用于擴增和復制亞硫酸氫鹽修飾的核酸的酶的制作方法

專利名稱：用于擴增和復制亞硫酸氫鹽修飾的核酸的酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及酶在復制或擴增核酸，特別是經亞硫酸氫鹽處理的核酸中的應用。
背景技術：
由于自動測序技術的發展，已經進行了大量工作來確定DNA的編碼區，實現包括 人基因組在內的許多動物基因組的完全測序。然而，多年來已經認識到基因組DNA的大部 分是非編碼的，且這些物質一度被認為是“無用”DNA。現在認為對DNA非編碼區的分析對 研究基因表達和功能是重要的。認為核酸特別是基因組DNA中的甲基化狀況或模式對動物 的基因表達和調控具有功能性或調節性作用。已經表明，在單鏈DNA中，與以非常慢的速度將5-甲基胞嘧啶脫氨基為胸腺嘧啶 相比，亞硫酸氫鈉優先將胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶(Shapiro, R.，DiFate, V.，and Welcher， M, (1974) J. Am. Chem. Soc. 96 906-912)。這項觀察結果成為 Frommer 等，1992 (Frommer M, McDonald LE,Miliar DS,Collis CM,Watt F,Grigg Gff,Molloy PL and Paul CL. PNAS 89: 1827-1831(1992))開發亞硫酸氫鹽基因組測序方案的基礎。總之，現在使用的這種方法包 括以下一般步驟DNA的堿變性；使用亞硫酸氫鈉進行脫氨基；通過脫鹽進行脫磺化，隨后 進行氫氧化鈉處理、中和及脫鹽。亞硫酸氫鹽修飾方法以及其已建立的變式方法的主要缺點之一是現已表明該方 法導致 84-96% 的初始引入 DNA 發生降解(Grunau et al. Nucleic AcidsResearch 29(13) e65, (2001))。與此方法相關的高損失意味著在實踐上很難成功地分析少量細胞的基因 組甲基化狀況，或成功地分析DNA已經處于部分降解狀態的古老的保存標本。此外，由于 現有方法固有的核酸降解，不可能按照與公立的人類基因組計劃(International Human Genome SequencingConsortium，2001，Nature，409，860-921)或私人的 CELERA 測序計劃(J CraigVenter et al.，2001，Science，291，1304-1351)所成功使用的相同方式，對生物體的 完整基因組進行測序和裝配，以確定其基因組范圍上的甲基化譜，這是因為序列中有大量 “空位(gap) ”。現在使用的亞硫酸氫鹽方法的另一個缺點是通常只可擴增DNA的小片段。經驗表 明，通常可成功處理并擴增小于約500個堿基對(bp)。該現有技術不適用于新的分子生物 學方法，例如長距離聚合酶鏈式反應(PCR)，該長距離聚合酶鏈式反應使得擴增一般長達約 50kb的大段未處理基因組DNA成為可能。目前，甚至不可能分析完整基因的甲基化狀況，因 為在哺乳動物基因組中大量基因的長度超過50kb。普遍使用的耐熱聚合酶不能繞過在亞硫酸氫鹽轉換中產生的無堿基位點，且通 胃&弓曾β·!^白勺(Sikorsky, J. Α. ， Primerano, D. Α. ， Fenger, Τ. W. and Denvir, J. (2004)Biochem. Biophys. Res. Commun. 323,823-230)。此外，這些聚合酶也不能成功和 有效地擴增含大加合物(bulky adduct)如磺酸鹽基團(sulphonate group)的DNA。這 需要在PCR擴增前在堿性介質中和高溫下將亞硫酸氫鹽轉換的核酸的脫磺化，且這導致此 方法期間所觀察到的大部分核酸損傷和損失(Munson，K.，Clark, J.，Lamparska-Kupsik,K. and Smith, S. S. (2007) Nucl. Acids. Res. 35 (9)，2893-2903)。此外，富含 T 的 3 堿基的 基因組的高效產生(因在PCR擴增期間非甲基化的C被轉換為U并隨后轉換為T，引起主 要包括堿基A、T、G的基因組)導致很難使用目前可用的聚合酶，并引起延伸期間頻繁滑 動。在PCR擴增亞硫酸氫鹽轉換的DNA期間，所遇到的另一問題是單鏈模板包含一些聚合 酶如古細菌DNA聚合酶，如Pfu、Pwo和Vent不能加工的尿嘧啶(Lasken，R. S.，Schuster, D. Μ. and Rashtchian,Α. (1996) J. Biol. Chem. 271 (30)，17692-17696)。因此，目前即便是為 了觀察相對小的基因(<4kb)的甲基化狀況，PCR反應也不得不艱難地通過目的基因區域 (D. SMillar, K. K Ow, C. L. Paul, P. J. Russell, P. L. Molloy, S. J. Clarke, 1999，Oncogene, 18(6) 1313-24 ；Millar DS, Paul CL, Molloy PL, Clarke SJ. (2000). J Biol Chem ； 275(32) :24893-9)。在一些情況下，在將RNA逆轉錄成cDNA并隨后進行PCR之前，期望用亞硫酸氫鹽 修飾RNA。然而，RNA在脫磺化所需高溫和pH下對降解更靈敏，且這導致靈敏度的進一步降 低。這需要能夠有效加工亞硫酸氫鹽修飾的、處理的或轉換的核酸的酶。

發明內容
本發明的發明人意外地發現可鑒別或修飾這樣的酶，其能更有效地加工亞硫酸氫 鹽修飾或處理的核酸。一般而言，本發明涉及新型或修飾的酶的應用，在基本相同的反應條件下，與目前 可獲得的酶如真細菌酶Taq聚合酶、Superscript III逆轉錄酶、Klenow外切聚合酶、Bst 聚合酶或Bca聚合酶相比，所述酶能更有效地復制或擴增亞硫酸氫鹽修飾或處理的核酸。第一方面，本發明提供了酶用于復制或擴增亞硫酸氫鹽修飾或處理的核酸的應 用，其中在基本相同條件下，與天然Taq聚合酶相比，所述酶在復制或擴增核酸中更有效。
優選地，所述酶能夠復制或擴增核酸，所述核酸為具有無堿基位點的核酸，具有大 加合物如磺酸鹽基團的核酸，基本上僅具有A、T、G和U堿基或基本上僅具有A、T和G堿基 的核酸。所述酶可為嗜熱或嗜溫聚合酶、逆轉錄酶、內切核酸酶，或其修飾或嵌合形式。優選地，所述酶選自EP 18012113中所述的酶(其中稱為5D4)、HIV-RT和它們的 修飾形式。適用于本發明的酶可使用公開于WO 99/02671、WO 00/40712、W002/22869、WO 03/044187,WO 05/045 和 EP 18012113 (Medical ResearchCounci 1)中的修飾方法獲得，上 述文獻通過引用并入本文。第二方面，本發明提供了用于復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸的方法，包括用亞硫酸氫鹽處理核酸；和使用酶來復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸，所述酶在基本相同條件下，與天然 Taq聚合酶相比，在復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸中更有效。優選地，亞硫酸氫鹽處理使用亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸氫鈉。優選地，亞硫酸氫鹽處理基本上無脫磺化步驟。優選地，此方法進一步包括在亞硫酸氫鹽處理前的核酸變性。優選地，變性步驟通過提供堿性環境或加熱所述核酸來進行。
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優選地，樣品中任何甲基化的核苷酸保持不變，而未甲基化的核苷酸經亞硫酸氫 鹽處理被轉換為尿嘧啶。優選地，此方法進一步包括將所述處理的核酸樣品脫鹽或分離所述處理的核酸樣品。優選地，所述酶能夠復制或擴增核酸，所述核酸為具有無堿基位點的核酸，具有大 加合物的核酸，基本上僅具有A、T、G和U堿基或基本上僅具有A、T和G堿基的核酸，所述 大加合物包括磺酸鹽基團。優選地，所述酶選自由嗜熱聚合酶、嗜溫聚合酶、逆轉錄酶、內切核酸酶以及它們 的修飾和嵌合形式組成的組。優選地，所述酶選自稱為5D4的嵌合酶、HIV-RT和其修飾形式。優選地，所述酶是5D4或其修飾形式。優選地，所述酶是HIV-RT或其修飾形式。優選地，所述方法進一步包括加工或分析所處理的核酸，以確定核苷酸序列、甲基 化狀況，鑒定核酸來源，或檢測微生物。優選地，亞硫酸氫鹽處理的核酸的擴增通過聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄酶 PCR、qPCR、等溫擴增或信號擴增進行。優選地，所述處理的核酸包括亞硫酸氫鹽修飾的DNA、亞硫酸氫鹽修飾的RNA、或 亞硫酸氫鹽處理的DNA和亞硫酸氫鹽修飾的RNA的組合。第三方面，本發明提供了用于復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸的方法，包括核酸樣品的變性；用亞硫酸氫鹽試劑處理所述核酸樣品，和溫育所述樣品以形成處理的核酸樣品， 其中所述樣品中任何甲基化的核苷酸保持不變，而未甲基化的核苷酸被轉換為其它形式；將所述處理的核酸樣品脫鹽或分離所述處理的核酸樣品；和使用能力上更有效的酶以有效地加工亞硫酸氫鹽修飾或處理的核酸以擴增、逆轉 錄、消化，或酶促加工亞硫酸氫鹽修飾的核酸。所述方法可進一步包括加工或分析所述處理的核酸，以確定核苷酸序列或甲基化狀況。亞硫酸氫鹽處理的核酸的擴增可通過任何適合的方法，如聚合酶鏈式反應(PCR)、 逆轉錄酶PCR、qPCR、等溫擴增或信號擴增進行。優選地，所述變性步驟通過提供堿性環境或加熱所述核酸樣品來進行。優選地，所述處理的核酸包括亞硫酸氫鹽修飾的DNA、亞硫酸氫鹽修飾的RNA、或 亞硫酸氫鹽處理的DNA和亞硫酸氫鹽修飾的RNA的組合。所述樣品可獲得自組織、器官、細胞、微生物、生物樣品或環境樣品。優選地，所述 組織或器官選自腦、結腸、泌尿生殖系統、肺、腎臟、造血系統、乳房、胸腺、睪丸、卵巢、子宮 及其混合物。優選地，所述微生物選自細菌、病毒、真菌、原生動物、類病毒或其混合物。優 選地，所述生物樣品選自由血液、尿液、糞便、精液、腦脊髓液、灌洗液或其混合物組成的組。不同于現有方法，所述方法使用下述酶，包括但不限于嗜熱和嗜溫聚合酶、逆轉錄 酶和內切核酸酶，其與目前可獲得的酶相比特異地具有更高的能力以加工亞硫酸氫鹽修飾 的核酸。類似地，與標準的酶如Taq聚合酶、Superscript III逆轉錄酶、Klenow外切聚合酶、Bst聚合酶或Bca聚合酶相比，所述酶具有更強的功能以繞過無堿基位點，DNA上大加合 物如磺酸鹽基團，以及更有效地作用于3堿基基因組，不過也可產生其它修飾。能夠加工帶 有磺酸鹽基團的核酸的新型酶的產生將不需要在亞硫酸氫鹽修飾后對核酸脫磺化，并因此 消除了現有方法中所見的核酸損傷和損失，以及節省時間。此外，使用繞過無堿基位點能力 更強的聚合酶將能夠使PCR反應更有效，并可比使用目前可用的標準酶產生更長的PCR產 物。優選地，所述亞硫酸氫鹽是亞硫酸氫鈉，其是在水存在下將胞嘧啶修飾為尿嘧啶 的試劑。亞硫酸氫鈉(NaHSO3)易于與胞嘧啶的5，6_雙鍵反應以形成磺化的胞嘧啶反應中 間產物，其易于脫氨基，且在水存在下引起尿嘧啶磺化。需要時，磺酸鹽基團可在溫和堿性 條件下去除，導致尿嘧啶的形成。因此，可能全部未保護的胞嘧啶將被轉換為尿嘧啶。然而， 任何甲基化的胞嘧啶因受到甲基化的保護而不能被亞硫酸氫鹽轉化。與未處理的核酸相比，DNA的亞硫酸氫鹽處理導致具有較少胞嘧啶總數的修飾的 核酸，其中任何未甲基化的胞嘧啶(C)將被轉換為尿嘧啶(U)。因此，未甲基化的亞硫酸氫 鹽處理的核酸將基本上包含堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，但仍 與相應未處理的核酸具有基本相同的堿基總數。如果該處理的核酸通過如PCR進行擴增， 則核酸的簡化形式基本上僅由堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)形成。對于含胞嘧啶的雙鏈DNA，亞硫酸氫鹽處理導致兩種核酸(每條互補鏈一種)，各 含堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。兩種核酸產生自雙鏈DNA的兩條單鏈。兩種核 酸可不具有胞嘧啶，但仍與原始未處理的DNA分子具有相同總數的堿基和序列長度。重要 地是，兩種處理的核酸彼此不互補，且形成用作擴增的頂和底鏈模板。鏈的一種或多種可用 作擴增或進一步加工的標靶。在處理的核酸擴增期間，頂(或底)鏈中的尿嘧啶被核酸相 應擴增產物中的胸腺嘧啶替代。隨著擴增繼續，頂鏈(和/或底鏈，如果擴增)將被稀釋， 因此每條新的互補鏈將僅具有堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶。第四方面，本發明提供了酶用于復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸的應用，所述 酶選自由5D4或其修飾形式、HIV-RT逆轉錄酶或其修飾形式組成的組。優選地，亞硫酸氫鹽處理基本上無脫磺化步驟。除非文章內容另有需要，否則在本說明書全文中術語“包含(包括)”應被理解為 含有指定的元素、整體或步驟，或者元素組、整體組或步驟組，但不排除其它元素、整體或步 驟，或者元素組、整體組或步驟組。包含在本說明書中的文獻、法規、材料、裝置或物品等的任何討論都僅出于提供本 發明內容的目的。不能認為由于以上任一項內容或所有內容在本申請的各項權利要求的優 先權日之前已在澳大利亞存在，就認定這些內容構成部分現有技術的基礎或者是本發明相 關領域的普遍常識。為了更清楚地理解本發明，將參考以下附圖和實施例對優選實施方案進行闡述。


圖1顯示了用Taq聚合酶(泳道1、4和7)、Dpo4聚合酶(泳道2、5和8)和雜合 聚合酶(泳道3、6和9)對(圖A)脫磺化的和(圖B)未脫磺化的亞硫酸氫鹽處理的DNA進行PCR擴增，得到所期望的結果。IOpg亞硫酸氫鹽處理的DNA使用產生200bp (泳道1_3)、 500bp (泳道4-6)或2000bp (泳道7-9)擴增子的引物擴增。圖2顯示了所期望的逆轉錄效率結果。32p-標記的cDNA在以下條件下合成20μ 1 反應體系，所示溫度下持續60分鐘，使用Superscript III(圖2A和圖2C)和嵌合逆轉錄酶 (B 和 D)，l. 3kb、2. 5kb、4kb、6. 5kb 和 IOkb 總 RNA 中每個為 0. 25 μ g 的混合物，Superscript III緩沖液中200單位的每種RT和0. 5 μ g隨機六聚物。對RNA進行亞硫酸氫鹽修飾和脫 磺化(圖2A和圖2B)或未脫磺化(C和D)。將cDNA產物在1. 4%堿性凝膠上進行電泳并 曝光于X射線膠卷上。圖3顯示了使用HIV-RT逆轉錄酶擴增亞硫酸氫鹽處理的RNA的結果。泳道1 在 76°C下脫磺化0分鐘；泳道2 在76°C下脫磺化1分鐘；泳道3 在76°C下脫磺化2分鐘；泳 道4 在76°C下脫磺化5分鐘；泳道5 在76°C下脫磺化10分鐘；泳道6 在76°C下脫磺化 15分鐘；泳道7 在76°C下脫磺化15分鐘(對照逆轉錄酶)；泳道8 =RT陰性對照；泳道9 PCR陰性對照。圖4顯示了在Taq和5D4酶之間的PCR擴增效率的比較。
具體實施例方式酶最近開發的技術區室化自我復制(compartmentalisedself-replication) (CSR) 或體外區室化(in vitro compartmentalisation) (IVC)是可被操作來產生具有特異特征 的新酶的一種技術(Tawfik，D. S and Griffiths,A. D. (1998)NatureBiotech. 16,652-656 ； Ghadessy,F. J. ,Ong, J. L. and Holliger,P. (2001) PNAS. 98 (8)，4552-4557 ；d，Abbadie，M.， Hofreiter, Μ. , Vaisman, Α. , Loakes, D. , Gasparutto, D. , Cadet, J. , Woodgate, R. , Paabo, S. and Holliger, P. (2007) NatureBiotech. 25 (8)，939-943)。此外，在生命的全部三界中 發現的新醇如聚合醇的 DinB 家族(Boudsocq, F. ， Iwai, S. ，Hanaoka, F. and Woodgate, R. (2001) Nucl. Acids. Res. 29, (22)，4607-4616)已經被報道具有新性質，其至今僅被用于 擴增古老的DNA，且可用于復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸。適用于本發明的酶的實例可使用公開于WO 99/02671、WO 00/40712、WO 02/22869、WO 03/044187、WO 05/045 和 EP 18012113 (Medical ResearchCounci 1)中的修 飾方法獲得，上述文獻通過弓I用并入本文。EP 18012113中公開了大量修飾的酶，它們是用在本發明中的潛在候選物，或被進 一步修飾以開發或增強對亞硫酸氫鹽處理的核酸的活性。酶包括被稱為2F3、1A10、1A9、 2F12、1C2、2G6、1A8、2F11、2H4、2H9、1B12、2H2、1C8、2H10X、3A10、3B5、3B6、3B8、3B10、3C12、 3D1、4D1和5D4的酶。本發明的發明人已經發現酶5D4特別適用于本發明。各種誘變和/或重組技術可用于產生突變的/雜合的酶。易錯PCR誘變(Zaccolo， Μ. and Gherardi,E. (1999) J. Mol. Biol. 285，775-783)、交錯延伸法(StEP ；Zhao,H. ,Giver, L. , Shao, Ζ. AffthoIter, J. A. and Arnold, F. H. (1998) Nature biotech. 16，258—261)禾口分 子育禾中(d' Abbadie, Μ. , Hofreiter, Μ. , Vaisman, Α. , Loakes, D. , Gasparutto, D. , Cadet, J. ，Woodgate, R. ， Paabo, S. and Holliger, P. (2007)Nature Biotech. 25(8),939-943) ^ 合適技術的實例，但也可使用其它技術。
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易錯PCR誘變是PCR反應期間突變序列的隨機方法，其中將嘧啶(6_ (2_脫 氧-β -D-呋喃核糖基)-3,4- 二氫-8Η-嘧啶并-[4，5-c] [1,2]噁嗪-7-酮；dP)的三磷酸 鹽衍生物和嘌呤(8-氧代-2'-脫氧鳥苷；8-oxodG)核苷類似物用在體外DNA合成反應中 并起誘變劑作用。通常將所用引物生物素化(或進行不同標記)以能從野生型DNA中純化 出突變的PCR產物，使得可根據所需特性來克隆和篩選突變的序列，并使其隨后經歷更多 輪的誘變和篩選。此步驟產生更高頻率的氨基酸殘基取代，至少比那些之前達到的頻率高 一個數量級。交錯延伸法(StEP)合并了 PCR形式中模板序列的體外誘變和重組。模板序列由 共同的側翼引物所引發，并經歷具有極短退火和延伸步驟的PCR循環。短延伸時間導致每 輪期間不完全的引物延伸。在隨后循環中，增長的片段基于序列互補性與不同模版退火并 進一步延伸，這有效地導致不同基因間的重組。此過程繼續進行直到制得全長序列，且輕微 調整延伸時間使交換基因片段的長度得到一定控制。已經表明分子育種比單獨的隨機誘變步驟更適于耐損傷聚合酶的選擇。此步驟使 用StEP合并來自不同生物體的各種聚合酶片段。這產生可隨后對所需特征進行測試的各 種嵌合聚合酶。此方法也適用于產生其它嵌合酶，如逆轉錄酶、內切核酸酶等。用于亞硫酸氫鹽修飾的核酸的目的酶包括但不限于嗜熱和嗜溫DNA聚合酶(如 Taq、Pfu, Tth、Tfl, Pfx, Pfx50 、Tko, Bst、Bca、VentR 、De印 Vent 、Phusion 、ABV, UlTima、DyNAzyme EXT , Therminator、polK、polIV、Dbh, Dpo4 和 Dpo4 類酶、DNA I、DNA I聚合酶Klenow片段、Klenow外切、Phi 29、T4和T7DNA聚合酶)，逆轉錄酶(如AMV RT、 M-MuLV RT, ThermoX R 、Thermoscript R 、Superscript III)，和內切核酸酶(如內切核 酸酶III、IV、V、VIII、T7內切核酸酶I、hOGGl、UDG、Fpg、USER)，和其突變體或嵌合體。具有更強加工亞硫酸氫鹽修飾的DNA或RNA能力的適用于本發明的新酶可使用 上述技術中的一種或多種，或這些技術的組合，或誘變和/或重組的其它適合技術，或通過 從不同細菌物種分離新型聚合酶如聚合酶的DinB家族來制備(Boudsocq，F.，Iwai, S.， Hanaoka，F. and Woodgate, R. (2001)Nucl. Acids. Res. 29，(22)，4607-4616)，其已顯示出具 有獨特的性質，此性質在使用亞硫酸氫鹽處理的核酸樣品時很有用。特別地，但不排它，以 嗜熱和嗜溫聚合酶、逆轉錄酶和內切核酸酶為目標。來自同類或不同類酶的兩種或多種酶 將經歷重組以產生大量突變的/雜合的酶。將篩選雜合的酶，且將選擇顯示出高加工性和 對DNA損傷高耐受性的那些酶并進一步檢驗。試驗的選擇將取決于所檢驗酶的類型。例如， 聚合酶活性的試驗可通過PCR和將“新”酶擴增野生型和亞硫酸氫鹽修飾的模版的能力與 親本聚合酶的此能力進行比較此時，將選擇顯示擴增亞硫酸氫鹽修飾的DNA能力更強的克 隆來用于進一步多輪重組和再選擇，直到產生這樣的一種或多種聚合酶，所述聚合酶與親 本聚合酶相比，顯示出能有效將亞硫酸氫鹽轉換的DNA擴增至更好的水平，同時顯示出令 人滿意的可加工性和熱穩定性水平。亞硫酸氫鹽修飾的核酸可以是或不是脫磺化的。兩種不同酶的嵌合體可有利于擴增亞硫酸氫鹽修飾的DNA的實例是熱穩定聚 合酶Taq和Dpo4類酶的重組，所述熱穩定聚合酶Taq具有高可加工性但對DNA損傷，所 述Dpo4類酶具有低可加工性但能夠復制通過若干類DNA損傷，包括無堿基位點和大加合 物(McDonald, J. P. , Hall, Α. , Gasparutto, D. , Cadet, J. , Ballantyne, J. and Woodgate, R. (2006) 34 (4) ,1102-1111)。聚合酶、逆轉錄酶、內切核酸酶、DNA改性酶和其它酶的任何
9組合可使用這些技術重組在一起，且本發明涵蓋了它們在加工亞硫酸氫鹽轉換的核酸中的 應用。應用本發明提供了利用此類酶的方法，所述酶具有更強的能力來加工亞硫酸氫鹽修飾 的核酸。此類方法的優點在于它們可鑒定酶的新陣列，其能夠例如但不限于改進PCR擴增 效率并增加亞硫酸氫鹽修飾的DNA的擴增子長度，和對亞硫酸氫鹽修飾的DNA進行有效的 逆轉錄和/或一步逆轉錄PCR。本發明的方法提供簡化的步驟，由此亞硫酸氫鹽修飾的核酸 可使用共同的分子生物學技術操作，而無需將樣品脫磺化，這相對于已知方法將極大地改 進產率并保持較高分子量DNA。與亞硫酸氫鹽修飾技術聯合的這些酶將能夠成功分析少量 細胞、保存核酸和大段核酸或整個基因中基因組的甲基化狀況，全部這些到現在為止是不 可能的。本文所用術語“更有效的活性”或“更高活性”是指在基本相同的反應條件下，與 目前所用的標準酶如Taq聚合酶、Superscript III逆轉錄酶、Klenow外切聚合酶、Bst聚 合酶或Bca聚合酶相比，根據本發明的分離的酶可更有效地加工亞硫酸氫鹽修飾的核酸， 且錯誤較少或基本無錯誤。 亞硫酸氫鹽修飾的樣品可包括DNA，或RNA，或DNA和RNA的組合。樣品可從組織、細胞制備，或可為任何生物學樣品，如血液、尿液、糞便、精液、腦脊 髓液、灌洗液，來自如腦、結腸、泌尿生殖系統、肺、腎臟、造血系統、乳房、胸腺、睪丸、卵巢、 子宮等來源的細胞或組織，來自胚胎細胞系或胚外細胞系的組織、環境樣品、植物、微生物， 所述微生物包括細菌、胞內寄生物、病毒、真菌、原生動物、類病毒等。適用于通過本發明處 理的最佳描述的哺乳動物細胞類型總結在B. Alberts et al.，1989，TheMolecular Biology of the Cell, 2nd Edition,Garland Publishing Inc New York andLondon,pp 995-997中。來自人、動物、植物、細菌、真菌和病毒來源的樣品DNA中5-甲基胞嘧啶殘基的分 析意在包括從受精至死后48小時內的所有細胞、組織和器官的所有生命周期階段，以及可 源自組織學來源的樣品如顯微鏡載玻片樣品，整塊包埋的樣品，或者從合成或天然表面或 從液體提取的樣品。分析包括健康(WHO定義的健康)個體的細胞、組織和器官，以及來自患病個體的 細胞、組織和器官之間天然存在的變異。此意義上的疾病包括在Harrison’ s Principles of Internal Medicine，第 12 版，由 Jean D Wilson 等編著，McGraw Hill Inc，以及之后的 版本中描述或提及的全部人類疾病、痛苦、不適和異常；以及在OMIM中描述的全部疾病、痛 苦、不適禾口異常((QnlineMendelian Inheritance in Man, www. ncbi. gov),但強調死亡的 主因，即惡性腫瘤(癌)、缺血性心臟病、腦血管疾病、慢性阻塞性肺病、肺炎和流感、動脈的 疾病(包括動脈粥樣硬化和主動脈瘤)、糖尿病和中樞神經系統疾病，以及社會性衰弱病癥 (socially debilitating conditions)如焦慮、壓力相關的神經精神病癥和肥胖，和由染 色體數異常或染色體重排引起的全部病癥(涉及常染色體以及性染色體的異倍性、復制、 缺陷、易位和插入)，以及線粒體基因組的類似異常。正常或患病個體可來自(i)不同種族劃分和進化譜系的人群；(ii)品系和地理的 隔離種；(iii)亞種；(iv)相同或不同性別的雙胞胎或更多胎；(ν)由普通配對方法、人工 授精、胚胎干細胞法克隆或核(來自體細胞或生殖系核)轉移克隆產生的個體，或由線粒體或其它細胞器官輸入或修飾產生的個體；(Vi)由轉基因敲除、敲入或敲減法產生的個體 (或體內、離體、或基因活性被瞬時或永久改變的任何方法，所述方法如RNAi、核酶、轉座子 活化、藥物或小分子方法學、肽核酸(PNA)、插入核酸(ΙΝΑ)、阿卓糖核酸(ΑΝΑ)、己糖醇核酸 (HNA)、鎖核酸(LNA)、環己烷核酸(Cyclohexanyl Nucleic Acid) (CAN)等，或基于核酸的類 綴合物，包括但不限于特洛伊肽)的個體，或在懷孕、正常或異位的任何時期的個體。分析還包括來自原核或真核生物體和病毒DNA或RNA (或其組合)中的5_甲基胞 嘧啶和胞嘧啶殘基，其與胞外或胞內模式的人類疾病相關，在正常改變體系和患病體系中， 用于診斷學和疾病狀態監測或確定，和治療學上改變以下疾病的變化參數和基礎機制⑴遺傳性疾病；(ii)由環境誘因(生物或非生物起源)引起的非遺傳性或表觀遺傳性疾病(此 意義上的環境也包括在懷孕全部時期，或在生育和不育處理情況下生物體本身內部的環 境)；(iii)對遺傳或非遺傳性疾病的傾向，包括由“朊病毒”類因子、暴露于壓力變化和 失重、或輻射作用所引起的結果；(iv)在全部細胞類型、組織、器官系統和生物網絡的老化過程中5-甲基胞嘧啶改 變，包括年齡相關的抑郁、疼痛、神經精神性和神經退行性病癥，和更年期前和更年期后病 癥(包括兩種性別中生育力降低)；(ν)在癌癥中5-甲基胞嘧啶改變(包括在具有因DNA擴增、缺失、重排、易位和 插入事件引起的異常核型的細胞中的變化)，和它們在不同細胞周期現象中的變化或改變 (包括晝夜節律、光周期、睡眠、記憶和“時差”對細胞周期的影響)；(vi)在最廣義定義的代謝網絡中的5-甲基胞嘧啶改變，其來自這樣的合子，所述 合子經過胚胎發生、胎兒發育、出生、青年、成年和老年(包括由低氧、缺氧、任何類型輻射 (離子化或非離子化，或由于化療治療、來自鄰近自然源如巖石或來自軍事或政府資助活動 的“放射性沉降物”的高海拔暴露輻射)、應激、線粒體、細胞核或器官基因組間不平衡引起 的代謝作用)；(vii) 5-甲基胞嘧啶改變，其是由于在分子、細胞、組織、器官和整個生物體水平上 響應蛋白質、多肽、肽和DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA等，或肽適配體(包括具有翻 譯后添加物、翻譯后裂解產物、翻譯后修飾物(如內含子和外顯子，泛素化和降解產物)的 任何肽適配體；涉及學習、腦生長和細胞死亡的含稀有天然氨基酸的蛋白質、多肽和肽以及 單個稀有氨基酸，如D-絲氨酸；藥物、生物藥劑、化學實體(其中化學實體和生物藥劑的定 義與 G.Ashton，2001，Nature Biotechnology 19，307-3111 的定義相同))、代謝物、新鹽、 前藥、現有化合物的酯、疫苗、抗原、聚酮、非核糖體肽、維生素和任何天然來源的分子(如 植物源的環巴胺)；(viii) 5-甲基胞嘧啶或胞嘧啶改變，其是由于在分子、細胞、組織、器官和整個生 物體水平上響應單鏈或雙鏈的RNA和DNA病毒，所述病毒是外源的，或在如內源轉座子或逆 轉座子(SINES和LINES)中被在內部活化；(ix)5-甲基胞嘧啶改變，其是由于在分子、細胞、組織、器官和整個生物體水平上 響應基因源或非基因源(含或不含內含子)的RNA轉錄本的逆轉錄拷貝；(χ) 5-甲基胞嘧啶改變，其是由于在分子、細胞、組織、器官和整個生物體水平上響應(a) DNA、RNA、ΡΝΑ、ΙΝΑ、ANA、HNA、LNA, CNA 等(或 DNA、RNA、ΡΝΑ、ΙΝΑ、ANA、HNA、LNA, CAN、 全部組合中任何的適配體)；包括在懷孕之前、期間和之后在包括血液和腦脊液的全部流 體以及母性液體中循環的DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CAN和類似分子，(b)綴合生物 分子的組合，所述綴合生物分子是肽和核酸的嵌合體；或天然分子如膽固醇部分、激素和核 酸的嵌合體；和(xi) 5-甲基胞嘧啶改變，其是由于人和動物源的干細胞(體內、離體或與新環境 或天然和合成底物(或其組合)有關)響應上述(i)至(X)中任何變化所引起。修飾的核酸可使用任何適于獲得核酸材料的方法。實例包括但不限于商購的DNA、RNA試劑盒 或試劑、工作站、含蛋白酶試劑的標準細胞裂解緩沖液，和本領域技術人員熟知的有機提取 方法。此方法可在反應容器中進行。反應容器可為任何適合的容器，如試管、平板、毛細 管、孔、離心管、微離心管、載玻片、蓋玻片、珠子、膜或任何適合的表面。此方法通常在一個 反應容器中進行，以降低核酸樣品降解或損失的可能性。通常，通過加入堿如NaOH來向樣品提供堿性環境。如果核酸材料是RNA，使用加熱 代替堿，以產生無二級結構的單鏈材料。提供堿性環境，以將雙鏈核酸分子變性為分子易于 與亞硫酸氫鹽試劑反應的狀態。然而，應理解，可加入或使用任何其它變性方法如熱處理或 其它適合的堿或變性劑，如KOH和任何其它堿。亞硫酸氫鹽處理通常，亞硫酸氫鹽試劑是偏亞硫酸氫鈉。亞硫酸氫鹽試劑使胞嘧啶堿基磺化，從而 獲得磺酸胞嘧啶(cytosine sulphonate)，隨后通過磺酸胞嘧啶的水解脫氨基獲得磺酸尿 嘧啶(uracil sulphonate)。然而，可理解，任何其它適合的亞硫酸氫鹽試劑可使用，例如亞 硫酸鹽或乙酸鹽離子(參見 Shapiro, R.，DiFate, V.，and Welcher，M, (1974) J. Am. Chem. Soc. 96 906-912)。與磺化試劑的溫育可在低于7的pH以及有利于形成尿嘧啶磺酸鹽基團的溫度下 進行。低于7的pH最適用于進行磺化反應，由此將胞嘧啶堿基轉化成磺酸胞嘧啶，隨后轉 化為磺酸尿嘧啶。然而，如果需要，這些方法可在7以上的pH下通過磺化反應進行。磺化反應可在能夠增強亞硫酸氫鹽反應的添加劑存在下進行。適合的添加劑的實 例包括但不限于醌醇、尿素、DTT和甲氧胺。在這些試劑中，醌醇為還原劑。尿素和甲氧胺 是為改進亞硫酸氫鹽反應效率而加入的試劑。此外，DTT可用在反應中以防止RNA被內源 核糖核酸酶降解。可理解，還可提供其他添加劑或試劑以輔助所述亞硫酸氫鹽反應。磺化 反應導致核酸樣品中的甲基化胞嘧啶保持不變，而未甲基化的胞嘧啶被轉換為尿嘧啶。運行很好的反應條件如下。將待處理的DNA或其它核酸制成20 μ 1體積，且通過 用2. 2μ 1新鮮制備的3Μ氫氧化鈉(BDH AnalaR#10252. 4X)溶液在37°C下溫育15分鐘 來變性。氫氧化鈉濃度和溫育時間可根據需要調節，以確保完成模板核酸的變性。加入 220 μ 1新鮮制備的3Μ偏亞硫酸氫鈉溶液(BDHAnalaR#10356. 4D)pH 5. 0 (該pH可通過添 加IOM氫氧化鈉(BDH AnalaR#10252. 4X)來調節到)，以及12 μ 1 IOOmM的醌醇溶液(BDH AnalaR#103122E)。所添加的醌醇的濃度可以是約IOmM至500mM范圍內的任何值，這根據試 驗確定。隨后將溶液渦旋混合，并覆蓋208 μ 1礦物油(Sigma，分子生物等級Μ-5904)。隨后
12將樣品在適合溫度下溫育充分的時間，以獲得用于完全亞硫酸氫鹽轉換的時間，如在80°C 下溫育45分鐘。本領域技術人員可以理解，只要反應條件適合于核酸的磺化，可改變上述 體積、濃度，以及溫育時間和溫度。將轉換的核酸隨后通過使用脫鹽柱，如根據生產商說明書使用Zymo-Spin I柱來 脫鹽，或通過沉淀來脫鹽。為了沉淀，將樣品稀釋，使得抑制隨后反應的鹽不與磺化的核酸 共沉淀。將鹽濃度稀釋至小于約1M。通常稀釋步驟使用水或緩沖液進行，從而將鹽濃度降 低至低于約0. 5M。例如，通常將鹽濃度稀釋至小于約ImM至約1M，特別是小于約0. 5M，小于 約0. 4M,小于約0. 3M,小于約0. 2M,小于約0. 1M,小于約50mM，小于約20mM，小于約10mM， 或者，如果需要，甚至可小于約ImM。本領域技術人員能很容易地測定減少鹽與核酸沉淀的 適合的稀釋度，從而能夠實施隨后的步驟，并使對所述核酸樣品的進一步凈化或處理縮減 至最小限度。稀釋通常在水中進行稀釋，但也可在任何適合的緩沖液，例如Tris/EDTA或其 它生物緩沖液中進行，前提是此緩沖液不明顯沉淀核酸，或導致鹽與核酸一起明顯沉淀以 至于抑制后續反應。通常沉淀使用沉淀劑如醇進行。用于沉淀核酸的示例性醇可選自異丙 醇、乙醇或任何其它適合的醇。使用能處理含大加合物如磺酸鹽基團的DNA的酶將消除對亞硫酸氫鹽轉換的核 酸進行脫磺化的需要。因為在亞硫酸氫鹽轉換方法期間，在脫磺化步驟時觀察到大部分核 酸損傷和損失，所以相對于之前已知的方法，能夠省略或改進此步驟將極大地改進產率并 保持較高分子量DNA。然而，會有仍需要將亞硫酸氫鹽修飾的核酸脫磺化的情況，且這可使 用下述標準方法或改進的方法進行。脫磺化步驟可通過將沉淀的經處理核酸的pH調節至最大到約12. 5來進行。暴 露于堿性環境有助于促進之前暴露于酸性PH所誘導的DNA中脫嘌呤位點處的鏈斷裂。因 此，使堿性PH的處理最少化以避免鏈斷裂。此步驟可使用適合的緩沖劑或堿性試劑在約pH 10. 5-11. 5下有效地進行。適合的緩沖劑或堿性試劑的實例包括具有pH 7. 0-12. 5的緩沖 劑。本領域技術人員可以理解，適合的緩沖劑或堿性試劑可選自大量已知可獲得的緩沖劑 和堿性試劑。脫磺化步驟的溫度范圍從室溫至約96°C，且時間可從2分鐘變化至96小時，這 取決于所使用條件。本領域技術人員可以容易地確定適合于進行脫磺化反應的時間和溫 度。也可使用低于室溫的溫度，只要增加溫育時間以進行充分脫磺化。因此，溫育步驟可 在約 10°C、約 20°C、約 22°C、約 25°C、約 30°C、約 35°C、約 37°C、約 40°C、約 45°C、約 50°C、 約 55°C、約 60°C、約 65°C、約 70°C、約 75°C、約 76°C、約 80°C、約 85°C、約 90°C、約 95°C和約 96°C下進行。進行脫磺化反應的特別有用的溫度在約75至95°C的溫度范圍內。本發明提供了表征甲基化核酸的方法。此方法可對核酸樣品進行有效的磺化(和 需要時的脫磺化步驟)。然而，應理解，如本文的公開，磺化或脫磺化步驟均不需要進行徹 底，只要足以隨后表征核酸的甲基化即可。本領域技術人員能很容易地測定是否這些步驟 應當進行至接近完全，或者不完全反應是否足以進行所需分析。例如，當使用少量細胞或少 量核酸樣品時，通常需要進行更完全的反應。在表征較大量的核酸樣品時，可進行不太完全 的反應，但仍可提供足以進行隨后核酸樣品甲基化狀況分析的反應產物。本發明提供了利用此類酶的方法，所述酶具有更強的能力來充分加工亞硫酸氫鹽 修飾的核酸。如本文公開，這些酶可用在基因組甲基化狀況的分析中以測量細胞、組織或生物體的狀態，或用于測定核酸給定區域的序列。本發明的結果提供了優于當前用于加工甲 基化核酸的酶的若干優點。此類方法的優點在于它們可提供酶的新陣列，其能夠例如但不 限于改進PCR擴增效率并增加亞硫酸氫鹽修飾的DNA的擴增子長度，和對亞硫酸氫鹽修飾 的RNA進行有效的逆轉錄和/或一步逆轉錄PCR。此類酶將具有更強的能力來加工在亞硫 酸氫鹽修飾期間產生的無堿基位點、磺酸鹽基團和3堿基基因組，以及其它核酸損傷位點， 且也能繞過其它大加合物，例如但不限于插入核酸。本發明的方法也可用于檢測或診斷微生物，參見WO 2006/058393' Methods for simplifying microbial nucleic acids by chemical modification ofcytosine‘禾口 WO 2006/066353' Detection of Human Papilloma virus' (HumanGenetic Signatures Pty Ltd, Australia)，它們通過引用并入本文。本發明的方法提供簡化的步驟，由此亞硫酸氫鹽修飾的核酸可使用共同的分子生 物學技術操作，而無需將樣品脫磺化，或使用更溫和方法脫磺化。因為在脫磺化步驟時可觀 察到大部分核酸損傷和損失，所以相對于之前已知的方法，能夠忽略或改進此步驟將極大 地改進產率并保持較高分子量DNA。這些酶將能夠成功分析少量細胞、保存核酸和大段核酸 或整個基因的甲基化狀況，或能夠測定臨床樣品中DNA或RNA中少量傳染性因子的存在與 否，全部這些到現在為止是不可能的。因此，本發明的方法提供了其它優點，即允許使用更少量的起始樣品并對甲基化 進行有效表征。用于確定樣品甲基化狀況的方法可在測試樣品和對照樣品中平行地進行， 使得可相對于參比樣品來比較并測定樣品的甲基化狀況。例如，可比較樣品來測定是否在 一般或特定位點處甲基化增加或降低。如本文所討論，此類測定方法可用于診斷和/或確 定疾病的預后。此方法可進一步包括如在診斷實施中報告樣品的甲基化狀況。應理解，本發明所用的組分可以以有效加工亞硫酸氫鹽修飾的核酸的試劑盒方式 來提供。應用對亞硫酸氫鹽修飾的核酸進行更好加工的工程化酶的實施方式以非限制性 形式描述如下。實施例方法和試劑化學品可如下獲得乙醇來自Aldrich(St. Louis MO ；200 proof E702-3)；異丙 醇來自 Sigma (St. Louis MO ；99% +Sigma 1-9516)；礦物油來自 Sigma (M-5904)；醌醇來自 BDH(AnalaR#103122E) ；3M的乙酸鈉溶液來自Sigma (S-7899)；氯化鈉來自Sigma (ACS試劑 S9888)；和氫氧化鈉來自 BDH(AnalaR#10252. 4X)；偏亞硫酸氫鈉來自 BDH(AnalaR#10356)； 二乙醚來自 Sigma (St. Louis MO ；309958)；己燒來自 Sigma (St. Louis MO ；650420) ；Luria 肉湯來自 Oxoid (Liverpool ； CM0996B)；氯化鎂來自 Sigma (St. Louis MO ；63069)；礦物油 來自 Sigma (M-5904)；氯化鉀來自 Sigma (St. Louis MO ；60142) ； Span 80 來自 Fluka (Buchs CH ；85548)；鹽酸四環素來自 Sigma (St. Louis MO ；T8032) ；Triton X-100 來自 Sigma (St. Louis MO ；93426)；三羥甲基氨基甲燒鹽酸鹽來自 Sigma (St. Louis MO ；T5941) ；Tween 80 來自 Sigma (St. Louis MO ；P8074)。酶/試劑可如下獲得dNTPs來自Promega(Madison WI ;C1145)；糖原來自 Roche (Indianapolis IN ；#10 901 393 001) ；tRNA 來自 Roche(Indianapolis IN ；#10109 495 001)；不含 DNA 酶的 RNA 酶來自 Roche(Castle Hill NSff ；11 119915 001)； SalI 來自 New England Biolabs (Beverly MA ;#R0138L，20 單位 / μ 1) ；XbaI 來自 New England Biolabs (Beverly MA ;#R0145L，20 單位 / μ 1)；和 DNA 標記物來自 Sigma (直接 上樣的 PCR 低梯度 lOO-lOOObp，Sigma D-3687 和 lOO-lOKb，Sigma D-7058) ；EcoRl 來自 Roche (Indianapolis IN ;#87930626，10 單位 / μ 1) ；HindIII 來自 Biolabs (Beverly ΜΑ; #R01045,10 單位 / μ 1) ；PCR 通用混合物來自 Promega(Madison WI ；#M7505)和 DNA 標記 物來自 Sigma(直接上樣的 PCR 低梯度 lOO-lOOObp，Sigma D-3687 禾口 lOO-lOKb，Sigma D-7058)。溶液如下(1)IOmM Tris/0. IM EDTA, ρΗ 7. 0-12. 5 ； (2) 3Μ NaOH(50ml 水中 6g ； BDHAnalaR#10252. 4X) ；(3)3M 偏亞硫酸氫鹽(7. 6g，在含 416 μ IlON NaOH 的 20ml水中(BDH AnalaR#10356. 4D)) ； (4) IOOmM 醌醇(50ml 水中 0. 55g ；BDH AnalaR#103122E) ； (5) 50X TAE 凝膠電泳緩沖液(242g Trizma堿、57. Iml冰乙酸、37. 2g EDTA和水至1L) ； (6)5X瓊脂糖凝 膠上樣緩沖液(Imll %溴酚藍(Sigma B6131)、Iml 二甲苯藍(Sigma Χ-4126)、3· 2ml甘油 (Sigma G6279) ,8 μ 1 0. 5M EDTA ρΗ 8. 0,200 μ 1 50Χ TAE 緩沖液和水至 10ml)；禾口 (7) Ix Taq 緩沖液(50mM KClUOmM Tris-HCl, ρΗ 9. 0,0. 1% Triton X-100U. 5mM MgCl2)。用亞硫酸氫鹽處理核酸用亞硫酸氫鹽處理核酸的示例性方法描述如下，且可用于產生本發明酶擴增或復 制用的模板核酸。此方法成功地導致保留基本全部的被處理的DNA。應理解可改變樣品或 試劑的體積或量。向20μ1體積的2yg核酸中加入2. 2μ1 3Μ Na0H(50ml水中6g，新鮮制備)。此 步驟將雙鏈核酸分子變性為單鏈形式，這是因為亞硫酸氫鹽試劑優選與單鏈分子反應。將 混合物在37°C下溫育15分鐘。在室溫以上的溫度下溫育可用于改進變性效率。在溫育后，連續加入20μ 1 3Μ偏亞硫酸氫鈉(3. 35g，在含320 μ IlONNaOH的 4. 68ml 水中；BDH AnalaR#10356. 4D ；新鮮制備)和 12 μ 1 IOOmM 醌醇(50ml 水中 0. 55g, BDHAnalaR#103122E;新鮮制備)。醌醇是還原劑，且有助于降低試劑的氧化。也可使用其 它還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇、醌(氫醌)，或其它適合的還原劑。同樣地，也可 加入增強反應的添加劑，如甲氧胺或尿素。將樣品用200 μ 1防止試劑揮發或氧化的礦物油 覆蓋，但這不是必需的。隨后將樣品在80°C下溫育45分鐘。也可使用25°C至90°C的其它 溫度，以及從5分鐘至8小時，或更長的溫育時長。在用偏亞硫酸氫鈉處理后，將油去除，且如果核酸濃度低，加入2μ 1糖原(20mg/ ml ；Roche#10 901 393 001)或 tRNA (Roche#10 109 495 001)。這些添加劑是任選的，且當 核酸以低濃度存在時，可用于改進通過與目標核酸共沉淀獲得的核酸的產率。通常，將糖原 用在DNA的沉淀中，將tRNA用作RNA的助沉淀劑，不過也可使用其它助沉淀劑。將亞硫酸氫鹽修飾的核酸隨后通過使用脫鹽旋轉柱，如根據生產商說明書使用 Zymo-spin柱(Zymo#C1003)來脫鹽。或者，樣品可通過異丙醇沉淀，如下將800 μ 1水加 入樣品中，混合，并隨后加入Iml異丙醇。水或緩沖液將反應容器中亞硫酸氫鹽的濃度降低 至鹽不與感興趣的目標核酸一起沉淀的水平。將樣品再混合并在4°C下放置60分鐘，不過 在有效引起核酸沉淀的前提下，可使用其它溫育溫度和時長。將樣品以15，OOOxg在4°C下 離心10至15分鐘，并將沉淀物(pellet)用70% EtOH清洗。此清洗處理可清除與核酸一起沉淀的任何殘余鹽。將沉淀物干燥并隨后重懸在合適體積的緩沖液或水中，這取決于下步應用。如果 需要脫磺化，發現在TE緩沖液(IOmM Tris,0. ImM EDTA，pH 10. 5)中重懸并在95°C下溫 育20分鐘特別有助于DNA樣品的脫磺化。也可使用pH 7. 0-12. 5的緩沖液，且可將樣品在 37°C至95°C下溫育1分鐘至96小時，以根據需要促進核酸脫磺化至使用者可接受的水平。上述方法可通過用一種或多種限制性酶消化來進行。兩種獨立的限制性酶消化建 立在與下述相同的DNA樣品上。消化選用的酶取決于待擴增的序列。例如，消化2yg基因 組DNA要使用20 μ 1體積的EcoRI在37°C下持續1小時。此步驟用于將基因組DNA消化為 比基因組DNA更易受到亞硫酸氫鹽轉換作用的較小片段。超聲波降解或物理力也可用于將 DNA剪切為較小片段。根據DNA片段的所需大小選擇超聲波的強度和超聲波的長度。如上 所述，單獨的消化反應通過如用HindIII消化2 μ g基因組DNA來進行。可選擇這些或其它 適合的限制性酶來用于預處理消化。如上所述，將消化的DNA用偏亞硫酸氫鹽處理。酶的產生和利用如何產生在擴增亞硫酸氫鹽轉換的DNA中使用的熱穩定性DNA聚合酶的實例被給 出以說明此技術，且其根據 d，Abbadie et al (d，Abbadi e，Μ. ,Hof re iter, Μ.，Vaisman，Α.， Loakes, D. , Gasparutto, D. , Cadet, J. , Woodgate, R. , Paabo, S. and HolIiger, P. (2007) Nature Biotech. 25 (8), 939-943)進行，其適用于專一產生下述加工亞硫酸氫鹽修飾的核 酸能力較高的酶。使用具有旁側XbaI和SalI限制性位點的基因特異性引物，分別將DNA聚合酶 基因Taq和Dpo4從嗜熱水生菌(Thermus aquaticus，登錄號J04639)和硫磺礦硫化葉 菌(Sulfolobus solfataricus，登錄號N002754)擴增。將純化的PCR產物克隆到預消 化的PASK75中，并將構建體轉化入大腸桿菌(E. coli)并表達，參見Ghadessy et al., (Ghadessy，F. J et al.，PNAS(1998)，98，(8)，4552-4557)和 Skerra(Skerra, A. (1994) Gene, 151，131-135的方法，其通過引用并入本文。為了純化，將Taq和Dpo4克隆通過經由 引物引入的N末端6個組氨酸亞克隆，如上表達，并裂解和根據制造商說明書使用Ni-NTA 旋轉柱(Qiagen, #31014)純化。使用分子育種以產生兩種酶的嵌合體。簡而言之，使用類似于旁側區的引物將相 同濃度的兩種聚合酶基因循環40次(94°C，30秒；55°C，1秒)。短退火/延伸時間導致每 輪期間不完全的引物延伸。在隨后循環中，增長的片段基于序列互補性與不同模版退火并 進一步延伸，這有效地導致不同基因間的重組。進行此方法直至制的全長序列，且可需要 更多或更少的循環。微調延伸次數對可被交換的基因片段的長度產生一些控制，且可改變 成與此處給出的次數不同。隨后將產物根據制造商說明書使用QIAquick凝膠提取試劑盒 (Qiagen，#28706)進行凝膠純化，再擴增并克隆入pASK75以產生雜合的聚合酶文庫。隨后將乳化和區室化自我復制反應(CSRs)按照d，Abbadie et al (2007)使用匹 配的引物、含無堿基位點的引物、脫磺化的亞硫酸氫鹽轉換的引物，或未脫磺化的亞硫酸氫 鹽轉換的引物，或它們的組合進行。CSRs通過在94°C循環5分鐘，隨后在94°C進行20個循 環，每個持續循環1分鐘，在50°C持續1分鐘和在72°C持續8分鐘來進行。5分鐘的初始變 性使含雜合聚合酶的細菌細胞破裂，所述雜合聚合酶隨后被釋放到水環境中。如果酶有活 性，這實現了聚合酶的自我復制。無活性的酶將不能自我復制，將不被選用于隨后的輪次，
16并因此被從基因池中去除。為了回收反應混合物，將乳液進行溶劑提取，且將純化的選擇產物再擴增并再克 隆，并隨后對它們通過PCR從如上(或脫磺化或未脫磺化)產生的亞硫酸氫鹽修飾的DNA中 擴增各種大小產物的能力進行篩選，所述PCR使用含IOpg模板DNA、0. 2mM dNTPsU μ M引 物的Ix Taq緩沖液，在94°C下循環5分鐘，隨后在94°C下進行30個循環，每個循環持續1 分鐘；在55°C下持續1分鐘；在68至72°C下持續30秒至2分鐘，這取決于所期望的產物大 小。假設將來自選擇輪次1和2的克隆進行StEP洗牌(shuffled)，并與上述親本聚合酶基 因回交。重組、再克隆、再篩選和再選擇繼續，直到產生比親本酶具有更強擴增亞硫酸氫鹽 修飾的DNA能力的一種或多種酶。特別地，與親本聚合酶相比，優勢體現在有能力更有效、 更大量地產生擴增子，產生更大的擴增子，和/或從未脫磺化的亞硫酸氫鹽處理的DNA產生 擴增子。可獲得的各種誘變和/或重組技術可用于產生在擴增或復制亞硫酸氫鹽修飾的 核酸能力上被特異增強的多種突變的/嵌合的酶，包括但不限于嗜熱和嗜溫聚合酶、逆轉 錄酶和內切核酸酶。此外，新發現的酶如聚合酶的DinB家族(如來自硫磺礦硫化葉菌的 Dpo4)可展現出更強地擴增亞硫酸氫鹽修飾的DNA的能力，而無需進一步誘變或重組。圖1例示與親本聚合酶相比，通過新型聚合酶(根據它們在加工亞硫酸氫鹽轉換 的核酸上的能力選擇)得到所期望的結果。與親本聚合酶相比，雜合的/突變的酶將顯示 在擴增脫磺化的亞硫酸氫鹽修飾的DNA上更強的能力，且更夠擴增加大的擴增子，且還能 夠從親本聚合酶不能擴增的未脫磺化的模板中擴增。圖2例示與親本逆轉錄酶相比，通過新型逆轉錄酶(根據它們在加工轉換的核酸 上的能力選擇)得到的結果。與可獲得的轉錄酶相比，新型轉錄酶將能夠更有效地復制各 種大小的脫磺化的亞硫酸氫鹽轉換的RNA模板，且還能夠從親本逆轉錄酶不能復制的未脫 磺化的模板中復制。實驗HIV-RT 酶HCV RNA使用QiAmp UltraSens (Qiagen)病毒試劑盒根據制造商說明書從 OptiQual HCV RNA 高陽性對照(Acrometrix cat# 96-0203)中分離，并以 5，OOOIU/μ 1
的終濃度重懸。通過亞硫酸氫鹽轉換RNA。將3. 3g 亞硫酸氫鹽(Sigma 59000500g ；批次號 116K0761)溶解在 5mlXceed 試劑 1中。將試劑在80°C下加熱直到完全溶解，冷卻。將0. Ilg 氫醌(Merck 8. 22333. 0250 ；批次號 K36100033 702)溶解在 IOml 不含
核酸酶的水中。將5 μ 1 RNA與220 μ 1亞硫酸氫鹽試劑和12 μ 1醌醇在PCR管中混合，并在PCR 儀中在70°C下溫育20分鐘。將800. μ 1 不含核酸酶的水與 2 μ 1 glycoblue (Ambion AM9515 ；批次號 0705003) 一起加入，將樣品充分混合，隨后加入Iml異丙醇，并將樣品在4°C下溫育1小時。將RNA通過在4°C下以16000xg離心20分鐘來沉淀。棄去上清，并使用70%乙醇在溫和渦旋混合下清洗沉淀。將樣品以16000xg在4°C
17下離心7分鐘。棄去上清，并將沉淀風干數分鐘。將沉淀重懸在70 μ 1脫磺化緩沖液(Xceed試劑5)，并在PCR儀中在76°C下脫磺 化0至15分鐘。將RNA冷卻，隨后加入2μ 1預混母液，對于每份反應，此預混母液包含以下成分10 μ 1 轉換的 RNA1 μ 1 IOmM dNTPS1 μ 1 隨機 H 引物(300ng/y 1)將樣品在65°C下加熱5分鐘，然后在冰上放置至少1分鐘。加入7 μ 1預混母液， 對于每份反應，此預混母液包含以下成分HIV-RT對照 RT2μ 1 IOxHIV-RT 緩沖液 4μ1 5x FS 緩沖液1 μ 1 HIV-RT (IU/ μ 1) 1 μ 1 0. IM DTT1 μ 1 RNA Sl OUTΙμ Superscript III4μ 1 7jCIylRNA酶OUT將樣品混合，并進行如下的逆轉錄25°C持續2分鐘，27°C持續2分鐘，29°C持續2 分鐘，31°C持續2分鐘，33°C持續2分鐘，35°C持續2分鐘，37°C持續30分鐘，45°C持續10 分鐘，50°C持續10分鐘，70°C持續5分鐘，隨后在15°C浸泡。取出5 μ 1 cDNA用于PCR分析，每份反應包含以下組分36. 5 μ 1 Promega 預混母液1. 0μ 1 Fl 引物(lOOng/μ 1)1 μ 1 RO 引物(lOOng/μ 1)6. 5 μ 1 7jC提示引物是在橙色盒中以“Herbert”標記的RNA引物循環條件如下95 °C，3 分鐘95°C, 10 #52°C，1 分鐘 40x68°C，1 分鐘68°C，7 分鐘從圖3中可見，HIV-RT能夠復制亞硫酸氫鹽處理的RNA而無需額外的脫磺化步驟。5D4 酶亞硫酸氫鹽轉換反應將1 μ g模板材料制成終體積20 μ 1。通過加入2 μ 1 3Μ NaOH將模板在37°C下變性 15分鐘。隨后根據MethylEasy Xceed亞硫酸氫鹽轉換試劑盒(HumanGenetic Signatures, Sydney, Australia)將DNA用亞硫酸氫鹽處理。為了脫磺化，將轉換的DNA在80°C下加熱 20分鐘，隨后在-20°C儲存備用。將未脫磺化的亞硫酸氫鹽處理的DNA重懸在水中(代替 來自MethylEasy試劑盒的試劑#5)并立即使用。引物延伸反應
制備50 μ 1體積的反應，其包含2 μ 1 100 μ M模板寡核苷酸、2 μ 1 2. 5yMCy3標記 的寡核苷酸、5 μ 1聚合酶緩沖液、4 μ 1 dNTPs (每種625 μ M得到終濃度50 μ Μ)和蒸餾水至 49 μ 1。BStemp35' -TAGCACCCTAGCCAGCTAGCTGGGTATAGTGAGTGGTATTA (SEQ ID NO 1)BStempC85' -CCCCCCCCTGGGTATAGTGAGTGGTATTA(SEQ ID NO 2)引物 5，-7C6C5CTATACCCA(SEQ ID NO 3)7 = Cy36 = LNAT5- = LNAA(CTCACTATACCC(SEQ ID NO 4))將樣品加熱至85°C，持續2分鐘，并隨后緩慢冷卻至40°C，持續1分鐘。隨后將樣 品加熱至55°C，持續1分鐘，并隨后加入1 μ 1每種酶的1/10稀釋液，并將樣品溫育適合的 時間。通過加入50μ1 8Μ尿素，50mM EDTA來終止反應。將樣品隨后加熱至95°C，持續2分鐘，隨后在冰上驟冷。將10 μ 1樣品在20%變 性丙烯酰胺凝膠上以30W電泳3小時。隨后在Typoon成像器上記錄熒光。PCR 擴增制備終反應體積25μ1的擴增反應，其包含2. 5μ1 XlO SuperTaq緩沖液、 1 μ IlOmM dNTPU μ 1 lOOng/μ 1 的每條弓I物、0· 5μ 1 SuperTaq(Cambio Ltd, Cambridge, United Kingdom)和18 μ 1蒸餾水。加入1 μ 1模板。
引物
Fl 5， -GAGGTTTGGAAGTTTTATTTTATT Rl 5， -TAACTTATCATCAAAATAAAC R3 5’ -TATACTACCTCAAAAATATAAATA R5 5’ -AAAAATCCTTACAAAACTTATAAC
(SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8)
模板質粒Tgo由Vitor Pinheiro (MRC實驗室)提供。
擴增在MJ Research PTC-200 (PTC200) DNA Engine Thermal Cycler PCR上，使用 如下PCR程序進行94°C1 分鐘 30 秒94°C20 秒45 °C 30 秒，重復 24 次68°C 1 分鐘將PCR產物溶解在含溴化乙錠的1. 5%瓊脂糖凝膠中。表1顯示使用6種聚合酶和部分脫磺化的BStemp3模板的引物延伸反應的結果。 從表1中可見，部分復制全長磺化的亞硫酸氫鹽處理的模板的酶僅是Taq聚合酶、5D4和 3A10酶。酶14、5D4、3A10、E10和Tgo全部通過區室化自我復制(CSR)產生，并定義在EP 18012113 (Medical Research Council)中。因此選擇 OT4 進一步表征。表1使用脫磺化和磺化的亞硫酸氫鹽處理的模板對多種突變的聚合酶進行引物 延伸分析。
Tgo-L=粗溶解產物Tgo-P=純化的酶表2顯示使用對照(C)、脫磺化的(D)和磺化的(S)亞硫酸氫鹽處理的BStemp3模 板的隨時間推移的引物延伸實驗。結果顯示，即使在如1分鐘這樣短的時間后，修飾的5D4 酶仍能夠從磺化的模板產生全長產物。在15分鐘后，5D4已經完成磺化模板的復制，而野 生型Taq聚合酶仍顯示多個停止，表示此酶未有效地加工磺化的模板。有趣地，5D4似乎比 Taq聚合酶更有效地復制脫磺化材料。表2使用脫磺化的和磺化的亞硫酸氫鹽處理的模板以及Taq聚合酶和5D4的隨時
間推移的引物延伸。
+++-無全長產物產生+低水平的全長產物++大量的全長產物+++全部產物是全長產物表3顯示在C8模板上進行的5分鐘引物延伸反應的結果。此外，能夠看出，在復 制含脫磺化和磺化目標的一系列C的能力方面，5D4酶優于Taq聚合酶。確實5D4完全復制 模板，而野生型Taq聚合酶又產生多個停止。表3使用聚C8硫酸氫鹽處理的脫磺化和磺化的模板，比較5D4和Taq聚合酶。 -表示在凝膠上未觀察到帶。+/"表示觀察到極弱的停止。+ 多個阻斷產物(blockage product)。++多個大阻斷物。+++強停止產物。表4顯示與被磺化的C模板阻斷的Taq聚合酶相比，5D4的保真度和更強的繞過磺 化DNA損傷的能力。NB在亞硫酸氫鹽處理后，C殘基轉換成U，其隨后被聚合酶作為T復制，因此如果 酶顯示出100%保真度，聚合酶應僅將A加入至正在延長的鏈中。表4使用聚C8亞硫酸氫鹽處理的脫磺化和磺化的模板，比較5D4和Taq聚合酶的 可加工性。 在PCR反應中比較Taq聚合酶和5D4，結果顯示在圖4中。條件如下模板亞硫酸氫鹽處理的Tgo質粒引物組1擴增250bp片段組2擴增600bp片段組3擴增1050bp片段94 "C -20 秒45 "C -30 秒；25 個循環68 "C -1 分鐘圖4顯示使用亞硫酸氫鹽處理的DNA在標準PCR反應中通過5D4完成改進的擴增。 此酶也能復制250bp磺化的模板，如箭頭中所見。本領域技術人員可以理解，在不偏離廣泛闡述的本發明的精神或范圍的前提下，
21可以對具體實施方案中所示的本發明進行多種改變和/或改進。因此，在所有方面考慮，本 發明的實施方案都是說明性的而非限制性的。
權利要求
酶用于復制或擴增亞硫酸氫鹽修飾或處理的核酸的應用，其中在基本相同條件下，與天然Taq聚合酶相比，所述酶在復制或擴增所述核酸中更有效。
2.如權利要求1所述的應用，其中所述酶能夠復制或擴增核酸，所述核酸為具有無堿 基位點的核酸，具有大加合物的核酸，基本上僅具有A、T、G和U堿基或基本上僅具有A、T和 G堿基的核酸，所述大加合物包括磺酸鹽基團。
3.如權利要求1或2所述的應用，其中所述酶選自由嗜熱聚合酶、嗜溫聚合酶、逆轉錄 酶、內切核酸酶以及它們的修飾和嵌合形式組成的組。
4.如權利要求1至3中任一項所述的應用，其中所述酶選自本文稱為5D4的嵌合酶、 HIV-RT和它們的修飾形式。
5.如權利要求4所述的應用，其中所述酶是5D4或其修飾形式。
6.如權利要求4所述的應用，其中所述酶是HIV-RT或其修飾形式。
7.用于復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸的方法，所述方法包括用亞硫酸氫鹽處理核酸；和使用酶復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸，所述酶在基本相同條件下，與天然Taq聚 合酶相比，在復制或擴增亞硫酸氫鹽處理的核酸中更有效。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述亞硫酸氫鹽處理使用亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸氫鈉。
9.如權利要求7或8所述的方法，其中所述亞硫酸氫鹽處理基本上無脫磺化步驟。
10.如權利要求7至9中任一項所述的方法，進一步包括在亞硫酸氫鹽處理前將所述核 酸變性。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述變性步驟通過提供堿性環境或加熱所述核酸 來進行。
12.如權利要求7至11中任一項所述的方法，其中所述樣品中甲基化的核苷酸都保持 不變，而未甲基化的核苷酸經所述亞硫酸氫鹽處理被轉換為尿嘧啶。
13.如權利要求7至12中任一項所述的方法，進一步包括將所述處理的核酸樣品脫鹽 或分離所述處理的核酸樣品。
14.如權利要求7至13中任一項所述的方法，其中所述酶能夠復制或擴增核酸，所述核 酸為具有無堿基位點的核酸、具有大加合物的核酸、基本上僅具有A、T、G和U堿基或基本上 僅具有A、T和G堿基的核酸，所述大加合物包括磺酸鹽基團。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述酶選自由嗜熱聚合酶、嗜溫聚合酶、逆轉錄 酶、內切核酸酶以及它們的修飾和嵌合形式組成的組。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述酶選自本文稱為5D4的嵌合酶、HIV-RT和它 們的修飾形式。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述酶是5D4或其修飾形式。
18.如權利要求16所述的方法，其中所述酶是HIV-RT或其修飾形式。
19.如權利要求7至18中任一項所述的方法，進一步包括加工或分析所述處理的核酸， 以確定核苷酸序列、甲基化狀況，鑒定核酸來源，或檢測微生物。
20.如權利要求7至19中任一項所述的方法，其中所述亞硫酸氫鹽處理的核酸的擴增 是通過聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄酶PCR、qPCR、等溫擴增或信號擴增進行的。
21.如權利要求7至20中任一項所述的方法，其中所述處理的核酸包括亞硫酸氫鹽修 飾的DNA、亞硫酸氫鹽修飾的RNA或亞硫酸氫鹽修飾的DNA和亞硫酸氫鹽修飾的RNA的組口 O
全文摘要
本發明涉及酶在復制或擴增亞硫酸氫鹽修飾或處理的核酸中的應用，其中在基本相同條件下，與天然Taq聚合酶相比，所述酶在復制或擴增所述核酸中更有效。
文檔編號C12Q1/68GK101918595SQ200880124807
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月27日 優先權日2007年11月27日
發明者道格拉斯·斯潘塞·米勒 申請人:人類遺傳標記控股有限公司