完全人抗-vegf抗體和使用方法
                            
            
                            
            文檔序號：571288閱讀：3640來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：完全人抗-vegf抗體和使用方法
            
完全人抗-VEGF抗體和使用方法相關申請本專利申請要求于2007年10月22日提交的美國臨時申請No. 60/981，808和于 2008年4月18日提交的美國臨時申請No. 61/046，370的優選權。將這些申請所公開的全 部內容，包括附圖并入本文作為參考。
            
背景技術：
            血管內皮生長因子(VEGF)是參與內皮細胞活化、增殖和存活，特別是在視網膜增 殖性疾病和腫瘤發生期間的血管原蛋白的主要家族。VEGF屬于VEGF-PDGF(血小板源性 生長因子)超基因家庭，并且是結合在血管和淋巴內皮細胞中表達的受體的小型糖蛋白 二聚體。目前，VEGF家族中有七種已知的配體VEGF-A(VEGF)、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (病毒源性)和胎盤生長因子(PIGF)-I和-2。這些VEGF配體通過與三種已知VEGF 受體(VEGF-R)中的一種或多種結合而介導它們的作用，其中每種受體均具有受體酪氨酸 激酶活性。VEGF-Rl(Flt-I)主要在內皮細胞和單核細胞中表達，與VEGF和VEGF-B結合， 并且看似介導內皮細胞和單核細胞的遷移。VEGF-R2(即人KDR或鼠Flk-I)主要在內皮細 胞中表達，對VEGF(以及VEGF-C和VEGF-D的特定片段)有選擇性，并介導VEGF-誘導的內 皮細胞增殖、存活和遷移，以及血管通透性。VEGF-R3(Flt-4)主要在淋巴內皮細胞中表達， 并且與VEGF-C和VEGF-D結合以促進淋巴管生成。VEGF-Rl、-R2和-R3各自在一些腫瘤細 胞中表達。VEGF與VEGF受體的結合觸發了受體二聚化，導致隨后的受體激活和信號轉導。 VEGF與VEGF-R2的結合啟動了在促進血管生成中占主導地位的信號轉導途徑。該途徑涉 及受體激活以及隨后胞內信號轉導的誘導。這種情況下，受體激活需要三個基本事件(i) VEGF結合至VEGF-R2，(ii)受體二聚化和(iii)受體酪氨酸激酶的受體自磷酸化(以及由 此的激活)。胞內信使，如磷脂酶C和磷脂酰肌醇-3-激酶直接結合至VEGF-R2的自磷酸化 形式并通過受體酪氨酸激酶而磷酸化，其隨后觸發信號轉導事件的胞內級聯，從而導致產 生了最終促進細胞增殖、遷移和存活(抗細胞凋亡)和提高血管通透性的核信號。異常血管生成與包括癌癥的各種疾病狀態有關(Holash 2002)。已證實VEGF 信號轉導在正常血管發育和與各種疾病有關的病理性血管生成中均起作用(Erikkson 1999 ；Ferrara 1999 ;Yancopoulos2000)。VEGF促進血管內皮細胞生長并提高血管通透性 (Ferrara2004)。先前研究已表明，在大多數腫瘤類型中VEGF表達水平升高(Berkman 1993 ；Brown 1993 ；Brown 1995 ；Dvorak 1995 ;Matternl996)。研究還顯示，在患有如濕性老年性黃斑變 性(AMD)的眼血管疾病的受試者中VEGF水平升高。濕性AMD僅占全部AMD病例的約10%， 但卻造成約90%由AMD引起的失明。濕性AMD的特征在于脈絡膜新血管形成(CNV)，即視 網膜的視網膜色素上皮層下的異常血管發育。認為VEGF-A在這些血管的形成中起主要作 用，這些血管在黃斑下滲漏并引起視網膜變形和視力退化。目前可獲得治療性抗VEGF抗體。例如，人源化IgGl單克隆抗體貝伐單抗 (bevacizumab) (a. k. a.，avastin ,由 Genentech 出售，San Francisco, CA ；本文中還禾爾為BM-1)與人VEGF結合的親合力(Kd)為約500pM。雖然貝伐單抗已用于治療各種癌癥，但是 在本領域需要具有更高體內效力的抗體。這樣的抗體提出了巨大的技術挑戰并且非常難以 實現，因為僅提高VEGF抗體的結合親合力不必定提高其體內效力(Liang 2006)。
            

            發明內容
            
本發明解決了對于具有優良效力的VEGF抗體的需求。本文提供了治療性抗體及 其抗原結合片段，以及用于治療如癌癥的醫學病癥的組合物和使用方法。在某些實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包含選自由XPA. 10. 064、 XPA. 10. 072、XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 禾P XPA. 10. 064. 10組成的組中的HCDR3區。在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段進一步 包含 XPA. 10. 064 或 XPA. 10. 072 的 HCDRl 和 / 或 HCDR2。在某些實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包含XPA. 10.072的 LCDRl、LCDR2 禾口 LCDR3 ；XPA. 10. 064 的 LCDRl、LCDR2 禾口 LCDR3 ；XPA. 10. 072 的 HCDRl、 HCDR2 和 HCDR3 ；XPA. 10. 064 的 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；XPA. 10. 064. 03 的 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；XPA. 10. 064. 04 的 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；XPA. 10. 064. 06 的 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ； XPA. 10. 064. 07 的 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3 ；和 / 或XPA. 10. 064. 10.的 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3。 在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段包含XPA. 10. 072,XPA. 10. 064,XPA. 10. 064. 03、 XPA. 10. 064. 04,XPA. 10. 064. 06,XPA. 10. 064. 07 或 XPA. 10. 064. 10 的重鏈。在某些實施方 式中，該抗體或抗原結合片段包含XPA. 10. 064或XPA. 10. 072的輕鏈。在某些實施方式中，提供了一種包含重鏈可變區的抗體或抗原結合片段，其中該 重鏈可變區包含選自由 SEQ ID N0:15、SEQ IDNO  16、SEQ ID NO  17,SEQ ID N0:18 禾口 SEQ ID NO: 19組成的組中的氨基酸序列。在這些實施方式的某些中，重鏈可變區進一步包含一 個或多個在SEQ ID N0:6和/或SEQ ID NO :7中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，該 抗體或抗原結合片段包含重鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO 20, SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22,SEQ ID N0:23和SEQ ID NO :24組成的組中的氨基酸順序。在某些實施方式中， 該抗體或抗原結合片段進一步包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含一個或多個在SEQ ID NO :12、SEQ IDNO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10 和 SEQ IDNO :11 中 所示的氨基酸序列。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合片段包含輕鏈，其中該輕 鏈包含在SEQ ID NO :5或SEQID NO 3中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，提供了一種包含重鏈可變區和輕鏈可變區的抗體或抗原結合 片段，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :17中所示的氨基酸序列，而該輕鏈可變區包含 一個或多個在 SEQ IDNO  12,SEQ ID NO  13,SEQ ID NO  14,SEQ ID NO :9、SEQ IDN0:10 禾口 SEQ ID NO :11中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段的重鏈可 變區進一步包含在SEQ ID NO :6和/或SEQ ID NO 7中所示的氨基酸序列，而在這些實施 方式的某些中，該抗體或抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含在SEQ ID N0:22 中所示的氨基酸序列而該輕鏈包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，提供了一種包含重鏈可變區和輕鏈可變區的抗體或抗原結合 片段，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :18中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含一 個或多個在 SEQ IDNO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 10 和
            
12SEQ ID NO :11中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段的重鏈可 變區進一步包含在SEQ ID NO :6和/或SEQ ID NO 7中所示的氨基酸序列，而在這些實施 方式的某些中，該抗體或抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含在SEQ ID N0:23 中所示的氨基酸序列而該輕鏈包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，提供了一種包含重鏈可變區和輕鏈可變區的抗體或抗原結合 片段，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :15中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含一 個或多個在 SEQ IDNO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 10 和 SEQ ID NO :11中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段的重鏈可 變區進一步包含在SEQ ID NO :6和/或SEQ ID NO 7中所示的氨基酸序列，而在這些實施 方式的某些中，該抗體或抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含在SEQ ID N0:20 中所示的氨基酸序列而該輕鏈包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，提供了一種包含重鏈可變區和輕鏈可變區的抗體或抗原結合 片段，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :16中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含一 個或多個在 SEQ IDNO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 10 和 SEQ ID NO :11中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段的重鏈可 變區進一步包含在SEQ ID N0:6和/或SEQ ID NO :7中所示的氨基酸序列，而在這些實施 方式的某些中，該抗體或抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含在SEQ ID N0:21 中所示的氨基酸序列而該輕鏈包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，提供了一種包含重鏈可變區和輕鏈可變區的抗體或抗原結合 片段，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :19中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含一 個或多個在 SEQ IDNO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO :1Q 禾口 SEQ ID NO :11中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段的重鏈可 變區進一步包含在SEQ ID N0:6和/或SEQ ID NO :7中所示的氨基酸序列，而在這些實施 方式的某些中，該抗體或抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含在SEQ ID N0:24 中所示的氨基酸序列而該輕鏈包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其特異地結合VEGF并具有 一種或多種下列性能1)與HVEGF165結合的Kd為約1(Γ10ΟΜ ；2)與hVEGF165結合的ka為約 1. 89 X IO5 ；3)與hVEGF165結合的kd為約1. 73X 10_5 ；4)對hVEGF165的結合親合力比貝伐單 抗對hVEGF165的結合親合力高約4. 25倍；5)抑制制HUVEC細胞增殖的IC5tl為約154pM ；6)抑 制HUVEC細胞增殖的IC5tl為貝伐單抗的約56% ;7)與hVEGF165結合的Kd在約1. 97 X KTltlOM 至約3. 49X KT11M的范圍內；8)與hVEGF165結合的ka在約1.5X IO5至約2. 16X IO5M的范 圍內；9)與hVEGF165結合的kd在約6. 65 X 10_6至約2. 94X ICT5M的范圍內；10)抑制HUVEC 細胞增殖的IC5tl在約129pM至約174pM的范圍內；11)對hVEGF的結合親合力比該抗體或 其抗原結合片段對mVEGF的結合親合力大至少約10倍；12)與貝伐單抗競爭結合hVEGF165 ； 13)當以相同或更低的劑量給藥時，作為腫瘤生長抑制百分率的函數，對腫瘤生長的抑制程 度與貝伐單抗相同或比貝伐單抗更大；和14)當以與貝伐單抗相同或更低的劑量給藥時， 延緩腫瘤生長使其達到特定尺寸的持續時間比貝伐單抗更長。在某些實施方式中，提供了 一種抗體或抗原結合片段，其與包含在SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO  16,SEQ ID NO  17,SEQ ID N0:18或SEQ ID NO :19中所示的氨基酸序列的抗體結合至hVEGF165上的相
            
13同表位。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合片段與包含在SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24中所示的氨基酸序列的抗體結合至hVEGF165上的相同表位。在某些實施方式中，抗體或抗原結合片段結合hVEGF165的Kd ( 200pM。在這些實 施方式的某些中，抗體或抗原結合片段結合hVEGF165的Kd ^ 150pM,而在其他實施方式中 ^ ΙΟΟρΜ，而在其他實施方式中< 50pM。在某些實施方式中，本文中提供的抗體或抗原結合 片段結合的hVEGF165上的表位與由貝伐單抗所結合的表位至少部分重疊。在某些實施方式中，本文所提供的抗體或抗原結合片段阻斷hVEGF165與VEGF受體 的結合，其中的受體在某些實施方式中為VEGF-Rl或VEGF-R2。在某些實施方式中，抗體或 抗原結合片段抑制hVEGF165誘導的VEGF受體磷酸化。在某些實施方式中，該抗體或抗原結 合片段結合HVEGF165的Kd比它們結合mVEGF165的Kd大至少10倍(S卩，親和力大至少10倍， 表示數量上小至少10倍)。在這些實施方式的某些中，抗體或抗原結合片段結合hVEGF165 的Kd比它們結合mVEGF165的Kd大至少50倍，而在某些實施方式中，大至少100倍。在上述實施方式的某些中，本文所公開的抗體或抗原結合片段包含κ輕鏈、Yl 重鏈、Y2重鏈、Y3重鏈或Y4重鏈恒定區。在這些實施方式的某些中，抗體或抗原結合 片段包含IgG2恒定區。在某些實施方式中，本文所公開的抗體為完全抗體。在這些實施方 式中的某些中，該抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、雙重特異性抗體、人源化 抗體、嵌合抗體、標記抗體、二價抗體、抗獨特型抗體或完全人抗體。在某些實施方式中，如 本文所提供的抗體或抗原結合片段可以為駱駝化(camelized)單域抗體、雙體抗體(雙特 異性抗體，diabody)、scFv、scFv 二聚體、dsFv、(dsFv) 2> dsFv-dsFv'、Fv 片段、Fab、Fab'、 F(ab，)2、ds雙體抗體、納米抗體、域抗體(domain antibody)或二價域抗體。在某些實施方式中，提供了用于抑制需要其的受試者體內血管生成的方法，通過 所述受試者給予治療有效量的本文所公開的一種或多種抗體或抗原結合片段。在這些實施 方式的某些中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包 含在SEQ ID NO 22中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQID NO 5中所示的氨 基酸序列。在其他實施方式中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該 重鏈可變區包含在SEQ ID N0:20、21、23或24中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在 SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，以每次給予5mg/kg或更小的劑量 給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，以每次給予lmg/kg或更小的劑量 給予該抗體或抗原結合片段，而在其他實施方式中給予0. 5mg/kg或更小的劑量，而在其他 實施方式中給予0. lmg/kg或更小的劑量。在某些實施方式中，以每天一次至每兩月一次的 間隔向受試者多次給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，可以以約每周 一次、約每兩周一次、約每月一次或約每兩月一次給予該抗體或抗原結合片段。在某些實施方式中，提供了用于治療需要其的受試者(例如，哺乳動物受試者，如 人類、靈長類、犬、大鼠、兔或小鼠)中與異常血管生成有關的疾病的方法，包括向所述受試 者給予治療有效量的本文所公開的一種或多種抗體或抗原結合片段。在這些實施方式中的 某些中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :22中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。 在其他實施方式中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :20、21、23或24中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO 5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，以每次給予5mg/kg或更小的劑量給予該 抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，以每次給予lmg/kg或更小的劑量給予該 抗體或抗原結合片段，而在其他實施方式中給予0. 5mg/kg或更小的劑量，而在其他實施方 式中給予0. lmg/kg或更小的劑量。在某些實施方式中，以每天一次至每兩月一次的間隔向 受試者多次給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，可以以約每周一次、約 每兩周一次、約每月一次或約每兩月一次給予該抗體或抗原結合片段。在某些實施方式中，提供了用于治療需要其的受試者(例如，哺乳動物受試者，如 人類、靈長類、犬、大鼠、兔或小鼠)中與VEGF信號轉導有關的炎性疾病的方法，包括向所述 受試者給予治療有效量的本文所公開的一種或多種抗體或抗原結合片段。在這些實施方式 的某些中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在 SEQ ID NO 22中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO 5中所示的氨基酸 序列。在其他實施方式中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈 可變區包含在SEQ ID NO :20、21、23或24中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，與VEGF信號轉導有關的疾病為類風濕 性關節炎、牛皮癬、硬皮病、慢性阻塞性肺病或哮喘。在某些實施方式中，以每次給予5mg/ kg或更小的劑量給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，以每次給予Img/ kg或更小的劑量給予該抗體或抗原結合片段，而在其他實施方式中給予0. 5mg/kg或更小 的劑量，而在其他實施方式中給予0. lmg/kg或更小的劑量。在某些實施方式中，以每天一 次至每兩月一次的間隔向受試者多次給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些 中，可以以約每周一次、約每兩周一次、約每月一次或約每兩月一次給予該抗體或抗原結合 片段。在某些實施方式中，提供了用于治療需要其的受試者(例如，哺乳動物受試者，如 人類、靈長類、犬、大鼠、兔或小鼠)中濕性急性黃斑變性或糖尿病性視網膜病的方法，包括 向所述受試者給予治療有效量的本文所公開的一種或多種抗體或抗原結合片段。在這些實 施方式的某些中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區 包含在SEQ ID NO 22中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO 5中所示的 氨基酸序列。在其他實施方式中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中 該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :20、21、23或24中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含 在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，以每次給予5mg/kg或更小的劑 量給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，以每次給予lmg/kg或更小的劑 量給予該抗體或抗原結合片段，而在其他實施方式中給予0. 5mg/kg或更小的劑量，而在其 他實施方式中給予0. lmg/kg或更小的劑量。在某些實施方式中，以每天一次至每兩月一次 的間隔向受試者多次給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，可以以約每 周一次、約每兩周一次、約每月一次或約每兩月一次給予該抗體或抗原結合片段。在某些實施方式中，提供了用于治療需要其的受試者(例如，哺乳動物受試者，如 人類、靈長類、犬、大鼠、兔或小鼠)中與VEGF信號轉導升高有關的癌癥的方法，包括向所述 受試者給予治療有效量的本文所公開的一種或多種抗體或抗原結合片段。在這些實施方式 的某些中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在
            
15SEQ ID NO 22中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO 5中所示的氨基酸 序列。在其他實施方式中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈 可變區包含在SEQ ID NO :20、21、23或24中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合片段進一步包 含一種為毒素、細胞因子或化療劑的軛合物。在某些實施方式中，抗體或抗原結合片段聯合 或連接至一種或多種化療劑進行給藥。在某些實施方式中，受試者接受一種或多種其他治 療方法，如外科腫瘤切除術或抗癌放射療法。在某些實施方式中，以每次給予5mg/kg或更 小的劑量給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，以每次給予lmg/kg或更 小的劑量給予該抗體或抗原結合片段，而在其他實施方式中給予0. 5mg/kg或更小的劑量， 而在其他實施方式中給予0. lmg/kg或更小的劑量。在某些實施方式中，以每天一次至每兩 月一次的間隔向受試者多次給予該抗體或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，可以 以約每周一次、約每兩周一次、約每月一次或約每兩月一次給予該抗體或抗原結合片段。在某些實施方式中，提供了一種試劑盒，其包含如本文所公開的一種或多種抗體 或抗原結合片段。在這些實施方式的某些中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈 可變區，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :22中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含 在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在其他實施方式中，抗體或抗原結合片段包含重鏈 可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :20、21、23或24中所示的氨基 酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，試 劑盒進一步包含使用該抗體或抗原結合片段和/或利用該試劑盒中其他組分的說明書。在某些實施方式中，提供了編碼在SEQ ID NO :2_24中所示的氨基酸序列的多核苷 酸。在某些其他實施方式中，提供了包含這些多核苷酸的載體，而在某些其他實施方式中， 提供了包含這些載體的宿主細胞。在某些實施方式中，提供了用于表達本文所公開的一種 或多種抗體或抗原結合片段的方法，通過在載體表達編碼抗體或抗原結合片段的多核苷酸 的條件下培養這些宿主細胞。在某些實施方式中，本文所提供的多核苷酸可操作地與載體 中的啟動子(如CMV啟動子)連接。在某些實施方式中，包含本文所提供載體的宿主細胞 為中華倉鼠卵巢細胞。在某些實施方式中，提供了包含本文所公開的一種或多種抗體或抗原結合片段的 藥物組合物。在這些實施方式的某些中，該組合物進一步包含一種或多種生理學耐受組分。 在這些實施方式的某些中，該一種或多種生理學耐受組分可以是一種或多種藥用載體、稀 釋劑、佐劑、賦形劑或無毒輔助物質。在這些實施方式的某些中，該一種或多種生理學耐受 組分可以包括一種或多種抗氧化劑，其可以選自蛋氨酸、抗壞血酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、 硫代硫酸鈉、鉬、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巰基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基 化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯和/或沒食子酸丙酯。同樣地，在某些實施方式中，提供了 使用一種或多種抗氧化劑用于抑制本文所提供抗體或其抗原結合片段的氧化和/或防止 其VEGF結合的親合力降低的方法。在某些實施方式中，用于該組合物的抗體或抗原結合片 段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID NO :22中所示的氨基酸 序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在其他實施方式中，抗體 或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在SEQ ID N0:20、 21、23或24中所示的氨基酸序列而該輕鏈可變區包含在SEQ ID NO :5中所示的氨基酸序列。在某些實施方式中，提供了本文所提供的一種或多種抗體或抗原結合片段在制備 用于治療與異常血管生成有關的疾病、與異常血管生成有關的炎癥疾病、與VEGF信號轉導 有關的炎性疾病、濕性急性黃斑變性、糖尿病性視網膜病或與VEGF信號轉導升高有關的癌 癥的藥劑中的應用。在某些實施方式中，提供了本文所公開的抗體或抗原結合片段用于治療與異常血 管生成有關的疾病、與異常血管生成有關的炎性疾病、與VEGF信號轉導有關的炎癥疾病、 濕性急性黃斑變性、糖尿病性視網膜病或與VEGF信號轉導(例如，相對于非癌細胞，癌癥表 現出VEGF信號升高)有關的癌癥。
            

            

            
圖1 :XPA. 10. 064和XPA. 10. 072的重鏈可變區(包括HCDR)和輕鏈可變區(包括 LCDR)。圖 2 對 XPA. 10. 064IgG2 與 hVEGF165 結合的 Biacore 分析。圖 3 對 XPA. 10. 072IgG2 與 hVEGF165 結合的 Biacore 分析。圖4 對貝伐單抗與hVEGF165結合的Biacore分析。圖 5 通過貝伐單抗(BMl)、XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 對 hVEGF165 與 VEGF-Rl 結 合的抑制。圖 6 通過貝伐單抗(BMl)、XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 對 hVEGF165 與 VEGF-R2 結 合的抑制。圖 7 對由貝伐單抗(BMl)、XPA. 10. 064 (064)和 XPA. 10. 072 (072)所結合的
            
hVEGF165表位的分析。圖8 :XPA. 10. 064與G153-694的共定位。部分A顯示了用XPA. 10. 064的染色。 部分B顯示了用G153-694的染色。部分C顯示了用核染料的染色。部分D顯示了合并的 圖像，其中較大的強度(白色)反映了共定位。圖9 :XPA. 10. 072與G153-694的共定位。部分A顯示了用XPA. 10. 072的染色。 部分B顯示了用G153-694的染色。部分C顯示了用核染料的染色。部分D顯示了合并的 圖像，其中較大的強度(白色)反映了共定位。圖 10 通過(A)XPA. 10. 064IgG2 和(B)XPA. 10. 072IgG2 對 HUVEC 增殖的抑制。圖11 用hVEGF165劑量滴定處理HUVEC導致VEGF-R2磷酸化的升高。圖12 用hVEGF165+貝伐單抗劑量滴定處理HUVEC導致VEGF-R2磷酸化的降低。圖 13 :XPA. 10. 064 (064)和 XPA. 10. 072 (072) IgG2 抑制 hVEGF165 誘導的 VEGF-R2
            
磷酸化。圖14 用于Matrigel 栓子的目測評分系統。顯示了 ο到3的每個得分的實例。圖15 Matrigel 栓子測定顯示 了在貝伐單抗(BM-I)、XPA. 10. 064(064)和 XPA. 10. 072(072)以不同劑量存在下的血管生成抑制的水平。圖16 通過Matrigel 栓子測定所確定的血管生成的抑制。數量為雙盲得分 的結果的平均值。(A)無細胞；⑶DU145+aKLH;(C)貝伐單抗(0. lmg/kg) ； (D)貝伐單 抗(lmg/kg) ； (E)貝伐單抗(5mg/kg) ； (F)XPA. 10. 064(0. lmg/kg) ； (G)XPA. 10. 064 (lmg/kg) ； (H) XPA. 10. 064(5mg/kg) ； (I)XPA. 10. 072(0. lmg/kg) ； (J) XPA. 10. 072 (lmg/kg) ； (K) XPA. 10. 072 (5mg/kg)。圖17:通過XPA. 10. 064和XPA. 072對體內A673腫瘤生長的抑制。(1)僅載 體；(2)0. 5mg/kg 的 XPA. 10. 064IgG2 ； (3) 5mg/kg 的 XPA. 10. 064IgG2 ； (4)0. 5mg/kg 的 XPA. 10. 072IgG2 ； (5)5mg/kg 的 XPA. 10. 072IgG2 ； (6)5mg/kg 的 CHO. KLH IgG2 ； (7)0. 5mg/ kg的貝伐單抗；(8) 5mg/kg的貝伐單抗。圖18 在四個獨立測定中通過XPA. 10. 064IgG2對HUVEC增殖的抑制(#1_4)。圖19 在四個獨立測定中通過XPA. 10. 064. 03IgG2對HUVEC增殖的抑制(#1_4)。圖20 在四個獨立測定中通過XPA. 10. 064. 06IgG2對HUVEC增殖的抑制(#1_4)。圖21 在四個獨立測定中通過XPA. 10. 064. 07IgG2對HUVEC增殖的抑制(#1_4)。圖22 在四個獨立測定中通過XPA. 10. 064. 10IgG2對HUVEC增殖的抑制(#1_4)。圖23 在四個獨立測定中通過貝伐單抗IgG2對HUVEC增殖的抑制(#1_4)。圖 24 通過 XPA. 10. 064. 03 ( ■ )、XPA. 10. 064. 04 ( ▲ )、XPA. 10. 064. 06 ( ▼)、 XPA. 10. 064. 07(   ) ,XPA. 10. 064. 10( · ) ,XPA. 10. 064(D)和貝伐單抗(x，氺)對 HUVEC 增殖的抑制。對各個抗體的結果均為四個獨立測定的平均值。圖25 24天中由XPA. 10. 064. 06和貝伐單抗對體內A673腫瘤生長的抑制。 (· )0. 5mg / kg同種型對照抗體；(▼)(). Img / kg的貝伐單抗；(  ) 0. Img / kg的 XPA. 10. 064. 06 IgG2 ； ( ■ )0. 5mg / kg 的貝伐單抗；(▲ )0. 5mg / kg 的 XPA. 10. 064. 06 IgG2 ； ( □ ) 5mg / kg 的貝伐單抗和(Δ )5mg / kg 的 XPA. 10. 064. 06 IgG2。χ 軸上的箭 頭指示劑量給藥天數。圖26 28天中由XPA. 10. 064. 06和貝伐單抗對體內Α673腫瘤生長的抑制。 (· )0.5mg / kg同種型對照抗體；(▼)(). Img / kg的貝伐單抗；(  )0. Img / kg的 XPA. 10. 064. 06 IgG2 ； ( ■ ) 0. 5mg / kg 的貝伐單抗；(▲ ) 0. 5mg 幾 g 的 XPA. 10. 064. 06 IgG2 ； ( □ ) 5mg / kg 的貝伐單抗和(Δ ) 5mg / kg 的 XPA. 10. 064. 06 IgG2。χ 軸上的箭 頭指示劑量給藥天數。圖27 :31天中由XPA. 10. 064. 06和貝伐單抗對體內Α673腫瘤生長的抑制。 (#)0.5mg / kg同種型對照抗體；(▼ )0· 1 mg / kg的貝伐單抗；(  )0· Img / Ikg的 XPA. 10. 064. 06 IgG2 ； ( ■ )0. 5mg / kg 的貝伐單抗；(▲ )0. 5mg / kg 的 XPA. 10. 064. 06 IgG2 ； (口)5mg / kg 的貝伐單抗和(Δ )5mg / kg 的 xPA. 10. 064. 06 IgG2。χ 軸上的箭 頭指示劑量給藥天數。圖28 抗體蛋氨酸氧化對hVEGF165結合的影響。A.在存在或不存在蛋氨酸氧化的 情況下對XPA. 10. 064與hVEGF165結合的Biacore分析。B.在存在或不存在蛋氨酸氧化的 情況下對XPA. 10. 064. 06與hVEGF165結合的Biacore分析。圖29 熱應力氧化條件后，蛋氨酸對xPA. 10. 064. 06與hVEGF165結合的影響。A. 熱應力氧化后對XPA. 10. 064. 06與hVEGF165結合的Biacore分析。B.在存在蛋氨酸的情況 下，熱應力氧化后對XPA. 10. 064. 06與hVEGF165結合的Biacore分析。圖30 氧化后，蛋氨酸對XPA. 10. 064. 06對hVEGF165結合親合力的影響。A.在 存在或不存在蛋氨酸的情況下，熱應力氧化后，對XPA. 10. 064. 06與hVEGF165結合的 ELISA (酶聯免疫吸附測定)分析。B.在存在或不存在蛋氨酸的情況下，化學應力氧化后對
            
18XPA. 10. 064. 06 與 hVEGF165 結合的 ELISA 分析。圖31 =XPA. 10. 064重鏈+輕鏈載體pMXSP117的結構。除了用hisD基因代替neo 基因外，XPA. 10. 064重鏈+輕鏈載體pMXSP 119具有相同結構。A.環形結構。B.用Xbal 消化后的線性結構。圖32 =XPA. 10. 064. 06重鏈和輕鏈可變區模塊表達載體。Α.重鏈載體的結構。B.輕 鏈載體的結構。
            
具體實施例方式本發明的以下描述僅旨在說明本發明的各種實施方式。同樣，不能將所討論的具 體變形視為對本發明范圍的限制。對于本領域的技術人員來說，在不背離本發明范圍的情 況下各種等同替換、變化和變形將是顯而易見的，并且應理解該類等價實施方式將包括在 本文中。MM本文使用了以下縮寫ADCC，抗體依賴的細胞毒性；AMD，年齡相關性黃斑變性； BDS，原料藥物質；BM-1，貝伐單抗；CDC，補體依賴的細胞毒性；CNV，脈絡膜新血管形成； C0PD，慢性阻塞性肺病；DF，滲濾；EDTA，乙二胺四乙酸；GMP，藥品生產質量規范；HAMA，人 抗_小鼠抗體；HIC，疏水性相互作用色譜；HUVEC，人臍靜脈內皮細胞；hVEGF，人VEGF ；MCB, 原始細胞庫；mpk，mg/kg ；mVEGF,鼠VEGF ；PD,藥效學；PK，藥物動力學；RA，類風濕性關節 炎；RIA，放射免疫沉淀；UF，超濾；VEGF，血管內皮生長因子；VEGF-R，血管內皮生長因子受 體；VHL，希林二氏(von Hippel/Lindau) ；X-反應性，交叉反應性。^JL如本文所用的，術語“抗體”包括與特定抗原結合的任何單克隆抗體、多克隆抗體、 多特異性抗體或雙特異性(二價)抗體。完全抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈 由可變區和第一、第二和第三恒定區組成，而每條輕鏈由可變區和恒定區組成。哺乳動物的 重鏈分為α、δ、ε、Υ和μ，而哺乳動物的輕鏈分為Y或κ類。抗體具有的形狀為“Y” 形，其中Y的柄部由通過二硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二和第三恒定區組成。Y的每條 臂包括與一條輕鏈的可變區和恒定區結合的一條重鏈的可變區和第一恒定區。輕鏈和重鏈 的可變區負責抗原的結合。兩種鏈中的可變區通常含有三個高度可變的環，其稱作互補決 定區(CDR)(輕(L)鏈 CDR 包括 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，而重(H)鏈 CDR 包括 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3)。可以通過 Kabat、Chothia 或 Al-Lazikani (Al-Lazikani 1997 ；Chothia 1985 ； Chothia 1987 ；Chothia 1989 ；Kabat 1987 ；Kabat 1991)的常規方法定義或鑒別本文所公 開的抗體和抗原結合片段的CDR邊界。將三個CDR插入到被稱為框架區(FR)的側翼延伸 之間，該框架區比CDR更加高度保守并形成支持高變環的支架。重鏈和輕鏈的恒定區不參 與抗原結合，但表現出各種效應子的功能。根據抗體重鏈恒定區的氨基酸序列對其進行分 類。抗體的五種主要種類或同種型為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分別存在α、 δ、ε、γ和μ重鏈。將幾種主要抗體種類分為子類，如IgGl(Yl重鏈)、IgG2(Y2重鏈)、 IgG3 ( γ 3 重鏈)、IgG4 ( γ 4 重鏈)、IgAl ( α 1 重鏈)或 IgA2 ( α 1 重鏈)。為“二價”的抗體或其抗原結合片段包含兩個抗原結合位點。該兩個抗原結合位 點可以與相同抗原結合，或它們可以各自與不同的抗原結合，這種情況下該抗體或抗原結合片段的特征在于“雙特異性”。如本文所用的，術語“抗原結合片段”指抗體片段，例如雙體抗體、Fab、Fab’、 F(ab，)2、Fv 片段、二硫鍵穩定的 Fv 片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性 dsFv(dsFv-dsFv')、 二硫鍵穩定的雙體抗體(ds雙體抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv 二聚物(二價雙體抗 體)、由包含一個或多個CDR的抗體部分形成的多特異性抗體、駱駝源化單域抗體、納米抗 體(nanoantibody)、域抗體、二價域抗體或與抗原結合但不包含完全抗體結構的任何其他 抗體片段。抗原結合片段能夠與親代抗體所結合的相同抗原結合。在某些實施方式中，抗 原結合片段可以包含一個或多個來自接枝到來自一個或多個不同人抗體的框架區上的特 定人抗體的CDR。與抗體有關的“Fab”指由通過二硫鍵結合至單重鏈的可變區和第一恒定區的單輕 鏈(可變和恒定區)所組成的抗體的部分。“Fab”，指包括部分絞鏈區的Fab片段。"F(ab' )2”指 Fab 的二聚體。與抗體有關的“Fe”指由通過二硫鍵結合至第二重鏈的第二和第三恒定區的第一 重鏈的第二和第三恒定區所組成的抗體的部分。抗體的Fc部分負責各種效應子功能，如 ADCC和⑶C，但是在抗原結合中不起作用。與抗體有關的“Fv”指具有完全抗原結合位點的抗體的最小片段。Fv片段由結合 至單重鏈的可變區結合的單輕鏈的可變區組成。“單鏈Fv抗體”或“scFv”指改造抗體，其由直接或肽接頭序列彼此連接的輕鏈可 變區和重鏈可變區所組成(Houston 1988)。“單鏈Fv-Fc抗體”或“scFv-Fc”指由連接至抗體Fc區的scFv所組成的改造抗 體。“駱駝源化單域抗體”、“重鏈抗體”或“HCAb”指含有兩個Vh結構域并且不含 輕鏈的抗體(Riechmann 1999 ；Muyldermans 2001 ；W094/04678 ；W094/25591 ；美國專利 No. 6005079) 0重鏈抗體最初來源于駱駝屬(駱駝、單峰駝和美洲駝)。盡管缺少輕鏈，但 是駱駝源化抗體具有可信的抗原結合組成部分(Hamers-Castermanl993 ；Nguyen 2002 ； Nguyen 2003)。重鏈抗體的可變結構域(VHH結構域)代表由適應性免疫應答所產生的最 小已知抗原結合單元(Koch-Nolte 2007)。“納米抗體”指由來自重鏈抗體的VHH域和兩個恒定域(CH2和CH3)所組成的抗體 片段。“雙體抗體”包括具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，其中這些片段包含連接至 相同多肽鏈中八結構域的Vh結構域(VH-VL或VH-VL)(見，例如，Holliger 1993 ；EP404097 ； W093/11161)。通過使用短到不允許在相同鏈的兩個結構域間配對的接頭，迫使這些域與另 一條鏈的互補結構域配對，由此產生兩個抗原結合位點。“ (結構)域抗體(domain antibody)，，指僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區的抗體 片段。在某些情況下，兩個或多個Vh域通過肽接頭共價結合而產生二價域抗體。二價域抗 體的兩個Vh域可以靶向相同或不同的抗原。在某些實施方式中，“(dsFv)2”包含三條肽鏈通過肽接頭連接且通過二硫橋結合 至兩個\部分的兩個Vh部分。
            
在某些實施方式中，“雙特異性ds雙體抗體”包含經由在Vhi和Vu之間的二硫橋 結合至Vu-Vh2 (通過肽接頭連接)的Vm-I2 (也通過肽接頭連接)。在某些實施方式中，“雙特異dsFv”或“dsFv-dsFv”包含三條肽鏈Vhi-Vh2部分，其 中重鏈通過肽接頭連接(例如，長的柔性接頭)并通過二硫橋分別結合至Vu和V。部分，其 中每個通過二硫橋成對的重鏈和輕鏈具有不同的抗原特異性。在某些實施方式中，“scFv 二聚體”為二價雙體抗體，其包含與另一 部分二聚 化的Vh-VJ通過肽接頭連接)從而使得一個部分的Vh與另一部分的\配位并形成兩個相 同的結合位點。在其他實施方式中，“ scFv 二聚體”是雙特異雙體抗體，其包含與Vu-Vh2 (通 過肽接頭連接)相連的Vm-I2 (也通過肽接頭連接)從而使得Vhi與Vu配位而Vh2與\2配 位，并且每個配位對具有不同的抗原特異性。如本文所用的，術語“表位”指抗原上與抗體結合的原子或氨基酸的特定基團。如 果兩個抗體對抗原表現出競爭性結合，則它們可以與抗原內的相同表位結合。例如，如果本 文所公開的抗體或抗原結合片段與貝伐單抗競爭與VEGF的結合，則可以(但不必須)認為 抗體所結合的表位與貝伐單抗相同。如本文所用的，“VEGF”或“VEGF配體”指目前已知的七種VEGF配體之一 VEGF_A、 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E (病毒來源)或胎盤生長因子(PIGF)-1 或-2。對于 VEGF-A， 目前有四種已知的拼接亞型，每種均表現出獨特的生物學功能。165氨基酸亞型(VEGF165、 SEQ ID NO 1)以肝素-結合和可溶形式存在。121氨基酸亞型(VEGF121)，其丟失了對應于 VEGF165中的殘基115和159之間的區域的片段，僅以可溶形式存在。更長的189和206氨 基酸亞型(分別為VEGF189和VEGF2J保持了結合肝素的能力。本文所提供的抗體和抗原結 合片段表現出對hVEGF165的高結合親合力，但在某些實施方式中，其可以交叉反應或表現出 對非人VEGF蛋白或對其他VEGF亞型的低結合親合力水平。如本文所用的，“VEGF信號轉導”包括由VEGF與一個或多個VEGF受體結合所誘導 的胞內事件，如受體磷酸化(例如，酪氨酸磷酸化)、胞內信號轉導分子(例如，PLCy ；磷脂 酶C- γ )與受體或其他胞內信號轉導分子的結合、信號轉導級聯的啟動和/或生物學響應 的啟動(例如，誘導細胞生理或發育(例如，增殖)中基因表達和變化)。如本文所用的，“癌癥”或“癌性病癥”指通過腫瘤形成或惡性腫瘤細胞生長、增殖 或轉移所介導的任何醫學病癥，包括實體癌癥和非實體癌(如白血病)兩種。如本文所用 的，“腫瘤”指腫瘤和/或惡性腫瘤細胞的實體塊。如本文所用的，病癥的“治療”包括防止或減輕病癥、減緩病癥的發作或發展速度、 降低發展病癥的風險、防止或延緩與病癥有關的癥狀發展，減少或終止與病癥有關的癥狀、 導致病癥完全或部分消退、治愈病癥或它們的一些組合。對于癌癥，“治療”可以指抑制或減 緩腫瘤形成或惡性腫瘤細胞生長、增殖或轉移，防止或延緩腫瘤形成或惡性腫瘤細胞生長、 增殖或轉移的發展，或它們的一些組合。對于腫瘤，“治療”包括消除所有或部分腫瘤、抑制 或減緩腫瘤的生長和轉移、防止或延緩腫瘤的發展，或它們的一些組合。如本文所用的，術語“特異結合”指兩個分子之間非隨機的結合反應，例如，抗體和 配體之間。如本文所用的，與第一配體特異結合的抗體或抗原結合片段可以表現出與第二 配體的交叉反應或低水平的結合親合力。在某些實施方式中，與配體特異結合的抗體或抗 原結合片段結合該配體的親合力(Kd)彡10_7M(例如，5X10_8M、10_8M、5X10_9M)。如本文所用的，Kd指解離速率與結合速率的比值(k。ff/k。n)，并可以使用本領域已知的方法確定(例 如，使用Biacore或Kinexa技術)。在某些實施方式中，與配體特異結合的抗體或抗原結 合片段結合該配體的結合親合力比該抗體結合第二配體的結合親合力高至少10倍(例如， 彡10倍、彡15倍、彡20倍、彡50倍、彡IO2倍、彡IO3倍或彡IO4倍)。在其他實施方式中， 與配體(如hVEGF165)特異結合的抗體結合該配體的結合親和力(Kd)彡ΙΟ—、，但該抗體對 第二配體(如mVEGF165)未表現出可檢測的結合親合力。“分離的”物質已被人改變了自然狀態。如果“分離的”組合物或物質是天然發生 的，則它已經從其原始環境中發生變化或移出，或兩者均發生。例如，天然存在于活動物中 的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是如果相同的多核苷酸或多肽已經與其天然狀態的共 存材料充分分離以致于以基本純態存在，則它是“分離的”。如本文所用的，術語“載體”指編碼蛋白質的多核苷酸可以可操作地插入其中從而 導致該蛋白質表達的載體。載體可用于轉化、轉導或轉染宿主細胞從而導致宿主細胞內其 所攜帶遺傳元件的表達。載體的實例包括質粒，噬粒，粘粒，諸如酵母人工染色體(YAC)、細 菌人工染色體(BAC)、或P 1來源人工染色體(PAC)的人工染色體，諸如λ噬菌體或Μ13 噬菌體的細菌噬菌體，和動物病毒。用作載體的動物病毒種類包括反轉錄病毒(包括慢病 毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭狀瘤病 毒、和乳多空病毒(例如，SV40)。載體可以包含控制表達的各種元件，包括啟動子序列、轉 錄起始序列、增強子序列、可選擇元件和報告基因。另外，載體可以包含復制原點。載體還 可以包含有助于其進入細胞的材料，包括，但不限于，病毒顆粒、脂質體、或蛋白質涂層。如本文所用的，短語“宿主細胞”指其中已引入外源多核苷酸和/或載體的細胞。 宿主細胞可以選自各種細胞類型，包括，例如，細菌細胞如大腸桿菌(E. coli)或枯草芽孢 桿菌(B. subtilis)細胞，真菌細胞如酵母細胞或曲霉菌(Aspergillus)細胞，昆蟲細胞如 果蠅S2 (Drosophila S2)或草地貪夜蛾(Spodoptera Sf9)細胞，或動物細胞如成纖維細 胞、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK293細胞、或人細胞。如本文所用的，“與異常血管生成有關的疾病”指由血管生成增加，特別是由與 VEGF信號轉導有關或通過它所介導的血管生成增加所引起的、加劇的或與之有關的任何病 癥。這樣的病癥包括由依賴于新生血管進行生長、增殖或轉移的細胞所介導的癌癥，諸如 (例如)濕性AMD的眼病和諸如(例如)類風濕性關節炎、牛皮癬、硬皮病、慢性阻塞性肺病 (COPD)、或哮喘的炎性病癥。如本文所用的，“阻斷結合”或“競爭結合”的能力指抗體或抗原結合片段將兩分 子間的結合相互作用抑制到任何可檢測程度的能力。在某些實施方式中，阻斷兩分子間結 合的抗體或抗原結合片段將兩分子間的結合相互作用抑制了至少50%。在某些實施方式 中，該抑制可以大于60%，在某些實施方式中大于70%，在某些實施方式中大于80%，在 某些實施方式中大于90%。在某些實施方式中，被抑制的結合相互作用可以是貝伐單抗對 hVEGF165的結合相互作用。在某些其他實施方式中，被抑制的相互作用可以是hVEGF165或任 何其他VEGF配體對VEGF-Rl和/或VEGF-R2的結合相互作用。完全人VEGF抗體和抗原結合片段相對于鼠抗體、嵌合抗體、或人源化抗體，完全人抗體在安全和效力方面具有幾個 潛在優勢。第一，它們缺少非人殘基使得給予完全人抗體后產生宿主免疫應答的可能性較小。第二，完全人抗體通常比其他抗體類型表現出較低的清除率。這種降低的清除率允許 使用較低的劑量和頻率。本文提供了抗-hVEGF抗體及其抗原結合片段，其特征在于具有優良的體內抗腫 瘤活性。由于與開發具有優良體外抗原結合特征(作為Kd的函數)以及優良體內生物學 作用的抗體有關的不確定性，這代表了意想不到和驚人的發現。事實上，眾所周知，對VEGF 具有特別高的體外結合親合力的抗體不一定具有高體內效力(Liang2006)。因此，對具有高 體內效力的抗體如本文所公開的那些的鑒別是高度不可預知的并且需要廣泛的科學實驗。本文公開了完全人親本抗體XPA. 10. 064和XPA. 072，兩者均與hVEGF165特異結合。 如以下所討論的，該親本XPA. 10. 064抗體為親合力成熟的從而產生具有高體內效力的抗 體。通過用hVEGF165淘選噬菌體展示scFv文庫而鑒別出XPA. 10. 064和XPA. 10. 072。以下 示出了 XPA. 10. 072的重鏈和輕鏈可變區序列并分別在SEQ IDNO 2和3中表示，以下還示 出了 XPA. 10. 064的重鏈和輕鏈可變區序列并分別在SEQ ID NO 4和5中表示。如在SEQ ID NO 2和4中分別所示的，XPA. 10. 072和XPA. 10. 064重鏈可變區在殘基31-35 (HCDR1， SEQ ID NO 6) ,50-66 (HCDR2, SEQ ID NO 7)和 99-108 (HCDR3，SEQ ID NO 8)處含有 CDR。 如在SEQ ID NO 3中所示的XPA. 10. 072輕鏈可變區在殘基26-35 (LCDR1，SEQ ID NO 9)、 51-57 (LCDR2, SEQ ID NO 10)和 90-100 (LCDR3，SEQ IDNO 11)處含有 CDR。如在 SEQ ID NO :5 中所示的XPA. 10. 064輕鏈可變區在殘基23-35 (LCDR1，SEQ ID NO :12)、51_57 (LCDR2， SEQ ID NO 13)和 90-100 (LCDR3，SEQ ID NO 14)處含有 CDR。成熟XPA. 10. 072和XPA. 10. 064重鏈和輕鏈的氨基酸序列(缺少信號序列)(⑶R 加下劃線)XPA. 10. 072 重鏈RLQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWARQAPGQGLEffMGfflNPYSGGTNFPREFQGRVT MTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDHRIVGGLDYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :2)。XPA. 10. 072 輕鏈QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNLGSNFVYffYQQLPGTAPKLLIYRNHQRPSGVPDRFSGSKSG TSASLAISGLRSEDEADYYCASffDDSLRYYYFGGGTKLTVL(SEQ ID NO :3)。XPA. 10. 064 重鏈EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEffMGfflNPYSGGTNFPREFQGRVT MTRDTSYNTYYMELTRLTSDDTSYYYCARDHRIYGGLDYffGQGTLYTYS S(SEQ ID NQ 4) XPA. 10. 064 輕鏈SYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYffYQQLPGTAPKLLIYRNDQRPSGVPDRFSGSKSG TSASLAISGLRSEDEADYYCATffDDSLSGYYFGGGTKYTVL(SEQ ID NO :5)。根據XPA. 10. 064和XPA. 10. 072scFv在ELISA中以高親和力結合hVEGF165的能力 和抑制hVEGF165結合VEGF-Rl和VEGF-R2的能力，選擇向scFv-Fc和IgG2轉化的抗體以進行 其他功能研究。如通過Biacore分析所確定的，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072scFv-Fc和IgG2 均對hVEGF165顯示出相似的高結合親合力。兩種抗體還都與hVEGF121結合。XPA. 10. 064和 XPA. 10. 072IgG2 對 mVEGF165 僅表現出弱結合。XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072IgG2 對 hVEGF165 的結合親合力分別為1.24-1.71nM和1. 66-1. 7nM。Biacore分析還揭示XPA. 10. 064和 XPA. 10. 072IgG2阻斷hVEGF165與VEGF-Rl和VEGF-R2的結合至與在貝伐單抗中所觀察到的類似程度。通過ELISA實驗確認了 XPA. 10. 064和XPA. 10. 072抑制VEGF信號轉導的能力， 表明這兩種抗體均抑制hVEGF165誘導的VEGF-R2磷酸化。表位分析表明，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072與hVEGF165上的線性表位結合，而且 這些表位可以與貝伐單抗所結合的表位至少部分重疊。免疫組織化學分析揭示，與貝伐 單抗不同，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072均表現出寬范圍的組織交叉反應性。這兩種抗體均 抑制HUVEC增殖，并且均抑制體內血管生成和腫瘤生長。表1中列出了對XPA. 10. 064和 XPA. 10. 072特性的總結。表1 :XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 特性總結   為了產生具有改善的結合和效力的完全人抗體的誘變形式，在XPA. 10.064的重 鏈⑶R上進行親合力成熟。通過對五個氨基酸區段的XPA. 10.064HCDR3進行隨機誘變處理 而生成抗體文庫，并使用噬菌體展示技術針對與hVEGF165的結合篩選該文庫。以下示出了五 種親合力成熟的 IgG(XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10)的 HCDR3 序列，并分別在 SEQ ID NO :15_19 中表示。XPA. 10. 064. 03:DQMVHGGLDY(SEQ ID NO15)。
            
XPA. 10. 064. 04:DEMQNGGLDY(SEQ ID NO16)。
            
XPA. 10. 064. 06:DEMTRGGLDY(SEQ ID NO17)。
            
XPA. 10. 064. 07:DEMHVGGLDY(SEQ ID NO18)。
            
XPA. 10. 064. 10=DEMVffGGLDY(SEQ ID NO19)。
            
如通過Biacore分析所確定的，每個XPA. 10. 064親合力成熟的克隆體與hVEGF:
            
結合的親合力比親本XPA. 10. 064抗體或貝伐單抗的親合力高，并且對mVEGF165僅表現出弱 結合。親合力成熟的克隆體還表現出比親本XPA. 10. 064對HUVEC增殖更大程度抑制的能 力。另外，以低至0. lmg/kg的劑量，XPA. 10. 064. 06在橫紋肌肉瘤腫瘤生長模型中表現出 比貝伐單抗對體內腫瘤生長更大程度抑制的能力。以0. lmg/kg和0. 5mg/kg的劑量給予 XPA. 10. 064. 06后，腫瘤生長抑制百分率與以至少高五倍的劑量給予貝伐單抗時所獲得的 百分率大致相同。當以相同劑量給予時，XPA. 10. 064. 06將腫瘤生長抑制在特定尺寸的持 續時間比貝伐單抗至少長二至三倍。如以上所討論的，由于VEGF抗體親合力的升高不必 定與降低體內腫瘤生長的效力的提高相關，因此這種體內效力的提高是出乎意外的(Liang 2006)。 在某些實施方式中，本文提供了抗體和抗原結合片段，其包含如分別在SEQ ID NO  15-19 中示出的 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 或XPA. 10.064. 10的HCDR3序列。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合片段可 以進一步包含分別在SEQ ID NO :6和7中示出的XPA. 10. 064的HCDRl (GHYIH)和/或 HCDR2 (WINPYSGGTNFPREFQG)序列。在某些實施方式中，本文所提供的抗體或抗原結合片 段包含以下提出且分別在SEQ ID NO :20-24中示出的XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、 XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07或XPA. 10. 064. 10的重鏈可變序列。在某些實施方式中， 該抗體或抗原結合片段進一步包含一個或多個在SEQ ID NO  12-14中示出的XPA. 10. 064 的LCDR序列。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合片段包含在SEQ ID NO 5 中示出的XPA. 10. 064的輕鏈可變序列。在某些實施方式中，本文還公開了抗體及其抗 原結合片段，其與親合力成熟的抗體XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、 XPA. 10. 064. 07或XPA. 10. 064. 10所結合的相同表位結合。以下示出了成熟親合力成熟的 XPA. 10. 064重鏈的氨基酸序列(缺少信號序列)并在SEQ ID NO 20~24中表示(用下劃 線表示CRD)
            
XPA. 10. 064. 03 EVQIVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEffMGfflNPYSGGTNFPREFQGRVT MTRDTSYNTYYMELTRLTSDDTSYYYCARDQMYHGGLDYffGQGTLYTYSS(SEQ ID NO :20)。XPA. 10. 064. 04 EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEffMGfflNPYSGGTNFPREFQGRVT MTRDTSYNTYYMELTRLTSDDTSYYYCARDEMQNGGLDYffGQGTLYTYS S(SEQ ID NO :21)。XPA. 10. 064. 06 EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLE麗GWINPYSGGTNFPREFQGRVT MTRDTSYNTYYMELTRLTSDDTSYYYCARDEMTRGGLDYffGQGTLYTYSS(SEQ ID NO :22)。XPA. 10. 064. 07 EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEffMGfflNPYSGGTNFPREFQGRVT MTRDTSYNTYYMELTRLTSDDTSYYYCARDEMHYGGLDYffGQGTLYTYSS(SEQ ID NO :23)。XPA. 10. 064. 10 EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEffMGfflNPYSGGTNFPREFQGRVT MTRDTSYNTYYMELTRLTSDDTSYYYCARDEMYffGGLDYffGQGTLYTYS S (SEQ ID NO :24)。CDR 加下劃線。在某些實施方式中，本文所提供的抗體和抗原結合片段包含分別在SEQ ID NO 17 和18中示出的XPA. 10. 064. 06或XPA. 10. 064. 07的HCDR3序列。在這些實施方式的某些 中，該抗體或抗原結合片段可以進一步包含分別在SEQ ID NO 6和7中示出的XPA. 10. 064 的H⑶Rl和/或HCDR2序列。在某些實施方式中，本文所提供的抗體或抗原結合片段包含 分別在SEQ ID NO :22和23中示出的XPA. 10. 064. 06或XPA. 10. 064. 07的重鏈可變序列。 在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段進一步包含一個或多個在SEQ ID N0:12-14中 示出的XPA. 10. 064的LCDR序列。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合片段包含 在SEQ ID NO :5中示出的XPA. 10. 064的輕鏈可變序列。在某些實施方式中，本文提供了抗體或其抗原結合片段，其特異地與VEGF結合并 具有下列一種或多種性能⑴對hVEGF165的Kd為約即與親合力成熟的XPA. 10. 064 抗體 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 所表現出的平均Kd類似)；⑵對hVEGF165的ka為約1. 89 X IO5 (即與親合力成熟的抗 體 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 所表現出的平均ka類似)；(3)對hVEGF165的kd為約1. 73 X 10_5 (即與親合力成熟的抗 體 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 所表現出的平均kd類似)；(4)對hVEGF165的結合親合力(作為Kd的函數)比貝伐單 抗(即約4. 25 X 10,)大的程度與親合力成熟抗體XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、 XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 對 hVEGF165 的結合親合力比貝伐單抗 大的程度大致相同；(5)抑制HUVEC細胞增殖的能力所具有的IC5tl為約154pM(即與親合 力成熟抗體 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 所表現出 的平均IC5tl類似)；(6)抑制HUVEC細胞增殖的能力所具有的IC5tl為貝伐單抗的約56% ； (7)對hVEGF165的Kd為從約1. 97X 10_10M至約3. 49X IiT11M之間(即在親合力成熟抗體 XPA. 10. 064. 03,XPA. 10. 064. 04,XPA. 10. 064. 06,XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 所表現
            
26出的范圍內)；⑶對hVEGF165的ka為從約1. 5X IO5至約2. 16X105之間(即在親合力成 熟抗體 XPA. 10. 064. 03,XPA. 10. 064. 04,XPA. 10. 064. 06,XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 所表現出的范圍之內)；(9)對hVEGF165的kd為從約6. 65 ΧΙΟ"6至約2. 94X 10_5之間(即 在親合力成熟抗體 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10所表現出的范圍之內)；(10)抑制HUVEC細胞增殖的能力所具有的IC50 為從約129pM至約174pM之間(即在親合力成熟抗體XPA. 10.064.03、XPA. 10.064.06、 XPA. 10. 064. 07和XPA. 10. 064. 10所表現出的范圍之內)；(11)對hVEGF165的結合親合力比 該抗體或抗原結合片段對mVEGF165的結合親合力大至少約10倍；和(12)與貝伐單抗競爭 與hVEGF165結合的能力。本文還提供了包含本文所公開的一個或多個抗體或抗原結合片段及其一個或多 個VEGF配體或抗原片段的復合體。這些復合體可以在體外或體內形成。例如，在某些實施 方式中，這樣的復合體可以在向受試者給予如本文所公開的抗體或抗原結合片段并且該抗 體或抗原結合片段在該受試者體內與VEGF結合時形成。通過對XPA. 10. 064HCDR3進行隨機誘變以及隨后的結合和功能測定，產生了 如本文所提供的親合力成熟抗體XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、 XPA. 10. 064. 07和XPA. 10. 064. 10。在某些實施方式中，可以用另一種氨基酸殘基例如丙氨 酸、賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或亮氨酸殘基取代XPA. 10. 064. 06HCDR3中的蛋氨酸殘基。在 SEQ ID N0:25-29中示出了這樣突變的HCDR3序列的實例。因此，在某些實施方式中，提供 了包含在SEQ ID N0:25-29的任一個中所示的HCDR3序列的抗體和抗原結合片段。在這些 實施方式的某些中，抗體或抗原結合片段可以進一步包含分別在SEQID NO :6和7中所示的 XPA. 10. 064的HCDRl和/或HCDR2序列。在某些實施方式中，抗體或抗原結合片段可以進 一步包含一個或多個在SEQ ID NO  12-14中所示的XPA. 10. 064的IXDR序列。在這些實施 方式的某些中，抗體或抗原結合片段可以包含在SEQ ID NO :5中所示的XPA. 10. 064的輕鏈 可變序列。在某些實施方式中，通過對XPA. 10. 064HCDR1、HCDR2、LCDRl、LCDR2 和 / 或 LCDR3 的一個或多個殘基進行誘變處理而產生了親本抗體XPA. 10. 064的其他親合力成熟形式。 因此，在某些實施方式中，提供了包含XPA. 10. 064的一個或多個⑶R序列的抗體和抗原結 合片段，其中該一個或多個CDR序列包含一個或多個氨基酸取代。為了鑒別具有改善的結 合特性的親合力成熟抗體，可以對以這種方式產生的抗體和抗原結合片段與hVEGF165的結 合進行篩選。可以對具有有利結合特性的抗體進行一種或多種功能測定以確定它們的例如 抑制HUVEC增殖、血管生成、腫瘤生長和/或hVEGF165誘導的VEGF-R2磷酸化的能力。在某些實施方式中，本文所提供的抗體或抗原結合片段結合hVEGF165的親合力比 貝伐單抗對hVEGF165的大。例如，在某些實施方式中，本文所提供的抗體或抗原結合片段 結合hVEGF165的&為< 500pM。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合片段結合 hVEGF165的Kd為彡200pM，在其他實施方式中為彡150pM，在其他實施方式中為彡ΙΟΟρΜ，而 在其他實施方式中為< 50pM。在某些實施方式中，本文所提供的抗體和抗原結合片段對HiVEGF165未表現出可檢 測的結合親合力或表現出弱的結合親合力。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合 片段對HiVEGF165所表現出的Kd為>約ΙΟΟηΜ。在某些實施方式中，抗體和抗原結合片段對
            
27hVEGF165所表現出的結合親合力比該抗體和抗原結合片段對mVEGF165的結合親合力大至少 10倍(例如，大20倍、30倍或40倍)。在這些實施方式的某些中，抗體或抗原結合片段對 hVEGF165的結合親合力比該抗體或抗原結合片段對mVEGF165的結合親合力大至少50倍(例 如，大60倍、70倍、80倍或90倍)，而在某些實施方式中大至少100倍(例如，大110倍、 120 倍、150 倍、175 倍、200 倍、250 倍、300 倍、400 倍或 500 倍)。根據它們對hVEGF165和hVEGFm的高結合親合力以及它們阻斷VEGF與VEGF-Rl和 VEGF-R2結合及VEGF誘導的受體磷酸化的能力，本文所提供的抗體和抗原結合片段可以用 于抑制VEGF信號轉導。在此基礎上，該抗體和抗原結合片段可以用于治療與VEGF表達和 /或信號轉導有關的各種病癥。已發現本文所提供的抗體和抗原結合片段抑制HUVEC增殖并抑制血管生成。因 此，該抗體和抗原結合片段可以用于治療與血管生成增加有關的各種病癥。例如，該抗體和 抗原結合片段可以通過抑制腫瘤位點的血管增殖并因此抑制腫瘤生長而用于治療癌癥。同 樣地，該抗體和抗原結合片段可以通過破壞腫瘤位點的血管從而導致腫瘤壞死而用于治療 癌癥。已在體內確認了本文所公開的抗體和抗原結合片段治療癌癥的效力。在某些實施方式中，本文所提供的抗體和抗原結合片段抑制血管生成和/或腫瘤 生長的水平與貝伐單抗類似或比貝伐單抗高。在體內A673橫紋肌肉瘤腫瘤生長抑制實驗 中，在所有測試的劑量，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072抑制腫瘤生長的程度與貝伐單抗類似或 比貝伐單抗高。親合力成熟抗體XPA. 10. 064. 06對腫瘤生長的抑制比貝伐單抗更有效。作 為腫瘤生長抑制百分率的函數，XPA. 10. 064. 06在減少腫瘤生長方面的有效性比貝伐單抗 高約五倍。同樣地，當以相同劑量給予抗體時，XPA. 10. 064. 06延緩腫瘤生長至特定尺寸的 持續時間明顯長于貝伐單抗。因此，在某些實施方式中，當以相同或相似劑量給予時，本文 公開的抗體和抗原結合片段對通過腫瘤生長抑制百分率或腫瘤生長延緩持續時間所測量 的腫瘤生長抑制的有效性至少是貝伐單抗的兩倍。在這些實施方式的某些中，本文公開的 抗體和抗原結合片段抑制腫瘤生長的有效性至少是貝伐單抗的三倍，而在其他實施方式中 至少是貝伐單抗的四倍，而在其他實施方式中至少是貝伐單抗的五倍，而在其他實施方式 中至少是貝伐單抗的五倍以上。同樣地，在某些實施方式中，當以低于貝伐單抗的劑量給予 時，本文公開的抗體和抗原結合片段對腫瘤生長的抑制程度大致等于或大于貝伐單抗的抑 制程度。在這些實施方式的某些中，當以貝伐單抗劑量的一半給予時，而在其他實施方式中 以貝伐單抗劑量的三分之一給予，而在其他實施方式中以貝伐單抗劑量的四分之一給予， 而在其他實施方式中以貝伐單抗劑量的五分之一給予，本文公開的抗體和抗原結合片段對 腫瘤生長的抑制程度大致等于或大于貝伐單抗的抑制程度。與貝伐單抗相比，本文所提供 的抗體和抗原結合片段可以表現出類似或改善的藥物動力學(PK)性能。例如，與貝伐單抗 相比，該抗體或抗原結合片段可以表現出提高的循環半衰期或降低的免疫原性。在某些實 施方式中，其中相對于貝伐單抗，該抗體或抗原結合片段表現出類似或改善的藥物動力學 性質，該抗體或抗原結合片段可以以比貝伐單抗更長的時間間隔給予而不表現出與貝伐單 抗給予間隔增長有關的負面影響。本文所公開的抗體和抗原結合片段可以用于治療與至少部分受VEGF信號轉導 控制的異常血管生成有關的任何病癥。這些病癥，通常與VEGF表達水平升高有關，包括 與血管生成增加有關的眼病，如濕性AMD或增殖性視網膜病如糖尿病性視網膜病、糖尿
            
28病性腎病以及其他糖尿病血管增殖性疾病、囊性纖維化和各種腫瘤類型(Amoroso 1997； McColley 2000 ；Khamaisi 2003)。可以使用本文公開的抗體或抗原結合片段治療的癌性病癥和腫瘤類型包括，但不 限于，惡性腫瘤、胚細胞瘤、肉瘤、生殖細胞腫瘤或血液或淋巴惡性腫瘤，如白血病、淋巴瘤 或多發性骨髓瘤。更具體地，可以使用本文公開的抗體治療的癌性病癥和腫瘤類型包括， 但不限于，鱗狀細胞癌、肺癌(例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌或肺鱗狀 細胞癌)、腹膜癌、肝癌(例如、肝細胞癌/肝瘤)、胃癌(例如，胃腸癌)、胰癌、腦腫瘤(例 如，成膠質細胞瘤/多形性成膠質細胞瘤(GBM)、非成膠質細胞瘤腦腫瘤或腦膜瘤)、神經膠 質瘤(例如，室管膜瘤、星形細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤、少突神經膠質瘤、或如少突星形 細胞瘤的混合性膠質細胞瘤)、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(例如，肝胚細胞瘤、肝細胞癌/肝細 胞瘤或肝部癌)、膀胱癌(例如，尿道癌)、乳腺癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、子宮內膜癌 或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(例如，腎臟桿狀腫瘤)、前列腺癌、外陰癌、陰莖癌、肛門癌(例 如，肛門鱗狀細胞癌)、甲狀腺癌、頭部和頸部癌(例如，鼻咽癌)、皮膚癌(例如，黑素瘤或 鱗狀細胞癌)、骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’ ssarcoma)、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤(例如，橫紋肌 肉瘤、纖維肉瘤、皮膚多發性出血性肉瘤)、類癌性癌、眼癌(例如，成視網膜細胞瘤)、間皮 瘤(mesothelioma)、淋巴細胞/成淋巴細胞白血病(例如，T細胞譜系和B細胞前體譜系的 急性淋巴細胞/成淋巴細胞白血病(ALL)、慢性成淋巴細胞/淋巴細胞白血病(CLL)、急性 骨髓性/成髓細胞白血病(AML)，其包括肥大細胞白血病、慢性骨髓性/骨髓細胞/成髓細 胞白血病(CML)、毛細胞白血病(HCL)、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、非霍奇金氏淋巴 瘤、慢性單核細胞白血病(CMML)、濾泡性淋巴瘤(FL)、彌漫型大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套 細胞淋巴瘤(MCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’ s lymphoma, BL)、蕈狀真菌病、賽謝綜合征 (Sezary syndrome)、皮膚T細胞淋巴瘤、肥大細胞贅生物、成神經管細胞瘤、腎胚細胞瘤、孤 立性漿細胞瘤(solitary plasmacytoma)、脊髓發育不良綜合征、慢性和非慢性骨髓增生性 疾病、中樞神經系統腫瘤、垂體腺瘤、前庭許旺氏細胞瘤(vestibular schwannoma)、原發性 神經外胚層腫瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、脾大性紅細胞增多、血小板增多、自發骨髓纖 維化和小兒癌癥，如小兒肉瘤(例如，成神經細胞瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤)。另外，腫瘤可 以是惡性的(例如，癌)或良性的(例如，增生、囊腫、擬孢囊、錯構瘤(hamartoma)和良性 贅生物)。可以使用本文公開的抗體或抗原結合片段治療的腫瘤類型還包括與特定生物標 記有關的癌。例如，生物標記包括，但不限于，希林二氏(von Hippel-Lindau, VHL)腫瘤抑 制基因中的突變和/或缺氧誘導因子-Ia (HIF-Ia)的過表達。在某些實施方式中，這些 抗體可用于治療顯示為VHL腫瘤抑制基因突變的癌。VHL基因中的突變導致缺氧誘導轉錄 因子Ia和2α的組成穩定化，該轉錄因子Ια和2α與VEGF基因中的增強子元件結合并 刺激血管生成(HarridOOO)。可以使用本文所公開的抗體治療的VHL突變腫瘤類型包括， 例如，中樞神經系統成血管細胞瘤、視網膜成血管細胞瘤、內淋巴囊腫瘤(endolymphatic sac tumor)、腎透明細胞癌和/或腎囊腫、嗜鉻細胞瘤、胰腺囊腫、神經內分泌腫瘤和附睪 以及闊韌帶囊腺瘤。通過已知方法，如使用突變特異的巢式反轉錄聚合酶鏈反應或巢式單 鏈構象多態性分析的分子檢測(Ashida 2003)，首先對受試者進行VHL基因突變存在性的 選擇或篩選。然后對所鑒別的受試者用本文公開的抗體或抗原結合片段進行治療。在其
            
29他實施方式中，這些抗體可用于治療受試者中顯示HIF-I α過表達的癌癥。可以通過組織 活檢(例如，腦、胸、子宮頸、食道、口咽、卵巢和前列腺組織)檢查HIF-I α的過表達。選 擇所鑒別的受試者并用這些抗體或抗原結合片段進行治療，或用這些抗體或抗原結合片段 聯合HIF-I α抑制劑進行治療，該抑制劑如2-甲氧雌甾二醇、4-0-methylsarcemeol、三白 脂素 A(manassantin A)、三白脂素 B 1、NSC-134754、NSC-643735、拓撲替康(topotecan)、 SCH66336、PX-478、R115777、西妥昔單抗(Cetuximab)、103D5R 和 NSAID (Kimbro 2006)。本 文提供了選擇使用本文公開的抗體或抗原結合片段治療的受試者的方法，如果觀察到受試 者具有一種或多種如上所討論的生物標記(例如，VHL基因突變)，和任選地，用該抗體或抗 體結合片段治療該受試者的方法。可以使用本文的抗體和抗原結合片段治療的其他疾病包括炎性病癥如類風濕性 關節炎、牛皮癬、硬皮病、慢性阻塞性肺病和哮喘。在某些實施方式中，本文所提供的抗體或 抗原結合片段可以用于治療已對貝伐單抗的治療有抗藥性的疾病。可以在各種非治療性用途中使用本文所提供的抗體和抗原結合片段。在某些實施 方式中，該抗體或抗原結合片段可以用作親合性純化試劑用于純化hVEGF165、其他VEGF亞 型或其片段。在這些實施方式中，可以使用本領域已知的方法將該抗體或抗原結合片段固 定至固相，如樹脂或濾紙上。抗體或抗原結合片段還可以用于使hVEGF165、其他VEGF亞型或 其片段從溶液中沉淀出來。在其他非治療性實施方式中，抗體或抗原結合片段可以在各種 體外或體內診斷或檢測應用中使用。在這些實施方式的某些中，抗體或抗原結合片段可以 與可檢測標記物軛合。在其他實施方式中，抗體或抗原結合片段可以不與可檢測標記物軛 合，但是可以使用與該抗體結合的標記第二抗體進行檢測。在某些實施方式中，本文公開的 抗體或抗原結合片段可以用于檢測hVEGF165的表達。在這些實施方式的某些中，該抗體或抗 原結合片段可以用于診斷與hVEGF165表達升高有關的病癥。例如，該抗體或抗原結合片段 可以與來自受試者的生物樣本接觸以診斷與受試者中hVEGF165表達升高有關的病癥。同樣 地，可以直接向受試者給予該抗體或抗原結合片段，并用本領域已知的方法檢測與hVEGF165 的結合。突變表位結合研究表明，本文公開的抗體和抗原結合片段可以結合VEGF上的線 性表位，這些線性表位可以與貝伐單抗所識別的表位至少部分重疊。因此，在某些實施方式 中，本文公開的抗體或抗原結合片段可以結合至由hVEGF165的殘基79-94(SEQ ID N0:1)組 成或包含這些殘基的表位。同樣地，抗體或抗原結合片段可以結合完全或部分與對應于SEQ ID NO :1的殘基79-94的序列重疊的表位。在某些實施方式中，本文公開的抗體或抗原結 合片段競爭性地抑制貝伐單抗與hVEGF165的結合。本文提供的抗體或抗原結合片段可以在人類中具有與貝伐單抗相似或比貝伐單 抗高的終末半衰期(t1/2)，其中貝伐單抗的終末半衰期為17-21天(Ferrara 2004)。例如， 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段可以具有的終末半衰期為約21天、28 天、35天或60天。終末半衰期，其是指所給予抗體的血漿濃度降低一半所需的時間，可以使 用本領域已知的方法計算。在某些實施方式中，本文所公開的抗體或抗原結合片段的終末 半衰期可以為至少17天。在某些其他實施方式中，它可以為17-21天，而在這些實施方式 的某些中，它可以大于21天。本文公開的抗原結合片段可以包含抗體的一個或多個片段，例如Fab、Fab’、
            
30F(ab' )2、Fv或scFv片段。可以使用本領域公知的方法從抗體中產生這些片段，例如用酶 進行蛋白水解裂解以產生Fab片段(使用木瓜蛋白酶)或F(ab’)2片段(使用胃蛋白酶)。 在某些實施方式中，本文公開的抗體或抗原結合片段可以包含來自接枝到一個或多個人框 架區的SEQ ID NO 2-5或20-24的一個或多個CDR。本文公開的抗體或抗原結合片段可以單獨給予或聯合一種或多種其他治療劑給 予。例如，可以聯合化學療法、放射療法、用于治療癌癥的外科手術(例如，腫瘤切除術)，用 于由化學療法引起的并發癥的一種或多種止吐藥或其他治療方法，或用于在治療癌癥或由 升高的VEGF表達和/或信號轉導所介導的任何醫學疾病中使用的任何其他治療劑，給予本 文公開的抗體或抗原結合片段用于治療癌癥。在這些實施方式的某些中，聯合一種或多種 其他治療劑給予的本文所公開的抗體或抗原結合片段可以與該一種或多種其他治療劑同 時給予，在這些實施方式的某些中，該抗體或抗原結合片段以及其他治療劑可以作為相同 藥物組合物的部分給予。然而，“聯合”另一種治療劑給予的抗體或抗原結合片段不必須與 該試劑或在相同組合物中同時給予。如本文所用的短語，認為在另一種試劑之前或之后給 予抗體或抗原結合片段為“聯合”該試劑給予，即使該抗體或抗原結合片段與第二試劑是通 過不同途徑給予的。如果可能，按照該其他治療劑的產品信息單上所列的時間表或按照“醫
            
2003 (Physicians' Desk Reference 2003, Physicians’ DeskReference, 57th Ed ；Medical Economics Company ； ISBN  1563634457 ；57th edition (November 2002)) "^； 本領域中公知的方案聯合本文公開的抗體或抗原結合片段給予的該其他治療劑。本領域的技術人員將認識到，可以將多種軛合物連接到本文提供的抗體或抗原 結合片段上(參見，例如"Conjugate Vaccines，，，Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds)，Carger Press，New York，(1989))。這 些軛合物可以通過共價結合、親合結合、插入、配位結合、絡合、締合、混合或加入以及其它 方法連接到該抗體或抗原結合片段。在某些實施方式中，本文公開的抗體和抗原結合片段 可以改造成包含表位結合部分之外的特異位點，其可以用于與一個或多個軛合物結合。例 如，這樣的位點可以包含一個或多個反應性氨基酸殘基，例如半胱氨酸或組氨酸殘基，以有 利于共價連接至軛合物。在某些實施方式中，抗體可以間接地或通過另一軛合物連接至軛 合物。例如，抗體或抗原結合片段可以軛合至生物素，然后間接地軛合至與抗生物素蛋白軛 合的第二軛合物。在某些實施方式中，連接至本文公開的抗體或抗原結合片段上的軛合物可以包含 旨在改變該抗體或抗原結合片段的一種或多種藥物動力學(PK)性能的一種或多種試劑， 例如聚乙二醇(PEG)，以增大該抗體或抗原結合片段的半衰期或降低其免疫原性(見，例 如，Katre 1990)。在某些實施方式中，連接到本文公開的抗體或抗原結合片段的軛合物可以包含一 種或多種可檢測標記物。這樣的標記物包括，但不限于，放射性同位素，如1231、1241、1251、1311、 35S、3H、mIn、112In、14C、64CU、67CU、86Y、88Y、9°Y、177LU、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi 和 32p ；其他鑭 系元素；發光標記物；熒光標記物，例如熒光素、羅丹明、丹磺酰(dansyl)、藻紅蛋白或得克 薩斯紅(Texas Red)；和酶-底物標記物，例如辣根過氧化酶、堿性磷酸酶或β _D_半乳糖 苷酶。在某些實施方式中，提供了包含與一種或多種細胞因子連接或聯合的本文所公
            
31開的抗體或抗原結合片段的組合物，該細胞因子包括作為細胞間介體在細胞上起作用的 蛋白質。細胞因子的實例包括，但不限于，淋巴因子、單核因子、人生長激素、N-甲硫氨酰 人生長激素、牛生長激素、甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松弛素、松弛素原 (prorelaxin)、促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、促黃體生成激素(LH)、肝生長因 子、成纖維細胞生長因子、促乳泌素、胎盤催乳質、腫瘤壞死因子α和β、苗勒抑制物質 (mullerian-inhibiting substance)、小鼠促性腺激素關聯肽、抑制素、活化素、整合素、促 血小板生成素(TPO)、神經生長因子如NGF-β、血小板生長因子、轉化生長因子如TGF-α 和TGF-β、胰島素樣生長因子I和II、促紅細胞生成素(EPO)、成骨因子、干擾素如干擾 素-α、-β和-Y、集落刺激因子如巨噬細胞-CSF、粒性白細胞巨噬細胞CSF和粒性白細 胞-CSF、白細胞介素如 IL-U IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-10、IL-11和IL-12、腫瘤壞死因子如TNF-α和TNF-β以及其他多肽因子。可以聯合任 何細胞因子，包括任何以上列出的那些細胞因子，提供和/或給予本文公開的抗體或抗原 結合片段。在某些實施方式中，提供了包含連接或聯合一種或多種化療劑的本文所 公開的一種或多種抗體或抗原結合片段的組合物。化療劑的實例包括，但不限于， ALT-110, AMN-107(尼羅替尼(Nilotinib))、氨柔比星(amrubicin)、ARQ-197、阿曲生 坦(atrasentan) ( Xinlay  )、AV-299、AZD 1152、AZD 2171、巴他布林(batabulin)、 BI0-111、BI0-140、骨化三醇(calcitriol)、CC 8490、西倉吉肽(cilengitide)、達沙 替尼(dasatinib)、迪卡他尼(decatanib)、DN-101、艾特咔林(edotecarin)、因扎托雷 (enzastaurin)、厄洛替尼(erlotinib)、依維莫司(everolimus)、吉馬替康(gimatecan)、 棉酚(gossypol)(例如，醋酸棉酚)、GSK461364、GSK690693、IL13-PE38QQR、IN01001、 IPdR、普利木單抗、KRX-0402、L印-etu、羅那法尼(Ionafamib)、硫蒽酮(Iucanthone)、 LY 317615、MK-0457、MLN8054、neuradiab、諾拉曲特(nolatrexed)、奧利默森 (oblimersen)、奧法木單抗(ofatumumab)、ON 0910. Na、奧戈伏單抗(oregovomab)、中白 木單抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、PHA-739358、R-763、RTA 744、盧比替康 (rubitecan)、Sdx 102、他倉帕奈(talampanel)、替西羅莫司(temsirolimus)、替米利芬 (tesmilifene)、粉防己堿(tetrandrine)、CTLA_4 單抗(ticilimumab)、TKI_258、TLK 286、 曲貝替定(trabectedin)、凡德他尼(vandetanib)、維特斯朋(vitespan)、Xr 311、扎木單 抗(zanolimumab)、131-I-TM-601和唑侖二膦酸鹽(zolendronate)、組氨瑞林、阿扎胞苷、 右雷佐生(dexrazoxane)、阿侖珠單抗、來拉度胺(lanalidomide)、吉妥珠單抗、酮康唑、氮 芥、替伊莫單抗、地西他濱、六甲三聚氰胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、棕櫚仁油酸 鹽(editronate)、環胞霉素、埃德溫-門冬酰胺酶(Edwina-asparaginase)和鍶89。在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合 romid印sin (—種組蛋白去乙酰化酶抑制劑)(Π(-228)，其具有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合ADS-100380，
            
其具有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合CG-781，其具
            
有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合CG-1521，其具
            
有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合SB-556629，其
            
具有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合厚膜素 (chlamydocin)，其具有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合 JNJ-16241199，其具有如下結構  
            
在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合以下化合物 
            
 
            
, 或在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合伏立諾他 (vorinostat) (SAHA)，其具有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合依托泊苷 (VP-16)，其具有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合吉西他濱，其
            
具有如下結構
            
在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合美國專利 No. 2004/0209878A1中公開的化合物，其中該化合物具有以下核心結構  在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至多柔比星 (Adriamycin )或與其聯合使用，包括Caelyx或Doxil  (多柔比星鹽酸脂質體注 射液；Ortho Biotech Products L. P.，Raritan, NJ)。Doxil 包含STEALTH 脂質 體載體攜帶的多柔比星，該脂質體載體由N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l，2-二硬脂 酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽(MPEG-DSPE)、完全氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)和膽固 醇組成。多柔比星具有以下結構  在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合5’ _脫氧-5-氟尿嘧啶，其具有如下結構 
            
 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合長春新堿，其
            
具有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合替莫唑胺 (methazolastone)，其具有如下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合CDK抑制劑， 如 ZK-304709 或 Seliciclib (R-細胞周期蛋白依賴激酶(R-roscovitine)、CYC-202)。 seliciclib具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合MEK抑制劑， 如 PD0325901 或 AZD-6244 (ARRY-142886)。PD0325901 具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合卡培他濱 (5’ -脫氧-5-氟-N-[(戊氧基)羰基]-胞啶)或培美曲塞(L-谷氨酸，N-[4-[2-(2-M 基-4，7- 二氫-4-氧代-IH-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]-二鈉鹽七水
            
合物)，其具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合喜樹堿 (camptothecin) (Beisler 1971 ；Stork 1971)。喜樹堿具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合伊立替康 (irinotecan)(作為CamptOSar 出售；Pharmacia&Upjohn Co. ；Kalamazoo,MI)；伊立替
            
康、5_氟尿嘧啶和亞葉酸的組合；或PEG-標記的伊立替康。伊立替康具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段聯合FOLFOX方案，該方案由 奧沙利鉬和灌注氟尿嘧啶以及亞葉酸組成(chaouche 2000 ；de Gramont 2000)。奧沙利鉬
            
具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合抗雌激素， 如他莫昔芬(tamoxifen)(作為Nolvadex 出售；AstraZeneca Pharmaceuticals LP; Wilmington DE)或托瑞米芬檸檬酸鹽(toremifene citrate)(作為Fareston  出售； Shire US, Inc, ；Florence，KY)。他莫昔芬具有以下結構  
            
來曲唑具有以下結構
            
依西美坦具有以下結構 托瑞米芬檸檬酸鹽具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合芳香酶抑制 劑，如阿那曲唑(作為Arimidex 出售；AstraZenecaPharmaceuticals LP ；WiImington DE)、依西美坦(exemestane)(作為 Aromasill  出售；Pharmacia Corporation ； Kalamazoo, MI)或來曲唑(作為 Femara  出售；Novartis Pharmaceuticals Corporation ；EastHanover，NJ)。阿那曲唑具有以下結構
            
HO
            
丨3
            
I3
            
CH
            
CH
            
.OCH2CH2N
            
CH2CI
            
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CH
            
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CN
            
-—H
            
42 瓦他拉尼具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合雌激素，如己 烯雌酚(diethylstibestrol) (DES)、雌二醇(作為Estrol 出售；Warner Chilcott, Inc.； Rockaway, NJ)或軛合雌激素(作為Premarin  出售；Wyeth Pharmaceuticals Inc., Philadelphia，ΡΑ)。己烯雌酚具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合抗血管增生 劑，如貝伐單抗、VEGFR-2抗體IMC-1C11、其他的VEGF-R抑制劑，如CHIR-258、瓦他拉尼 (vatalanib) (PTK/ZK ；CGP-79787 ；ZK-222584)、AG_013736、3-[5-(甲磺酰基哌啶甲基)_吲 哚基]-喹諾酮或VEGF捕獲(AVE-0005)，它是包含VEGF受體1和2部分的可溶性誘騙受 體。CHIR-258具有以下結構 AG-013736具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合具有下列專利 中所示核心結構的抗血管增生劑，W02004/13145    W000/71129  W02004/09601  W02004/0105  W001/29025    在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合黃體生成素釋 放激素(LHRH)或促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑，如醋酸瑞林(goserelin acetate) (作為Zoladex 出售；AstraZeneca UK Limited ；Macclesfield, England)、亮脯利特醋 Slife (leuprolide acetate) ( {^^jEligard ^^ ；Sanofi-Synthelabo Inc. ；New York, NY)或曲普瑞林雙羥萘酸鹽(triptorelin pamoate)(作為Trelstar 出售；Pharmacia Company, Kalamazoo MI)。醋酸性瑞林是[D-Ser(But)6，Azgly10] LHRH 的醋酸鹽，化學名為 pyro-Glu-His-Tr p-Ser-TYr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 醋酸鹽[C59H84N18O14C2H4O2) x，其中 χ = 1 至
            
2.4])。醋酸性瑞林的結構為
            
RJ
            
W002/32861
            
H4
            
Rl
            
(R4)t
            
ZN^^
            
R3 W003/88900
            
A"
            
, 和
            
46 亮脯利特醋酸鹽為LHRH的合成九肽，化學名稱為5_氧-L-脯氨酰-L-組氨 酰-L-色氨酰-L-絲氨酰-L-酪氨酰-D-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-N-乙基-L-脯氨
            
酰氨醋酸(鹽)。亮脯利特醋酸鹽的結構為 曲普瑞林雙羥萘酸鹽具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合舒尼替尼 (simitinib)或舒尼替尼蘋果酸鹽。舒尼替尼具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合孕激素劑 (progestational agent),如醋酸甲輕孕麗(作為 Provera  出售；Pharmacia&Upjohn Co. ；Kalamazoo，MI)、己酸羥孕酮(17_((1_氧代己基)氧)孕甾_4_烯_3，20-二酮))、甲
            
地孕酮或孕酮。
            
醋酸甲羥孕酮具有以下結構  在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合抗雄激素，如 比卡魯胺(bicalutamide)(作為 CASODEX  出售；AstraZeneca Pharmaceuticals LP ；Wilmington DE)、氟他胺(flutamide) (2-甲基-N-[-4-硝基 _3_(三氟甲基)苯 基]丙酰胺；作為 Eulexin  出售；Schering Corporation ；Kenilworth, NJ)、尼魯米在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合選擇性雌 激素受體調節劑(SERM)，如雷洛昔芬(作為Evista 出售；Eli Lilly and Company ； Indianapolis, IN)，其具有以下結構 己酸羥孕酮具有以下結構 
            
特(nilutamide)(作為 Nilandron  出售；Aventis Pharmaceuticals Inc. ；Kansas
            
City, MO)或醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(作為Megace 出售 ；Bristol-Myers
            
Squibb)。比卡魯胺具有以下結構 
            
在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合拮抗EGF受體 或HER2的作用的一種或多種抑制劑，如CP-724714、TAK_165(莫立替尼(mubritinib))、 HKI-272、0SI-774(厄洛替尼(erlotinib) ；Hidalgo 2001)、拉帕替尼(Iapatinib) (GW2016 ； Rusnak 2001 ；N-{3-氯-4-[ (3_ 氟代芐基)氧]苯基}-6-[5-({[2_(甲磺酰 基)乙基]氨基}甲基)-2_呋喃基]-4-喹唑啉胺；PCT專利申請TO99/35146)、卡紐替 尼(canertinib)(CI-1033 ；Erlichman 2001 ；Smaill 2000)、EKB-569(Wissner 2003)、 PKI-166(CGP-75166)、ABX_EGF 抗體(Abgenix, Inc.，Freemont，CA ；Yangl999 ；Yang 2001)、 愛必妥(erbitux) (IMC-C225、西妥昔單抗；美國專利申請 No. 6217866 ；Imclone,New York, NY)、Gff-572016或任何抗EGFR或抗-HER2抗體。CP-724714具有以下結構 TAK_165(莫立替尼)具有以下結構
            
HKI-272具有以下結構 0SI_774(厄洛替尼)具有以下結構  PKI-166具有以下結構 卡紐替尼具有以下結構  
            
EKB-569具有以下結構  在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合羅那法尼 或
            
(Ionafarnib)(作為Sarasar 出售；Schering-Plough，KeniIworth, NJ)，其結構如下 
            
 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合FPT抑制劑，
            
其具有以下結構
            
在其他實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合FPT抑制劑， 如 BMS-214662 (Hunt 2000 ；Dancey 2002 ； (R)-7-氰-2，3，4，5-四氫-1-(1H-咪唑-4-基 甲基)-3-(苯基甲基)-4-(2_噻吩酰基)-1Η-1，4-苯二氮雜草)或R155777(替吡法 尼(tipifamib) ；Garner2002 ；Dancey 2002 ； (B)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-IH-咪 唑-5-基)-甲基]-4-(3-氯苯基)-l-甲基-2(1H)-喹啉酮]；作為Zarnestra 出售； Johnson&Johnson，New Brunswick, NJ)。BMS-214662 具有以下結構 R155777具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合下列化合物， 包括氨磷汀(amfostine)、NVP-LAQ824(Atadja2004)、辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoyl analide hydroxamic acid)、丙戊酸(Michaelis 2004)、曲古菌素 A(trichostatin A)、 FK-228 (Furumai 2002)、SUl 1248 (Mendel 2003)、BAY43-9006 (索拉非尼(sorafenib))， KRN951、氨魯米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、阿那格雷(anagrelide)、 阿那曲唑(anastrozole)(作為Arimidex 出售；AstraZeneca Pharmaceuticals LP, Wilmington, DE)、門冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗(Garrido 1997)、博來霉素、布舍瑞 林(buserelin)、白消安(1，4-丁二醇二甲磺酸鹽；作為Busulfex  出售；ESP Pharma, Inc.，Edison, New Jersey)、沙鉬、卡鉬(作為 Paraplatin  出售 ；Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱(cladribine)、氯屈膦 酸(clodronate)、環磷酰胺、環丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素D、 柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、羥基脲、伊達比 星、異環磷酰胺、伊馬替尼(imatinib)(作為Gleevec 出售；NovartisPharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJ)、亞葉酸、亮脯利特(Ieuprolide)、左旋咪唑、洛莫司汀、 氮芥、美法侖(作為Alkeran 出售；Celgene Corporation, Warren, NJ)、巰嘌呤、美司 鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽(octreotide) (Katz 1989 ；
            
Sandostatin LAR  Depot 出* ；Novartis Pharm. Corp. ， E. Hanover, NJ)、|^貞 ft 肽(edotreotide) (yttrium-90標記的或未標記的)、奧沙利鉬(作為Eloxatin 出售； Sanofi-Synthelabo Inc.，New York，NY)、帕米膦酸(pamidronate)(作為Aredia 出售； Novartis Pharmaceuticals Corp.，East Hanover, NJ)、噴司他丁 (pentostatin)(作為 Nipent 出售；5叩6邙611，011131丨11丄4)、普卡霉素、卩卜吩姆(porfimer)(作為Photofrin  出售；Axcan ScandipharmInc. , Birmingham, AL)、丙卡巴餅(procarbazine)、雷替曲 塞(raltitrexed)、利妥昔單抗(作為 Rituxan  出售；Genentech，Inc. ；South San Francisco,CA)、鏈佐星(str印tozocin))、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、沙利度胺聯合地塞米 松、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、全反式視黃酸或13-順式-視黃酸。氨磷汀具有 以下結構 SU11248具有以下結構 BAY43-9006具有以下結構 KRN951具有以下結構 氨魯米特具有以下結構 安吖啶具有以下結構 阿那格雷具有以下結構 阿那曲唑具有以下結構
            
博來霉素具有以下結構 布舍瑞林具有以下結構 白消安具有以下結構  卡鉬具有以下結構卡莫司汀具有以下結構 苯丁酸氮芥具有以下結構 順鉬具有以下結構 克拉屈濱具有以下結構  氯屈膦酸具有以下結構 環磷酰胺具有以下結構 環丙孕酮具有以下結構  達卡巴嗪具有以下結構 放線菌素D具有以下結構 柔紅霉素具有以下結構
            
63阿糖胞苷具有以下結構
            
NH2
            
己烯雌酚具有以下結構 表柔比星具有以下結構氟達拉濱具有以下結構   
            
氟甲睪酮具有以下結構
            
氟他胺具有以下結構 
            
輕基脲具有以下結構
            
伊達比星具有以下結構
            
氟氫可的松具有以下結構  
            
異環磷酰胺具有以下結構    巰嘌呤具有以下結構 美司鈉具有以下結構 甲氨蝶呤具有以下結構 絲裂霉素具有以下結構  米托坦具有以下結構 米托蒽醌具有以下結構 
            
尼魯米特具有以下結構
            
奧曲肽(oactreotide)具有以下結構  
            
奧沙利鉬具有以下結構 普卡霉素具有以下結構 帕米膦酸具有以下結構 噴司他丁具有以下結構 卟吩姆具有以下結構 丙卡巴胼具有以下結構 雷替曲塞具有以下結構 鏈佐星具有以下結構 替尼泊苷具有以下結構 13-順式-視黃酸具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至abraxane (—種注射 用紫杉醇)或與其聯合使用。abraxane是包含紫杉醇的白蛋白結合形式的紫杉醇蛋白質 結合顆粒的可注射懸液，其平均粒度為約130納米。供應的abraxane為白色至黃色的無菌 凍干粉末，靜脈內注射前用20mL的0. 9%氯化鈉注射液(美國藥典)重新溶解。每個單次 使用小瓶包含IOOmg的紫杉醇和約900mg人白蛋白。每毫升(mL)重新溶解的懸液中含有 5mg紫杉醇。abraxane不含溶劑和克列莫佛(cremophor)(聚氧乙烯蓖麻油)。在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合以下化合物維A酸具有以下結構 長春地辛具有以下結構 
            
的一種或多種，包括苯基丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌氮芥、六甲蜜胺、氮尿苷、5_脫氧尿 苷、阿糖胞苷、6_巰基嘌呤、脫氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、普卡霉素、長春堿、長春 瑞濱、拓撲替康、雷佐生、馬立馬司他(marimastat)、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊 胺、內皮他丁(endostatin)、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、 維塔辛(vitaxin)、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內酯、非那雄胺(finasteride)、甲腈咪胍、曲 妥珠單抗、地尼白介素-2、ddftitox、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、多西他賽、埃博霉素B、 BMS-247550 (Lee 2001)、BMS_310705、屈洛昔芬(3-羥基他莫昔芬)、4_羥基他莫昔芬、哌噴 昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬(CP-336156)、艾多昔芬、TSE-424、 HMR-3339、ZK186619、拓撲替康、PTK787/ZK 222584 (Thomas 2003)、VX-745 (Haddad 2001)、PD 184352 (Sebolt-Leopold 1999)、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、 LY293646 (Vlahos 1994)、渥曼青霉素(Wortmannin)、BAY-43-9006 (Wilhelm 2002)、 ZM336372、L-779450、Raf 抑制劑(Loffinger 2002)、夫拉平度(flaopiridol) (L86-8275/ HMR 1275 ；Senderowicz 2000)、UCN-01 (7-羥基星孢菌素；Senderowicz 2000)、任何 mTOR 抑制劑、雷帕霉素(西羅莫司)、依維莫司(雷帕霉素的40-0-(2_羥乙基)衍生物)、 CCI-779(替西羅莫司；Sehgall994 ；Elit 2002)、AP-23573、RAD001、ABT_578 或 BC-210。雷
            
帕霉素(西羅莫司)具有以下結構 
            
 CCI-779具有以下結構 AP-23573具有以下結構 RADOOl具有以下結構 ABT-578具有以下結構 BC-210具有以下結構 在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合以下專利所示 化合物中的一種或多種，包括美國專利No. 5，656，655，其中公開了苯乙烯基取代的雜芳 基EGFR抑制劑；美國專利No. 5，646，153，其中公開了雙、單和/或雙環芳基雜芳基碳環和 雜碳環EGFR和PDGFR抑制劑；美國專利No. 5，679，683，其中公開了抑制EGFR的三環嘧啶 化合物；美國專利No. 5，616，582，其中公開了具有受體酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生 物；Fryl994，其中公開了具有抑制EGFR的結構的化合物(參見Fry 1994中圖1)；美國專 利No. 5，196，446，其中公開了抑制EGFR的雜芳基乙烯二基或雜芳基乙烯二基芳基化合物； 和Panek 1997，其中公開了被鑒別為PD 166285 (6-(2，6-二氯苯基)-2-(4-(2-乙基氨基乙 氧基)苯氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3-d)嘧啶-7-酮)的化合物，其抑制EGFR、PDGFR 和FGFR受體家族。在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段連接至或聯合一種或多種聚 乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素α-2a、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素α _2b、聚乙二 醇化或非聚乙二醇化干擾素α-2c、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素αη-l、聚乙二醇化 或非聚乙二醇化干擾素α η-3和聚乙二醇化、非聚乙二醇化復合干擾素或白蛋白-干擾 素_α。可以通過將干擾素α偶合至水溶性聚合物而制備其他干擾素α軛合物。這樣 的聚合物的非限制性列表包括如聚丙二醇的其他聚環氧烷均聚物、聚氧乙烯化多元醇、它 們的共聚物和它們的嵌段共聚物。作為聚環氧烷基聚合物的替代，可以使用有效非抗原性 物質，如葡聚糖、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、碳水化合物基聚合物等。在下 列專利中描述了這樣的干擾素α “聚合物軛合物，例如，美國專利No. 4，766，106、美國專利No. 4，917，888,EP 專利申請 No. 0236987 或 0593868 以及國際專利 No. W095/13090。可以通 過將PEG聚合物連接至干擾素α -2b分子上的組氨酸殘基而制備PEG12000-IFNci 2b。適于腸胃外給藥的聚乙二醇化干擾素α的藥物組合物可以用適合的緩沖液配 制，例如，用于注射的無菌水中的Tris-HCl、乙酸鹽或如磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液 的磷酸鹽緩沖液和藥用賦形劑(例如，蔗糖)、載體(例如，人血漿白蛋白)、毒性試劑(例 如，NaCl)、防腐劑(例如，水楊乙汞(thimerosol)、甲酚或苯甲醇)和表面活性劑(例如， tween或多山醇酯)。可以以凍干粉末的形式在2_8°C的冷藏環境下儲存聚乙二醇化干 擾素α。當在2至8°C存儲并在重新溶解后24小時內使用，則該重新溶解的水溶液是穩 定的(見，例如，美國專利NO. 4492537 ；5762923和5766582)。該重新溶解的水溶液也可 以儲存在預填充、多劑量注射器中，如用于遞送如胰島素的藥物的那些注射器。典型、適 合的注射器包括包含連接至筆型注射器的預填充小瓶的系統，該筆型注射器如購自Novo Nordisk WNOVOLET  Novo Pen S Schering Corporation, Kenilworth, NJ 白勺 REDIPEN 。其他注射器系統包括包含玻璃藥筒的筆型注射器，其中該藥筒中含有稀釋 劑以及位于獨立隔間內的凍干聚乙二醇化干擾素α粉末。包含止吐藥的組合物可用于防止或治療惡心；一種化學療法常見的副作用。因 此，在某些實施方式中，提供了組合物，其包含與一種或多種抗癌化療劑和一種或多種 止吐藥連接或聯合的本文提供的抗體或抗原結合片段，該止吐藥包括，但不限于，卡索 匹坦(casopitant)(GlaxoSmithKline)、奈妥匹坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)及其 他NK-I受體拮抗劑、帕洛諾司瓊(palonosetron)(作為Aloxi出售；MGI Pharma)、 阿瑞匹坦(aprepitant)(作為 Emend 出售；Merck and Co. ；Rahway, NJ)、苯海拉明 (diphenhydramine) ( #^jBenadryl djyS ；Pfizer ；New York, NY)、胃■ (hydroxyzine) (作為 Atarax  出售；Pf izer ；New York, NY)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(作為 Reglan 出售；AH Robins Co，；Richmond，VA)、勞拉西泮(loraz印am)(作為Ativan 出 yS ；Wyeth ；Madison, NJ)、！5可胃P坐^· (alprazolam) ( #^JXanax ^y& ；Pfizer ；NewYork, NY)、氟哌啶醇(haloperidol)(作為Haldol 出售；Ortho-McNeil ；Raritan, NJ)、氟哌利 多(droperidol) (Inapsine  )、屈大麻酚(dronabinol)(作為Marinol 出售；Solvay Pharmaceuticals, Inc. ；Marietta, GA)、jft■ f 豐公(# %Decadron  Hj yS ；Merck and Co. ；Rahway, NJ)、潑尼松龍、甲潑尼龍(作為Medrol 出售；Pfizer ；NewYork, NY)、丙氯 拉嗪(作為Compazine 出售；Glaxosmithkline ；Research Triangle Park, NC)、格拉 司瓊(granisetron)(作為Kytril  出售；Hoffmann-La Roche Inc. ；Nutley，NJ)、昂丹 司瓊(ondansetron)(作為Zofrail 出售；Glaxosmithkline ;Research Triangle Park, NC)、多拉司瓊(dolasetron)(作為Anzemet 出售；Sanofi-Aventis ；NewYork, NY)、托 烷司瓊(tropisetron)(作為Navoban 出售；Novartis ；East Hanover, NJ)。本文還提 供了通過向有需要的受試者(例如，哺乳動物受試者，如人類、靈長類、犬、大鼠、兔或小鼠) 給予這樣的組合物治療癌癥的方法。癌癥治療的其他副作用包括紅細胞和白細胞缺乏。因此，提供了組合物，其包含與 治療紅細胞和/或白細胞缺乏的藥劑連接或聯合的本文提供的抗體或抗原結合片段，該治 療紅細胞和/或白細胞缺乏的藥劑如聚乙二醇化非格司亭、促紅細胞生成素、依伯汀α或 達貝泊汀α。
            
在某些實施方式中，提供了組合物，其包含與一種或多種抗高血壓劑連接或聯合 的抗體或其抗原結合片段，該抗高血壓劑如利尿劑、腎上腺素能受體拮抗劑、腎上腺素能 受體激動劑、鈣離子通道阻斷劑、ACE抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、醛留酮拮抗劑、血 管擴張劑或中樞作用腎上腺素能藥物。在某些實施方式中，本文公開的抗體或抗原結合片段可以作為包含一種或多種生 理學耐受組分的藥物組合物的一部分進行給藥。因此，在某些實施方式中，本文提供了這樣 的組合物以及配制這樣的組合物的方法。包含本文公開的一種或多種抗體或抗原結合片段 以及一種或多種生理學耐受組分的組合物可以用于治療與高VEGF表達水平和/或信號轉 導、和/或血管生成增加有關的疾病。在本文公開的藥物組合物中使用的生理學耐受組分可以包括，例如，藥用液體、凝 膠或固體載體、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒輔助性物質、本領域已知的其他組分或它們的 各種組合。適合的組分可以包括，例如，抗氧化劑、填充劑、粘結劑、崩解劑、緩沖劑、防腐劑、 潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑或乳化劑。適合的抗氧化劑可以包括，例如，蛋氨酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉬、過氧化 氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巰基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥 基甲苯和/或沒食子酸丙酯。如本文所公開的，在包含本文所提供的抗體或抗原結合片段 的組合物中包含一種或多種抗氧化劑(如蛋氨酸)降低了該抗體或抗原結合片段的氧化。 氧化的這種降低防止或減少了結合親合力的損失，從而改善了抗體穩定性并使貯藏期限最 長。因此，在某些實施方式中提供了組合物，其包含本文公開的一種或多種抗體或抗原結合 片段以及一種或多種抗氧化劑(如蛋氨酸)。通過將該抗體或抗原結合片段與一種或多種 抗氧化劑(如蛋氨酸)混合，進一步提供了防止本文提供的抗體或抗原結合片段氧化、延長 其貯藏期限和/或改善其效力的方法。適合的載體可以包括，例如水性載體，如氯化鈉注射液、林格注射液、等滲葡萄糖 注射液、無菌水注射液或葡萄糖和乳酸化林格注射液；非水載體，如植物來源的不揮發性 油、棉子油、玉米油、芝麻油或花生油；抑制細菌或抑制真菌濃度的抗微生物劑；等滲試劑， 如氯化鈉或葡萄糖；緩沖劑，如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑；抗氧化劑，如硫酸氫鈉；局部麻 醉劑，如鹽酸普魯卡因；懸浮和分散劑，如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯基 吡咯烷酮；乳化劑，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；掩蔽劑或螯合劑，如EDTA(乙二胺四乙 酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。可 以將作為載體使用的抗微生物劑加入到置于多劑量容器內的藥物組合物中，包括苯酚或甲 酚、水銀、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯銨和芐索氯銨。適合 的賦形劑可以包括，例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇。適合的無毒輔助性物質可以包括， 例如，潤濕劑或乳化劑、PH緩沖劑、穩定劑、助溶劑或如醋酸鈉、山梨糖醇單月桂酸酯、油酸 三乙醇胺或環糊精的試劑。如本文所使用的，術語“治療有效量”或“有效劑量”指治療疾病或病癥的有效藥 物劑量或濃度。例如，對于使用本文公開的抗體或抗原結合片段治療癌癥來說，治療有效量 為能夠消除全部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長、抑制介導癌性病癥的細胞生長或增殖、 抑制腫瘤細胞轉移、改善與腫瘤或癌性病癥有關的任何癥狀或標記物、防止或延緩腫瘤或 癌性病癥發展或它們的一些組合的抗體或抗原結合片段的劑量或濃度。
            
可以使用本領域公知的方法確定本文提供的抗體或抗原結合片段的有效劑量。例 如，可以通過在給予特定劑量后確定受試者中正在治療的腫瘤是否縮小、停止生長或生長 更加緩慢來建立有效劑量。可以使用本領域公知的方法確定腫瘤的尺寸和進程，例如，X射 線、磁共振成像(MRI)、CT掃描或目視檢測(例如，外科手術程序)。例如，當治療的癌癥為多 形性膠質母細胞瘤時，臨床醫師可以通過使用CT或MRI掃描對腫瘤成像以監測治療進展。 與腫瘤生長的癥狀表現有關的患者訪問(例如，頭疼、行為或情緒變化)也是有教益的。根 據臨床醫師的發現，可以相應地改變劑量方案。在另一實施例中，所治療的癌癥為黑素瘤， 臨床醫師可以通過對黑素瘤病變進行目視檢查來監測治療進展。臨床醫師可以評價各種各 樣的目視參數，例如，尺寸、厚度、生長模式的改變或外觀改變。根據臨床醫師的發現，可以 相應地改變劑量方案。一般說來，可以使用胸苷PET掃描測量腫瘤尺寸和增殖(見，例如，Wells 1996)。 胸苷PET掃描通常需要注射放射性示蹤劑，如[2-"C]_胸苷，然后再對受試者身體進 行 PET 掃描(Vander Borght 199Ia ；Vander Borght 1991b)。可用的其他示蹤劑包括 [18F]-FDG (18-氟脫氧葡萄糖)、[124I] IUdR (5-[1241]碘 _2，_ 脫氧尿苷)、[76Br] BrdUrd ( ^ 脫氧尿苷)、[18F] FLT (3’ -脫氧-3’氟代胸苷)或[11C] FMAU (2’ -氟_5_甲基-D-阿 拉伯呋喃糖基尿嘧啶)。如本文所提供的抗體或抗原結合片段的有效劑量將取決于本領域已知的各種因 素，例如，體重、年齡、既往病史、現有藥物療法、受試者的健康狀況和交叉反應的可能、過敏 性、敏感性和不利的副作用，以及給藥途經和腫瘤發展的程度。本領域的常規技術人員(例 如，內科醫師或獸醫)可以根據這些及其他環境或要求的指示按比例降低或增加劑量。在某些實施方式中，如本文所提供的抗體或抗原結合片段可以以約0.01mg/kg至 約100mg/kg的治療有效劑量給予(例如，約0. 01mg/kg、約0. 5mg/kg、約lmg/kg、約2mg/ kg、約 5mg/kg、約 10mg/kg、約 15mg/kg、約 20mg/kg、約 25mg/kg、約 30mg/kg、約 35mg/kg、約 40mg/kg、約 45mg/kg、50mg/kg、約 55mg/kg、約 60mg/kg、約 65mg/kg、約 70mg/kg、約 75mg/ kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg或約100mg/kg)。在這些實施方式的某 些中，以約50mg/kg或更小的劑量給予該抗體或抗原結合片段，而在這些實施方式的某些 中，該劑量為10mg/kg或更小、5mg/kg或更小、lmg/kg或更小、0. 5mg/kg或更小或0. lmg/kg 或更小。可以以各種時間間隔給予給定劑量，例如，每天一次，每天兩次或更多次、每周兩次 或更多次、每周一次、每兩周一次、每三周一次、每月一次或每兩月或更長時間一次。在某些 實施方式中，可以隨治療療程改變給藥劑量。例如，在某些實施方式中，初始給藥劑量可以 高于隨后的給藥劑量。在某些實施方式中，可以隨治療療程根據受試者的反應改變給藥劑
            
Mo可以調整給藥方案以提供最佳的所期望響應的反應(例如，治療反應)。例如，可 以給予單劑量，或可以隨時間給予分成幾份的劑量。可以通過藥學領域公知的方法制備包含本文公開的抗體或抗原結合片段，以及在 某些實施方式中的各種化療劑的藥物組合物。見，例如，Gilman et al.，(eds.) (1990) ,The Pharmacological Bases ofTherapeutics，，, 8th Ed.，Pergamon Press ；A. Gennaro (ed.), Remington  sPharmaceutical S ciences，，，18th Edition, (1990)，Mack Publishing Co.， Easton, Pennsylvania ；Avis et al.，(eds.) (1993)，Pharmaceutical DosageForms 
            
81Parenteral Medications”，Dekker, New York ；Lieberman et al.，(eds. ) (1990)， Pharmaceutical Dosage Forms :Tablets”，Dekker, NewYork ；and Lieberman et al.， (eds.) (1990)，Pharmaceutical DosageForms !Disperse Systems”，Dekker, New York0 
            
 可以通過本領域已知的任何途徑給予本文公開的抗體和抗原結合片段，例如腸胃 外途徑(例如，皮下注射、腹膜內注射、包括靜脈內輸注的靜脈內注射、肌內注射或皮內注 射)或非腸胃外途徑(例如，口服、鼻內給藥、眼內給藥、舌下給藥、直腸給藥或局部給藥)。 在通過注射給予該抗體或抗原結合片段的實施方式中，可以將可注射藥物組合物制備成任 何常規形式，例如液體溶液、懸液、乳液或適于形成液體溶液、懸液或乳液的固體形式。注射 液制劑可以包括待注射的無菌溶液、使用前準備聯合溶劑的無菌干燥可溶性產品(如凍干 粉末，其包括皮下片劑)、待注射無菌懸液、使用前準備聯合載體的無菌干燥不溶性產品和 無菌乳液。這些溶液可以是水性的或非水性的。 在某些實施方式中，將單位劑量的腸胃外制劑包裝在安瓿、小瓶或帶針注射器中。 如在本領域中已知和實踐的，腸胃外給藥的所有制劑應為無菌的。在某些實施方式中，通過將如本文所公開的抗體或抗原結合片段溶解至適合的溶 劑而制備無菌、凍干粉末。溶劑可以含有賦形劑，其改善了粉末或由粉末制備的重新溶解的 溶液的穩定性或其他藥理學要素。可以使用的賦形劑包括，但不限于，水、葡萄糖、山梨醇、 果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適合的試劑。溶劑可以含有緩沖劑，如檸 檬酸鹽、磷酸鈉鹽或鉀鹽或本領域技術人員已知的其他這樣的緩沖劑，在一個實施方式中， 緩沖液的PH為約中性。隨后對該溶液過濾除菌，接著在本領域技術人員已知的標準條件下 凍干從而提供了所期望的劑型。在一個實施方式中，將所得溶液分裝至小瓶中凍干。各個 小瓶可以含有單劑量或多劑量的抗-VEGF抗體或其抗原結合片段或它們的組合物。用少量 超過所需劑量或劑量組的量(例如，約10% )對小瓶過量填注是可接受的，以便有利于準確 吸取樣品和準確定量配料。可以在適當的條件下儲存凍干粉末，如約4°C至室溫。用注射用水重新溶解凍干粉末提供了腸胃外給藥的劑型。在一個實施方式中，將 凍干粉末加入至無菌水或其他液體適合載體以重新溶解。精確的量取決于所采取的選中療 法，并且可以通過經驗進行確定。在某些實施方式中，提供了用于表達本文公開的抗體或抗原結合片段的表達系 統。這些表達系統包括編碼所述抗體或抗原結合片段的多核苷酸、包含這些多核苷酸的載 體、以及包含這些載體的宿主細胞。可以使用本領域已知的方法分離或合成編碼本文所公 開的抗體或抗原結合片段的多核苷酸，并且可以將其插入至可復制載體用于擴增或克隆。 可以從單個載體中表達編碼所述抗體可變輕鏈和可變重鏈(Vh)的多核苷酸，或可以 使用兩個單獨的載體對它們進行表達，然后再進行體外裝配。在某些實施方式中，可以使用 同一細胞內的兩個不同載體對它們進行共表達并胞內裝配(見，例如美國專利No. 4816567 或5595898)。適合的載體可以包含一個或多個調控序列的各種構造，如啟動子、增強子或轉 錄起始序列，以及編碼用于表型選擇的標記物的基因。具有用于表達本文所公開的抗體或 抗原結合片段的適合主鏈的載體是本領域中已知的(見，例如美國專利No. 7192737)。在 某些實施方式中，該載體可以包含編碼人IgG2免疫球蛋白的重鏈(Ch)和輕鏈(Q)的恒定 區的多核苷酸序列。可替換地，載體可以僅表達該抗體的Vh和\鏈，其中所表達的多肽包 含Fv片段而不是完整的抗體。可以將載體插入至適合的宿主細胞以擴增或表達該多核苷酸序列。可以在本領域已知的多種培養基上培養這些宿主細胞用于抗體生產，例如最低必 需培養基(MEM) (Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、杜皮克氏改良愛哥爾氏培養基(Dulbecco，s Modified Eagle's Medium) (DMEM) (Sigma)和哈姆氏 FlO 培養基(Ham's F10) (Sigma)。可 以向培養基中添加各種各樣的試劑，例如激素、生長因子、鹽、緩沖劑、核苷酸、抗生素、微量 元素、葡萄糖或其他能源。可以使用本領域熟知的參數調節培養條件，如溫度和PH。表達 后，可以使用本領域已知的方法純化如本文所提供的一種或多種抗體或抗原結合片段。本文公開的抗體或抗原結合片段可以包含用于特異地向癌細胞遞送的軛合物。另 外，可以使用抗體或抗原結合片段與腫瘤細胞的結合來招募宿主免疫應答。可以通過利用 二價抗體來提供這種宿主免疫應答，其中該二價抗體的一個結合位點對應于本文提供的完 全人抗體或抗原結合片段，而另一個結合位點識別另一抗原。在某些實施方式中，本文公開的抗體或抗原結合片段可以包含高巖藻糖(fucose) 含量的低聚糖。在其他實施方式中，本文公開的抗體或抗原結合片段可以具有低巖藻糖含 量，例如不含巖藻糖的Fc抗體。可以使用具有低巖藻糖基化活性的細胞系產生低巖藻糖抗 體，例如大鼠 YB2/0 細胞(Shinkawa 2003)或 CHO 變體細胞系 Lecl3 (Shields 2002)。提供了下列實施例以更好地舉例說明所要求保護的發明，并且不應將下列實施例 解釋為對本發明范圍的限制。如下所述的所有具體的組合物、材料和方法以整體或部分地 落入本發明的范圍。這些具體組合物、材料和方法不用來限制本發明，而僅用于說明屬于本 發明范圍的具體實施方式
            
。在沒有創造性能力的實踐和不背離本發明范圍的情況下，本領 域技術人員可以形成等價的組合物、材料和方法。應理解，可以對本文所述的程序做出多種 變化，但其仍在本發明的范圍內。本發明發明人的意圖在于這些變化包含在本發明的范圍 內。實施例實施例1 結合hVEGF!的抗體的產生針對固定的hVEGF165對人單鏈FV(SCFV)噬菌體展示文庫進行淘選以鑒別具有結 合hVEGF165能力的一組抗體片段。使用標準方案進行淘選(見，例如，Methods in Molecular Biology, vol. 178 Antibody Phage Display :Methods and Protocols Edited by P. M. 0' Brien and R. Aitken, Humana Press ；"Panning of AntibodyPhage-Display Libraries,，，Coomber. D.W.J· , PP. 133-145, and "Selection of Antibodies Against Biotinylated Antigens, "Chames,P.etal.，pp.147-157)。簡要地，用50μ 1在PBS中濃度為10μ g/ml的重組hVEGF165(R&D Systems,目錄 號293-VE)包被NUNC  MAXISORP板的三個孔。在4°C孵育過夜后，在室溫下用5%的 牛奶PBS溶液阻斷自由結合位點達1小時。然后，將約200μ 1在5%牛奶/PBS中的噬菌 體文庫加入至封閉的孔中并在室溫下孵育約1至2小時。使用標準方法，清洗孔并洗脫結 合的噬菌體(見，例如，Sambrook andRussell, Molecule Cloning :A Laboratory Manual, 3th Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001)。將洗脫的噬菌體在 37°C感染 到處于對數生長期的大腸桿菌(E. coli)TGl宿主細胞中進行擴增。以2500RPM的轉速離心 5分鐘回收感染的TGl細胞，將其置于15cm 2YT-氨芐西林葡萄糖瓊脂板上并在30°C 孵育過夜。然后使用擴增的噬菌體重復該淘選過程。用降低的濃度將淘選、洗脫和擴增循環重復三輪(例如，第一輪為50 μ g/ml的hVEGF165 ；第二輪為10 μ g/ml ；接著第三輪為10 μ g/ml)，此時將來自涂板的TGl細胞的單個 菌落用于接種96孔板中的培養基。微量(細胞)培養生長至0D600為0. 6，此時通過加入 ImM的IPTG并在30°C下在震蕩器中孵育過夜而誘導可溶性scFv的表達。細菌離心沉淀， 并且胞質提取物用來利用標準ELISA測定而測試scFv與固定化的hVEGF165的結合。實施例2 通過scFv對hVEGF，與VEGF警體結合的阻斷使用基于微板的競爭性篩選DELFIA 測定(Perkins Elmer, ffaltham, ΜΑ)，對 實施例1中通過ELISA表現出與hVEGF165結合的噬菌體克隆體測試它們阻斷hVEGF165與 VEGF-Rl和/或VEGF-R2結合的能力。簡要地，將生物素化的hVEGF165溶液以體積比1  1加入至實施例1的胞質提取 物中以達到0. 5 μ g/ml的最終濃度。將100 μ 1該混合物加入到用VEGF-Rl或VEGF-R2 (R&D Systems :VEGF-Rl/Flt_l，目錄號321_FL ；VEGF_R2/KDR/Flk_l，目錄號357_KD)包被的板 上并在室溫下孵育1. 5小時。用PBST清洗板，并以50 μ 1/孔的量加入在DELFIA測定緩沖 液中的銪-抗生蛋白鏈菌素的1  250稀釋液。將該板在室溫下孵育1小時，然后用DELFIA 清洗緩沖液清洗。以50 μ 1/孔的量加入DELFIA增強緩沖液，并將該板在室溫下孵育5分 鐘。用時間分辨熒光Gemini板讀數器讀取該板。實施例3 :scFv向ScFvzFc和IgG的轉化選擇實施例2中將hVEGF165與VEGF-Rl或VEGF-R2的結合抑制超過60 %的 兩個scFv (XPA. 10. 064和XPA. 10. 072)用于向scFv-Fc和/或IgG的轉化。圖1示出 了 XPA. 10. 064和XPA. 10. 072的重鏈可變區(包括重鏈OTR)和輕鏈可變區(包括輕鏈 ⑶R)。通過Kabat編號系統 (Kabat, Ε. A.，et al. 1987，in Sequences ofProteins of Immunological Interest,US Department of Health andHuman Services,NIH,USA)石角定 重鏈 CDR (例如，HCDRl、HCDR2 和 HCDR3)和輕鏈 CDR (例如，LCDRl、LCDR2 和 LCDR3)。分別 在 SEQ ID NO :6、7 和 8 中示出 了 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 的 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3 氨基 酸序列。分別在 SEQ ID NO :12、13 和 14 中示出了 XPA. 10. 064 的 LCDRULCDR2 和 LCDR3 氨 基酸序列。分別在 SEQ ID NO :9、10 禾Π 11 中示出了 XPA. 10. 072 的 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3 氨基酸序列。對于XPA. 10. 064和XPA. 10. 072向scFv-Fc融合蛋白的轉化來說，將scFv cDNA 克隆入已經過修飾以編碼Y 2重鏈恒定區基因的CH2和CH3結構域的真核表達載體中(美 國專利 No. 7192737 ；WO 2004/033693)。對于XPA. 10. 064和XPA. 10. 072向IgG的轉化來說，將重鏈和輕鏈的可變區均克 隆入編碼κ、λ或γ 2重鏈和輕鏈恒定區基因的真核表達載體中(US 2006/0121604)。XPA. 10. 064和XPA. 10. 072scFv_Fc和IgG抗體在之前所述的293E細胞中瞬間表 達(US 2006/0121604)。在培養的第6天收獲轉染細胞的上清液，并通過蛋白質-A色譜法 純化IgG。實施例4 :XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072scFv_Fc 和 IgG 結合動力學的 Biacore 分析使用BIAC0RE 2000和具有以高密度固定在所有流動池上的蛋白質A/G(Piece) 的CM5傳感芯片(Biacore)來評價XPA. 10. 064和XPA. 10. 072scFv_Fc的結合親合力。用 于這些實驗的稀釋液和運行緩沖液為用Chemiblocker  (Chemicon)以1  50稀釋的 HBS-EP (Biacore)。通過以20ul/min的流速向流動池2 (fc2)注入稀釋的XPA. 10. 064和
            
84XPA. 10. 072scFv-Fc進行抗體捕獲，所注入的體積是變化的以達到大約為50-70RU的抗體 捕獲。抗體濃度為約0. 5 μ g/ml。使用相對于fcl和fc2進行15分鐘解離的Kinject特 性，以30 μ 1/min的流速在5分鐘內注入sf21細胞所表達的hVEGF165。通過一系列的三倍稀 釋，制備了四種HVEGF165的稀釋液，得到的濃度為5 μ g/ml (119nM)、1. 667 μ g/ml (39. 7ηΜ)、 0. 55 μ g/ml (13. 2ηΜ)和 0. 185 μ g/ml (4. 4ηΜ)。以 50 μ 1/min 的流速注入兩次 IOOmMHCl (每 次各12秒)以進行再生。在兩次參考對照流動池和空白注射后，在Scrubbed中處理 數據并通過1  1朗格繆爾相互作用模型(Langmuir interaction model)進行擬合。 XPA. 10. 064和XPA. 10. 072scFv_Fc對hVEGF165表現出高且幾乎相同的結合親合力。利用相似的方案評價XPA. 10. 064和XPA. 10. 072IgG2的結合動力學。XPA. 10. 064 和XPA. 10. 072IgG2均以相似的低單數位納摩爾親合力(圖2_4)特異地與hVEGF165結合， 并且對mVEGF165僅表現出弱結合(> ΙΟΟηΜ)。兩種抗體均表現出與貝伐單抗相似的結合動 力學(表2)。表2 :XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072IgG2 與 hVEGF165 的結合親合力 實施例5 :ΧΡΑ. 10. 064 和 XPA. 10. 072IgG 對 hVEGF，與 VEGF 警體結合的阻斷使用具有CM5 芯片的 Biacore 2000 評價了 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072IgG2 阻斷 hVEGF165與VEGF-Rl和/或VEGF-R2結合的能力。通過胺偶合(Biacore)以約15000的密度將VEGF受體(R&DSystems)固定在CM5 芯片上。將VEGF-R2固定在fc2上，而將VEGF-Rl固定在fc4上。流動池1和3用作參 照，并用與受體固定的流動池相同的方法進行活化和阻斷。將在HBS-EP運行緩沖液中的 0. 15 μ g/ml的hVEGF165溶液與抗體樣本或緩沖液1  1混合。最終抗體濃度為15,5,1. 667、 0. 556,0. 185,0. 0617,0. 0206和0 μ g/ml。在開始Biacore分析運行之前，將樣品孵育至少 1小時。所有樣品均注射兩次，每組抗體重復均具有其自己的陽性和陰性對照(分別為無 抗體和VEGF以及無VEGF)。以lOul/min的流速注入樣品1. 5分鐘以通過所有流動池。以 50 μ 1/min的流速注入pH 1. 75的Glycenel2秒以進行再生。對于數據分析，通過線性擬合確定結合相的結合線性部分(30秒至1分鐘)的斜 率。來自各個點的信號減去最近的空白，然后再除以100%匹配的信號(無抗體)對照以得到該循環的抑制百分率。用GraphPad Prism對數據畫圖，并用S形劑量反應曲線擬合以計 算 EC50。XPA. 10. 064和XPA. 10. 072IgG2均以與貝伐單抗類似的水平阻斷hVEGF165與 VEGF-Rl 和 VEGF-R2 的結合(圖 5-6，表 3)。表3 :XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 對 hVEGF165 與 VEGF-R1/R2 結合的抑制 實施例6 對由XPA. 10. 064和XPA. 10. 072結合的hVEGF，表位的分析為了確定XPA. 10. 064和XPA. 10. 072識別的hVEGF165表位是否為線性或構象的， 在三塊獨立的SDS-PAGE凝膠上對未降低的或降低的且熱變性的重組hVEGF165的三個200ng 樣品進行電泳。將電泳后的蛋白質轉移到Immulon-P膜上，將印跡與XPA. 10. 064IgG、 XPA. 10. 072IgG或貝伐單抗抗體雜交并與1 μ g/ml的第二羊-抗人IgG HRP-軛合抗體進行 孵育。用增強的化學發光(ECL)底物(Pierce)檢測結合。XPA. 10. 064、XPA. 10. 072和貝伐單抗均與hVEGF165上的線性表位結合(圖7)。實施例7 :XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072hVEGF^ 表位結合研究為了確定XPA. 10. 064和XPA. 10. 072所結合的hVEGF121表位是否與貝伐單抗相同， 使用多種hVEGF121突變體進行了三次ELISA比較結合測定。之前的突變分析表明，VEGF殘基M81、G88、Q89和G92對于貝伐單抗與hVEGF165的 結合是至關重要的(Fuh 2006)。為了確定這些殘基是否對XPA. 10. 064以及XPA. 10. 072的 結合也至關重要，產生了下列 hVEGF121 突變體hVEGF121-M81A、hVEGFm-Q89A、hVEGF121-G92A 和hVEGFm-G88S。在CHO-Kl細胞中瞬間表達這些突變體，并且收集細胞上清液用于通過 ELISA進行結合分析。以1、2或5μ g/ml的濃度用XPA. 10. 064、XPA. 10. 072、貝伐單抗或對照多克隆山 羊-抗人VEGF(PAB)包被微滴定板并在4°C孵育過夜。在室溫下用30%的ChemiBlock  試劑(Millipore)的PBS溶液阻斷該板1小時，并且在適合的孔中加入30、60或100 μ 1 的各種突變體的CHO-Kl培養上清液或1 μ g/ml的野生型hVEGFm、重組hVEGF165或重組 mVEGF165。孵育1小、時后，沖洗該板并與生物素化的山羊多克隆抗-VEGF抗體在室溫下孵 育1小時。用HRP軛合的抗生蛋白鏈菌素進行檢測，隨后使用制造商的方案用TMB生色底 物(Calbiochem)進行檢測。XPA. 10. 064和XPA. 10. 072與hVEGFm突變體的結合類型與貝伐單抗類似(表 4-5)，表明這些抗體與重疊或類似的表位結合。表4 :XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 與 hVEGF 突變體的結合 每種抗體的上一行相對于CHO背景的結合倍數每種抗體的下一行原始數據表5 表位結合結果的總結 實施例8 :ΧΡΑ. 10. 064和XPA. 10. 072的組織交叉反應件利用單色顯色技術，將冷凍正常人組織陣列(TMA)用來評價XPA. 10. 064和 XPA. 10.072的免疫組織化學(IHC)反應性。TMA包含32個正常人組織類型，其中各個類型 由來自兩到三個不同供體的組織組成。除TMA之外，使用正常人肝、腎、輸卵管、胰腺、輸尿 管和腎上腺的較大組織切片以證實TMA的染色結果或代替TMA中缺失的組織。陽性對照包 括在UV-樹脂片上的hVEGF蛋白質斑點和如用抗-hVEGF兔單克隆抗體強染色所評價的表 達高水平hVEGF的腎惡性腫瘤組織。利用人對人IHC染色方案，以20 μ g/ml的濃度用XPA. 10. 064、XPA. 10. 072 (人類 IgG2)或貝伐單抗對TMA和正常人組織以及hVEGF蛋白質斑點和腎惡性腫瘤陽性對照進行 染色。還包含人類扁桃腺炎病例以監測染色方案的有效性。最終方案對扁桃體組織B細 胞區中的組織內源免疫球蛋白不具有反應性。陰性對照抗體為人IgG 1和IgG2(Sigma， St. Louis, MO)和人 KLH 抗體 CHO. KLHG2. 60 (IgG2)。XPA. 10. 064、XPA. 10. 072和貝伐單抗對hVEGF蛋白質斑點均具有2_3+(范圍為 0-4+)的反應性，其中4+表示最高的染色強度。對于腎惡性腫瘤組織，貝伐單抗的染色模 糊，而XPA. 10. 064和XPA. 10. 072對腫瘤細胞的細胞質染色。人IgGl和IgG2不染色任何組織成分，僅有最低的背景染色。CHO. KLHG2. 60對腎 上腺皮質中的細胞，食管、乳腺、胰腺、前列腺、胃、甲狀腺、輸尿管頸和輸卵管中的上皮細胞 具有反應性。由于這種反應性，使用人IgGl和IgG2作為參考陰性對照。XPA. 10. 064對測試抗體具有最廣泛的組織反應性譜。XPA. 10. 064對膀胱、胃腸道、輸卵管、乳腺、前列腺、輸尿管和子宮中的平滑肌細胞，以及輸卵管、前列腺、皮膚、小腸、 胃、甲狀腺、輸尿管、子宮的子宮內膜腺和子宮頸中的上皮細胞強染色。另外，XPA. 10. 064對 小腦、大腦皮層和脊髓中的一些神經元和神經纖維，以及心肌和骨骼肌，腦下腺、腎小球、肝 竇狀隙內皮中的細胞，胸腺基質細胞，肺巨噬細胞和腎上腺皮質細胞染色。XPA. 10. 072對小 腦、大腦皮層和脊髓中的神經纖維強染色。XPA. 10. 072還對胃腸道、輸卵管、前列腺、輸尿管 和子宮的平滑肌，食管、輸卵管、乳腺、前列腺、胃、小腸、甲狀腺和輸尿管中的上皮細胞，肺 巨噬細胞和胎盤的成纖維細胞/組織細胞染色。貝伐單抗對所有正常人組織陰性染色。為了確定XPA. 10. 064和XPA. 10.072的免疫組織化學反應性是否表示靶標上 (on-target)結合或靶標外(off-target)結合，利用了多色免疫熒光基方法。該方法基于 同時比較已知“金標準”抗-VEGF抗體與測試抗體的免疫反應性。測試抗體的靶標上反應 性證實與“金標準”抗體的共定位，而缺少共定位表明靶標外反應性。利用初始實驗中采用的相同顯色IHC方法，用商購小鼠抗_人抗-VEGF抗體(BD Pharmingen, clone G153-694)對來自陽性(Dul45)和陰性(Hek 293)對照細胞的細胞球 粒的冷凍切片進行染色。該抗體對Dul45細胞染色，但是不能對Hek 293細胞染色。另外， 用該抗體染色的結腸惡性腫瘤的冷凍切片表明了在上皮和腫瘤相關基質組分與良好內部 陰性對照中的反應性特征類型。因此，G153-694指定為“金標準”陽性對照抗體。使用來自Zenon IgG標記試劑盒(Molecular Probes)的方案，將一次抗體用熒 光染料軛合的Fc-靶向抗-人Fab進行預孵育，隨后用摩爾過量的恰當正常血清中和未反 應的Fab。使用熒光抗體-Fab復合體作為染色劑，隨后用DAPI進行核復染色。使用來自 結腸(Tissue ID 4558)腺癌的冷凍切片作為這些共定位研究的對照VEGF-陽性組織。用 紅色(Alexa Fluor 594)標記 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 抗體，而用綠色(Alexa Fluor 488)標記“金標準”抗體。使用相反的顏色組合重復該測定，得到基本相同的結果。使用 LeicaTCS SP (型號DM RXE)激光掃描共聚焦顯微鏡和2. 0版的Leica共聚焦軟件(Leica Microsystems,ffetzler,Germany)獲取圖像。以400X對多個視野成像(至少三個)，并使 用 Image Pro software (Media Cybernetics, Silver Spring，MD)并分析代表性視野的共定 位。由于在對結腸惡性腫瘤和冷凍球粒切片的初始IHC研究中，貝伐單抗基本上均為陰性， 因此在共定位研究中未將其包括在內。XPA. 10. 064和XPA. 10. 072顯示了類似的高度共定位，其中XPA. 10. 064顯示出最 大的組織染色強度(圖8-9)。實施例9 :XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 對 HUVEC 增殖的抑制對XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 的 scFv-Fc 和 IgG2 測試了它們阻斷 HUVEC 增殖的 能力。在ECGM 完全培養基(Clonetics#CC-3024)加 BulletKit-2 (補充了 rhEGF、rhFGF、 rhVGEF、抗壞血酸、氫化可的松、IGF、肝素、慶大霉素/兩性霉素和2% FBS)中生長混合的 HUVEC(Clonetics#CC-2519)。細胞在每個T-75燒瓶中以2_3X IO5個細胞進行接種，并在 3-4天達到匯合。用PBS沖洗接近匯合的單層細胞后，使其受胰蛋白酶作用，并用含有PBS 的完全培養基中和。為了測量存在hVEGF165下HUVEC的增殖，通過用基本生長培養基稀釋(0-200ng/ml 的最終濃度，2 X稀釋，2 X濃度，50 μ 1/孔)建立了 HEK 293細胞所表達的hVEGF165的16個點的劑量滴定。在冷的基本培養基/0. BSA中以2X IO5細胞/毫升重新懸浮HUVEC 細胞，向hVEGF165滴定板的各個孔中加入50 μ 1的細胞(1 X 104c/w)至最終體積為100 μ 1/ 孔。孔外充滿PBS，并用石蠟封口膜密封該板以防止脫水。將板在37°C，5%的CO2中孵育 96小、時，然后在約15-20分鐘內使其恢復到室溫。將Cell TiterGlo (TTG,Promega)解凍 并恢復到底物溫度，并向各個孔中加入100 μ 1的底物/緩沖液混合物。將該板在定軌板式 振蕩器上震蕩1-2分鐘，然后從各個孔中取出150 μ 1溶液轉移到白底白壁板并在黑暗中孵 育5-10分鐘。用具有1秒積分的光度計讀取該板。對于增殖抑制測定，生成XPA. 10. 064、XPA. 10. 072和貝伐單抗的滴定(0-50 μ g/ ml最終濃度，3 X稀釋，4X濃度，25 μ 1/孔的最終體積)。抗體用hVEGF165以1  1的比例 預孵育2小時。預孵育后，向50 μ 1/孔的重新懸浮的HUVEC細胞中加入50 μ 1/孔的VEGF/ 抗體復合體，然后將該板孵育96小時并用如上該的TiterGlo緩沖液處理。XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072scFv 和 IgG2 抑制 HUVEC 增殖。圖 10 和表 6 中示出 了 IgG2的結果。表6 =XPA. 10. 064、XPA. 10. 072和貝伐單抗對HUVEC增殖的抑制 實施例10 :XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 對 VEGF-R2 磷酸化的抑制通過ELISA 分析了 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 抑制 hVEGF165 的 VEGF-R2 磷酸化的 能力。要產生溶菌物板，解凍2代至6代之間的HUVEC細胞并鋪放在TC燒瓶的EGM2完全 培養基(Lonza)中，并使其生長一至兩代。用胰蛋白酶作用接近匯合細胞，并用完全培養基 中和，再用PBS沖洗兩次然后計數。以IX IO5個/孔將細胞置于24孔板的完全培養基(重 復三個孔)中并在37°C孵育24小時。孵育后，用室溫PBS沖洗細胞兩次，并在加有0. BSA的EBM2培養基(Lonza)中饑餓5小時。倒出PBS，將細胞與劑量滴定的hVEGF165(刺 激)或預復合的 VPA. 10. 064+hVEGF165、VPA. 10. 072+hVEGF165 或貝伐單抗 +hVEGF165 (抑制) 孵育5分鐘。通過將2X劑量滴定的抗體與2XhVEGF165(最終濃度20ng/ml)以1  1的 比例混合并在 37°C孵育 24 小時產生了 VPA. 10. 064+hVEGF165 和 VPA. 10. 072+hVEGF165。倒出 hVEGF165、VPA. 10. 064+hVEGF165 和 VPA. 10. 072+hVEGF165，用冰冷的 PBS 沖洗細胞兩次。每孔 加入 65 μ 1/孔的溶菌緩沖液(1% ΝΡ-40 ；20mM Tris，pH 8. 0 ； 137mM 的 NaCl ； 10% 的甘油； 2mMEDTA ； ImM活化的原釩酸鈉；10 μ g/ml的亮肽素)，細胞在4°C搖動30分鐘備用。將捕獲的VEGF-R2(R&D Systems, VEGF_R2/KDR/Flk_l，目錄號 357-KD)特異抗體 在PBS中稀釋至8. Og/ml的工作濃度，并以100 μ 1/孔包被96孔微板。VEGF_R2/KDR/Flk_l 與磷酸化和非磷酸化的VEGF-R2均結合。密封該板并孵育過夜。吸取各個孔中的液體并用 沖洗緩沖液沖洗5次，然后加入300 μ 1/孔的封閉緩沖液并在室溫下孵育1至2小時以封 閉該板。吸取各個孔中的液體并用沖洗緩沖液再沖洗5次，然后向各個孔中加入100 μ 1的HUVEC溶菌物。將該板在室溫下孵育2小時，吸取孔中的液體并用沖洗緩沖液沖洗5次。向 各個孔中加入100μ 1對磷酸化酪氨酸特異的HRP-軛合的檢測抗體，覆蓋該板并在室溫下 避光孵育2小時。吸出孔中液體并用沖洗緩沖液沖洗5次，然后向各個孔中加入100 μ 1底 物溶液。將該板在室溫下避光孵育20分鐘，然后向各個孔中加入50μ1終止溶液。用酶標 儀讀取各個孔在450nm處的光密度。用劑量滴定的hVEGF165處理的HUVEC表現出磷酸化的VEGF-R2的增加(圖11)。 用劑量滴定的貝伐單抗+hVEGF165處理的HUVEC表現出VEGF-R2磷酸化的減少(圖12)。用 劑量滴定的 XPA. 10. 064+hVEGF165 或 XPA. 10. 072+hVEGF165 處理的 HUVEC 表現出 VEGF-R2 磷 酸化的減少。圖13中總結了各個抗體的結果。實施例11 :ΧΡΑ. 10. 064和XPA. 10. 072對血管牛成的抑制使用Matrigel 栓測定檢測ΧΡΑ. 10.064和χρα. 10.072抑制體內血管生成的能 力。向6-7周齡的雌性NU/NU小鼠腹腔注射0. 5mL含有2 X IO6個DU145細胞的 Matrigel  (BD Biosciences, San Jose，CA)，其產生人VEGF以誘導血管生成。在第0和 3天，小鼠用載體對照或0. 1、1或5mg/kg的XPA. 10. 064,XPA. 10. 072或貝伐單抗腹膜內注 射。第7天，處死小鼠并切下Matrigel 栓、稱重并拍照。根據以下方案，對栓進行目視評 分(O至3分)0，無顏色或無明顯的血管；1，有顏色跡象和少量血管；2，黃色-紅色，血管 清楚；和3，均勻的紅色或粉紅色，血管發暗(圖14)。由得到照片的盲評員對栓進行評價， 其中打亂了照片的順序。在所有測試的劑量，XPA. 10. 064的給予均導致血管生成顯著降低，而XPA. 10. 072 以lmg/kg和5mg/kg給予時導致顯著降低(圖15和16)。血管生成抑制水平與存在貝伐單 抗時所觀察到的類似。在最后一次給予抗體劑量后的第4天，通過ELISA測量小鼠血清中XPA. 10. 064、 XPA. 10. 072和貝伐單抗的濃度。在任何測試的劑量，三種抗體之間的抗體水平無顯著差異。實施例12 :ΧΡΑ. 10. 064和XPA. 10. 072對腫瘤生長的抑制利用先前公開的方案(Liang 2006)，用A673橫紋肌肉瘤腫瘤生長模型測試 了 XPA. 10. 064和XPA. 10. 072抑制腫瘤生長的能力。保持培養的A673細胞生長直至匯 合，然后收獲并重新懸浮于無菌的50%Matrigel 中。通過向6周齡的雌性裸鼠肋部 皮下注射懸浮于Matrigel 中的5XIO6個細胞而建立異種移植。當腫瘤尺寸達到約 IOOmm3時，將小鼠隨機分為8組(每組10個)，并腹膜內注射僅載體(組1)、0. 5mg/kg ΧΡΑ. 10. 064IgG2(組2)、5mg/kg ΧΡΑ. 10. 064IgG2(組3)、0· 5mg/kg ΧΡΑ. 10. 072IgG2(組4)、 5mg/kg ΧΡΑ. 10. 072IgG2 (組 5)、5mg/kg 的同種型對照抗-KLH IgG2 (組 6)、0· 5mg/kg 貝伐 單抗(組7)或5mg/kg貝伐單抗(組8)，每周注射兩次持續18天(共計6次劑量)。在最 后一次劑量后的24、72和168小時，采集血液和組織樣本。在所測試的兩種劑量下，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072的給予導致顯著的體內腫瘤 生長抑制(圖17)。在所有測試的劑量，兩種抗體的生長抑制水平均比貝伐單抗中所觀察到 的略高。在給定的劑量給予的所有抗體的血清水平相似(0. 5mg/kg，血清水平為約5-7yg/ ml ；5mg/kg，血清水平為約 75-100 μ g/ml)。實施例13 親合力成熟
            
對XPA. 10. 064進行親合力成熟以優化親合力。使用標準分子生物學技術(見，例 如，Clackson&Lowman，Phage Display-APractical Approach (Oxford University Press， 2004))，通過HCDR3的隨機誘變產生了 scFv文庫。為了覆蓋全部10個氨基酸的⑶R，將 HCDR3隨機分為兩個五個氨基酸的區，從而得到了文庫H3B1 (HCDR3的N末端5個氨基酸區) 和H3B2 (HCDR3的C末端5個氨基酸區)。使用類似于實施例1中所述的那些技術，對兩個 文庫均進行了噬菌體選擇。隨著連續每輪淘選的進行，靶抗原的包被濃度逐步降低。使用類似于實施例3中所述的那些技術，將相對于親本抗體表現出改善的 hVEGF165結合的k。ff速率的五種scFv克隆體轉化為IgG。通過在極低密度的抗原表面上注 射抗體，在Biacore 2000 上測試了這些IgG的VEGF結合親合力。通過標準胺偶合法， 將人或鼠VEGF165固定到在Cl (平面羧基表面)芯片上的流動池。固定了約85RU的每種抗 原，并活化和封閉了參考流動池。在兩個不同的濃度，經過400秒注入抗體通過芯片表面， 在此之后監測解離。利用雙參考和以1  1相互作用擬合，通過Scrubber 分析數據。用 90mM HCl 和 500mM NaCl 進行再生。每個親合力成熟的克隆體XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、 XPA. 10. 064. 07和XPA. 10. 064. 10與hVEGF165結合的親合力比親本XPA. 10. 064或貝伐單 抗的更大(表 7)。分別在 5EQID NO  15-19 中示出了 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、 XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 的 HCDR3 氨基序列。分別在 SEQ ID NO -.20-24 中示出了 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 的完整重鏈序列。XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、 XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 的輕鏈序列與 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 (SEQ ID NO 5) 的相同。所有五種這些親合力成熟的抗體均在HCDR3中含有蛋氨酸殘基。表7 親本XPA. 10. 064和親合力成熟的XPA. 10. 064對hVEGF165的結合親合力  親本XPA. 10. 064 以及親和力成熟的克隆 XPA. 10. 064. 06 和 XPA. 10. 064. 07 每一 個均對mVEGF165僅表現出弱結合(> IOOnM)(表8)。表8 親本XPA. 064和親和力成熟的XPA. 064對mVEGF165的結合親和力 實施例14 親合力成熟的XPA. 10. 064對HUVEC增殖的抑制使用類似于實施例9中所述的方案，測試了親合力成熟的XPA. 10. 064IgG2阻斷 HUVEC 增殖的能力。產生了 XPA. 10. 064、XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07、 XPA. 10. 064. 10和貝伐單抗的滴定，并且這些抗體用hVEGF165預孵育2小時。預孵育后，將 VEGF/抗體復合體加入到懸浮的HUVEC細胞中。對每個抗體，實驗重復四次。在圖18-23中示出了對各個抗體的結果，并在圖24中總結了這些結果。每個 親合力成熟的抗體 XPA. 10. 064. 03、XPA. 10. 064. 04、XPA. 10. 064. 06、XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10抑制HUVEC增殖的程度均比親本XPA. 10. 064大。表9中示出了各個抗體IC5tl 的幾何平均數。表9中所示的P值基于相對于貝伐單抗，各個抗體的Iog(IC5tl)的試驗內配 對單側t檢驗。在該分析中，親合力成熟的XPA. 10. 064. 03,XPA. 10. 064. 06,XPA. 10. 064. 07 和XPA. 10. 064. 10抗體彼此之間在統計學上無差異。表9 親合力成熟的XPA. 10. 064HUVEC測定總結   實施例15 :ΧΡΑ. 10. 064. 06對腫瘤牛長的抑制使用實施例12中所討論的相同A673橫紋肌肉瘤腫瘤生長模型，測試 XPA. 10. 064. 06抑制腫瘤生長的能力。從第0天開始，將含有2. 5 X IO6個腫瘤細胞的50% Matrigel 皮下注射入六周齡裸鼠的中線胸脊柱區。第3天，當腫瘤尺寸達到約200mm3 時，將小鼠隨機分成7組(20只一組)并腹膜內注射同中型對照抗-KLH IgG2，以0. 1,0. 5 或5mg/kg的XPA. 10. 064. 06，或以0. 1、0. 5或5mg/kg的貝伐單抗，每周兩次。在第3、7、10、 14、17、21、24、28和31天測量腫瘤尺寸。如果和當腫瘤尺寸達到2000mm3時，處死小鼠。對 每只小鼠進行最終腫瘤測量后，采集腫瘤和血清樣本。XPA. 10. 064. 06和貝伐單抗均以劑量依賴方式抑制腫瘤生長(圖25-27)。用 0. 5mg/kg的XPA. 10. 064. 06處理導致至第17天的腫瘤退化，腫瘤尺寸保持在200mm3以下 (圖 25-27)。在第 17、21、24、28 和 31 天，用 0. 1 或 0. 5mg/kg 的 XPA. 10. 064. 06 處理的小 鼠表現出比用相同劑量的貝伐單抗處理的小鼠顯著更小的腫瘤(圖25-27)。由于腫瘤體積 超過2000mm3，因此必須在第24天處死三只用0. lmg/kg貝伐單抗處理的小鼠和三只用對照 抗體處理的小鼠，而在整個研究過程中用XPA. 10. 064. 06處理的小鼠無一達到該閾值。在第24天(所有動物均存活的最后一次測量日)，用0. lmg/kg的XPA. 10. 064. 06 處理的小鼠的腫瘤生長抑制百分率(％ TGI) (55% )與用5倍劑量的貝伐單抗所得到的結 果(0. 5mg/kg時為50% )類似。類似地，用0. 5mg/kg的XPA. 10. 064. 06處理的小鼠的％ TGI (85%)與用10倍劑量的貝伐單抗處理的小鼠中所觀察到的結果(5mg/kg時為95%) 類似。這些結果表明，XPA. 10. 064. 06在降低腫瘤體內生長方面比貝伐單抗有效至少5倍。 表10中總結了各個抗體在第24天時的腫瘤生長抑制百分率結果。表10 =XPA. 10. 064. 06對腫瘤生長的抑制  將各個抗體對腫瘤生長的延緩計算為用抗體和對照處理后腫瘤分別達到500mm3 所需的天數之間的差值。在0. 5mg/kg的劑量(分別為14天和5天)和在0. lmg/kg的劑 量(分別為7天和2天)，XPA. 10. 064. 06對腫瘤生長的延緩明顯長于BM-1。這些結果顯 示當抗體以相同劑量給予時，XPA. 10. 064. 06延緩腫瘤生長至特定尺寸的持續時間比貝伐 單抗長2到3倍。表11中總結了結果。表11 :XPA. 11. 064. 06對腫瘤生長的延緩 在第28天，對各個抗體/劑量進行基于腫瘤體積對時間的曲線下面積(AUC)的 計算。0. 5mg/kg的BM-I的AUC明顯比相同劑量的XPA. 10. 064. 06的高(分別為8865和 5517)。盡管差異不太明顯，但是0. lmg/kg的BM-1的AUC也比XPA. 10. 064. 06的高(分別 為9638和8703)。表12中總結了結果。表12 =XPA. 10. 064的曲線下面積
            
 進一步在HT-29人結直腸腺癌模型中測試了 XPA. 10. 064. 06抑制腫瘤生長的能 力。初步結果表明，每周給予兩次0. 1、0. 5或5mg/kg的XPA. 10. 064. 06在35天內不會導 致腫瘤尺寸在統計學上的顯著降低。對相同濃度的貝伐單抗得到了類似的結果。實施例16 對親合力成熟的抗體氧化的抑制如以上在實施例13中所討論的，每個親合力成熟的抗體XPA. 10. 064. 03、 XPA. 10. 064. 04,XPA. 10. 064. 06,XPA. 10. 064. 07 和 XPA. 10. 064. 10 均在 HCDR3 中含有親本
            
抗體中不存在的蛋氨酸殘基(具體地，在101殘基)。蛋氨酸殘基的氧化是蛋白質產品在儲 存期間常見的降解途徑。為了測試蛋氨酸氧化對親合力成熟抗體的影響，將XPA. 10. 064. 06和親本 XPA. 10. 064均暴露于氧化劑叔丁基過氧化氫(tBHP)。通過胰蛋白酶標測(tryptic mapping)結合液相色譜-質譜法(LC/MS)分析了在各個蛋氨酸殘基處所得的氧化程度。表 13中總結了結果。兩種抗體在蛋氨酸殘基48和81處表現出氧化，而在蛋氨酸殘基70處無 可測量的氧化。XPA. 10. 064. 06在位置101處的額外蛋氨酸殘基表現出顯著的氧化程度。表13 =XPA. 10. 064和XPA. 10. 064. 06中的蛋氨酸殘基的氧化  用Biacore分析了氧化的抗體對hVEGF165的結合動力學。XPA. 10. 064的氧化對 hVEGF165結合動力學的影響較小(圖28A)，而XPA. 10. 064. 06的氧化則導致體外VEGF結合
            
95親合力顯著降低(圖28B)。為了克服與氧化有關的問題并提高親合力成熟抗體長期儲存的穩定性，測試了包 含XPA. 10. 064. 06加抗氧劑的劑型。將用IOmM的L-組氨酸和140mM的L-精氨酸(pH 6. 0) 配制的lmg/ml的XPA. 10. 064和XPA. 10. 064. 06通過化學應力或熱應力進行氧化。對于化 學應力，將抗體用0. 的tBHP在存在或不存在5mM的L-蛋氨酸的情況下室溫孵育過夜。 對于熱應力，將抗體在存在或不存在5mM的L-蛋氨酸的情況下，在聚山梨醇酯中在40°C孵 育4周。用Biacore和ELISA分析這些抗體結合hVEGF165的能力。在抗體劑型中存在蛋氨 酸保留了熱應力下的hVEGF165結合親合力(圖29A、29B和30A)，并降低了化學應力對結合 親合力的消極影響(圖30B)。表14中總結了結果。表 14  實施例17 :XPA. 10. 064的講一步親合力成熟可以向XPA. 10. 064的重鏈可變區引入其他突變。具體地，XPA. 10. 064. 06HCDR3 中的蛋氨酸殘基可以突變為一個或多個丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和亮氨酸。SEQ ID NO 25-29中分別示出了這些突變體的HCDR3氨基序列。將對含有所得的HCDR3序列的抗 體進行結合分析以確定對hVEGF165的結合親合力。對hVEGF165表現出高親合力并且解離速 率高于10_5的抗體將重整為IgG并進行功能性分析以確定它們抑制HUVEC增殖、血管生成、 腫瘤生長和/或hVEGF165誘導的VEGF-R2磷酸化的能力。實施例18 :ΧΡΑ. 10. 064. 06 的表汰構建第一載體用于在CHO-Kl細胞中表達XPA. 10. 064. 06IgG2。該載體(pMXSP117) 含有分別融合至Y _2和κ恒定區的XPA. 10. 064. 06重鏈和輕鏈可變區，其中每個區均受 人CMV啟動子和小鼠輕鏈3’未翻譯區的控制。該載體含有用于選擇G418-耐受轉染子的 新基因。在圖31A和31B中分別示出了環形和線性形式的pMXSP117結構。構建pMXSP117 之前，將XPA. 10. 064. 06重鏈和輕鏈可變區克隆入含有分別如圖32A和32B所示的重鏈 (Y-2)和輕鏈(κ)恒定區中的模塊表達載體。將含有抗體信號順序的重鏈可變區作為 Sall/Blpl片段克隆如該重鏈模塊載體中。將含有抗體信號順序的輕鏈可變區作為Sail/ Bsiffl片段克隆入輕鏈模塊載體中。分兩步構建第二載體(PMXSP119)，其中除用編碼耐組氨醇(histidinol) WhisD 基因(組氨醇脫氫酶)代替neo基因外，該第二載體的結構與pMXSP117相同。第一步涉及 將XPA. 10. 064. 006重鏈轉錄單元與含有hisD基因的載體節段組合以產生載體pMXSP118。 第二步涉及將由XPA. 10. 064. 06輕鏈轉錄單元組成的限制片段與來自含有XPA. 10. 064. 06 重鏈轉錄單元和hisD基因的pMXSP118的載體節段組合而產生pMXSP119。培養出表達XPA. 10. 064. 06IgG2的CHO-Kl細胞系。轉染前，將來自未轉染細胞的研究細胞庫的細胞解凍并在EX-CELL  302無血清培養基(SAFC Biosciences, Lenexa, KS)上生長。通過使用線性聚氮丙啶(PEI ；25000MW ；Polysciences, Warrington, PA)和已經過Xbal消化而線性化的pMXSP117(圖31B)進行轉染，將編碼XPA. 10. 064. 06 輕鏈和重鏈的基因引入至適應無動物產品培養基的CHO-Kl細胞。在無動物產品培養基 上孵育三天后，將細胞懸浮于補充了 0.8mg/mlGeneticin 和胎兒牛血清(FBS)的 EX-CELL  302培養基并鋪在96孔板上。將含有單菌落的孔轉移到深孔96孔板中無 FBS的EX-CELL  302培養基上。再次用ELISA篩選后，在含有IOmL培養物的50ml開 口管和含有25mL培養物的125mL搖瓶中測試較好的(top)產生克隆以用于表達。根據它們的生產能力選擇的，將來自用pMXSP117初始轉染的幾種較好的生產細 胞調整到生產培養基，以便產生XPA. 10.064.06IgG2。為了進一步提高生產水平，用表達 相同重鏈和輕鏈序列但具有不同的可選擇標記物的另一載體(例如，載體PMXSP119，其 編碼了組氨醇耐受性)對較好遺傳霉素(Geneticin)耐受的生產細胞進行再轉染。通過 Xbal消化使PMXSP119載體線性化。在無動物產品培養基上孵育三天后，將細胞懸浮于補 充了 0. 4mg/ml遺傳霉素、8mM組氨醇和10A FBS的EX-CELL : 302培養基并鋪在96孔 板上。將含有通過ELISA鑒別為高產細胞的單菌落的孔轉移到深孔96孔板中無FBS的 EX-CELL  302培養基。在通過另外的ELISA篩選后，在搖瓶中測試產生較好的克隆體 的表達。根據生長和生產能力選擇的，將來自這種再轉染的幾種較好的生產細胞調整至無 動物產品生產培養基以便評價在搖瓶培養和生物反應器中的生長和生產。為已適應生產培 養基的這些較好的克隆準備了研究細胞庫。根據這些測試結果，將選擇一個克隆體用于主 細胞庫(MCB)的準備，其將用作良好作業規范(GMP)下生產XPA. 10. 064. OBIgG2的起點。實施例19 :ΧΡΑ. 10. 064. 06 的純化可以使用下列程序純化表達XPA. 10. 064. 06或其片段的細胞，如實施例18中該的 CHO-Kl細胞。發酵完成后，澄清細胞培養物并通過包含深度過濾器(CUN0，Meriden，CT)和 荷電膜濾器以及無菌0. 2μπι過濾器的過濾系列的過濾后收獲。將無細胞的澄清培養液上 樣至蛋白質A親和層析柱，然后用平衡緩沖液沖洗。用PH范圍在3-4的低ρΗ緩沖液洗脫 抗體，然后在PH 3. 8士0.2進行最長60分鐘的病毒滅活。調整病毒滅活池的ρΗ和電導率， 然后以流通模式上樣至陰離子交換柱，借此抗體流過該柱而雜質與其結合。將從陰離子交 換柱流過的液體用疏水相互作用色譜(HIC)柱進一步純化，除去諸如聚集體、DNA和宿主細 胞蛋白質的雜質，然后再通過納米濾器過濾，如Viresolve 常規流動細小病毒(NFP)過 濾器(Millipore)以除去病毒顆粒。使用超濾和滲濾(UF/DF)，將經過納濾的抗體配制成目 標濃度并將緩沖液交換成劑型緩沖液以產生大量藥物物質(BDS)。上述內容僅用于舉例說明本發明的各種實施方式。不能將上述討論的特定變形視 為對本發明范圍的限制。可以在不背離本發明范圍的情況下做出各種等同替換、改變和變 形，這對本領域技術人員將是顯而易見的，并且應理解這樣的等價實施方式將包括在本文 中。如同在本文中提供一樣，本文引用的所有參考文獻以它們的整體并入作為參考。參考文獻1. Al-Lazikani, B.，et al. 1997. J Mol Biol 273 :927_948.2. Amoroso, A. , et al. 1997. Eur Rev Med Pharmacol Sci 1  17-25.3. Ashida, S.，et al. 2003. J Urol 169 :2089_2093·
            
97
            
4.」
            
5.」
            
6.
            
7.
            
8.
            
9.
            
10
            
11,
            
12,
            
13
            
14,
            
15,
            
16,
            
17,
            
18,
            
19,
            
20
            
21,
            
22,
            
23
            
24,
            
25,
            
26,
            
27,
            
28,
            
29,
            
30
            
31
            
32
            
33
            
34,
            
35
            
36
            
37,
            
38,6444-6448.
            
39
            
40,
            
41,
            
Chaouche，M.，et al. 2000. Am J Clin Oncol 23:288-289.
            
Chothia, C.，et al. 1985. J Mol Biol 186 :651_663.
            
Chothia, C.，Lesk, Α. M. 1987. J Mol Biol 196 :901_917.
            
Chothia, C.，et al.1989. Nature 342 877-883.
            
Cumbers, S. J. , et al. 2002. Nat Biotechnol 20:1129—1134.
            
Dancey, J. Ε. 2002. Curr Pharm Des 8 :2259_2267·
            
de Gramont, Α. , et al. 2000. J Clin Oncol 18:2938-2947.
            
Dimmeler, S. ，Dembach, Ε. ，Zeiher, Α. Μ. 2000. FEBS Lett 477 258-262.
            
Dupont, J. , et al. 2005. Proc Am Soc Clin Oncol 23  199s.
            
Dvorak, H.F.，et al. 1995. Am J Pathol 146  1029-1039.
            
Elit, L. 2002. Curr Opin Investig Drugs 3:1249-1253.
            
Erlichman, C. , et al. 2001. Cancer Res 61 :739_748·
            
Erikkson, U. ,Alitalo, K. 1999.Curr Top Microbiol Immunol 237 :41_57·
            
Ferrara, N. 1999.Curr Top MicrobiolImmunol 237:1—30.
            
Ferrara, N.，et al. 2004. Nat Rev Drug Discov 3 :391_395.
            
Fishwild, D. M.，et al. 1996. Nat Biotechnol 14 :845_851.
            
Fry, D. W.，et al. 1994. Science 265  1093-1095.
            
Fuh, G.，et al. 2006. J Biol Chem 281 :6625_6631.
            
Furumai，R.，et al. 2002. Cancer Res 62 :4916_492L
            
Gamer, R.C.，et al. 2002. Drug Metab Dispos 30 :823-830.
            
Garrido, J. L. , et al. 1997. Cytobios 90 :47_65.
            
Giri，J. G.，et al. 1994. EMBO J 13 :2822_2830·
            
Haddad, J. J. 2001. Curr Opin Investig Drugs 2  1070-1076.
            
Hamers-Casterman, C. , et al. 1993. Nature 363 446-448.
            
Harris, A. L. 2000. Oncologist 5Suppl 1 :32_36.
            
Hawkins, R. E.，Russell, S. J.，Winter, G. 1992. J. Mol Biol. 226 :889_896. Hidalgo，M.，et al. 2001. J Clin Oncol 19:3267-3279. Holash, J. , et al. 2002. Proc Natl Acad Sci USA 99:11393—11398. Holliger, P. ， Prospero, Τ. ， Winter, G. 1993. Proc Natl Acad Sci USA90
            
Houston, et al. 1988. Proc Natl Acad Sci USA 85 :5879-5883. Hunt, J. T.，et al. 2000. J Med Chem 43 3587-3595. Hunt, S.2001. Curr Opin Mol Ther 3 :418_424·
            
98
            
42. Jianhua, H.，Kontos, C. D. 2002. J Biol Chem 277  10760—10766.43. Jostock, T.，et al. 2004. J Immunol Methods 289 :65_80·44. Kabat, Ε. Α. , et al. 1987. Sequences of Proteins of Immunological Interest,4thEdition, Public Health Service, NIH, Washington, D. C.45. Kabat, E.A. , et al. 1991. Sequences of Proteins of Immuno logical Interest, 5thEdition, Public Health Service, NIH, Washington, D. C.
            
Katre, N.V. 1990. J Immuno1144 :209-213. Katz, M. D.，Erstad, B. L. 1989. Clin Pharm 8 :255_273. Khamaisi, Μ. , et al. 2003. Nephrol Dial Transplant 18  1427-1430. Kim, K. S.，et al. 2003. J. Biol Chem 278  11449. Kimbro, K. S. , Simons, J. W. 2006.Endocr Relat Cancer 13 :739_749. Koch-Nolte, F.，et al.2007. FASEB J 21 :3490_3498. Lee, F. Y. , et al. 2001. Clin Cancer Res 7  1429-1437. Lee, Y. K.，et al. 2004. Blood 104 :788_794. Li, J. , et al. 2006. Proc Natl Acad Sci USA 103:3557-3562. Liang, ff-C,et al. 2006. J Biol Chem 281 :951_961. Lonberg, N. 2005. Nat Biotechnol 23:1117-1125. Loffinger, T.B.，et al. 2002. Curr Pharm Des 8 :2269_2278. Lowman, H. B. 1998. Phage display of peptide libraries on protein scaffolds. InS. Cabilly,Editor,Methods in Molecular Biology, vol. 87 !Combinatorial PeptideLibrary Protocols, Humana Press, Totowa, NJ,USA,pp.249—264.46,
            
47,
            
48,
            
49,
            
50
            
51,
            
52,
            
53
            
54,
            
55
            
56,
            
57,
            
58 230-235
            
931-934.
            
161 1 877-1880.
            
59.Matt em, J. , Koomaqi, R. , Volm, M. 1996. Brit J Cancer 73
            
60.McColley，S. A.，et al. 2000. Am J Respir Crit Care Med
            
61.Mendel, D. B. , et al. 2003. Clin Cancer Res 9:327-337.
            
62.Mendez, M. J.，et al. 1997. Nat Genet 15  146-156.
            
63.Michaelis, M.，et al. 2004. Mol Pharmacol 65 :520_527.
            
64.Michels, S. , Rosenfeld, P. J. 2004. Retinal Physician 1:16-22.
            
65.Michels, S. , et al. 2005. Opthamology 112:1035-1047·
            
66.Murohara, T.，et al.1998.Circulation 97 :99-107.
            
67.Muyldermans, S. , CambilIau, C. , Wyns, L. 2001. Trends Biochem Sci26
            
68.Nguyen,V. K. ,Desmyter,A. ,Muyldermans, S. 2001. Adv Immunol 79 :261-296.
            
69.Nguyen, V. K. , et al. 2002. Immunogenetics 54 :39_47.
            
70.Panek, R.L.，et al. 1997. J Pharmacol Exp Ther 283  1433-1444.
            
71.Riechmann, L. , Muyldermans,S.1999. J Immunol Methods 231 :25.
            
72.Rosenfeld, P. J. ， Moshfeghi, A. A. ， Puliafito, C. A. 2005. Ophthalmic Surg LasersImaging 36 :331_335.73. Rusnak, D. W.，et al. 2001. Mol Cancer Ther 1 :85_94.74. Sebolt-Leopold, J. S.，et al. 1999. Nat Med 5 :810_816.
            
99
            
75,
            
76,
            
77,
            
78,
            
79,
            
80
            
81,
            
82,
            
83,
            
84,
            
85,
            
86,
            
87.
            
88,
            
89,
            
90
            
91,
            
92,
            
Sehgal，S. N.，et al. 1994. Med Res Rev 14 1~22.
            
Senderowicz, Α. M. 2000.Oncogene 19 :6600_6606.
            
Shields, R. L.，Lai, J.，Keck, R. 2002. J Biol Chem 277 :26733_26740.
            
Shinkawa, T.，et al. 2003. J Biol Chem 278 :3466_3473.
            
Smaill, J. B.，et al. 2000. J Med Chem 43 :1380_1397·
            
Stork, G.，Schultz, A. G. 1971.J Am Chem Soc 93 4074-4075.
            
Tamura, M.，et al.1998. Science 280 :1614-1617.
            
Thomas, A. L. , et al. 2003. Semin Oncol 30 (3Suppl 6) :32_38.
            
Tomizuka, K. , et al. 2000. Proc Natl Acad Sci USA 97 -.122-121.
            
Vander Borght, Τ., et al.1991a.Gastroenterology 101 :794_799.
            
Vander Borght, T.，et al. 1991b. Int J Rad Appl Instrum[A]42  103-104.
            
Vlahos, C. J.，et al. 1994. J Biol Chem 269 :5241_5248.
            
Wells, P., et al. 1996. Clin Oncol(R Coll Radiol)8 :7_14.
            
ffilhelm, S.，Chien,D.S.2002. Curr Pharm Des 8 :2255_2257.
            
Wissner, A.，et al. 2003. J Med Chem 46 49-63.
            
Yancopoulos, G. D.，et al. 2000. Nature (London) 407 -.242-248.
            
Yang, X. D.，et al.1999.Cancer Res 59 :1236-1243.
            
Yang, X.D., et al. 2001. Crit Rev Oncol Hematol 38  17-23.
            
權利要求
            
一種分離的抗體或其抗原結合片段，包含一個或多個選自由以下組成的組中的成員a)包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的重鏈可變區；b)包含SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的輕鏈可變區；c)包含SEQ ID NO12、SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的輕鏈可變區；d)包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO15的重鏈可變區；e)包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO16的重鏈可變區；f)包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO17的重鏈可變區；g)包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO18的重鏈可變區；h)包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO19的重鏈可變區；i)包含在SEQ ID NO3中列出的XPA.10.072輕鏈的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈；j)包含在SEQ ID NO5中列出的XPA.10.064輕鏈的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈；k)包含在SEQ ID NO2中列出的XPA.10.072重鏈的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈；1)包含在SEQ ID NO4中列出的XPA.10.064重鏈的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈；m)包含在SEQ ID NO20中列出的XPA.10.064.03重鏈的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈；n)包含在SEQ ID NO21中列出的XPA.10.064.04重鏈的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈；o)包含在SEQ ID NO22中列出的XPA.10.064.06重鏈的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈；p)包含在SEQ ID NO23中列出的XPA.10.064.07重鏈的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈；和q)包含在SEQ ID NO24中列出的XPA.10.064.10重鏈的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈。
            
2.一種分離的抗體或其抗原結合片段，包含一個或多個選自由以下組成的組中的成員a)包含SEQID NO 2的重鏈；b)包含SEQID NO 3的輕鏈；c)包含SEQID NO 4的重鏈；d)包含SEQID NO 5的輕鏈；e)包含SEQID NO 20的重鏈；f)包含SEQID NO 21的重鏈；g)包含SEQID NO 22的重鏈；h)包含SEQID NO 23的重鏈；和i)包含SEQID NO 24的重鏈。
            
3.一種分離的抗體或其抗原結合片段，其特異地結合VEGF并包含下列性能中的一種 或多種a)結合人VEGF165的Kd為約10_10M；b)結合人VEGF165 的 ka 為約 1. 89 X IO5 ；c)結合人VEGF165 的 kd 為約 1. 73X 10_5 ；d)對人VEGF165的結合親合力比貝伐單抗對人VEGF165的結合親合力強約4.25倍；e)抑制HUVEC細胞增殖的IC5tl為約154pM；f)抑制HUVEC細胞增殖的IC5tl為貝伐單抗的約56%；g)結合人VEGF165 的 Kd 在約 1. 97 X 10_10M 至約 3. 49 X IiT11M 的范圍；h)結合人VEGF165的ka在約1.5 X IO5至約2. 16 X IO5M的范圍；i)結合人VEGF165的kd在約6.65 X 10_6至約2. 94X ICT5M的范圍； j)抑制HUVEC細胞增殖的IC5tl在約129pM至約174pM的范圍；k)對人VEGF的結合親合力比所述抗體或其抗原結合片段對鼠VEGF的親合力大至少約 10倍；1)與貝伐單抗競爭結合人VEGF165 ；m)當以相同或較低劑量給予時，作為腫瘤生長抑制百分率的函數，抑制腫瘤生長的程 度與貝伐單抗相同或更大；和η)當以與貝伐單抗相同或更低的劑量給予時，延緩腫瘤生長至規定尺寸的持續時間比 貝伐單抗更長。
            
4.一種分離的抗體或其抗原結合片段，包含a)包含在SEQID NO 20中列出的氨基酸序列的重鏈可變區；和b)包含在SEQID NO 5中列出的氨基酸序列的輕鏈可變區。
            
5.一種分離的抗體或其抗原結合片段，包含a)包含在SEQID NO 21中列出的氨基酸序列的重鏈可變區；和b)包含在SEQID NO 5中列出的氨基酸序列的輕鏈可變區。
            
6.一種分離的抗體或其抗原結合片段，包含a)包含在SEQID NO 22中列出的氨基酸序列的重鏈可變區；和b)包含在SEQID NO 5中列出的氨基酸序列的輕鏈可變區。
            
7.一種分離的抗體或其抗原結合片段，包含a)包含在SEQID NO 23中列出的氨基酸序列的重鏈可變區；和b)包含在SEQID NO 5中列出的氨基酸序列的輕鏈可變區。
            
8.一種分離的抗體或其抗原結合片段，包含a)包含在SEQID NO 24中列出的氨基酸序列的重鏈可變區；和b)包含在SEQID NO 5中列出的氨基酸序列的輕鏈可變區。
            
9.根據權利要求1-8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，為單克隆抗體。
            
10.根據權利要求1-8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，為多克隆抗體、雙特異 性抗體、嵌合抗體、人源化抗體、重組抗體、完全人抗體、標記的抗體、二價抗體或抗個體基 因型抗體。
            
11.根據權利要求1-8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，為駱駝化單域抗體、雙 體抗體、scFv、scFv 二聚體、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv，、Fv 片段、Fab、Fab，、F(ab，)2、ds 雙 體抗體、納米抗體、結構域抗體或二價結構域抗體。
            
12.根據權利要求1-8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，進一步包含免疫球蛋 白恒定區。
            
13.根據權利要求12所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述免疫球蛋白恒定區是 κ輕鏈、γ 1重鏈、γ 2重鏈、γ 3重鏈或γ 4重鏈恒定區。
            
14.根據權利要求1-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，當以貝伐單抗 劑量的二分之一給予時，作為腫瘤生長抑制百分率的函數，所述抗體或抗原結合片段抑制 腫瘤生長的程度與貝伐單抗相同或更大。
            
15.根據權利要求14所述的抗體或抗原結合片段，其中，當以貝伐單抗劑量的三分之 一給予時，作為腫瘤生長抑制百分率的函數，所述抗體或抗原結合片段抑制腫瘤生長的程 度與貝伐單抗相同或更大。
            
16.根據權利要求15所述的抗體或抗原結合片段，其中，當以貝伐單抗劑量的四分之 一給予時，作為腫瘤生長抑制百分率的函數，所述抗體或抗原結合片段抑制腫瘤生長的程 度與貝伐單抗相同或更大。
            
17.根據權利要求16所述的抗體或抗原結合片段，其中，當以貝伐單抗劑量的五分之 一給予時，作為腫瘤生長抑制百分率的函數，所述抗體或抗原結合片段抑制腫瘤生長的程 度與貝伐單抗相同或更大。
            
18.根據權利要求1-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，當以與貝伐單 抗相同或更低的劑量給予時，所述抗體或抗原結合片段抑制腫瘤生長至規定尺寸的持續時 間是貝伐單抗的至少兩倍。
            
19.根據權利要求1-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，當以與貝伐單 抗相同或更低的劑量給予時，所述抗體或抗原結合片段抑制腫瘤生長至規定尺寸的持續時 間是貝伐單抗的至少三倍。
            
20.根據權利要求1-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或抗 原結合片段與人VEGF165結合的Kd彡200pM。
            
21.根據權利要求1-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或抗 原結合片段與人VEGF165上的表位結合，所述表位與貝伐單抗所結合的表位至少部分地重 疊。
            
22.根據權利要求1-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或抗 原結合片段阻斷人VEGF165與VEGF-Rl和VEGF-R2的結合。
            
23.根據權利要求1-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或抗 原結合片段與人VEGF165結合的Kd是所述抗體或抗原結合片段與鼠VEGF165結合的Kd在數 量上的至多十分之一。
            
24.根據權利要求23所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或抗原結合片段 與人VEGF165結合的Kd是所述抗體或抗原結合片段與鼠VEGF165結合的Kd在數量上的至多 五十分之一。
            
25.根據權利要求24所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或抗原結合片段 與人VEGF165結合的Kd是所述抗體或抗原結合片段與鼠VEGF165結合的Kd在數量上的至多百分之一。
            
26.—種藥物組合物，包含根據權利要求1-25中任一項所述的抗體或其抗原結合片段 以及一種或多種生理學耐受組分。
            
27.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中，所述一種或多種生理學耐受組分包括一種或多種藥用載體。
            
28.根據權利要求27所述的藥物組合物，其中，所述一種或多種生理學耐受組分包括 一種或多種抗氧化劑。
            
29.根據權利要求28所述的藥物組合物，其中，所述一種或多種抗氧化劑選自由蛋氨 酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉬、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巰基乙酸、 硫代山梨糖醇、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、和/或沒食子酸丙酯組成的組。
            
30.一種藥物組合物，包含與一種或多種其他化療劑連接或聯合的根據權利要求1-25 中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
            
31.根據權利要求30所述的組合物，其中，所述其他化療劑選自由以下組成的組依 維莫司、曲貝替定、abraXane、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910. Na、AZD 6244 (ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、因扎托雷、凡 德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、FLT-3 抑制劑、VEGF-R 抑制劑、 EGFR TK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-I調節劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制 劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFR TK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗-HGF抗體、PI3激酶抑 制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、MAP激酶 激酶(MEK)抑制劑、VEGF誘捕抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、迪卡他尼、帕木單抗、氨 柔比星、奧戈伏單抗、L印-etu、諾拉曲特、azd2171、巴他布林、奧法木單抗、扎木單抗、艾特 咔林、粉防己堿、盧比替康、替米利芬、奧利默森、CTLA-4單抗、普利木單抗、棉酚、醋酸棉酚、 Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BI0 140、CC 8490、西倉吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、 INO 1001、IPdR、KRX-0402、硫蒽酮、LY 317615、neuradiab、維特斯朋、Rta 744,Sdx 102、他 倉帕奈、阿曲生坦、Xr 311、1~011^(1印8丨11、405-100380丄6-781丄6-1521、58-556629、厚膜素、 JNJ-16241199、伏立諾他、依托泊苷、吉西他濱、多柔比星、脂質體多柔比星、5’-脫氧-5-氟 尿苷、長春新堿、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib ；PD0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-谷 氨酸、^[4-[2-(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1!1-吡咯并[2，3-(1]嘧啶_5_基)乙基] 苯甲酰基]-二鈉鹽七水合物、喜樹堿、伊立替康；伊立替康、5-氟尿嘧啶和亞葉酸的組合、 PEG-標記的伊立替康、FOLFOX方案、他莫昔芬、托瑞米芬檸檬酸鹽、阿那曲唑、依西美坦、來 曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、軛合的雌激素、貝伐單抗(一種分離的與人IGFlR 特異結合的抗體)、IMC-lCll、CHIR-258、3-[5-(甲磺酰基哌啶甲基)_吲哚基]-喹諾酮、瓦 他拉尼、AG-013736、AVE-0005、醋酸性瑞林、亮脯利特醋酸鹽、曲普瑞林雙羥萘酸鹽、舒尼替 尼、舒尼替尼蘋果酸鹽、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、乙酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟 他胺、尼魯米特、乙酸甲地孕酮、CP-724714 ；TAK-165、HKI-272、厄洛替尼、拉帕他尼、卡紐替 尼、ABX-EGF 抗體、愛必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、羅那法尼、BMS-214662、替吡法尼； 阿米斯丁、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺異羥肟酸、丙戊酸、曲古菌素A、FK-228, SU11248、索拉 非尼、KRN951、氨魯米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來霉素、 布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯屈膦酸、環磷酰胺、環丙 孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的 松、氟甲睪酮、氟他胺、羥基脲、伊達比星、異環磷酰胺、伊馬替尼、亞葉酸、亮脯利特、左旋咪 唑、洛莫司汀、氮芥、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、 尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米膦酸、噴司他丁、普卡霉素、嚇吩姆、丙卡巴胼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、聯合地塞米松的沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替 派、維A酸、長春地辛、13-順-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌氮芥、六甲蜜胺、氮尿 苷、5-脫氧尿苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、6-巰基嘌呤、脫氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、普 卡霉素、長春堿、長春瑞濱、拓撲替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、 角鯊胺、內皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、維塔辛、屈洛 昔芬、idoxyfene、螺內酯、非那司提、甲腈咪胍、曲妥珠單抗、地尼白介素-2、吉非替尼、硼替 佐米、紫杉醇、不含克列莫佛的紫杉醇、多西他賽、埃博霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈 洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾 多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、拓撲替康、PTK787/ZK 222584、VX-745、PD 184352、 雷帕霉素、40-0-(2_羥乙基)-雷帕霉素、替西羅莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、 LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L_779，450、 PEG-非格司亭、達貝泊汀、5-氟尿嘧啶、促紅細胞生成素、粒性白細胞群刺激因子、唑侖二 膦酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒性白細胞巨噬細胞群刺激因子、組氨瑞林、聚乙二醇化干擾 素α-2a、干擾素α-2a、聚乙二醇化干擾素α-2b、干擾素α-2b、阿扎胞苷、PEG_L_天冬酰 胺酶、來拉度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿侖珠單抗、全反式維甲 酸、酮康唑、干擾白細胞素_2、甲地孕酮、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素、地西他濱、六 甲三聚氰胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、可的松、棕櫚仁油酸、米托坦、環胞霉素、 脂質體柔紅霉素、埃德溫_門冬酰胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-I受體拮抗劑、帕洛 諾司瓊、阿瑞吡坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、勞拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、 屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、托烷司瓊、聚乙 二醇化非格司亭、促紅細胞生成素、依伯汀α和達貝泊汀α，
            
32.   所述的抗體或其抗原結合片段。
            
33.一種分離的多肽，包含一個或多個選自由SEQ ID NO :2-5和20-24組成的組中的氨基酸序列。
            
34.一種分離的多核苷酸，編碼權利要求33所述的多肽。
            
35.一種分離的載體，包含權利要求34所述的多核苷酸。
            
36.一種分離的宿主細胞，包含權利要求35所述的載體。
            
37.一種表達包含一個或多個選自由SEQ ID NO :2_5和20-24組成的組中的氨基酸序 列的多肽的方法，包括在表達權利要求34所述的多核苷酸的條件下培養權利要求36所述 的分離的宿主細胞。
            
38.根據權利要求37所述的方法，其中，所述多核苷酸可操作地與CMV啟動子連接并且 其中所述宿主細胞為中華倉鼠卵巢細胞。
            
39.一種抑制需要其的哺乳動物受試者中的血管生成的方法，包括向所述受試者給予 治療有效量的根據權利要求1-25中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體 或其抗原結合片段可選地連接或聯合一種或多種其他化療劑。
            
40.一種治療需要其的哺乳動物受試者中的與異常血管生成有關的疾病的方法，包括 向所述受試者給予治療有效量的根據權利要求1-25中任一項所述的抗體或其抗原結合片 段，其中，所述抗體或其抗原結合片段可選地連接或聯合一種或多種其他化療劑。
            
41.一種治療需要其的哺乳動物受試者中的與VEGF信號轉導有關的炎性疾病的方法， 包括向所述受試者給予治療有效量的根據權利要求1-25中任一項所述的抗體或其抗原結 合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段可選地連接或聯合一種或多種其他化療劑。
            
42.根據權利要求41所述的方法，其中，所述疾病選自由類風濕性關節炎、牛皮癬、硬 皮病、慢性阻塞性肺病和哮喘組成的組。
            
43.一種治療需要其的哺乳動物受試者中的濕性急性黃斑變性或糖尿病視網膜病變的 方法，包括向所述受試者給予治療有效量的根據權利要求1-25中任一項所述的抗體或其 抗原結合片段。
            
44.一種治療需要其的哺乳動物受試者中的與VEGF信號轉導升高有關的癌癥的方法， 包括向所述受試者給予治療有效量的根據權利要求1-25中任一項所述的抗體或其抗原結 合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段可選地連接或聯合一種或多種其他化療劑。
            
45.根據權利要求44所述的方法，其中，所述癌癥選自由以下組成的組惡性腫瘤，胚 細胞瘤，肉瘤，生殖細胞腫瘤，如白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤的血液或淋巴惡性腫瘤，如 小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌或肺鱗狀細胞癌的肺癌，腹膜癌，如肝細胞癌/肝細胞 瘤的肝癌，如胃腸癌的胃癌、胰癌，如成膠質細胞瘤/多形性成膠質細胞瘤、非成膠質細胞 瘤、腦腫瘤或腦膜瘤的腦腫瘤，如室管膜瘤、星形細胞瘤、間變型星形細胞瘤、少突神經膠質 細胞瘤、或如少突星形細胞瘤的混合性神經膠質瘤的神經膠質瘤，宮頸癌，卵巢癌，如肝母 細胞瘤、肝細胞癌/肝細胞瘤、或肝部癌的肝癌、如尿道癌的膀胱癌，乳腺癌，結腸癌，結直 腸癌，直腸癌、，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，如腎橫紋肌樣瘤的腎癌，前列腺癌，外陰 癌，陰莖癌，如肛門鱗狀細胞癌的肛門癌，甲狀腺癌，如鼻咽癌的頭部和頸部癌癥，如黑素瘤 或鱗狀細胞癌的皮膚癌，骨肉瘤，尤因肉瘤，軟骨肉瘤，如橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、皮膚多發 性出血性肉瘤的軟組織肉瘤，類癌性癌，如成視網膜細胞瘤的眼癌，間皮瘤，如急性淋巴細胞/成淋巴細胞白血病、慢性成淋巴細胞/淋巴細胞白血病、急性骨髓性/成髓細胞白血病 的淋巴細胞/成淋巴細胞白血病，包括肥大細胞白血病、慢性骨髓性/髓細胞/成髓細胞白 血病、毛細胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性單核細胞性白血病、濾泡性淋巴瘤、 彌漫性大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、蕈狀真菌病、賽謝綜合征、皮膚T 細胞淋巴瘤、肥大細胞贅生物、成神經管細胞瘤、腎胚細胞瘤、孤立性漿細胞瘤、脊髓發育不 良綜合征、慢性和非慢性骨髓增生性疾病、中樞神經系統腫瘤、垂體腺瘤、前庭許旺氏細胞 瘤、原發神經外胚層腫瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅細胞增多、血小板增多、和自 發骨髓纖維化。
            
46.一種試劑盒，包括根據權利要求1-25中任一項所述的抗體或其抗原結合片段以及 使用所述抗體或抗原結合片段的說明書。
            
47.一種分離的抗體或其抗原結合片段，包含重鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含選 自由 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19 組成 的組中的氨基酸序列。
            
全文摘要
            
本文公開了完全人抗體及其抗原結合片段，所述抗體及其抗原結合片段特異地結合人VEGF并抑制VEGF與VEGF-R1和VEGF-R2的結合，并因此抑制VEGF信號轉導。本文公開的抗體和抗原結合片段可用于，例如，治療體內和體外血管生成以及與血管生成有關的病癥。
            
文檔編號C12P21/08GK101918579SQ200880122208 
            
公開日2010年12月15日 申請日期2008年10月20日 優先權日2007年10月22日
            
發明者沃爾特·羅伯特·畢曉普, 琳達·馬薩特, 竹內俊彥, 舒曼特·拉馬錢德拉, 西瑪·坎塔克, 黃清儀, 黃超白 申請人:先靈公司;佐馬技術有限公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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