專利名稱：使用漆酶在飼料產品中降解玉米赤霉烯酮的方法
技術領域：
本發明涉及解毒受到真菌毒素玉米赤霉烯酮(mycotoxin zearalenone)污染的飼 料產品的方法。
背景技術：
谷物上的幾種植物致病性和/或收獲后鐮孢屬菌種產生牲畜和家禽生產者相當 關注的毒性物質，例如，脫氧瓜萎鐮菌醇(deoxynivalenol)、T_2毒素、ΗΤ_2毒素、蛇形菌素 (diacetoxyscirpenol)和玉米赤霄煉麗。玉米赤霉烯酮存在于世界范圍的多種谷類作物中，如玉米、大麥、燕麥、小麥、黑 麥、稻、黍和高粱。在收獲前玉米赤霉烯酮的產生似乎不以顯著的量發生，但在合適的環境 條件下，其易在儲藏中的玉米和小谷粒上產生。當在乙醇生產中使用谷物顆粒并消耗淀粉時，玉米赤霉烯酮集中在發酵副產品 (例如，蒸餾干酒糟(distiller's dried grain))中。發酵副產品中的玉米赤霉烯酮含量 可能相對于谷物顆粒增加為三倍。所述毒素是熱穩定的，并且不因長期儲存、烘烤或因丙酸或霉菌生長延緩劑的加 入而受到破壞。盡管它們與留族雌激素在結構上不相似，但是玉米赤霉烯酮及其幾種衍生物具有 雌激素活性。玉米赤霉烯酮經過折疊使得羥基或潛在的羥基變成合適的朝向以促進與通常 結合雌激素的組織受體結合。玉米赤霉烯酮是引起不育、敗育或其它繁殖問題的主要毒素，特別是在豬中。所述 癥狀在青春期前的小母豬(prepubertal gilt)中尤其嚴重，包括乳房增大、子宮和陰門腫 脹和卵巢萎縮。在嚴重的情況中，可能發生陰門和直腸下垂。公豬展現出乳房增大和睪丸 下垂。玉米赤霉烯酮存在于來自用受污染的谷物喂養的動物的肉中，以及從受污染的小 麥焙烤的面包中。盡管人中毒的情況罕見，但是存在對于人長期曝露于這種雌激素活性的 結果的關注。使用環氧酶或內酯酶失活真菌毒素(包括玉米赤霉烯酮)在TO9612414中公開。需要進一步的解毒受到真菌毒素玉米赤霉烯酮污染的動物飼料產品的方法，所述 產品例如，如發酵副產品，包括蒸餾濕酒糟和干酒糟。
發明內容
本發明的發明人發現了飼料產品中的真菌毒素能夠通過用漆酶處理所述飼料產 品而降解成無毒物質。因此，在第一個方面本發明提供用于降解飼料產品中真菌毒素的方法，所述方法包括用漆酶處理所述飼料產品。所述真菌毒素優選是玉米赤霉烯酮。在第二個方面本發明提供漆酶用于降解真菌毒素的用途。發明詳述玉米赤霉烯酮在本發明的上下文中，術語“玉米赤霉烯酮”包括自某些鐮孢屬菌種(Fusarium sp.)產生的真菌毒素玉米赤霉烯酮。IUPAC名稱為(4S，12E)-15，17-二羥基-4-甲基-3-氧 雜二環[12. 4. 0]十八碳-12，15，17，19-四烯-2,8- 二酮((4S, 12E) -15，17-Dihydroxy-4-methyl-3-oxabicyclo [12. 4. 0]octadeca-12,15,17,19-tetraene_2,8-dione)。術語“玉米 赤霉烯酮”還包括任何玉米赤霉烯酮的衍生物，其包含一個或多個對漆酶的修飾易感的羥 基。動物飼料產品術語“動物”包括所有動物，包括人。動物的實例是牛(cattle)，(包括但不限于乳 牛/母牛(cow)和牛犢(calf))；單胃動物，例如豬(pig or swine)(包括，但不限于，小豬 (piglet)、飼育豬(growing pig)和母豬(sow))；家禽如火雞(turkey)和雞(chicken)(包 括但不限于雛雞(broiler chick)、蛋雞(layer))；和魚(包括但不限于鮭魚(salmon))。術語“飼料”或“飼料產品”意指任何適用于或意圖用于由動物攝取的化合物、制 備物、混合物或組合物。所述飼料產品可以是與不想要的水平的玉米赤霉烯酮分離的產品，其適合于由動 物食用(consumption)。所述飼料產品也可以是疑似包含不想要的水平的玉米赤霉烯酮的 產品，和/或玉米赤霉烯酮水平未知的產品，包括不包含可檢測水平的玉米赤霉烯酮的產
P
ΡΠ O所述飼料產品優選是基于谷粒的產品。所述基于谷粒的產品優選包含谷物，例如， 玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、高粱和黍中的一種或多種。在一個實施方案中，所述飼料產物可 以例如僅源自一種或多種谷物，而在另一個實施方案中部分源自豆類(例如源自大豆)且 部分源自谷物。所述基于谷粒的產品可以包含完整的或研磨的谷粒，例如，濕磨或干磨的 谷粒，包括包含濕磨或干磨谷粒的級分的基于谷粒的產品，所述級分例如，谷蛋白、蛋白質、 淀粉和/或油級分。還優選包含來自釀造和/或發酵過程的副產品(例如，酒糟(spent grain))的產品。酒糟是來自酒精飲料和乙醇燃料生產的副產品。啤酒酒糟(brewers，spent grain) (BSG)是釀酒廠中啤酒釀造的殘余物，這種釀酒廠使用發芽大麥作為主要原料。蒸 餾酒糟(distiller，s spent grain) (DSG)是在從發酵的谷粒如玉米、小麥、大麥、稻和 黑麥通過蒸餾去除醇之后在蒸餾室(distillery)中剩余的產品。蒸餾酒糟也稱作酒糟 (distiller，s grain)。將濕酒糟(WDG)干燥產生干酒 (DDG)，其主要用作動物飼料。漆酶在本發明的上下文中，術語“漆酶”包括由酶類別E. C. 1. 10. 3. 2所包含的酶。優選下述的酶，特別是重組的和/或基本上純化的酶。優選地，所用的漆酶源自多孔菌屬菌種(Polyporus sp.)的菌株，特別 是 Polyporus pinisitus 或雜色多孑L 菌(Polyporus versicolor),或毀絲霉屬菌 種(Myceliophthera sp.)的菌株，例如嗜熱毀絲霉(M. thermophila)，或絲核菌 屬菌種(Rhizoctonia sp.)的菌株，特別是Rhizoctonia praticola或立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的菌株，或鹽膚木屬物種(Rhus sp.)，特別是木蠟樹(Rhus vernicifera)的株。在本發明的具體實施方案中，所述氧化還原酶是多孔菌屬菌種漆酶，特別是WO 96/00290 中描述的 Polyporus pinisitus 漆酶(也稱長絨毛栓菌(Trametesvillosa)漆 酶)或毀絲霉屬菌種漆酶，特別是WO 95/33836中描述的嗜熱毀絲霉漆酶。進一步地，漆酶可以是柱頂孢屬菌種(Scytalidium sp.)漆酶，如W095/33837中 描述的嗜熱柱頂孢(S. thermophilium)漆酶，或梨孢屬(Pyricularia sp.)漆酶，如能夠 以商品名SIGMA no. L5510購自SIGMA的稻梨孢/稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)漆酶， 或鬼傘屬菌種(Coprinus sp.)漆酶，如灰蓋鬼傘(C. cinereus)漆酶，特別是灰蓋鬼傘IFO 30116漆酶，或絲核菌屬菌種漆酶，如立枯絲核菌漆酶，特別是WO 95/07988中描述的、具有 范圍在6. O至8. 5的最適pH的中性立枯絲核菌漆酶。漆酶也可以源自真菌如金錢菌屬(Collybia)、層孔菌屬(Fomes)、香菇屬 (Lentinus) >{IiJ^M (Pleurotus) > ffi^M (Aspergillus)、Mi包胃M (Neurospora) >^tE 孢屬(Podospora)、射脈菌屬(Phlebia)(例如輻射射脈菌(P. radiate) (W092/01046))、 革蓋菌屬菌種(Coriolus sp.)(例如毛革蓋菌(C. hirsitus) (JP2-238885))、或葡萄孢屬 (Botrytis)。在優選的實施方案中，漆酶是來自嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila) (MtL)的、具有作為GENESEQP:AAR88500保藏并在本文作為SEQ ID NO :1顯示的氨基酸序 列的漆酶，來自Polyporus pinsitus (PpL)的、具有作為UNIPROT :Q99044保藏并在本文作 為SEQ ID NO :2顯示的氨基酸序列的漆酶，來自天藍色鏈霉菌(Sti^ptomyces coelicolor) ScL的、具有作為SWISSPROT :Q9XAL8保藏并在本文作為SEQ ID NO :3顯示的氨基酸序列的 漆酶，或具有與這些序列中的任一同源的氨基酸序列的漆酶。漆酶必需以有效量存在于要解毒的介質中。漆酶優選以0. Ol-IOOmg酶蛋白每kg 干物質，優選0. I-IOmg酶蛋白每kg干物質，或更優選l_5mg酶蛋白每kg干物質的濃度存在。介體(mediator)在一個實施方案中，將充當供漆酶用的電子供體的介體與漆酶一起使用。所述介 體應該以有效量存在于要解毒的介質中。已知多種介體；參見例如 W09412620、W09412621、W09501626、W09600179 和 W09923887。將其中的介體通過提述并入本文。優選用于本發明的是選自以下的介體丁香酸甲酯(Methylsyringate) (MES)、吩 噻嗪-10-丙酸(phenothiazine-10-propionicacid) (PPT)、N- (4-氰基苯基)乙酰氧廂酸 (N-(4-cyanophenyl)acetohydroxamic acid) (NCPA)、乙酉先丁香酮(acetosyringone)、丁 香醛(syringaldehyde)、對香豆酸(p-coumaric acid),2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑 啉-6-磺酸)(2，2' -Azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate))、1_羥基苯并三唑 (1-hydroxybenzotriazole) >2,4-戊二酮和吩噻嗪。所述介體是商業上可獲得的或能夠通過本領域已知方法制備的。介質(medium)在一個實施方案中，漆酶降解包含飼料產品的介質中的玉米赤霉烯酮。所述介質優選是水性的并且可以是液體、糊劑(paste)或漿。為了形成合適的介質，可以向飼料產品 加入水。漆酶和介體可以單獨或一起包含在適合施用于所述介質的固態或液態配制劑中。在一個實施方案中，漆酶以某種程度降解玉米赤霉烯酮，由此使每kg干物質飼料 產品的玉米赤霉烯酮含量降低至低于初始量的50%、低于60%、低于70%、優選低于80%、 更優選低于85%、還更優選低于90%、和最優選低于95%。本發明的解毒效力依賴于例如介質的氧的可用性、pH、溫度和緩沖液。例如，處理 可以在實際漆酶(actual laccase)的相對活性為至少50、或60、或70、或80或90%的pH 值進行。同樣，例如，處理可以在實際漆酶的相對活性為至少50、或60、或70、或80或90% 的溫度進行。相對活性是相對于觀察到最高活性的PH值的活性計算的。介質中的氧漆酶所需的氧的來源可以是來自大氣的氧或用于原位產生氧的氧前體。來自大氣 的氧會通常以充足的量存在。如果需要更多的02，可以加入額外的氧，例如，作為加壓的大 氣或作為加壓的純氧。介質中的DH依賴于漆酶的特征和所用的介體等，所用介質的pH應通常在5-11的范圍，優選在 6-10的范圍，例如6. 5-8. 5。介質中的溫度優選使用接近于用于漆酶的最適溫度的反應溫度。在本發明的多個實施方案中， 應使用范圍在10-65°C，更優選30-50°C的溫度。處理持續時間處理的持續時間依賴于處理類型、要處理的對象(item)的類型、介質的性質(例 如溫度和PH)和所用的酶和介體的類型和量等。酶反應不斷進行直到達到期望的結果，其后可以可以或可以不通過使酶失活(例 如，通過熱處理步驟)終止所述酶反應。為了解毒的目的，可以使用范圍在1分鐘至1周的處理時間。在許多情況下，范圍 在6-48小時的處理時間將是合適的。同一性兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關聯性用參數“同一性”描述。就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16 =276-277)(優選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中所執行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443_453)來確定的。 所用的可選參數是缺口產生罰分(gapopen penalty)為10，缺口延伸罰分(ap extension penalty)為 0· 5，和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版本)取代矩陣。使用 Needle 標記為 "longestidentity"( “最長同一性”)的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比 同一性并且該輸出結果是如下計算的(相同的殘基數XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程 序包(EMBOSS The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice 等，2000，見上文)(優選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中所執行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和Wunsch，1970，見上文)來確定的。所用的可選參數是缺口產生罰分為10， 缺口延伸罰分為0. 5，禾口 EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle 標記為“longest identity” ( “最長同一性”)的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作 為百分比同一性并且該輸出結果是如下計算的(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)同源序列術語“同源序列”定義為在使用指定序列進行的tfasty檢索(Pearson，W. R.， 1999,于 Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener 禾口 S. A. Krawetz 編，185-219 頁)中給出的E值(或期望得分)小于0.001的預測蛋白。術語“同源序列”也可以定義為與指定序列具有至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或甚至100 %同一性程度的序列。
實施例實施例1材料和方法塵來自嗜熱毀絲霉(MtL)的、具有在本文如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的漆酶。來自Polyporus pinsitus (PpL)的、具有在本文如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序 列的漆酶。來自天藍色鏈霉菌(ScL)的、具有在本文如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的漆酶。介體丁香酸甲酯(MeS)吩噻嗪-10-丙酸(PPT)測定法反應在Eppendorf管中的300微升體積中進行，其中包含玉米赤霉烯酮 30 μ M、介體0. 2mM、乙酸鈉IOOmM和酶0. Img EP/mL。在對照反應中，將所述含酶體積用等 量H2O替代。將反應在37°C溫育24小時，其后通過加入600 μ L的100 μ M乙腈終止溶液來 終止反應。將反應儲存在-20°C直到進行層析分析。層析分析將樣品離心并通過HPLC-DAD 如 Smedsgaard (J. Chromatogr. A， 1997，760，264-270)所述分析上清液的玉米赤霉烯酮。DAD掃描從200_600nm。在 Phenomenex (Torrance, CA) Luna C18(2) 10X 2mm ID，3 μ M，柱 2 上在 20 分鐘使用從 5%到 100%乙腈的線性梯度進行分離。相對于對照計算殘余的玉米赤霉烯酮。結果示于表1和 2中。表1.在pH 4. 5分別以3種不同的漆酶和兩種介體溫育24小時之后的殘余玉米 赤霉烯酮(ZEA) 表2.在pH 6分別以3種不同的漆酶和兩種介體溫育24小時之后的殘余玉米赤 霉烯酮(ZEA)
權利要求
一種用于降解飼料產品中的真菌毒素的方法，所述方法包括用漆酶處理所述飼料產品。
2.權利要求1的方法，其中所述真菌毒素是玉米赤霉烯酮。
3.權利要求1或2任一項的方法，其中所述漆酶的劑量是0.Ol-IOOmg酶蛋白每kg干 物質，優選0. I-IOmg酶蛋白每kg干物質，或更優選l-5mg酶蛋白每kg干物質。
4.權利要求1或3任一項的方法，其中使用介體。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述介體是丁香酸甲酯或吩噻嗪-10-丙酸。
6.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述飼料產品是基于谷物的飼料產品。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述飼料產品包含選自玉米、小麥、大麥、黑麥、 稻、高粱和黍中的一種或多種。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述飼料產品是動物飼料組合物。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中所述飼料產品是發酵方法的副產品。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述飼料產品包含啤酒酒糟、蒸餾酒糟、蒸餾 濕酒糟和/或蒸餾干酒糟。
11.權利要求1-10中任一項的方法，其中所述飼料產品是豬飼料產品。
12.漆酶用于降解真菌毒素的用途。
13.根據權利要求12的用途，其中所述真菌毒素是玉米赤霉烯酮。
14.根據權利要求11或13的在基于谷物的飼料產品中的用途。
15.權利要求11-14中任一項的用途，其中所述漆酶的劑量是0.Ol-IOOmg酶蛋白每kg 干物質，優選0. I-IOmg酶蛋白每kg干物質，或更優選l_5mg酶蛋白每kg干物質。
全文摘要
本發明涉及用于受到真菌毒素玉米赤霉烯酮污染的飼料產品解毒的方法。
文檔編號A23L1/03GK101903527SQ200880121196
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月12日 優先權日2007年12月14日
發明者伯思·H·索倫森, 安德斯·維克索-尼爾森 申請人:諾維信公司