包含人血清的無飼養(yǎng)物多能干細胞培養(yǎng)基的制作方法

專利名稱：包含人血清的無飼養(yǎng)物多能干細胞培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及用于培養(yǎng)多能干細胞和/或癌干細胞的組合物和方法，其包括含 有人血清的確定培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
胚胎干(ES)細胞是一種強大的模式系統(tǒng)，可用于多能細胞生物學(xué)和早期胚胎內(nèi) 分化潛在機制的研究，以及提供哺乳動物遺傳操作的機會和所得的商業(yè)化、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)應(yīng) 用。而且，ES細胞的適宜增殖和分化可以潛在地用于生成適宜于移植以治療由細胞損傷 或功能障礙引起的疾病的無限源細胞。其它多能細胞和細胞系包括如國際專利申請WO 99/53021所述的早期原始外胚層樣(EHJ細胞，體內(nèi)或體外衍生的ICM/上胚層，體內(nèi)或體 外衍生的原始外胚層，原生殖細胞(EG細胞)，畸胎癌細胞(EC細胞)，和由去分化或核移植 衍生的多能細胞，將共享某些或所有這些特性和應(yīng)用。國際專利申請WO 97/32033和美國 專利第5，453，357號描述了包括來自非嚙齒類物種的細胞的多能細胞。在國際專利申請WO 00/27995和美國專利第6，200, 806號描述了人ES細胞，而在國際專利申請WO 98/43679描 述了人EG細胞。迄今為止，僅報導(dǎo)了幾種分離和生長靈長類干細胞的次優(yōu)方法。例如，使用添加了 白血病抑制因子(LIF)的無飼養(yǎng)物(feeder)培養(yǎng)，將鼠科胚胎干細胞維持在未分化狀態(tài)。 另一方面，當(dāng)細胞在無飼養(yǎng)物細胞層或來自適宜飼養(yǎng)物細胞系的條件培養(yǎng)基下培養(yǎng)時，即 使存在LIF，人胚胎干細胞也會分化。采用飼養(yǎng)物細胞(或來自飼養(yǎng)物細胞培養(yǎng)物的條件培 養(yǎng)基)的系統(tǒng)通常使用來自不同物種的細胞而不是正培養(yǎng)的干細胞，例如在大部分報道的 人胚胎干細胞未分化生長中，小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)會形成飼養(yǎng)層(feeder layer) 0 而且，無飼養(yǎng)物系統(tǒng)的報道通常需要使用來自MEF培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基，其不能滿足非異 種產(chǎn)物/試劑的需要。甚至采用人飼養(yǎng)物細胞的系統(tǒng)具有將未分化細胞暴露于不確定培養(yǎng) 條件下的缺陷，因此許多干細胞培養(yǎng)條件通常是不可再現(xiàn)的。此外，對于大多數(shù)細胞療法，治療需要極大量的多能干細胞。根據(jù)使用埃德蒙頓方 案的胰島移植所需的細胞數(shù)量，所需的分化細胞估計量在IO9-IOltl細胞/患者的數(shù)量級。而 且，取決于hES衍生分化靶細胞，未分化hESCs的數(shù)量可能在更高數(shù)量級。因此需要鑒定培養(yǎng)、穩(wěn)定和大規(guī)模生產(chǎn)治療目的的均一種群的靈長類多能干細胞 的方法和組合物，其中培養(yǎng)組合物是確定的和/或按GMP標(biāo)準生產(chǎn)的。在下文具體描述的本發(fā)明提供了使用未暴露或源于非人類的試劑，培養(yǎng)未分化 hESCs的方法和組合物，從而提供更安全的培養(yǎng)基。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了用于支持未分化干細胞長期培養(yǎng)的確定培養(yǎng)基的組合物和方法。該 培養(yǎng)基基本上是無飼養(yǎng)物的(即不需要飼養(yǎng)物細胞或飼養(yǎng)物細胞條件培養(yǎng)基)，且基本上 不含任何基質(zhì)涂層(matrix coating)。因而，一方面，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)干細胞包括未分化多能干細胞的確定培養(yǎng)基。 在溶液中，相對于正培養(yǎng)的干細胞，該培養(yǎng)基基本上是等滲的。在給定的培養(yǎng)中，特定培養(yǎng) 基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和一定量的多種基本上支持胚胎干細胞未分化生長的因子。在優(yōu)選實施 方式中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有鹽，必需氨基酸，可被靈長類干細胞代謝的碳源，和人血清。所有這 些成分都按基本上支持靈長類干細胞未分化生長的量來提供。在一實施方式中，本發(fā)明提供了無飼養(yǎng)物靈長類多能干細胞組織培養(yǎng)組合物，其 包含未分化的人胚胎干細胞(hESC)，含有人血清(hS)的確定培養(yǎng)基，其中人血清還含有至 少一種具有至少IOOkDa分子量的可溶性粘附組分，其中該組合物本質(zhì)上無飼養(yǎng)物細胞。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了無飼養(yǎng)物靈長類多能干細胞組織培養(yǎng)組合物， 其包含未分化的人胚胎干細胞(hESC)，含有人血清(hS)或其可溶性粘附組分的確定培養(yǎng) 基，其中人血清還含有至少一種具有至少IOOkDa分子量的可溶性粘附組分，其中該組合物 本質(zhì)上無飼養(yǎng)物細胞。在又一實施方式中，本發(fā)明提供了在無飼養(yǎng)物確定培養(yǎng)基中培養(yǎng)靈長類胚胎干細 胞的方法，其是通過在可支持干細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞，該培養(yǎng)基基本上 無飼養(yǎng)物細胞并還包含約0. 5% -約2%的人血清，培養(yǎng)步驟進行超過一個月，在培養(yǎng)中胚 胎干細胞增殖而維持干細胞分化成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織的衍生物的潛能，并維持 胚胎干細胞的核型。本文將更具體地描述本發(fā)明的這些和其它實施方式。本發(fā)明的每個限制可包括本發(fā)明的多種實施方式。因此預(yù)期涉及任一元素或元素 組合的本發(fā)明的每個限制可包括在本發(fā)明的每個方面。本發(fā)明的應(yīng)用不限于以下說明書所 列出的或附圖
所解釋的具體構(gòu)建和組分排布。本發(fā)明可以有其它實施方式和以多種方式實 踐或執(zhí)行。本文所用的措辭和術(shù)語是為描述的目的而不應(yīng)認為是限制。本文所用的“包括”， “含有”，或“具有”，“包含”，“涉及”，和其變體，表示包括其后所列的項目和其等效物以及其 它項目。附圖簡要說明圖IA-圖IE顯示了在0-3代(p0_p3)和第1_4天(dl_d4)，在包含多種濃度人血 清的確定培養(yǎng)基中多能干細胞培養(yǎng)物的顯微圖象。圖2是包含RT-PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠顯微圖象，其使用了多能hESCs的0CT4， NANOG, REXl，S0X2, UTFl，CRIPTO, F0XD3, TERT, DPPA5AFP, MSXl 和 HANDl 細胞標(biāo)志物(2-11 道，從左到右)和分化的hES-衍生細胞(12-14道)。圖3描述了在多能hESCs (67代；1道，左)、d3定形內(nèi)胚層培養(yǎng)物(2，4和5道) 和d5前腸內(nèi)胚層培養(yǎng)物(3和6道)中S0X17、HNFlB和HNF4A的標(biāo)準化、相對表達。發(fā)明詳述Stojkovic et al. (Stem Cells Express (干細胞表達)(2005) Stem Cells23 895-902，2005年5月11日在線原始出版)描述了人血清用作無飼養(yǎng)物條件下人胚胎干細胞(hESCs)生長的基質(zhì)。該方法涉及室溫下以人血清(hs)涂布平板1小時，之后去除過量 的血清并將平板在室溫下干燥1小時。人血清是源于男性凝固血，通過FDA批準的檢驗，檢 驗發(fā)現(xiàn)對乙型肝炎表面抗原成陰性，抗丙型肝炎病毒，和抗HIV/HIV-2。hESC的再接種也應(yīng) 該使用血清預(yù)涂平板。在一些實施方式中，人血清與hESC-dF-條件培養(yǎng)基一起使用。條件 培養(yǎng)基源于成纖維細胞樣細胞培養(yǎng)物，其來源于自發(fā)分化的hESCs，如Stojkovic et al所 述的。如以下更具體描述，本發(fā)明提供了用于在確定培養(yǎng)基中且缺乏基質(zhì)、飼養(yǎng)層或平 板涂層下培養(yǎng)、維持和生長均一和未分化靈長類多能干細胞、特別地hESCs的組合物和方 法。除非另外指出，本文所用術(shù)語應(yīng)按照相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。 除了以下提供的術(shù)語定義之外，分子生物學(xué)中常用術(shù)語的定義也可查詢Rieger et al., 1991 Glossary of genetics :classical andmolecular, 5th Ed.(經(jīng)典禾口分子遺傳學(xué) 詞匯，第 5 版)，Berlin :Springer_Verlag ;and in Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗方案)，F(xiàn). M. Ausubel et al. ,Eds. ,Current Protocols(現(xiàn) 代實驗方案)，GreenePublishing Associates, Inc.和 John ffiley&Sons, Inc.的合資企 業(yè)(1998增補)，或任何基于網(wǎng)絡(luò)的詞典。應(yīng)該理解的是，如說明書和權(quán)利要求書中所用的， “一個/種”可表示一個/種或多個/種，這取決于其所在的上下文。因而，例如涉及“一個 /種細胞”可表示可利用至少一個/種細胞。如本文所用的，術(shù)語“接觸”(即將細胞例如可分化細胞與化合物接觸)意在包括 在體外一起孵育化合物和細胞(例如，添加化合物至培養(yǎng)細胞中)。應(yīng)理解與確定培養(yǎng)基接 觸的細胞可以以細胞分化環(huán)境進一步處理，以穩(wěn)定細胞，或分化細胞。如本文所用的，術(shù)語“穩(wěn)定”，當(dāng)用于涉及細胞或細胞培養(yǎng)物的分化狀態(tài)時，表示該 細胞將繼續(xù)增殖多代，這發(fā)生在培養(yǎng)中，并優(yōu)選不確定地培養(yǎng)中，其中，培養(yǎng)物中的大部分 (如果不是所有)細胞處于相同的分化狀態(tài)。此外，當(dāng)穩(wěn)定細胞分裂時，分裂通常產(chǎn)生相同 細胞類型的細胞或產(chǎn)生相同分化狀態(tài)的細胞。穩(wěn)定細胞或細胞種群通常不會進一步分化或 去分化，如果細胞培養(yǎng)條件不改變且細胞繼續(xù)傳代并不過度生長。在一實施方式中，被穩(wěn)定 的細胞可以在穩(wěn)定狀態(tài)下不確定地增殖，或至少大于2代。在一更具體實施方式
中，細胞穩(wěn) 定大于3代，4代，5代，6代，7代，8代，9代，大于10代，大于15代，大于20代，大于25代， 或大于30代。在一實施方式中，細胞穩(wěn)定繼續(xù)傳代大于大約1個月，2個月，3個月，4個月， 5個月，6個月，7個月，8個月，9個月，10個月，或11個月。在另一實施方式中，細胞穩(wěn)定繼 續(xù)傳代大于大約1年。在一實施方式中，通過在確定培養(yǎng)基中常規(guī)傳代使干細胞在多能狀 態(tài)下維持培養(yǎng)，直至希望它們分化。如本文所用的，術(shù)語“增殖”是指細胞培養(yǎng)中細胞數(shù)量 的增加。因此，如本文所用的，術(shù)語“生長環(huán)境”是干細胞(例如靈長類胚胎干細胞)在體 外增殖的環(huán)境。環(huán)境的特征包括培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，和(如果存在)支持結(jié)構(gòu)(例如在固 定表面上的基底)?！按_定”培養(yǎng)基是指僅含有生物化學(xué)確定組成物的生物化學(xué)上確定的配方。確定 培養(yǎng)基可僅包括具有已知化學(xué)組成的組成物。確定培養(yǎng)基還可包括衍生自已知來源的組成物。例如，確定培養(yǎng)基還可包括由已知組織或細胞分泌的因子和其它組合物；然而，確定培 養(yǎng)基不包括來自這些細胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基。因而，如果標(biāo)明，“確定培養(yǎng)基”可包括添加 以形成培養(yǎng)基的特定化合物。如本文所用的，術(shù)語“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”是指可有效支持培養(yǎng)細胞生長的氨基酸、維生 素、鹽和營養(yǎng)素的溶液，盡管通常地，這些化合物并不支持細胞生長除非添加了其它化合 物。營養(yǎng)素包括可被細胞代謝的碳源(例如糖如葡萄糖)，以及細胞存活必需的其它化合 物。存在細胞自身不能合成的化合物，這是由于缺乏編碼合成該化合物(例如必需氨基 酸)所必需蛋白的一個或多個基因，或與細胞可以合成的化合物相關(guān)，因為它們的特定的 發(fā)育狀態(tài)，編碼必需生物合成蛋白的基因不按足夠水平表達。許多基礎(chǔ)培養(yǎng)基是哺乳動物 細胞培養(yǎng)領(lǐng)域所已知的，例如達爾貝科改良依格培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium) (DMEM)，敲除-DMEM(KO-DMEM)，和DMEM/F12，盡管可采用在基本上不分化狀態(tài)下支 持靈長類胚胎干細胞生長的任何基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本文所述的“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”也是指2007年6 月13日提交的PCT/US2007/062755所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將其全文并入本文。基礎(chǔ)培養(yǎng)基可包含或不包含“外源胰島素或胰島素替代物”，其是指并非有意加入 本發(fā)明的組合物或方法中的胰島素或胰島素替代物。因而，在本發(fā)明的特定實施方式中，方 法和組合物不含有意提供的胰島素或胰島素替代物。然而，組合物或方法可以不必不含內(nèi) 源胰島素。如本文所用的，“內(nèi)源胰島素”表示根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)時，培養(yǎng)細胞自身可產(chǎn) 生胰島素。內(nèi)源胰島素也可用于表示來自原代細胞培養(yǎng)物的殘留雜質(zhì)或來自起始材料的雜 質(zhì)。在特定實施例中，本發(fā)明的組合物和方法包含小于50，45，40，35，30，25，20，15，10，9，8， 7,6,5,4,3,2,1,0. 5,0. 25，0. 1 μ g/ml的胰島素，或基本上不包含胰島素。需明確的是，術(shù)語“胰島素”是指在正常生理濃度下與胰島素受體結(jié)合和可通過胰 島素受體誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，或變體或其片段。術(shù)語“胰島素”包括具有天然人胰島素或 其它哺乳動物胰島素的多肽序列、或這些序列的任意同源物或變體的多肽序列的蛋白。此 外，術(shù)語胰島素包括能夠結(jié)合胰島素受體以通過胰島素受體誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽片段。術(shù) 語“胰島素替代物”是指可用于替代胰島素以提供基本上與胰島素類似結(jié)果的任何含鋅化 合物。胰島素替代物的實例包括但不限于氯化鋅，硝酸鋅，溴化鋅和硫酸鋅。還需明確的是，胰島素樣生長因子不是胰島素替代物或胰島素同源物，如本發(fā)明 所涉及的。因此，在另一具體實施方式
中，本發(fā)明的組合物和方法包括使用至少一種胰島素 樣生長因子(IGF)或其變體或功能片段。在另一實施方式中，本發(fā)明的組合物和方法不含 任何外源胰島素樣生長因子(IGFs)。在具體實施方式
中，本發(fā)明的組合物和方法包含小于 200，150，100,75,50,25,20,15，10，9，8，7，6，5，4，3，2 或 lng/ml 的 IGF-I0確定培養(yǎng)基和/或基礎(chǔ)培養(yǎng)基可包括“非必需氨基酸”，其是指對于給定細胞類型 而言不需要加入培養(yǎng)基的氨基酸物質(zhì)，因為通常細胞會合成，或能夠合成特定氨基酸物質(zhì)。 雖然物質(zhì)之間不同，但是非必需氨基酸已知包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷 氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸和L-絲氨酸。確定培養(yǎng)基和/或基礎(chǔ)培養(yǎng)基也可包括多種生長因子，因此本文所述確定培養(yǎng)基 中可包括或不包括的術(shù)語“生長因子”是指有效促進干細胞生長的物質(zhì)，并且除非作為補充 劑加入培養(yǎng)基中，否則其不是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分。換言之，生長因子是正培養(yǎng)細胞(包括 任何飼養(yǎng)物細胞，如果存在)不分泌的分子，或如果是由培養(yǎng)基中細胞分泌的，其分泌量不足以實現(xiàn)外源加入生長因子所獲得的結(jié)果。生長因子包括但不限于堿性成纖維細胞生長 因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、胰島素樣生長因 子-I (IGF-I)、胰島素樣生長因子-II (IGF-II)、血小板衍生生長因子-AB(PDGF)、和血管內(nèi) 皮細胞生長因子(VEGF)、激活素-A、和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、細胞因子、炎癥趨化因子、 形態(tài)發(fā)生素、中和抗體、其它蛋白和其它分子，包括但不限于PCT/US07/062755所述的神經(jīng) 生長因子，通過參考將其全文并入本文。本文所述的確定培養(yǎng)基基本上也不包含胰島素或 缺乏實質(zhì)量的胰島素。本文所述的培養(yǎng)條件是“等滲”，該術(shù)語是指與相比較的另一溶液具有本質(zhì)上相同 張性(即有效滲透壓當(dāng)量)的溶液。在細胞培養(yǎng)中，“等滲”培養(yǎng)基是可以在無可見凈水流 通過細胞膜下培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基。此外，本文所述的培養(yǎng)條件是具有“低滲透壓”的溶液，其是指具有小于約300毫 滲摩爾每千克(“mOsm/kg”)的滲透壓的溶液。盡管本發(fā)明不采用條件培養(yǎng)基，但如本文所述的短語“條件培養(yǎng)基”是指還添加了 來源于培養(yǎng)基中所培養(yǎng)細胞的可溶性因子的生長培養(yǎng)基。從細胞培養(yǎng)物中分離條件培養(yǎng)基 的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。應(yīng)該理解的是，條件培養(yǎng)基優(yōu)選本質(zhì)上不含細胞。在該語境中，“本 質(zhì)上不含細胞”是指與其所分離自的培養(yǎng)物相比，包含比每單位體積細胞數(shù)量小約10%，優(yōu) 選小約5%、1%、0. 1%,0.01%,0. 001%和0. 0001%的條件培養(yǎng)基。但是，應(yīng)考慮到技術(shù)人 員可“基本上去除”一種或多種可檢測的條件培養(yǎng)基組分。例如，技術(shù)人員可從條件培養(yǎng)基 中去除一定量的可檢測已知組分，這與未分級的條件培養(yǎng)基相比，形成分級的條件培養(yǎng)基。 可通過適宜去除可檢測組分的任何方法(或方法的組合)實施條件培養(yǎng)基的分級，所述方 法例如凝膠過濾層析、親和層析、免疫沉淀、大小排阻裝置等?！叭伺咛ジ杉毎被颉癶ES細胞”或“hESCs”或“干細胞”或“多能干細胞”是從動 物(例如靈長類，例如人)胚胎獲得的細胞。這些術(shù)語和短語與短語“可分化細胞”是等同 的?！翱煞只毎庇糜诿枋鲞@樣的細胞或細胞群，其可分化成至少部分成熟細胞，或可參與 可分化成至少部分成熟細胞的細胞的分化、例如與其它細胞融合。如本文所用的，“部分成 熟細胞”是表現(xiàn)出來自相同器官或組織的成熟細胞的至少一種表型、例如形態(tài)或蛋白表達 的特征的細胞。如本文所用的可分化細胞可以是多能、多向(multipotent)、寡能或甚至單能的， 如下文具體定義。在本發(fā)明的特定實施方式中，可分化細胞是多能可分化細胞。在更具體 實施方式中，多能可分化細胞選自胚胎干細胞、ICM/上胚層細胞、原始外胚層細胞、原生殖 細胞和畸胎癌細胞。在一特定實施方式中，可分化細胞是哺乳動物胚胎干細胞。在一更特 定實施方式中，可分化細胞是人胚胎干細胞。本發(fā)明也考慮了來自動物體內(nèi)任何來源的可分化細胞，只要該細胞如本文所定義 是可分化的。例如，可從胚胎，或其中的任何原生胚層，從胎盤或絨毛膜組織，或從更多成熟 組織例如成人干細胞包括但不限于脂肪、骨髓、神經(jīng)組織、乳房組織、肝組織、胰腺、上皮、呼 吸、性腺和肌肉組織收獲可分化細胞。在具體實施方式
中，可分化細胞是胚胎干細胞。在另 一具體實施方式
中，可分化細胞是成人干細胞。在又一具體實施方式
中，干細胞是胎盤或絨 毛膜源的干細胞。當(dāng)然，本發(fā)明考慮使用來自于能夠生成可分化細胞的任何動物的可分化細胞，例
7如胰腺型細胞如β細胞。從其收獲可分化細胞的動物可以是脊椎動物或無脊柱動物、哺乳 動物或非哺乳動物、人或非人。動物來源的實例包括但不限于靈長類、嚙齒類、尖牙類、貓科 動物、馬類、牛類和豬類?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法衍生本發(fā)明的可分化細胞。例如，可使用 去分化和核移植方法產(chǎn)生人多能細胞。此外，可在體內(nèi)或體外衍生本發(fā)明所用的人ICM/上 胚層細胞或原始外胚層細胞。如W099/53021所述，可在貼壁培養(yǎng)中或以懸浮培養(yǎng)中的細胞 團塊生成原始外胚層細胞。而且，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法使人多能細胞傳 代，包括人工傳代法，和容積傳代法例如酶或非酶傳代。如本文所用的，術(shù)語“分化”是指產(chǎn)生比其所源自的細胞類型更分化的細胞類型。 因此該術(shù)語包括部分和終末分化的細胞類型。在本發(fā)明的某些實施方式中，術(shù)語“富含”是指包含至少50 %、55 %、60 %、65 %、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%所需細胞譜系的細胞培養(yǎng)物。如本文所用的，術(shù)語“基本上未分化”的細胞培養(yǎng)物是指包含至少約50%、優(yōu)選 至少約60%、70%或80%、甚至更優(yōu)選至少約90%未分化干細胞的干細胞群。熒光活化 細胞分選法可用于測定給定干細胞群中有多少細胞是未分化的，所述分選法使用一個或多 個指示所需未分化狀態(tài)的標(biāo)志物的標(biāo)記抗體或報告基因/蛋白(例如，增強綠色熒光蛋白 [EGFP])。為進行這種評估，可檢測與未分化狀態(tài)相關(guān)的一個或多個細胞表面標(biāo)志物(例如 SSEA-4、Tra-1-60和Tra_l_81)，以及典型的多能干細胞轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)志物，0ct_4。也可檢測 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)活性和堿性磷酸酶。對于靈長類干細胞，陽性和/或陰性選擇可用 于例如通過免疫染色或采用報告基因(例如EGFP)，檢測某些標(biāo)志物(例如0ct-4、SSEA-4、 Tra-l-60、Tra-l-81、SSEA-l、SSEA-3、巢蛋白、端粒酶、Myc、p300 和 Tip60 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移 酶和堿性磷酸酶活性)的表達(或其缺乏)或某些翻譯后修飾(例如乙?；M蛋白)的存 在，由此促進細胞自我更新或分化狀態(tài)的評估。此外，本文所述的未分化細胞通常具有本領(lǐng) 域熟知的干細胞形態(tài)?！岸嗄堋笔侵改軌蚍只啥喾N不同細胞類型(盡管不一定是所有細胞類型)之一 的細胞。多能細胞的示例性種類是胚胎干細胞，其能夠分化成人體內(nèi)的任何細胞類型。因 而，會認識到，當(dāng)多能細胞可分化成多向細胞和其它更分化細胞類型時，逆分化的過程(即 去分化)可能更復(fù)雜并需要“再編程”細胞變得更原始，這表示再編程之后，它具有分化成 與再編程之前所可能的相比更多種的或不同的細胞類型的能力?！叭堋笔侵高@樣的細胞，其能夠分化成任何細胞類型包括多能、多向和完全分化 細胞(即細胞不能再分化成多種細胞類型)，非限制性地例如，胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、骨 髓干細胞、造血干細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、星形細胞、肌細胞和結(jié)締組織細胞。如本文所用的，“多向細胞”包括細胞和它們的后代，其可能能夠分化成或產(chǎn)生多 向、寡能和單能祖細胞，和/或一種或多種成熟或部分成熟細胞類型，除了源自多向細胞的 成熟或部分成熟細胞類型限定于特定組織、器官或器官系統(tǒng)的細胞。例如，多向造血祖細 胞和/或其后代擁有分化成或產(chǎn)生一種或多種寡能細胞類型，例如骨髓祖細胞和淋巴祖細 胞，以及產(chǎn)生血液中通常存在的其它成熟細胞組分的能力。“寡能細胞”包括能夠分化成成 熟或部分成熟細胞的細胞和它們的后代，所述分化能力比多向細胞更受限。然而，寡能細胞 仍可擁有分化成寡能和單能細胞，和/或給定組織、器官或器官系統(tǒng)的一種或多種成熟或部分成熟細胞類型的能力。寡能細胞的一個實例是骨髓祖細胞，其最終可產(chǎn)生成熟或部分 成熟紅細胞、血小板、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞?！皢文芗毎卑?括擁有分化成或產(chǎn)生其它單能細胞和/或一種類型的成熟或部分成熟細胞類型的能力的 細胞和它們的后代。此外，“正常”干細胞是指不表現(xiàn)出異常表型或具有異?；蛐停瑥亩梢援a(chǎn)生可 由這種干細胞衍生的全范圍細胞的干細胞(或其后代)。對于全能干細胞，例如該細胞可產(chǎn) 生例如健康的完整、正常的動物。相反的，“異常”干細胞是指由于例如一個或多個突變或基 因修飾或病原體而不正常的干細胞。因此，異常干細胞不同于正常干細胞。另外，盡管本發(fā)明不采用組織培養(yǎng)容器涂層或基質(zhì)，例如“細胞外基質(zhì)”，如本文所 用的“細胞外基質(zhì)”或“基質(zhì)”是指為支持細胞生長提供基本相同條件的一種或多種物質(zhì)， 其如由飼養(yǎng)物細胞合成的細胞外基質(zhì)所提供。基質(zhì)可在基底上(例如纖維連接蛋白、膠原、 MATRIGEL 等)提供。如本文所用的，術(shù)語“飼養(yǎng)物細胞”或“飼養(yǎng)物細胞層”是體外生長并與靶細胞共 培養(yǎng)的、例如與干細胞共培養(yǎng)的細胞。如本文所用的，術(shù)語“本質(zhì)上無飼養(yǎng)物細胞”或“無 飼養(yǎng)物”和其等同物是指不包含有意加入的飼養(yǎng)物細胞的組織培養(yǎng)條件。此外，當(dāng)在培養(yǎng) 物中不包含外源加入的取自飼養(yǎng)物細胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基，也無外源加入的飼養(yǎng)物細胞 時，細胞培養(yǎng)物是“本質(zhì)上無飼養(yǎng)物”，其中“無外源加入的飼養(yǎng)物細胞”表示待發(fā)育成飼養(yǎng) 物細胞層的細胞尚未為此原因而有意導(dǎo)入。當(dāng)然，如果待培養(yǎng)的細胞來源于包含飼養(yǎng)物細 胞的種子培養(yǎng)物，小部分這些飼養(yǎng)物細胞連同所需細胞(例如未分化靈長類干細胞)的偶 然的共分離及之后被導(dǎo)入另一培養(yǎng)中不應(yīng)視為有意導(dǎo)入飼養(yǎng)物細胞。在這種情況中，培養(yǎng) 物包含最少量的飼養(yǎng)物細胞。通過“最少量”，表示從之前培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)移至目前培養(yǎng)條件的 飼養(yǎng)物細胞數(shù)量，其中可分化細胞可已在飼養(yǎng)物細胞上培養(yǎng)。相似地，由播入培養(yǎng)物中的干 細胞發(fā)育的飼養(yǎng)物細胞或飼養(yǎng)物樣細胞不應(yīng)視為有意導(dǎo)入培養(yǎng)物中的。本發(fā)明包含還含有多種量的人血清的確定培養(yǎng)基，所述量例如約0. 5% -約40%、 約 0. 5% -約 30%、約 0. 5% -約 20%、約 0. 5% -約 10%、約 0. 5% -約 5%、約 0. 5% -約 3%、約0.5% -約2%、約0.5% -約1%。但是，典型的確定培養(yǎng)基干細胞培養(yǎng)使用術(shù)語 “本質(zhì)上不含血清”，其指外源加入的血清。加入這種培養(yǎng)基的血清通常比本文所述的量更 大。當(dāng)然，如果正培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生一些或所有血清組分，或如果待培養(yǎng)的細胞來源于在包含 血清的培養(yǎng)基中生長的種子培養(yǎng)物，則少量血清(例如小于約1%)的偶然共分離和隨后的 導(dǎo)入另一培養(yǎng)中不應(yīng)視為有意導(dǎo)入血清。如本文所用的，術(shù)語“大小排阻裝置”是指能夠基于材料大小分離材料的過濾裝 置。這種裝置的一個非限制性、示例性種類是過濾型類，其中通過允許小分子比較大分子更 快通過的基質(zhì)，基于分子量分離樣品組分。通常地，過濾型裝置特征在于表示能夠通過基質(zhì) 的分子的分子量上限的截留分子量。通常，通過應(yīng)用離心力(通過離心)或正壓(例如在 溶液或反應(yīng)混合物上方應(yīng)用氣壓或應(yīng)用活塞)促使樣品溶液或反應(yīng)混合物通過分子量分 離基質(zhì)。在一些實施方式中，所提供的基質(zhì)是膜。這類裝置通常在上下室之間具有完整過 濾材料。這類大小排阻裝置的實例是商業(yè)可供的Microcon 300、100、50、30、3和Centricon 3K、30K、50K、100K、和 300Κ(均來自 Millipore)，和可供的 10Κ、30Κ、100Κ 和 300k 截留的 Nanos印(均來自Pall Corp.)。Microcon和Centricon單元是相同裝置，但可用的溶液體積是不同的。另外還可供用于同時處理許多樣品的96孔板。使用這種多樣品孔板使純化 過程更簡單。因而，在一些實施方式中，“大小排阻裝置”含有多孔、大小辨別屏障，其允許 更小的分子(例如小于預(yù)定的截留分子量，如以上示例的)通過而同時阻滯更大分子(其 具有大于截留的分子量)。例如，這種裝置可以是超濾裝置，其含有多孔膜，例如所述類型 的Microcon或Centricon過濾裝置類型。可選擇大小排阻裝置的截留分子量以阻滯所需 組分，并允許非所需物種通過。因而，這種實施方式是通過阻滯可以瞬時陷于顆粒孔的較大 分子而較小分子隨大量洗脫液通過以致較小分子先洗脫而起作用的。在一些實施方式中， 大小排阻裝置具有300K的截留、或IOOK的截留、或30K的截留。然而應(yīng)認識的是，本方法 中可采用具有任何適宜截留的大小排阻裝置。本文所述方法包括將細胞平板接種在貼壁培養(yǎng)中。如本文所用，術(shù)語“平板接種 的”和“平板接種”是指允許細胞在貼壁培養(yǎng)中生長的任何過程。如本文所用的，術(shù)語“貼 壁培養(yǎng)”是指一種細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，借此細胞培養(yǎng)在固體表面上，可以依次對其涂布不溶性 基底，對于該基底可以依次涂布基底的另一表面涂層(如以下所列的那樣)，或允許培養(yǎng) 的細胞增殖或穩(wěn)定的任何其它化學(xué)或生物材料。細胞可以或可以不緊密粘附在固體表面 或基底上。貼壁培養(yǎng)的基底可包括MATRIGEL 聚鳥氨酸、層粘連蛋白、聚賴氨酸、純化膠 原、凝膠、纖連蛋白、肌腱蛋白、玻連蛋白、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、聚乙醇酸(poly glycolyticacid) (PGA)、聚乳酸(PLA)、以及聚乳-乙醇酸(PLGA)中的任一種或組合。而 且，貼壁培養(yǎng)的基底可包括由飼養(yǎng)層鋪設(shè)的、或由多能人細胞或細胞培養(yǎng)物鋪設(shè)的基質(zhì)。如本文所用的，短語“可溶性粘附組分”或“可溶性粘附劑”或其等同物是指人血清 包含的可溶性組分，例如多肽，其功能是促進多能干細胞粘附在基底上，例如促進多能干細 胞粘附在塑性組織培養(yǎng)容器上?？扇苄哉掣浇M分是至少lOOkDa、至少150kDa、至少200kDa、 至少250kDa、或至少300kDa或更大，并保持懸浮或溶解在溶液中。即，這種可溶性粘附組分 不是用來涂布組織培養(yǎng)容器的，因此不會形成通常所理解的在靈長類干細胞培養(yǎng)中的基質(zhì) 涂層的基礎(chǔ)。如本文所用的，術(shù)語“組織培養(yǎng)容器”或“組織培養(yǎng)塑體(plastic) ”或其等同物是 指目前已知的或之后發(fā)現(xiàn)的，常用于培養(yǎng)和生長干細胞的任何和所有容器。例如，一些組織 培養(yǎng)容器具有帶底壁的基和由所述底壁向上延伸成的多個側(cè)壁，跨所述側(cè)壁延伸并與底壁 相對的蓋?？蛇x地，所述蓋可形成為具有至少一個開口和跨所述開口延伸而允許通過另一 裝置進入所述容器內(nèi)部的隔膜。而且，許多組織培養(yǎng)容器通常是具有多個在相對的頂部和 底壁之間延伸的直立側(cè)壁的棱形(例如生物反應(yīng)器)。通常構(gòu)建側(cè)壁以致容器的長度和寬 度超過高度。因此，容器的底壁確定了相對于容器體積的相對大的表面積。通常在容器的 一個側(cè)壁形成管形頸以提供進入內(nèi)部的入口。頸的外表面可形成具有多列螺紋用于接受螺 帽。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到本發(fā)明和使用包含hS的培養(yǎng)基以促進細胞粘附在組織 培養(yǎng)或組織培養(yǎng)樣容器的基、底或側(cè)壁上，包括許多和潛在的所有組織培養(yǎng)容器，不依賴形 狀，大小和體積。還可參照以下具體描述的本發(fā)明優(yōu)選實施方式和本文所包括的實施例以便更容 易地理解本發(fā)明。但是，公開并描述本發(fā)明組合物和方法之前，需理解本發(fā)明并不限于具體 核酸、具體多肽、具體細胞類型、具體宿主細胞、具體條件、或具體方法等，當(dāng)然這些是可以 變化的，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，其眾多修改和改變都是顯而易見的。
生長、增殖和維持多能干細胞的確定培養(yǎng)本發(fā)明描述了使用確定培養(yǎng)基的方法和確定培養(yǎng)基組合物，這在2007年6月13 日提交的PCT/US2007/062755中首先描述過，將該申請全文并入本文。在將hESC技術(shù)引導(dǎo)至臨床中，一個待處理的關(guān)鍵問題是在hESCs的培養(yǎng)和維 持中缺乏標(biāo)準化。在缺乏小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)層時，許多研究者依賴“條件 化(conditioning)”，其中首先將培養(yǎng)基暴露于MEFs以獲得支持培養(yǎng)的未分化hESCs繁 殖的可溶性因子。難以辨別MEF條件化如何使得hESCs維持在未分化狀態(tài)下。最近發(fā)展 的hESC培養(yǎng)條件的其它常見特征包括存在FGF2，缺乏血清，和存在血清替代物例如敲除 血清替代劑(KSR-Invitrogen，專有配方)或無異種成分(Xeno-free)的敲除血清替代劑 (XFKSR-Invitrogen，專有配方)。表明具有支持hESCs維持作用的其它因子包括TGF β 1、 激活素A(ActA) ,PDGF和鞘氨醇-1-磷酸鹽、BI0、GSK3 β的小分子抑制劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子。 已經(jīng)描述了幾種用于hESCs的確定培養(yǎng)基系統(tǒng)，它們是基于FGF2與節(jié)點、TGFi^ 1、GABAJi 可酸、外加氯化鋰、Wnt3a加April/BAFF、或N2/B27補充劑的組合。當(dāng)這些研究關(guān)注于鑒定 支持未分化hESCs增殖的生長因子和條件時，對于在hESCs暴露于自我更新所偏愛的條件 下時被激活的細胞表面受體知之甚少，在PCT/US2007/062755中描述了支持hESC自我更新的確定培養(yǎng)基的方法和組合 物，并將其全文通過引用并入本文。使用確定培養(yǎng)基的益處在于，培養(yǎng)基所含成分都是已知 的并具有已知量。相反的，非確定培養(yǎng)基具有某些復(fù)合成分，其是由未知比例的許多許多化 學(xué)物質(zhì)的混合物的組成。采用化學(xué)上確定培養(yǎng)基的原因也是實際的，因為這種培養(yǎng)基可在 不同時間在不同實驗室再現(xiàn)。確定培養(yǎng)基可用可控方式改變，并且不含可能影響所研究反 應(yīng)的未知生物活性，例如酶和可選地生長因子。本發(fā)明的組合物和方法可用于培養(yǎng)細胞、特別地可分化細胞。應(yīng)理解的是，在培養(yǎng) 可分化細胞期間的不同點，可在細胞培養(yǎng)中加入多種成分以便培養(yǎng)基可包含除本文所述那 些之外的組分。組合物和方法含有基礎(chǔ)鹽營養(yǎng)溶液。如本文所用的，并如全文并入本文的PCT/ US2007/062755所描述的，基礎(chǔ)鹽營養(yǎng)溶液是指鹽混合物，其可向細胞提供正常細胞代謝必 需的水和某些大無機離子，維持細胞內(nèi)外的滲透壓平衡，提供碳水化合物作為能量源，并提 供緩沖體系以維持培養(yǎng)基在生理PH范圍內(nèi)?；A(chǔ)鹽營養(yǎng)溶液的實例包括但不限于達爾貝 科改良依格培養(yǎng)基(DMEM)、最小必需培養(yǎng)基(MEM)、基礎(chǔ)依格培養(yǎng)基(Basal Medium Eagle) (BME)、RPM1 1640,Hams F_10、Ham，s F-12、β -最小必需培養(yǎng)基(β MEM)、格拉斯格最小必 需培養(yǎng)基(G-MEM)和伊斯科夫改良達爾貝科培養(yǎng)基(Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium)、和其混合物。在一特定實施方式中，基礎(chǔ)鹽營養(yǎng)溶液是大約50 50的DMEM和 Ham' sF12的混合物。在一實施方式中，本發(fā)明的組合物和方法提供了可溶性粘附因子或試劑，這種可 溶性粘附組分包含在人血清中，其處于適當(dāng)?shù)臐舛确秶纱偈筯ESC細胞粘附至組織培養(yǎng) 型塑體上。這種細胞粘附允許細胞粘附并形成單層，但是在缺乏飼養(yǎng)層或基底涂層例如基 質(zhì)涂層，MATRIGEL 等下。優(yōu)選地，采用人血清以提供無動物環(huán)境。人血清可從任何商業(yè) 供應(yīng)者的組織培養(yǎng)產(chǎn)品中獲得，實例包括Gibco-Invitrogen Corporation (Grand Island, N. Y. USA)，Sigma (St. Louis Mo.，USA)和 ATCC (Manassas, Va. USA)。本發(fā)明所用的血清濃度范圍是大約0. 1 % -約20 %、更優(yōu)選大約0. 1-約3 %、更優(yōu)選大約0. 5-約2 %、更優(yōu)選大 約0. 5-約1.5%、且更優(yōu)選大約0. 5-大約1%。在本發(fā)明的另一方面，人血清是使用微流體大小排阻裝置分級的。多種過濾用的 微流體裝置都是商業(yè)可供的。裝置可用于例如凝膠過濾，大小排除過濾，離子交換過濾，或 這些過濾技術(shù)的組合。例如過濾材料可裝載在和/或包含在裝置中，并可包含過濾材料的 微球?？梢允褂每勺铚詷悠返母》肿油瑫r允許樣品的更大分子通過或繞過的大小排 除材料。例如，可使用Bio-Rad的P-IOBIO-GEL材料，其是由平均顆粒大小直徑為45-100 μ m 的丙烯酰胺顆粒組成的?？赏ㄟ^微流體裝置經(jīng)重力壓力差異、或例如向心力處理樣品。然 后可分析、使用從裝置中洗脫的所得濾過物，或之后將其通過裝置進行后續(xù)處理階段。在本 發(fā)明的一方面，大小排阻裝置具有300KDa截留、或IOOKDa截留、或30KDa截留的離心分離 柱(spin-offcolumn)、例如 Microcon 離心分離柱。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，過濾器適應(yīng)材料可被“壓入適應(yīng)”至相關(guān)室中，置于相關(guān) 室中，或定位于相關(guān)室中。在本發(fā)明的另一方面，凝膠過濾材料可布置在微流體裝置通道中?？赏ㄟ^移液至 裝置輸入開口和/或通過使用例如應(yīng)用在裝置的輸入開口的真空力將材料吸入裝置中，來 將凝膠過濾材料裝載到裝置中。可以通過經(jīng)裝置的輸入開口加壓裝載凝膠過濾材料使凝膠 過濾材料分散在裝置的通道或室中，來以凝膠過濾材料填充裝置的通道。一旦通道填充了 水合凝膠過濾材料，可離心裝置以使凝膠過濾材料脫水并“裝緊”凝膠過濾材料，形成純化 柱。這個過程可用于制備樣品過濾裝置并用于從凝膠過濾材料中去除非必需或過量的水或 緩沖液。因而，需認識到通常具有任何適宜過濾材料和/或試劑并具有任何適宜截留分子 量的微流體大小排阻裝置可用于本發(fā)明中；本文所述的組合物和方法并不限于所述裝置。本發(fā)明的組合物和方法也可 括至少一種FGF受體激活劑，包括任何FGF多肽，其 功能性片段或其變體。本發(fā)明的組合物和方法可包括血清白蛋白(SA)，例如牛SA(BSA)或 人SA(HSA)，至少一種不溶性基底。例如，可分化細胞可置于含有但不限于聚苯乙烯和聚丙 烯的這類化合物的細胞培養(yǎng)物表面上。本發(fā)明不同于其它確定培養(yǎng)條件，其中組合物和方法包括增殖多能干細胞，其基 本上無飼養(yǎng)物細胞或?qū)?，或“無飼養(yǎng)物”，或通過從飼養(yǎng)物細胞培養(yǎng)物中收集培養(yǎng)基產(chǎn)生的 條件培養(yǎng)基。此外，本發(fā)明的組合物和方法不要求多能干細胞在任何基底上增殖和生長，所 述基底包括涂布了細胞外基質(zhì)組分(即單獨或不同組合的膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋 白聚糖、巢蛋白、硫酸類肝素等)，或MATRIGEL 的任何基底。本文所提供的人血清濃度足 以促進細胞粘附并促進未分化多能干細胞生長和增殖。在一實施方式中，將可分化細胞與至少一種缺乏飼養(yǎng)物細胞層的本發(fā)明組合物接 觸，以便細胞維持在未分化狀態(tài)至少一(1)至十二(12)個月或更久。通過與表面標(biāo)志物、 轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物、核型和分化成三胚層細胞的能力相關(guān)的細胞表征，可測定多能性。這些特征是 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所涉及的是，可以在與本發(fā)明確定培養(yǎng)基接觸之前和/或之后，使用酶、非酶、或 人工解離方法使可分化細胞傳代。酶解離方法的非限制性實例包括使用蛋白酶例如胰蛋 白酶、膠原酶、中性蛋白酶和ACCUTASE 。在一實施方式中，將ACCUTASE 用于傳代所接觸細胞。當(dāng)使用酶傳代方法時，所得培養(yǎng)物可含有單細胞(singlets)、雙細胞(doublets)、 三細胞(triplets)和依賴所用的酶而大小變化的細胞團塊的混合物。非酶解離方法的非 限制性實例是細胞分散緩沖液。人工傳代技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，例如在Schulz et al., 2004Stem Cells, 22 (7) :1218_38中。傳代方法的選擇受其它培養(yǎng)條件的影響，包括但不限 于飼養(yǎng)物和/或細胞外基質(zhì)；盡管本發(fā)明不期望這兩種。本發(fā)明方法中所用的解聚溶液可以是任何解聚溶液，其能夠使細胞分開或解 聚成單個細胞，且不會對細胞造成大量毒性。解聚溶液的實例包括但不限于胰蛋白酶、 ACCUTASE 、0. 25%胰蛋白酶/EDTA、TrypLE、或VERSENE (EDTA)和胰蛋白酶。本發(fā)明的方 法不需要使匯合層的每個細胞解聚成單細胞，如果至少少數(shù)單細胞被解聚并能夠再培養(yǎng)。本發(fā)明的組合物和方法事實上可包含以上所列的或本文其它地方所述的(例如 PCT/US2007/062755)組分的任何組合。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認為的，本發(fā)明的組合物和方 法的組分可根據(jù)方案設(shè)計而變化。因此，本發(fā)明的一實施方式涉及在96孔板和/或384孔 板或在更大容器包括生物反應(yīng)器、細胞工廠或其它可獲得的或由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計的自 動化、符合GMP、專業(yè)化裝置中培養(yǎng)可分化細胞。因而，本發(fā)明的方法不限于特定的培養(yǎng)箱尺 寸。本發(fā)明的培養(yǎng)方法包括在生長環(huán)境中培養(yǎng)干細胞例如靈長類胚胎干細胞，所述生 長環(huán)境是本質(zhì)上無飼養(yǎng)物的，并且包括本發(fā)明所述的確定的、等滲培養(yǎng)基且缺乏基質(zhì)。這種 確定的、等滲培養(yǎng)基包含將干細胞(例如多能干細胞)維持在基本上未分化狀態(tài)(或它們 的功能等同物)所要求的必需組分。可在這種環(huán)境下在任何適宜培養(yǎng)容器中，在允許維持 未分化狀態(tài)的條件下培養(yǎng)細胞。使用這種方法，可從所得細胞培養(yǎng)物中分離干細胞群，包括基本上未分化的靈長 類干細胞，例如人胚胎干細胞，由此表示本發(fā)明的另一方面。可通過任何適宜技術(shù)分離這些 群。這種技術(shù)包括親和層析、淘洗和熒光輔助細胞分選。這些技術(shù)每個采用一種或多種分 離試劑(例如但不限于抗體和抗體片段，報告基因/蛋白等)，所述試劑對指示未分化狀態(tài) 的細胞基標(biāo)志物是特異的。對于基本上未分化的人胚胎干細胞，這種標(biāo)志物包括但不限于 例如轉(zhuǎn)錄因子0ct4，和細胞表面標(biāo)志物SSEA-4，Tra-l-60和Tra_l_81。其它標(biāo)志物包括端 粒酶、Myc、p300、和Tip60組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰化組蛋白和堿性磷酸酶和典型干細胞形 態(tài)。鑒定能夠促講多能干細朐,牛長禾π/或分化的因子/ iMimmi本發(fā)明的另一實施方式涉及使用干細胞以鑒定促進細胞分化、或可選地細胞持續(xù) 維持和穩(wěn)定在基本上未分化狀態(tài)下的因子的方法。簡而言之，對于分化或維持基本上未分 化狀態(tài)，這種方法包括例如將檢驗化合物暴露于在本發(fā)明確定的、等滲培養(yǎng)基中培養(yǎng)的基 本上未分化的靈長類胚胎干細胞。暴露于檢驗化合物之后，評估細胞以測定它們是較好地 維持在基本上未分化狀態(tài)還是被誘導(dǎo)分化。如果細胞較好地維持在基本上未分化狀態(tài)下， 可以將檢驗化合物鑒定為促進靈長類多能干細胞的未分化狀態(tài)或自我更新的化合物。如果 細胞被誘導(dǎo)分化，可以將檢驗化合物鑒定為促進基本上未分化靈長類多能干細胞的分化的 化合物。分化細胞之后可以測定它們的發(fā)育命運，換而言之，測定它們因分化所變成的細胞 譜系。對于去分化，將更分化狀態(tài)的細胞暴露于一種或多種化合物，然后對其評估，以測定 暴露是否獲得比最初暴露于該檢驗化合物的那些具有更原始類型的細胞(例如多能干細
13胞)。如果是這樣的話，產(chǎn)生該效果的化合物被鑒定為促進細胞的去分化、或再編程的化合 物。優(yōu)選地，以高通量的方式進行本發(fā)明所述的這些和其它篩選方法，以便可同時篩選眾多 化合物。由可分化細胞分化的細胞類型在不同研究和發(fā)展領(lǐng)域具有多種用途，包括但不限 于藥物發(fā)現(xiàn)，藥物開發(fā)和檢驗，毒理學(xué)，治療目的的細胞生產(chǎn)以及基礎(chǔ)科學(xué)研究。這些細胞 類型表達了廣泛研究領(lǐng)域感興趣的分子。這些包括如標(biāo)準參考文獻所述的已知行使多種細 胞類型的功能所需的分子。這些分子包括但不限于細胞因子、生長因子、細胞因子受體、細 胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、分泌多肽和其它分子、和生長因子受體。應(yīng)該理解的是，通過本發(fā)明所述方法培養(yǎng)干細胞所提供的益處之一是減少和避免 了對干細胞外源的病原體或抗原對干細胞的污染。當(dāng)使用來自不同物種或來自相同物種的 不同和非相關(guān)個體的飼養(yǎng)物細胞時，可發(fā)生這種類型的污染。本發(fā)明的方法意在盡可能避 免進一步檢驗干細胞系(包括病原體含量的檢驗)。在一些實施方式中，預(yù)期人干細胞和/ 或它們的分化后代可被移植到遺傳相關(guān)個體而無需提前檢驗一些或所有病原體含量。適當(dāng)?shù)?，在凍存之前或之后檢驗細胞系的基因型和組織相容性單元型。基因型檢 驗是指在一個或多個分辨率水平下，測定干細胞系的基因型。不一定要在單個核苷酸分辨 率下測得細胞系的基因型。相反，基因分型僅需在允許普通技術(shù)人員確定干細胞系與其任 何預(yù)期受體之間的相似性的分辨率水平下進行?；蚍中涂砂炊喾N方式進行，包括但不限 于限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)等。也可檢驗細胞系和/或它們后代的組織相容性單元型；或確定它們是“正?！边€是 “異?！备杉毎?。組織相容性單元型是在組織相容性基因位點(loci)上的一組等位基因，該 位點是免疫系統(tǒng)用來辨別自我和非我(即外源)組織和/或細胞。對于人，主要組織相容性 (MHC)位點是由在6號染色體短臂上的四個位點所組成的。人也具有一組次要組織相容性 位點。例如，對多種移植物例如造血細胞移植物常實施人白細胞抗原(HLA)分型。主要和次 要組織相容性抗原存在于細胞表面并作為細胞或組織來源的指示物通過免疫系統(tǒng)被識別。 通過宿主抗移植物免疫反應(yīng)，被視為外源的細胞或組織通常被受體所排斥。但是，有時可以 使用例如免疫抑制藥物例如但不限于環(huán)孢菌素Α、Π(506、納巴霉素、環(huán)磷酰胺(CY)、丙卡巴 胼(PCB)和抗胸腺細胞球蛋白(ATG)，來克服組織相容性的某些差異，特別地次要組織相容 性位點的差異。此外，某些組織對例如在人HLA位點上的差異是較不易感。這些組織包括但 不限于肝、腎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。最近報道了胚胎干細胞具有免疫赦免(immune privileged) 特性(Li et al. Stem Cells 200433:448-456)。試劑盒本發(fā)明還涉及試劑盒，其中該試劑盒包含基礎(chǔ)鹽營養(yǎng)溶液和至少一種能夠刺激 ErbB2-定向的酪氨酸激酶活性的化合物。在一實施方式中，試劑盒包含至少一種ErbB3配 體，其如本文所述。在另一實施方式中，試劑盒包含多于一種的ErbB3配體。在另一實施方 式中，試劑盒包含如本文所述的TGF-β或TGF-β家族成員或其變體或功能性片段中的至 少一種。在又一實施方式中，試劑盒包含TGF-β或TGF-β家族成員或其變體或功能性片 段中的多于一種。在再一實施方式中，試劑盒包含至少一種的成纖維細胞生長因子或其變 體或功能性片段。在另一實施方式中，試劑盒包含多于一種的成纖維細胞生長因子或其變 體或功能性片段。在特定實施方式中，試劑盒包含F(xiàn)GF-7、FGF-10、FGF-22或其變體或功能性片段中的至少一種。在另一實施方式中，試劑盒包含血清白蛋白。在又一實施方式中，試 劑盒包含血清和/或至少一種如本文所述的不溶性基底和/或至少一種解聚溶液。本發(fā)明的試劑盒事實上可包含以上所列或本文其它地方所述的組分的任何組合， 其包括但不限于所述的含有人血清或其高分子量部分的確定培養(yǎng)基。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所 認識的，本發(fā)明試劑盒提供的組分可根據(jù)試劑盒的預(yù)定用途而變化。因而，可將試劑盒設(shè)計 成實施本申請所列的多種功能并且這類試劑盒的組分會相應(yīng)變化。在本申請中，引用了多篇出版物。所有這些出版物的公開內(nèi)容和這些出版物內(nèi)所 全文引用的參考文獻都通過引用其全文并入本申請，以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 狀態(tài)。
實施例實施例1
_2] 細找鮮M胞甚鋪ΦΙλ血·歹言為闡明符合管理臨床安全性和效應(yīng)的預(yù)期調(diào)控規(guī)范的培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)條件，申 請人提供了 hESC擴大策略，其符合以下具體描述的要求。在無飼養(yǎng)物、不含條件培養(yǎng)基和 不含基質(zhì)的培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)未分化hESCs對于為基于細胞的療法提供無限細胞供應(yīng)、以 及指導(dǎo)hESCs的系譜特異性分化是至關(guān)重要的。之前，確定了支持未分化hESCs長期生長所需要的最小必需條件。參見PCT/ US2007/062755)。部分地基于形態(tài)學(xué)分析以及通過細胞表面標(biāo)志物的表達和堿性磷酸酶分 析評估了干細胞的發(fā)育階段。為建立無異種成分、無飼養(yǎng)物、不含條件培養(yǎng)基和不含基質(zhì)的生長培養(yǎng)環(huán)境，使用 了并入如本文和PCT/US2007/062755所述的確定培養(yǎng)基的培養(yǎng)系統(tǒng)。此外，為維持不含非 人動物產(chǎn)物、但促進細胞結(jié)合或粘附或鋪設(shè)在塑體上和生長的培養(yǎng)條件，使用人血清。將使 用人飼養(yǎng)物細胞在GMP條件下分離的NIH-注冊的BG01、BG02和BG03hESC系、以及CyT49、 hESC系(Novoce 11, San Diego, CA)在包含約0. 5-2%人血清(hS)的確定培養(yǎng)基中于37°C 培養(yǎng)約12-24小時?？蛇x地，在溫室下，將hES細胞接種至不含血清的培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)盤， 然后加入hS至大約1-10%終濃度。大部分商業(yè)可供類型的人血清都是可以使用的，例如 ALBUMARC人血清用于本文所述的某些hESC培養(yǎng)物。ALBUMARC是美國紅十字血液服務(wù)中心 (American Red Cross Blood Services)人血清的注冊名。值得注意的是，未分化hESCs生 長并維持在非被涂層的組織培養(yǎng)容器中。所用的hS量促進細胞粘附到組織培養(yǎng)塑體上，以 致不需要用例如ECM、纖連蛋白、膠原和/或MATRIGEL 等來涂布組織培養(yǎng)容器。也可采用 增加濃度的hS，例如將高達20%的hS用于培養(yǎng)和維持hESC培養(yǎng)物。去除基質(zhì)要求提供了更有效的細胞培養(yǎng)和生長。常規(guī)以ACCUTASE傳代細胞培養(yǎng) 物。在組織培養(yǎng)平板上接種大約12-24小時之后，hESCs表現(xiàn)出形態(tài)正常。而且，使用標(biāo)準 G帶顯技術(shù)對hS和在確定培養(yǎng)基上生長的hESCs進行核型分析。為確定hS是熱敏感性還是熱不穩(wěn)定性，以及它是否影響hESC生長，首先將hS加 熱至大約50-60°C約20-60分鐘，然后加入濃度大約0. 5_2%的確定培養(yǎng)基。在該培養(yǎng)基中 的hESCs增殖不明顯，接種后大約1-3天之后大部分死亡。因而，hS的細胞粘附促進組分 是熱敏感性的，并且在大約50-60°C下活性會明顯降低且hESCs不會存活。由于hS中的一種或多種可溶性粘附因子的熱敏感性(其可變?yōu)闊崾Щ畹?，hESCs很可能不會存活。這些 可溶性粘附因子的熱失活預(yù)防了多能干細胞粘附至塑體上，其粘附促進了 hESCs的生長和 維持。為進一步確定這些可溶性粘附因子的大致大小，假設(shè)hS中的特定部分負責(zé)加強 hESCs的生長和增殖。為確定是哪一部分，使用多種大小排阻裝置，例如Microcon 300K、 100K和30K截留離心分離柱對hS分級。使用這些截留離心分離柱允許某些分子量蛋白通 過并作為洗脫或阻滯部分被收集。然后在包含基本上如上所述的多種阻滯部分中的一種的 確定培養(yǎng)基中培養(yǎng)hESCs。來自300K和100K截留離心分離柱的阻滯部分表現(xiàn)出包含特定 可溶性粘附因子和/或試劑，其促進未分化hESC生長和增殖。未分化hESC生長和增殖與 來自300K和100K截留離心分離柱的多種阻滯部分一致，這不依賴于(非熱處理的)hS的 商業(yè)源。因而，這些能夠保留在300K至100K截留離心分離柱的阻滯部分中的可溶性粘附 因子是很重要的并能夠促進生長和增殖。圖IA-圖IE是在具有不同量人血清的未涂層組織培養(yǎng)容器的確定培養(yǎng)基中生長 的hESCs(BG02細胞)的圖像。圖IA是在未涂層組織培養(yǎng)容器中的包含全血清DC-HAIF 中生長4天之后的hESCs圖像。將細胞與加l%hS的DC-HAIF孵育大約24小時然后以 DC-HAIF替換培養(yǎng)基。圖IB是在包含hS的DC-HAIF中生長1天之后的hESC圖像，hS 是在300K截留離心分離柱中部分分級的(使用阻滯部分)。圖IC是在包含約0.7% hS的 DC-HAIF中生長4天之后的hESC圖像，hS是在100K截留離心分離柱中部分分級的(使用 阻滯部分)。圖ID是在包含約0. 7% hS的DC-HAIF培養(yǎng)基中生長1代和3天之后的hESC 圖像，hS是在100K截留離心分離柱中部分分級的(使用阻滯部分)。圖IE是在DC-HAIF 和約hS中培養(yǎng)的連續(xù)傳代(2代)群的hESC圖像，hS是在100K截留離心分離柱中部 分分級的(阻滯部分)。此外，為確定在這些培養(yǎng)條件下的hESCs連續(xù)傳代對干細胞形態(tài)是否有影響，將 未分化hESCs連續(xù)傳代大約2、3、4、5、6、7、8、9和10次等。分裂成單細胞的未分化hESCs 還可以基本上如所述的生長和增殖。借助顯微鏡，所有培養(yǎng)物表現(xiàn)出正常形態(tài)。相反地，當(dāng) 使用全hS對未分化hESCs連續(xù)傳代時，相對于使用如上所述阻滯部分傳代的hESC，在hESC 培養(yǎng)物的形態(tài)質(zhì)量上有所劣變。然而，為恢復(fù)典型的hESC細胞形態(tài)，可使用100K截留離心 分離柱通過過濾大約20% hS部分地純化hS，然后將收集的洗脫/阻滯部分稀釋回原始體 積。因而，本文所述的hS的分級極大地避免了連續(xù)傳代hESC形態(tài)質(zhì)量的劣變。這在大約 0. 5-1. 0%的hS濃度下也可觀察到。為證實在以上所述確定的不含生物制品培養(yǎng)條件下所維持的未分化hESCs的自 我更新，對hESCs進行酶處理，并將其解離成單細胞懸浮液，然后在基本上如上所述的確定 條件下進行培養(yǎng)。在體外大約4、5、6和7天之后，開始顯現(xiàn)出未分化的成熟大小的單細胞 衍生的hESC群落。平板接種效率可與PCT/US2007/062755所述的在DC-HAIF中培養(yǎng)的或使用 MATRIGEL 作為ECM在DC-HAIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hESCs上所觀察到的相較。使用MATRIGEL 的平板接種效率明顯高于使用MEF-CM或飼養(yǎng)物的效率。一個解釋是，與其它飼養(yǎng)物和/或 飼養(yǎng)物和基質(zhì)類型培養(yǎng)相比，解離的單細胞有效地接種于包含hS的DC-HAIF或確定hESC
培養(yǎng)基。
本實施例鑒定了將靈長類胚胎干細胞、特別是hESCs維持在能夠延續(xù)傳代以及隨 后定向分化的健康、未分化狀態(tài)所必需的最小必需組分。已經(jīng)辨別這些分子要求，使得衍生 條件變得可能，所述條件允許用完全確定組成替換未充分表征和未指明的生物添加劑和基 底(包括衍生自動物的那些)。這種確定培養(yǎng)系統(tǒng)具有允許酶介導(dǎo)解離之后有效且穩(wěn)定擴 增hESCs的優(yōu)勢。因此，該研究提供了可行方法，所述方法為基于細胞的療法提供大量供應(yīng) 的良好表征的、臨床可接受的健康細胞。此外，已經(jīng)建立了 hESCs的未分化生長所需的單個 組分，現(xiàn)在有可能更準確地評估其它生長因子和化合物對hESCs發(fā)育命運的影響。如所理 解的，確定培養(yǎng)基對于為治療目的使必要數(shù)量的多能hESCs有效地、均一地、穩(wěn)定地且可再 現(xiàn)地定向于特定譜系是至關(guān)重要的。此外，在具有100K人血清部分的DC-HAIF中維持 10代的BG02細胞的FISH分析物顯示出在人12號染色體(hChr 12;98%兩個拷貝，η = 591)和hChr 17(98%兩個拷貝，η = 578)上的正常計數(shù)。因此，在包含小量百分比人血清 的培養(yǎng)基中的多能hESCs的自我更新不選擇在hESCs中通常觀察到的非整倍體。實施例2#用100K人血清部分的HESCS的長其月自我為了可用，任何hESC培養(yǎng)基必須能夠支持長期或延長的細胞自我更新，即持續(xù)數(shù) 代。為證實本文所述的含hS DC-HAIF培養(yǎng)基可支持hESCs的長期或延長自我更新，將hESCs 在具有約IOOk人血清阻滯部分的DC-HAIF中培養(yǎng)。為確保hESCs維持它們的多能性且 不自發(fā)分化成不同細胞譜系，使用本領(lǐng)域公知的用于描述和鑒定多能干細胞和/或分化的 干細胞衍生譜系的細胞標(biāo)志物進行RT-PCR分析。對6代和10代之后的hESC培養(yǎng)物實施 RT-PCR0對于對照培養(yǎng)物，僅在確定培養(yǎng)基中53代之后實施RT-PCR(圖2)。圖2顯示來自 第6(中間插圖)、第10 (底部插圖)和第53 (頂部插圖)代的培養(yǎng)物中表達典型多能干細 胞標(biāo)志物，例如 0CT4、NAN0G、REX1、S0X2、UTF1、CRIPT0、F0XD3、TERT 和 DPPA5 的表達。相反 地，在這些培養(yǎng)物中未檢測到分化的干細胞衍生系譜的典型標(biāo)志物例如α-胎蛋白(AFP)、 MSXU HANDl0因而，這些數(shù)據(jù)表明了在具有人血清的DC-HAIF培養(yǎng)基中生長的hESCs促進 了多能hESCs的長期或延長的自我更新且不促進向hES衍生的細胞系譜的自發(fā)分化。實施例3維持在包含100K人血清部分的確定培養(yǎng)基中的HESCS可分化成多種細胞譜系為確定如本文所述培養(yǎng)的hESCs是否也可分化成多種hES衍生的細胞譜系，在體 外將BG02細胞分化成hES衍生的細胞(圖3)。首先將hESCs在使用100K截留離心分離柱 分級的0. 7%或1 % hS中維持5-7天(3份)。然后分別在第5和第7天通過將培養(yǎng)物在包 含2%的無脂肪酸BSA、25ng/ml Wnt3a、100ng/ml激活素A和8ng/ml FGF2的RPMI中暴露 24小時，之后在包含2% BSAUOOng/ml激活素A和8ng/ml FGF2的RPMI中暴露另外兩天 (分化的第3天)，誘導(dǎo)hESCs分化成定形內(nèi)胚層。通過將細胞在包含2 % BSA、50ng/ml FGF7 和0. 25 μ M KAAD-環(huán)巴胺的RPMI中暴露另外約2_3天(分化的第6天)使定形內(nèi)胚層細胞 的進一步分化成前腸內(nèi)胚層。通過如之前在D，Amour et al. · 2005，Nat. Biotechnol. 23 1534-1541 和 D，Amour et al.，2006，Nat. Biotechnol. 24 1392-1401 所述的 qPCR 檢測細 胞培養(yǎng)物，并將該文獻通過引用全文并入本文。在分化的第三天檢測hES衍生的細胞(定形內(nèi)胚層)。圖3顯示了描述d3(定形 內(nèi)胚層，DE)和d5(前腸內(nèi)胚層，F(xiàn)G)下多種細胞標(biāo)志物的標(biāo)準化表達水平的圖。圖3的頂部插圖顯示了在d3 (定形內(nèi)胚層)，S0X17表達明顯增加；而在d5 (前腸)樣品中，HNFlB和 HNF4A表達水平上調(diào)。在定形內(nèi)胚層和前腸型hES衍生細胞中的S0X17、HNF1B和HNF4A表 達水平與D' Amour et al. 2005和2006 (見上)描述的一致。這些數(shù)據(jù)證實了所述的使用來自100K人血清部分的阻滯部分維持的無飼養(yǎng)物培 養(yǎng)物可有效分化成多種hES衍生的細胞譜系，包括定形內(nèi)胚層和前腸內(nèi)胚層。本說明書中所提到的所有專利和專利申請、出版物、科技文獻和其它參考材料都 指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，通過引用將每篇文獻并入本文，如同單獨地引 用每篇參考文獻全文而并入。申請人:保留在物理上將來自任意此類專利和專利申請、出版物、科技文章、電子可 供的信息和其它參考材料或文件的任意和所有材料和信息并入本說明書的權(quán)利。本文所述的方法、組合物和裝置現(xiàn)代表優(yōu)選實施方式并且是示例性的，并非意在 限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的精神內(nèi)所包括的并由公開內(nèi)容的范圍所確定的該處的變化 和其它用途為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可在不偏 離本發(fā)明范圍和精神下，對本文所公開的發(fā)明作出各不相同的替換和修改。如以下權(quán)利要求書和全部本公開內(nèi)容中所用，短語“本質(zhì)上由......組成”表示
包括短語之后所列的任何元素，還可包括不干擾或促成公開內(nèi)容中所列元素指明的活性或
作用的其它元素。因而，短語“本質(zhì)上由......組成”表示所列元素是必需的或強制性的，
但其它元素是任選的，并且依據(jù)它們是否影響所列元素的活性或作用而存在或不存在。
權(quán)利要求
無飼養(yǎng)物(feeder)的靈長類多能干細胞組織培養(yǎng)組合物，其含有a)未分化的人胚胎干細胞(hESC)；b)確定培養(yǎng)基，其含有人血清(hS)或其可溶性粘附組分，其中所述人血清還含有至少一種具有至少100kDa分子量的可溶性粘附組分，并且其中所述組合物本質(zhì)上無飼養(yǎng)物細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述人血清處于所述培養(yǎng)基的約0.5% -約2%的 濃度。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述可溶性粘附組分的大小選自至少lOOkDa、至 少 150kDa、至少 200kDa、至少 250kDa 和至少 300kDa。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組分促進所述hESCs粘附至基底。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述基底來自組織培養(yǎng)容器。
6.在無飼養(yǎng)物(feeder)培養(yǎng)基中培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的方法，其包括在可以支持干細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述靈長類胚胎干細胞，所述培養(yǎng)基本質(zhì)上無飼養(yǎng) 物細胞，并且其中所述培養(yǎng)基含有人血清或其可溶性粘附組分，由此促進未分化胚胎干細胞的增殖。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約0.5 % -約2 %的人血清或其可溶 性粘附組分。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括富集至少一種胚胎干細胞可溶性粘附組分，所述 可溶性粘附組分選自通過分級富集的lOOkDa、150kDa、200kDa、250kDa和300kDa。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中富集是通過使用大小排阻裝置分級所述人血清。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述大小排阻裝置具有300kDa的截留分子量。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述大小排阻裝置具有IOOkDa的截留分子量。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述大小排阻裝置具有30kDa的截留分子量。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述靈長類胚胎干細胞是人胚胎干細胞(hESCs)。
14.在無飼養(yǎng)物(feeder)的確定培養(yǎng)基中培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的方法，其包括在可以支持干細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述靈長類胚胎干細胞，所述培養(yǎng)基基本上無飼養(yǎng) 物細胞并還包含約0. 5% -約2%的人血清或其可溶性粘附組分，進行培養(yǎng)步驟超過一個 月，在培養(yǎng)中，所述胚胎干細胞增殖，而同時維持所述干細胞分化成內(nèi)胚層、中胚層和外胚 層組織衍生物的潛能，并同時維持所述干細胞的核型。
全文摘要
本發(fā)明提供了培養(yǎng)和維持多能干細胞的組合物和方法。更特別地，本發(fā)明提供了在還含有促進細胞粘附的人血清或人血清的可溶性粘附組分的無飼養(yǎng)物(feeder)確定培養(yǎng)基中培養(yǎng)、維持、生長和穩(wěn)定靈長類多能干細胞的組合物和方法。
文檔編號C12N5/0735GK101903515SQ200880121734
公開日2010年12月1日 申請日期2008年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月19日
發(fā)明者尤金·P·布蘭頓, 托馬斯·C·斯庫爾茲, 艾倫·J·羅賓斯 申請人:伯沙珍公司