸胍溶液溶解細胞后進 行提取來制備。以所得的mRNA為模板制作cDNA，將其整合到載體中，由此制作cDNA文庫。 使用該cDNA文庫，可以獲得編碼本發明單克隆抗體的基因。此外，關于本發明抗體的基因，它們的核苷酸序列和氨基酸序列均通過以下實施 例而明確，所以還可以按照本領域技術人員所公知的基因化學合成法來制造。例如，對于分 別含有編碼SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的適當的核苷酸序列以及與其互補的核苷酸序列的基因，將它們的基因分成若干個寡核苷酸后進行化學合成，再將每個 嵌段依次適當連接，即可制作。將編碼本發明的單克隆抗體的基因插入表達載體中，可以構建重組表達載體。表 達載體通常在翻譯起始密碼子(ATG)的上游具有啟動子區，在翻譯終止密碼子(TAA、TGA或 TAG)的下游具有polyA信號區。可以通過公知方法將重組表達載體導入宿主細胞中，培養該 轉化的宿主細胞，從而可以使本發明的單克隆抗體表達。作為宿主細胞，可以使用大腸桿菌、 酵母或動物細胞等。通過培養被轉化的宿主細胞，可以在培養物中產生本發明的單克隆抗體。4.使用本發明的單克降抗體的藥物本發明的單克隆抗體以及根據需要使用藥學上可接受的適當的載體、賦形劑、稀 釋劑等，可以用作HIV感染癥的預防和/或治療藥。作為HIV感染癥的預防和/或治療藥， 例如可以制成注射劑。HIV感染癥的預防和/或治療藥的給藥量取決于患者的癥狀程度、年 齡和體重、給藥方法等，以作為有效成分的抗體的重量計算，通常為約IOng 約100mg/kg 體重的范圍。5. #用本發明的單克降杭體的HIV病毒的表擬的檢測丨 本發明中，通過使用本發明的單克隆抗體或其片段進行免疫測定，還可以檢測HIV 病毒。該方法優選至少包括下述步驟(a)和(b)。(a)使本發明的單克隆抗體或其片段與試樣反應的步驟；以及(b)使步驟(a)中形成的抗原抗體復合物與用于檢測的標記抗體反應的步驟；本發明的檢測和/或定量方法只要是使用抗體進行的測定、即免疫測定即可，可 以是任一種方法，例如酶免疫測定法(ELISA)、熒光免疫測定法、放射免疫測定法(RIA)、發 光免疫測定法、酶抗體法、熒光抗體法、免疫比濁法、膠乳凝集反應、膠乳比濁法、紅細胞凝 集反應、顆粒凝集反應或蛋白質印跡法等。當利用酶免疫測定法、熒光免疫測定法、放射免疫測定法或發光免疫測定法等使 用標記抗體的免疫測定法來實施本發明的檢測方法時，還可以通過夾層法或競爭法來進 行，采用夾層法時，只要固化抗體和標記抗體中的至少一種是本發明的單克隆抗體即可。使抗體致敏固相載體后再使用時，作為固相載體，可以使用由聚苯乙烯、苯乙 烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯類聚合物、膠乳、明膠、脂質體、微囊、紅細胞、二氧化 硅、氧化鋁、炭黑、金屬化合物、金屬、陶瓷或磁性體等材質制成的顆粒。作為該致敏方法，可以采用物理吸附法、化學結合法或將這些方法結合使用等公 知的方法。測定的操作方法可以利用公知的方法來進行，例如，利用光學方法進行測定時， 使試樣與抗體、或者使試樣與致敏固相載體的抗體反應，利用終點法或速率法測定透過光 或散射光。目視測定時，使試樣與致敏固相載體的抗體在板或微量滴定板等容器中反應，目 視判定凝集狀態。需要說明的是，也可以使用酶標儀(microplate reader)等儀器進行測 定，以代替目視測定。利用以下實施例來進一步具體說明本發明，但本發明并不受實施例的限定。 實施例實施例1 中和單克隆抗體的制作
使EB病毒感染末梢血B細胞，并反復進行克隆，分離具抗gpl20活性的抗體產生 細胞。制作方法基本上采用我們以前對人T細胞白血病病毒1型(Human T-cell leukemia virus type 1 ；HTLV-1)感染病例進行的方法(Matsushita S.等人，Proc. Natl. Acad, ki. (USA)83 :3672-3676,1986)。從對廣泛的病毒株具有中和活性的一例長期非進展病例采集 末梢血到含有肝素的采血管內(20 30ml)，利用FicolI-Hypaque的比重離心法采集末梢 血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell ；PBMC)部分。利用 Dynabeads、免疫磁 體從所得的PBMC中除去CD8陽性細胞。具體如下將PBMC和DynabeadsCD8在4°C下培養 1小時，利用磁性器具除去磁性珠粒，得到除去了⑶8的PBMC(⑶8-缺失的PBMC)。將1 IOXlO6個⑶8-缺失的PBMC，懸浮于2 5ml含有50% EB病毒產生株B95-8 (ATCC)的培 養上清的培養基(15%胎牛血清；含FCS的RPMI1640)中，之后移入M孔培養皿(Linbro， ICN)中，在37°C、含5% CO2的培養箱內培養12 18小時。在此期間，使EB病毒感染末梢 血中的B細胞，考慮可以以該IO4個細胞中產生1株的比例得到無限增殖細胞。收集培養的 細胞，離心，舍棄舊培養基，分注到96孔平底培養板(Falcon)中，使新培養基中CD8-缺失 的PBMC的密度達到IX IO4個/孔以下，進一步在37°C、5% CO2培養箱內培養7 10天， 其間每天將一半培養基換成新的培養基，同時等待B細胞株的增殖。將已增殖的細胞在48 孔或M孔培養皿(Linbro，ICN)中擴增(Expand)，回收進行增殖的細胞的培養上清，通過 后述的“gpl20-捕捉試驗”進行篩選。對于通過反復篩選判斷為陽性的克隆，以對正常人的 PBMC照射了 X射線而得到的細胞作為飼養細胞，利用極限稀釋法進行克隆，分離具抗gpl20 活性的抗體產生細胞。根據需要，重復克隆的程序。實施例2 :gpl20-捕捉 ELISA在具抗gp 120活性的抗體產生細胞的篩選中，使用“ gp 120-捕捉ELISA ”(J. P. Moore等人，J. Virol. 67，第6136-6151頁，1993)。即，在實驗前1天向96孔聚丙烯板 (Falcon)中加入50 μ 1用CC緩沖液(碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，ρΗ9. 6)調整至13. 3 μ g/ ml 的抗 gpl20-C5 綿羊抗體(D73M，Aalto Bioreagents, Dublin, Ireland)，在 4°C下靜置 一夜。除去上清后，加入175 μ 1封閉緩沖液牛血清白蛋白；BSA、0. 疊氮化物、PBS、 ρΗ7· 2)，在室溫下靜置30分鐘。用ELISA清洗緩沖液(0. 15% Tween20, PBS ρΗ7· 2)清洗 孑L 3 次，之后每孑L中力口人 50 μ 1 單體 gpl20(gpl20_SF2 ；Austral Biologicals^San Ramon, California)。在室溫下靜置2小時，之后用ELISA清洗緩沖液清洗3次，制成“gpl20_捕 捉板”。向該板中加入B細胞培養上清，使之在室溫下反應2小時。用ELISA清洗緩沖液清 洗3次，加入100 μ 1用ELISA緩沖液稀釋了 1000倍的抗人IgG-ALP，在室溫下靜置1小時。 用ELISA清洗緩沖液清洗3次，之后將磷酸酶底物(SIGMA)溶于底物緩沖液(二乙醇胺緩 沖液pH9. 85)中，向每孔中分別加入100 μ 1，在室溫下靜置10 30分鐘，之后用酶標儀測 定吸光度G05nm)。如此操作，得到20種產生gpl20結合抗體的B細胞克隆(表1)。[表 1]由長期“非進展HIV-I感染病例”得到的中和單克隆抗體的列表
權利要求
1.單克隆抗體，其為選自以下任一種抗體的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的V3 環的單克隆抗體，(a)抗體，該抗體具有SEQID NO :1記載的氨基酸序列作為H鏈可變區VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列作為L鏈可變區VL的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQID NO 3記載的氨基酸序列作為H鏈可變區VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 4記載的氨基酸序列作為L鏈可變區VL的氨基酸序列。
2.單克隆抗體，其為選自以下任一種抗體的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的CD4 結合位點的單克隆抗體，(a)抗體，該抗體具有SEQID NO 5記載的氨基酸序列作為H鏈可變區VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 6記載的氨基酸序列作為L鏈可變區VL的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQID NO 7記載的氨基酸序列作為H鏈可變區VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 8記載的氨基酸序列作為L鏈可變區VL的氨基酸序列；(c)抗體，該抗體具有SEQID NO :9記載的氨基酸序列作為H鏈可變區VH的氨基酸序 列和具有SEQ ID NO 10記載的氨基酸序列作為L鏈可變區VL的氨基酸序列。
3.單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體是具有保藏號FERMBP-11021或保藏號FERM BP-11060的細胞產生的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的V3環的單克隆抗體。
4.單克隆抗體，該單克隆抗體是具有保藏號FERMBP-11020、保藏號FERM BP-11022或 保藏號FERM BP-11023的細胞產生的識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gpl20的⑶4結合位點 的單克隆抗體。
5.權利要求1 4中任一項所述的抗體，該抗體是由下述細胞產生的所述細胞由根 據與gpl20的結合性篩選長期非進展病例的HIV感染患者的B細胞，并選擇產生gpl20結 合抗體的B細胞而來。
6.權利要求1 5中任一項所述的抗體的制造方法，該方法包括以下步驟根據與 gpl20的結合性篩選長期非進展病例的HIV感染患者的B細胞，并選擇產生gpl20結合抗體 的B細胞，之后采集所選擇的B細胞產生的抗體。
7.細胞，其是具有保藏號FERMBP-11021或保藏號FERMBP-11060的產生權利要求1所 述的抗體的細胞。
8.細胞，其是具有保藏號FERMBP-11020、保藏號FERMBP-11022或保藏號FERM BP-11023的產生權利要求2所述的抗體的細胞。
9.HIV感染癥的預防和/或治療藥，其中含有權利要求1 5所述的至少一種以上的單 克隆抗體。
10.HIV感染癥的預防和/或治療藥，其中含有權利要求1或3所述的單克隆抗體與權 利要求2或4所述的單克隆抗體的組合。
全文摘要
根據本發明，提供選自以下任一種抗體的、識別AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3環的單克隆抗體。(a)抗體，該抗體具有SEQ IDNO1記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO2記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列；(b)抗體，該抗體具有SEQ ID NO3記載的氨基酸序列作為H鏈可變區(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO4記載的氨基酸序列作為L鏈可變區(VL)的氨基酸序列。
文檔編號C12P21/08GK102066418SQ200880125590
公開日2011年5月18日 申請日期2008年11月19日 優先權日2007年11月19日
發明者吉村和久, 松下修三 申請人:國立大學法人熊本大學