檢測核酸的裝置和方法

專利名稱：檢測核酸的裝置和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測核酸，例如用于分子診斷的方法和設備，例如生物傳感器。
背景技術：
磁性顆粒在核酸檢測方法中是用途是公知的。例如，W02006131892描述了在其中 擴增核酸的磁性生物傳感器。在擴增期間，磁性顆粒摻入到擴增的DNA中。擴增的核酸隨后 利用摻入的磁性顆粒來檢測。檢測方法涉及在傳感器表面附近磁性顆粒的結合。在傳感器 表面附近的結合是通過目標與附著到傳感器表面的探針的結合來實現(xiàn)的。在這些方法中， 必需添加嚴格的步驟來獲得對探針/目標相互作用的高靈敏性和特異性。這一般涉及改變 溫度和/或緩沖條件。現(xiàn)有技術提出了在固體表面上的雜化分析，其中信號產(chǎn)生在核酸酶的作用下被控 制(W003052139、W002059364)。在這些公開物中，描述了一些方法，其中核酸目標/探針雜 化物被酶裂解，引起可檢測信號的分離。這樣的酶裂解步驟使得該分析更為選擇性和更嚴 格。選擇對某些堿基序列為選擇性的酶的可能性進一步提高了檢測的特異性。在某些情況 下，甚至可以檢測到單個核苷酸錯配(例如，SNP)。W002059364提出了磁性顆粒作為標記 物的用途?，F(xiàn)有技術的分析具有幾個缺點，它們是在反應表面附近或反應表面上進行檢測的 結果。在酶消化之后需要洗滌步驟，來確保低背景信號和消除假陽性。雖然可能等待裂解 的標記物擴散遠離表面，但這顯著地提高了得到結果的時間。在涉及快速檢測的應用中，過 程步驟的數(shù)量的減少是期望的。第二，由于標記物附著到表面，可測量的濃度的動態(tài)范圍與 在總(bulk)體積中產(chǎn)生信號的同質的分析相比會是有限的。另外，存在著很少的方法，其容許從目標產(chǎn)生的信號的擴增而不擴增目標本身或 添加更多標記物。這些方法對于低濃度的核酸目標的檢測是有益的，而不會擴增這種目標。具有核酸酶活性的核酸(DNAzymes)已經(jīng)用于在擴增期間核酸的定量實時檢測。 在同質階段，Qzyme探針(Clontech)采用DNAzymes通過供體和接受體染料之間的拴系物 的酶裂解來控制光的產(chǎn)生。染料還已經(jīng)與金納米粒子組合作為探針中的淬滅劑。這些探針 的檢測利用包括熒光和比色方法的方法光學地進行。這些定量性的方法需要探針和染料標 記物的復雜的設計。發(fā)明概述本發(fā)明公開了基于磁性或可磁化顆粒的操作檢測核酸目標的方法，所述磁性或可 磁化顆粒從探針上朝向傳感器表面釋放。這種釋放是裂解酶的作用的結果。這些方法可以 應用于例如核酸的定量檢測。它們可以任選地與擴增技術(例如，PCR)組合。本發(fā)明的特別的和優(yōu)選的方面在附隨的獨立和從屬權利要求中列出。從屬權利要 求的特征可以視情況與獨立權利要求的特征以及與其他從屬權利要求的特征組合，不僅僅 是如權利要求中明確闡述的。本發(fā)明的一個方面涉及檢測樣品中目標核酸分子(1)的方法。最特別地，本發(fā)明 涉及一些方法，其組合了通過磁場移動的磁性顆粒的使用和核酸特異性酶的作用。在特定
3的實施方式中，提供了檢測樣品中的目標核酸分子(1)的方法，其包括步驟a)提供了與目標核酸分子(1)互補的核酸探針(2)，其中所述探針(2)與磁性或 可磁化顆粒(3)連接，并附著到表面(4)b)在容許所述探針(2)與所述目標核酸(1)的結合的條件下使所述樣品與所述探 針接觸，從而形成探針/目標雜化物，c)施加或活化核酸裂解酶(E)，其區(qū)別未結合的探針和結合的探針/目標雜化物，d)至少在步驟(c)期間，施加磁場(F)以操作未結合的磁性或可磁化顆粒朝向遠 離所述表面的區(qū)域，e)在一個或更多個時間點檢測在所述表面⑷上磁性或可磁化顆粒的濃度和/或 在遠離所述表面的所述區(qū)域中磁性或可磁化顆粒的濃度，在特定的實施方式中，在所述表面處和/或在遠離所述表面的所述區(qū)域中的檢測 通過測量所述磁性或可磁化顆粒的磁場來進行。在進一步的實施方式中，在所述表面處和/或在遠離所述表面的區(qū)域中磁性或可 磁化顆粒的檢測是通過FTIR(frustrated total internalreflection，受抑全內(nèi)反射)進 行的。在進一步特定的實施方式中，在所述表面處和/或在遠離所述表面的區(qū)域中磁性 或可磁化顆粒的檢測通過測量附著到所述磁性或可磁化顆粒的可檢測標記物來進行。在特定的實施方式中，在本發(fā)明的上下文中使用的磁性或可磁化顆粒是包含磁性 材料和熒光標記物的顆粒。在特定的實施方式中，本發(fā)明的方法利用了核酸裂解酶，其至少裂解所述探針/ 目標雜化物中的所述探針。在可選擇的實施方式中，本發(fā)明的方法利用了核酸裂解酶，其裂解雙鏈DNA。在特定的實施方式中，本發(fā)明的方法利用了核酸裂解酶，其是序列特異性酶，或是 對甲基化的核酸具有特異性的酶。在此處描述的方法的某些實施方式中，在核酸裂解酶之前添加切口酶。在特定的實施方式中，本發(fā)明的方法利用核酸裂解酶，其是形成所述探針(2)的 一部分的 DNAzyme 或 RNAzyme。在又進一步的實施方式中，本發(fā)明的方法利用核酸裂解酶，其在所述目標核酸分 子(1)的PCR擴增期間被摻入到所述目標核酸分子(1)中。在特定的實施方式中，本發(fā)明的方法利用核酸裂解酶，其裂解DNA/RNA雜化物。在進一步的實施方式中，描述了一些方法，其中所述目標核酸(1)是DNA，所述探 針⑵是RNA，其中所述酶(E)是僅消化RNA/DNA雜化物中的RNA的酶。本發(fā)明的進一步的方面涉及用于根據(jù)磁性或可磁化顆粒的檢測來檢測目標核酸 的設備。根據(jù)本發(fā)明的設備包括反應表面(4)和檢測區(qū)域，其中所述檢測區(qū)域是能夠檢測 結合到所述表面的標記物的檢測區(qū)域，或是能夠檢測在遠離所述表面的區(qū)域中的標記物的 檢測區(qū)域。一般地，此處描述的設備進一步包括移動磁性或可磁化顆粒遠離和/或朝向能 夠檢測結合到所述表面的標記物的檢測區(qū)域、和/或遠離和/或朝向能夠檢測在遠離所述 表面的區(qū)域中的標記物的檢測區(qū)域的裝置。在進一步特定的實施方式中，本發(fā)明的設備包 括
-反應表面(4)，-具有能夠檢測與所述反應表面(4)結合的標記物的第一檢測區(qū)域的第一傳感器 (61)，-用于施加從所述檢測表面到遠離所述檢測表面的區(qū)域的磁場(F)的裝置-具有遠離所述檢測表面的第二檢測區(qū)域的第二傳感器(62)，和-任選地，用于將磁性或可磁化顆粒移動朝向所述第二檢測區(qū)域的裝置。在特定的實施方式中，設備包括反應室，其中所述反應室包括_包括反應表面(4)和能夠檢測結合到所述反應表面(4)的標記物的第一檢測區(qū) 域的第一區(qū)域，-遠離所述第一區(qū)域的第二區(qū)域，包括能夠檢測所述遠離第一區(qū)域的區(qū)域中的標 記物的第二檢測區(qū)域，和-施加從所述第一區(qū)域到所述第二區(qū)域的磁場(F)的裝置。在此處描述的設備的特定的實施方式中，所述第一和/或第二傳感器能夠檢測不 同的標記物。在進一步特定的實施方式中，此處設想的設備進一步包括具有附著于所述反應表 面的磁性或可磁化顆粒的多個不同的探針，其中每個探針包括不同的可檢測標記物。在又進一步特定的實施方式中，在此設想的設備的第一和第二區(qū)域處在所述反應 室的對側上。根據(jù)以下詳細說明，連同附圖，本發(fā)明的上述和其他特征、特點和優(yōu)點將變得明 顯；


了，舉例來說，本發(fā)明的原理。給出這種描述僅是為了舉例，而不是限制本發(fā)明 的范圍。以下引用的附圖標記涉及附圖。附圖的簡要說明附圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的核酸探針/目標雜化的核酸酶依賴性檢測的特定實施 方式的示意圖。畫面A到C描繪了其中存在于樣品中的目標核酸結合到探針的情況(A 目標核酸 存在但是不雜化)。探針/目標雜化物的存在(B:探針/目標雜化物的形成)引起了這種 雜化物被僅消化雙鏈核酸的酶的裂解(畫面C)，并引起磁性或可磁化顆粒從探針釋放(C: 釋放的磁性或可磁化顆粒被磁場F移動離開反應表面)。畫面D到F描繪了不與目標雜化的(過量的)探針的結局(其也相應于樣品中不 存在目標核酸的情況)。不形成雜化物，不發(fā)生消化，磁性或可磁化顆粒不釋放。(1 目標核酸；2 探針核酸；3 磁性或可磁化顆粒；4 反應表面；E 核酸酶；F磁 力)。附圖2顯示了其中沒有目標核酸的擴增而發(fā)生信號放大的本發(fā)明的特定實施方 式的示意圖。在第一個步驟(A)中，核酸目標結合探針。然后添加僅消化探針/目標雜化 物中的探針的酶，引起附著到探針的磁性或可磁化顆粒的釋放(畫面B)。然后所述釋放的 目標核酸可再次結合探針(畫面B)。所述探針/目標雜化物中的探針再次消化，引起其他 磁性或可磁化顆粒的釋放(畫面C)。1 目標核酸；2 探針核酸；3 磁性或可磁化顆粒；4 反應表面；E 核酸酶；F磁 場。
附圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式用于進行核酸酶依賴性分析的設備的示意 圖。所述設備包括具有反應表面(4)和兩個傳感器(61和62)的反應室(5)和產(chǎn)生磁場(F) 的裝置。附圖3顯示了利用不同的探針和標記物用于多路化的設備起作用的實施方式。帶 有磁性或可磁化顆粒和標記物的每個探針的部分在雜化和核酸酶處理之后被裂解。存在于 未消化的探針(21)和(22)的部分上的磁性或可磁化顆粒(31)和(32)保持在傳感器(61) 附近。釋放的磁性或可磁化顆粒(31')和(32')通過磁力F被操縱朝向傳感器(62)。
在不同的附圖中，相同的附圖標識是指相同的或類似的元件。將針對特定的實施方式和參考某些附圖描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不受此限制，僅 由權利要求限制。權利要求的任何附圖標識將不被看做限制范圍。描述的附圖僅是示意性 的而非限制性的。在附圖中，為了說明性的目的，某些元件的大小可以被擴大，并且沒有按 比例尺描繪。當術語“包括”在本說明書和權利要求中使用時，它不排除其他元素或步驟。 當涉及單名詞時使用不定冠詞或冠詞例如“a”、或“an”、“the”的地方，這包括該名詞的復 數(shù)，除非特別聲明了其他的情況。此外，在說明書中和在權利要求中，術語第一、第二、第三等等，是用于區(qū)分相似的 要素，而不一定描述次序或時間順序。要理解的是，這樣使用的術語在合適的狀況下是可互 換的，在此描述的本發(fā)明的實施方式能夠以不同于在此描述和說明的其他順序來操作。單獨地提供以下術語或定義來幫助理解本發(fā)明。這些定義不應當被認為具有小于 本領域普通技術人員所理解的范圍。發(fā)明的詳細說明定義在此使用的術語“目標”是指在本發(fā)明的方法中要被檢測和/或定量的核酸。本 申請設想的目標分子的實例的非限制性列表在說明書中提供。術語目標可以指樣品中存在 的核酸，但還可以指其擴增的版本(通過PCR、AMR、TMR、NASBA等)。在本申請中使用的術語“探針”是指包含能夠特異性結合目標(的部分)的序列 的核酸。在本發(fā)明中“核酸”是指在天然的樣品中存在的DNA和RNA，但還指合成的分子，例 如PNA (具有肽骨架的核酸)。當在磁場中的操作的上下文中被提及時，能夠在磁場中被磁吸的磁性珠子、球體 或其他形狀被稱為“顆粒”。在此使用的術語“標記物”是指產(chǎn)生可檢測信號的任何化合物。在這方面，磁性或 可磁化顆粒當它們在例如它們的磁場的檢測或它們的光學性質的檢測的上下文中被提及 時，被稱為“標記物”。術語“反應表面”是指探針可以附著之上的表面，并且在本發(fā)明的方法中核酸酶消 化在此處發(fā)生。如在此使用的“檢測區(qū)”(或區(qū)域)是指一種區(qū)域，任選地相應于反應室的一部分， 其處在傳感器的范圍之內(nèi)，容許這個區(qū)域內(nèi)標記物的檢測。當在表面上進行檢測時，這也被 稱為檢測表面。檢測表面可以相同于或不同于反應表面。本發(fā)明的一個方面涉及檢測樣品中的目標核酸分子的方法。這些方法基于目標核 酸分子與探針的結合，其除核酸酶活性以外還確保釋放可檢測的標記物。根據(jù)特定的實施
6方式，這些方法包括以下步驟提供包含與目標核酸分子(1)互補的序列的核酸探針(2)，其中所述探針(2)與磁 性或可磁化顆粒(3)連接，并附著到表面(4)，在容許探針(2)與目標核酸(1)的結合的條件下使懷疑含有目標核酸的樣品與所 述探針接觸，從而，如果所述目標核酸存在于樣品中，容許探針/目標雜化物的形成，施加或活化核酸裂解酶(E)，其區(qū)別未結合的探針和結合的探針/目標雜化物，施加磁場(F)，以操縱未結合的磁性或可磁化顆粒朝向遠離所述表面的區(qū)域，在一個或更多個時間點檢測所述表面(4)上磁性或可磁化顆粒的數(shù)量，和/或在 遠離所述表面的檢測區(qū)域中磁性或可磁化顆粒的數(shù)量。在本發(fā)明的上下文中，提及“遠離”或“遠離所述表面”的區(qū)域，是指一種區(qū)域，其 特征在于，磁性/可磁化顆粒在該區(qū)域中的存在不影響在所述表面上磁性顆粒的檢測，和/ 或在該區(qū)域中的檢測不受到所述表面上磁性/可磁化顆粒的存在的影響。對于檢測來說， 遠離所述表面的區(qū)域與在所述表面處的區(qū)域是不相關的。取決于使用的核酸酶的特征，在所述表面處或在遠離所述表面的區(qū)域中磁性或可 磁化顆粒的檢測直接地或逆反地與樣品中目標核酸的數(shù)量相關。在特定的實施方式中，區(qū)別未結合的探針和結合的探針/目標雜化物的核酸酶能 夠至少裂解探針/目標雜化物中的探針，并且不裂解未結合的探針。在這些實施方式中，僅 未結合的探針將保持在反應表面上。在反應表面處由未結合的探針上的標記物產(chǎn)生的信號 與樣品中目標的數(shù)量逆相關。在遠離結合表面的檢測區(qū)域中釋放的顆粒所產(chǎn)生的信號(裂 解的探針/目標雜化物)與樣品中目標的數(shù)量直接相關。在可選擇的實施方式中，區(qū)別未結合的探針和結合的探針/目標雜化物的核酸酶 僅裂解未結合的探針核酸。在這些實施方式中，僅在使探針與樣品接觸時形成的探針/目 標雜化物保持在反應表面上。在反應表面處由探針/目標雜化物上的標記物產(chǎn)生的信號與 樣品中目標的數(shù)量直接相關。在遠離結合表面的區(qū)域中釋放的顆粒所產(chǎn)生的信號(裂解的 未結合的探針)與樣品中目標的數(shù)量逆相關。在此處設想的方法中，組合核酸雜化、核酸酶裂解和磁性分離。在這些方法的特定 實施方式中，雜化和核酸酶消化都不受磁場的存在的影響。因而，磁場的應用不必限于方法 中的那些步驟，其中釋放的磁性或可磁化顆粒被操縱朝向遠離所述表面的區(qū)域，和/或其 中在所述表面上磁性或可磁化顆粒的存在被檢測。這具有的優(yōu)點是，檢測可以在整個方法 中發(fā)生，以及目標的檢測可以與例如目標的PCR擴增同時地進行。本發(fā)明的方法適合于各種各樣的樣品中核酸的檢測。樣品可以是任何來源，包括 環(huán)境樣品、法醫(yī)樣品、來自工業(yè)過程的樣品、微生物樣品、組織或體液樣品，等等。本發(fā)明的 方法適合于DNA以及RNA。在特定的實施方式中，樣品中的核酸在分析前被加工，通過，例 如，除去蛋白質、從RNA分離DNA、分離mRNA、經(jīng)由逆轉錄酶將RNA轉化成DNA、經(jīng)由超聲處理 或限制消化的DNA的斷裂，等等。在特定的實施方式中，經(jīng)由PCR或其他方法，例如SDA (鏈置換擴增)、TMA (轉錄介 導的擴增)或NASBA(基于核酸序列的擴增)，DNA或RNA目標核酸在此處描述的分析之前 或期間被擴增。在本發(fā)明的方法中使用的核酸探針可以是DNA、RNA或甚至合成的核酸樣分子，例
7如PNA。探針一般經(jīng)由化學方法合成，但是也可以通過從質?；蚱渌d體分離核酸來制備。 做為選擇，所述探針通過體外轉錄和/或翻譯方法，或通過擴增方法例如PCR來制備。在特 定的實施方式中，除了能夠特異性結合目標(的部分)的序列之外，探針任選地含有間隔 區(qū)。這樣的間隔區(qū)的功能是進一步提高酶裂解位點和磁性顆粒之間，和/或酶的裂解位點 和反應表面之間的物理距離。這樣，酶較少地被各種表面阻礙。間隔區(qū)可以是任何物質，核 酸、蛋白質、小分子、肽，等等，其不是分析中使用的核酸酶的底物。在本發(fā)明的方法中，核酸探針通過微陣列領域中公知的方法附著到表面。所述表 面被用作反應表面，一般地是反應室的部分。在現(xiàn)有技術中使核酸與其他化合物反應的不同方法是已知的，例如通過反應性功 能基團(_C00H、NH2、HS、環(huán)氧基、醛、甲苯磺酰基、馬來酰亞胺，等等)的化學偶聯(lián)或經(jīng)由中 間結合基團和結合基團對來偶聯(lián)，例如抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原、抗體/半抗原、 蛋白質/蛋白質、蛋白質/凝集素、蛋白質/DNA、DNA/DNA、蛋白質/適體。這些和其他方法 可以用于將探針附著到本發(fā)明的方法中設想的表面上。此處描述的方法中使用的探針一般進一步用磁性或可磁化顆粒來功能化。將磁性 或可磁化顆粒結合到DNA的方法是技術人員公知的，由例如Dynal商品化。 為了最佳靈敏度，本發(fā)明的方法利用磁性顆粒，其中磁性顆粒/探針比例是1。在此處設想的方法的特定的實施方式中，磁性或可磁化顆粒作為標記物起作用， 被能夠在它的檢測區(qū)域(例如，在檢測表面上)中檢測磁性或可磁化顆粒的存在的傳感器 來檢測。例如，這可以由顆粒的磁場的檢測來確保。做為選擇，磁性顆粒通過它們的光學性 質利用例如FTIR來檢測。在本發(fā)明的上下文中設想的方法的進一步特定的實施方式中，使用探針，其除了 磁性或可磁化顆粒之外包含一個或更多個其他功能基團。這樣的基團一般是可檢測標記 物，例如光學標記物(熒光、磷光、SERRS)或超聲標記物。這些標記物可直接附著到核酸探 針上。在進一步特定的實施方式中，所述磁性或可磁化顆粒包含一個或更多個功能基團，其 可以用作標記物。標記物可以經(jīng)由化學方法附著到磁性或可磁化顆粒的表面，或可以摻入 到磁性或可磁化顆粒中(例如，含有順磁材料的熒光聚合物顆粒)。對此處描述的方法的主 要要求是，在分析期間，例如，作為核酸酶處理的結果，所述磁性或可磁化顆粒和可檢測標 記物不相互分離。本發(fā)明的方法設想DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA探針/目標雜化物的形成。一 般地，能夠與目標特異性雜化的探針內(nèi)的序列相應于比目標核酸更短的寡核苷酸。任選地， 如上所述，探針可以包含間隔區(qū)。因素例如雜化物的性質(DNA/DNA或DNA/RNA)、探針/目 標雜化物的長度、探針和目標之間互補性的程度對雜化具有影響。探針的長度和序列、緩 沖劑組成和溫度的合適的選擇容許探針和目標之間特異性結合的操作。合適的條件的選 擇是技術人員已知的，且例如在 Sambrook 等(2001) 〃 Molecular Cloning :A Laboratory Manual"，Cold Spring HarborPress)中被解釋。如上文詳述的，根據(jù)本發(fā)明的方法包括形成的目標/探針雜化物內(nèi)探針(任選地 還有目標)的裂解，或僅單鏈探針，即，不與目標雜化的探針的裂解，從而確保磁性或可磁 化顆粒的釋放。這一般通過添加或活化核酸酶(核酸裂解酶)到反應表面上的目標/探針 雜化物來保證。在本發(fā)明的方法中設想了不同類型的核酸裂解酶的使用。使用的酶可以
8是裂解或消化核酸的任何類型的催化分子，包括蛋白質、肽和核酶(DNAzymes、RNAzymes或 DNA和RNA的組合)。所選的酶可以在探針內(nèi)的單個位置或在多個位置裂解(包括其中的 間隔區(qū)內(nèi))。合適的酶的選擇取決于探針和目標的性質和序列。在本發(fā)明的特定的實施方式中，提供了一些方法，其包括探針/目標雜化物的消 化。在此，使用核酸酶，其至少裂解所述探針/目標雜化物中的探針，任選地還裂解目標。在特定的實施方式中，目標和探針都是DNA。在這樣的方法中，所選的酶一般僅作 用于雙鏈DNA。其實例是雙鏈特異性DNAses，例如T7核酸外切酶和核酸外切酶III。雙鏈DNA的裂解還可以用僅在特定的位置識別特定堿基并裂解的限制性內(nèi)切酶 來進行。這些特異性裂解序列可以是目標中固有的，或是在目標擴增過程期間修飾的結果。 稀有限制性酶識別位點(例如，8bp切割物)的摻入顯著地提高分析的特異性。在其中不發(fā) 生擴增步驟的那些分析中，特異性可以通過篩選目標核酸的序列中較低頻繁地出現(xiàn)的限制 性酶識別位點并利用這種區(qū)域用于探針的設計來提高。在此處描述的方法的其他實施方式中，目標和探針都是RNA。在這樣的方法中，所 選的酶一般僅作用于雙鏈RNA。其實例是E.coli的核糖核酸酶(RNAse)III。在此處描述的方法的進一步的實施方式中，目標是DNA，探針是RNA。在這樣的方 法中，所選的酶一般僅作用于DNA/RNA雜化物，其中至少RNA被裂解。其實例是Rnase H，其 特異性地降解RNA/DNA雜化物中的RNA，或T7核酸外切酶，其降解RNA/DNA雜化物中的RNA 和DNA，但不降解單鏈RNA。在此處描述的方法的又另一個實施方式中，目標是RNA，探針是DNA。在這些方法 中，所選的酶一般僅作用于DNA/RNA雜化物，其中至少DNA被裂解，例如來自堪察加半島蟹 的雙鏈特異性核酶(DSN) (Shagin 等(2002) Genome Res. 12,1935-1942)。在進一步特定的實施方式中，目標和探針都是DNA，其中在目標和探針DNA之 間發(fā)生錯配(突變或環(huán)體)。酶例如CEL1 (US658322)或SP1 (Pimkin等(2007) BMC Biotechnol.7,29)可以在存在錯配時切開DNA。切口酶一般特異于雙鏈核酸，不裂解單鏈 核酸。任選地，核酸外切酶例如核酸酶Bal-31或T7核酸外切酶可以進一步降解切口的DNA， 并促進磁性或可磁化顆粒的釋放。在本發(fā)明的特定的實施方式中，提供了一些方法，其包括僅未結合的探針，S卩，不 與目標雜化的探針的消化。在此，使用裂解單鏈探針、但是不裂解探針/目標雜化物中的探 針或目標的核酸酶。在使用DNA探針時，適合于在這些方法中使用的酶的實例包括單鏈特異性 DNAses (例如，核酸外切酶1、綠豆核酸酶、核酸酶Bal31、Recjf, SI核酸酶)。在其他實施 方式中，對于RNA探針，使用的酶是單鏈特異性RNAse(RNAse I、RNAse A、RNAse T1、綠豆核 酸酶、核酸酶Bal31)。這樣的酶的使用在其中形成DNA/RNA雜化物的分析中是特別適合的。 為了避免在目標的結合之前探針的非期望的消化，單鏈特異性核酸酶在目標/探針雜化物 形成之后添加。在本發(fā)明的特定的實施方式中，核酸酶是具有催化性質的核酸。最特別地，核酸酶 在探針和/或擴增的目標核酸之內(nèi)存在。在這些實施方式中，所述酶不需要添加到探針，而 是被活化以確保所需的活性。在特定的實施方式中，使用基于核酸的酶(例如，DNAzymes和RNAzymes)，從而催化性質被構建到探針之中，使得DNA或RNAzyme成為探針的整體部分。一種這樣的探針的實 例是在 Sando 等(2005 Org. Biomol. Chem. 3，1002-1007)中描述的 TASC (Target-Assisted-SelfCleaving,目標輔助的自我裂解)探針。這樣的探針與目標的結合產(chǎn)生了導致DNAzyme 裂解自身的構象變化。附著到包含這樣的DNAzyme的探針的磁性或可磁化顆粒，由此可以 通過目標與探針的結合被裂解下來并釋放。在另一個實施方式中，除了能夠與目標雜化的序列之外，所述探針還含有作為核 酶的裂解反應的底物的序列。在這種情況下，探針可能必需滿足某些酶要求，例如，在裂 解位點處特定核糖核苷酸的存在。相關的活性核酶在擴增的核酸目標中(例如，經(jīng)由PCR 中的引物)提供，或在擴增期間釋放。在探針與目標的雜化之時，磁性或可磁化顆粒被 釋放。裂解的顆粒的數(shù)量可以與核酶的濃度、因而與目標的濃度相關。核酶的實例包括 (Qzyme (Clontech)，Hammerhead。這樣的核酶的使用容許PCR產(chǎn)物的實時、定量的檢測。本發(fā)明的方法中設想的核酸酶對于它們的活性可能需要特定的條件，例如，ATP、 GTP等等和任何輔因子(例如，NAD+)的存在。這些條件是已知的，可以在反應表面保證(例 如，通過使用適合的緩沖劑)。在對如上所述的核酸酶可應用時，探針結構可以調配來滿足合適的核酸酶的要 求(例如，游離的3’或5’末端、切口、缺口)。此外，如果目標要經(jīng)歷目標擴增過程(PCR、 NASBA、SDA...),擴增的目標可以被修飾(例如，通過引物)來滿足核酸酶的要求，或容許在 目標和探針兩者中的相似的修改。本發(fā)明的方法包括通過探針將磁性或可磁化顆粒結合到表面，然后釋放磁性或可 磁化顆粒，并確保它移動遠離它所結合的表面。更特別地，此處描述的方法包括其中磁性或 可磁化顆粒被磁場操縱遠離所述反應表面的步驟。本發(fā)明的方法公開了根據(jù)磁性或可磁化顆粒與表面的結合、裂解酶釋放所述顆粒 的比活性、和磁性或可磁化顆粒經(jīng)受磁力遠離所述表面、降低洗滌需要的，用于核酸目標的 定量分析。在此處描述的其中核酸酶僅作用于探針/雜化物的方法的實施方式中，當核酶 酶是活性的時候，施加磁場將所述顆粒拉離所述反應表面進一步確保了裂解的磁性或可磁 化顆粒被快速地從反應表面除去而不影響擴增，容許實時檢測。樣品中目標的存在所產(chǎn)生的信號可以在兩個水平上檢測。首先，與反應表面結合 的顆粒的數(shù)量可以在核酸酶的活性之前和之后來檢測。在這個實施方式中，反應表面作為 檢測區(qū)域、任選地作為檢測表面起作用。在僅僅設想來自探針/目標雜化物的標記物的裂 解、以及標記物僅可以在存在目標分子的情況下從表面釋放的那些實施方式中，從所述表 面釋放的顆粒的數(shù)量(以及因而在所述反應表面上降低的信號)與樣品中存在的目標的 數(shù)量相關。在其中核酸酶特異于單鏈探針的實施方式中，標記物僅可以從處在所述表面上、 不結合目標分子的那些探針釋放。因而在這些實施方式中，從所述表面釋放的顆粒的數(shù)量 (因而，在反應表面上降低的信號)，與樣品中存在的目標的數(shù)量逆相關。其次，釋放的磁性或可磁化顆?？梢栽谶h離所述反應表面的檢測區(qū)域中測量(例 如，在傳感器表面)，從而從所述反應表面釋放的顆粒(至少部分地)通過磁場被移動朝向 該檢測區(qū)域(在此稱為第二檢測區(qū)域)。這個檢測區(qū)域遠離所述反應表面。再一次，在僅探 針/目標雜化物被裂解的那些方法中，在遠離所述反應表面的這個檢測區(qū)域中檢測到的顆 粒的數(shù)量，與樣品中存在的目標的數(shù)量直接相關(越多目標存在于樣品中，信號越強)，而在利用僅降解單鏈探針的核酸酶的方法中，在第二檢測區(qū)域中檢測的信號與樣品中目標的 數(shù)量逆相關(越多的目標存在于樣品中，信號越弱)。不論在此處描述的方法的不同實施方 式中是否使用兩個檢測區(qū)域，能夠檢測所述反應表面上標記物的存在的傳感器和相應的檢 測區(qū)域被稱為第一傳感器/第一檢測區(qū)域，而能夠檢測遠離所述反應表面的區(qū)域中的標記 物的傳感器和相應的檢測區(qū)域被稱為第二傳感器/第二檢測區(qū)域。進行兩個獨立測量的可能性允許以高精度和在大的動態(tài)范圍之內(nèi)核酸目標的濃 度的動力學測定，因為可以對一個濃度進行若干測量。用磁場從反應表面除去的磁性或可 磁化顆粒的使用進一步提供了物理地采集顆粒以及計數(shù)它們的數(shù)量的選項(例如，作為遠 離反應表面的第二傳感器的特定的實施方式或除該實施方式以外)。這容許以高準確度和 精確度確定目標濃度。要注意的是，在上文設想的檢測方案中，在反應表面處和在遠離反應表面的檢測 區(qū)域中的檢測都可以根據(jù)檢測區(qū)域中磁性或可磁化顆粒的磁性或光學性質，或根據(jù)如下文 詳述的在磁性或可磁化顆粒之中或之上的在一個或兩個檢測區(qū)域中可檢測的另一個標記 物(不同于磁場)來發(fā)生。因而，在特定的實施方式中，所述磁性或可磁化顆粒的磁性本身用作檢測的標記 物。這可以用任何適合的電磁傳感器來進行，所述電磁傳感器可以檢測磁性或可磁化顆粒 的存在，例如，電極、電線、線圈、磁抗性傳感器GMR、AMR、TMR)、磁限的傳感器、Hal 1傳感器、 平面的Hall傳感器、SQUID、磁共振傳感器。做為選擇，檢測根據(jù)磁性或可磁化顆粒本身的 光學性質發(fā)生(例如，檢測例如氧化鐵的FTIR)。做為選擇，或與磁性和/或FTIR檢測組合地，可以使用其他標記物或檢測方法。例 如，磁性或可磁化顆粒也可以用于電檢測。做為選擇，磁性或可磁化顆?？梢园判圆牧?和例如熒光物質的混合物，還容許使用兩種獨立的方法檢測這樣的顆粒。在其他實施方式 中，核酸可以例如單獨地用磁性或可磁化顆粒和熒光標記物(參見上文)兩者來標記。還設想了其中磁性或可磁化顆粒根據(jù)一種材料來檢測的方法，所述材料不被包含 在磁性或可磁化顆粒本身之內(nèi)，或不附著于所述磁性或可磁化顆粒本身。例如，磁性或可磁 化顆粒結合的探針可以進一步包含光學標記物。所設想的檢測方法的這樣的實施方式僅適 合于其中在酶消化步驟中核酸探針不被完全消化的分析(其將引起磁性或可磁化顆粒從 標記物上的釋放)。例如，當探針包含某接頭和該接頭時，所述標記物可以連接到所述接頭， 條件是標記物所結合的接頭的至少這個部分(和將這個部分連接到所述顆粒的區(qū)域)未進 行酶裂解。基于磁性或可磁化顆粒本身的性質，或被包含在顆粒之內(nèi)的或直接附著到所述 顆粒的材料的性質的檢測方法，特別適合于其中核酸探針被完全地消化、因而通過核酸酶 從所述顆粒完全除去的分析。當除了磁性或可磁化顆粒本身的磁性或光學性質之外使用標記物時，探針的差異 化標記提供了進行多路化分析的可能性。例如，不同的探針(即，結合不同的目標)各自用 不同的標記物標記，從而可以同時檢測不同的目標的存在。例如，設想了細菌的不同菌株的 檢測。這可以在一種分析中進行，在所述分析中，結合到反應表面的菌株特異性探針各自用 包含磁性材料和不同的熒光材料的聚合物顆粒標記。取決于樣品內(nèi)存在的菌株的種類，特 異性著色的磁性或可磁化顆粒將在探針/目標雜化物的消化之后從所述表面釋放。如上文 詳述的，這可以任選地在反應表面處和/或在遠離反應表面的檢測區(qū)域中檢測。
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依靠探針/目標雜化物中探針的選擇性裂解的、此處描述的方法的那些實施方式 僅僅提供了額外的益處，即，任一檢測區(qū)域(或附著到任一傳感器表面)中標記物數(shù)量的檢 測可以在分析期間進行，以及作為時間的函數(shù)的信號的測量可以用于確定目標濃度。雖然 在單個時間點的信號足以評估濃度，一般進行在幾個時間點的測量，因為這改善了精確度。 基于動力學的測量的另一個優(yōu)點是可以測定在大的范圍內(nèi)的濃度。對于高濃度，可能希望 的是使用短的反應時間，因為標記物從反應表面的完全除去可以快速地獲得，而對于低濃 度，結合到反應表面的標記物的數(shù)量不受限制，長的反應時間是實現(xiàn)盡可能大的信號改變 所希望的。依靠終點或單一時間點測量的分析，例如在現(xiàn)有技術中描述的，檢測更有限的濃 度范圍。來自高目標濃度的信號的動力學檢測可以在短時間方式中測量(在從反應表面除 去所有標記物之前)，并外推到長時間方式，或反之，來自低目標濃度的信號可以在長時間 方式中測量，并內(nèi)推到短時間方式。由于測量可以實時地完成，有可能原位地根據(jù)反應速度 確定濃度是屬于高濃度方式還是低濃度方式。在信號改變的測量中，大信號中的小的改變(即，低目標濃度)將具有高誤差。為 了提高測量的精確度，在此處描述的方法的特定的實施方式中，測量從反應表面釋放的標 記物的數(shù)量，而不是保持附著到所述表面的標記物的數(shù)量。與其他力場(優(yōu)選磁性的)組 合地、被用于除去已經(jīng)被酶裂解反應釋放的顆粒的磁力，被用于收集和重定向裂解的顆粒 到另一個區(qū)域，在其中任選地檢測它們的標記物和測定它們的數(shù)量。裂解的和未裂解的顆 粒的測量產(chǎn)生了目標濃度的確定方面的非常高的精確度。容許裂解的和未裂解的顆粒的同 時實時測量的特定結構是通過與在反應表面處的第一傳感器、在遠離但是平行于這個反應 表面的檢測區(qū)域(例如，在傳感器表面處)中的第二傳感器，以及能夠拖動顆粒遠離所述反 應表面并朝向所述第二檢測區(qū)域的磁力的一種反應。所有裂解的顆粒通過磁力被拖離所述 反應表面，以及任選地在第二檢測區(qū)域就位，并被檢測。其他可能的結構包括鄰近的傳感器 (例如，在同一平面上相互遠離的兩個區(qū)域)與磁力組合，所述磁力能夠將平行于這些表面 的磁性或可磁化顆粒從反應表面處的第一檢測區(qū)域移動到遠離所述反應表面的第二檢測 區(qū)域。進一步的結構包括磁場與例如顆粒的微流運動組合，從而在通過磁力從所述反應表 面上除去之后，所述顆粒通過微流轉運到第二檢測區(qū)域。本發(fā)明的方法容許擴增的目標核酸的實時檢測。在包括病原體鑒定、病毒載荷測 試、食物測試和mRNA表達作圖的許多應用中，低數(shù)量的目標核酸使得必需利用各種指數(shù)性 (例如，PCR，NASBA)和線性(例如，LCR、TMA)擴增技術來擴增目標。這些核酸目標的定量 檢測例如在某些診斷方法中通常是理想的。在擴增期間目標核酸的實時檢測確保拷貝形成 的速率與原始目標核酸濃度的偶聯(lián)。因此，本發(fā)明的方法進一步確保實時地測定作為模板 的核酸目標的擴增速率。在這些實施方式中，核酸探針含有可在核酶的作用下裂解的片段 (DNA、RNA或組合)。如上所述，核酶的活化可以在核酸目標的擴增期間發(fā)生。更具體地，模 板復制的循環(huán)過程(聚合酶結合、引物結合或鏈延伸)可以引起核酶的釋放、活化或產(chǎn)生。 對于PCR和NASBA來說，有可能使用例如含有核酶的模板的引物，從而鏈延伸引起附著到擴 增子的活性核酶序列的產(chǎn)生(這樣的引物是在W02007056312A2中公開的Qzyme引物)?；?性核酶可以與含有必需的識別序列的核酸探針雜化，并從反應表面釋放磁性或可磁化顆粒 (即，標記物)。隨著每一輪擴增，酶的數(shù)量與擴增子的數(shù)量成正比地提高。在釋放的標記 物的提高中觀察到酶活性的指數(shù)式提高。如在標準的實時PCR中，目標的濃度越高，達到某一檢測水平所需的循環(huán)數(shù)越少。游離標記物由于酶作用僅可在溶液中存在，背景信號將是 極低的。在特定的實施方式中，本發(fā)明的方法被用于檢測甲基化的目標核酸。DNA甲基化一 般通過DNA甲基化酶在CpG位點(在順序上為胞嘧啶隨后是鳥嘌呤)發(fā)生。在細菌中，甲基 化通過酶，例如通過EcoR I甲基化酶(識別GAATTC序列)在腺嘌呤位點發(fā)生。還描述了 甲基化RNA底物的RNA甲基化酶。取決于分析的設計(甲基化的或未甲基化的探針DNA)， 可以使用某些核酸內(nèi)切酶，對于它們，裂解取決于甲基化DNA的存在(例如，MCRBc, Dpnl) 或甲基化DNA的缺乏(例如，DpnII、SacI)。這些分析適合于，例如，腫瘤診斷，因為許多基 因的甲基化狀況是某些癌癥的指示。本發(fā)明的另一個方面提供了用于進行例如此處描述的那些的方法的設備。更特別 地，提供了設備，其容許磁性或可磁化顆粒從反應表面移動到遠離所述反應表面的區(qū)域，和 具有檢測區(qū)域的傳感器，所述檢測區(qū)域能夠檢測在所述反應表面處和/或遠離所述反應表 面的顆粒。在特定的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的設備包括反應表面(4)遠離所述反應表面的檢測區(qū)域施加磁場的裝置，所述磁場能夠將磁性或可磁化顆粒從所述反應表面移動到遠離 所述反應表面的區(qū)域。在此設想的設備的特定的實施方式進一步包括傳感器(在此稱為第一傳感器)， 其保證第一檢測區(qū)域能夠檢測結合到所述反應表面的標記物。在進一步特定的實施方式中，施加磁場的裝置保證了在反應表面和遠離所述反應 表面的檢測區(qū)域之間磁場的存在。做為選擇，設想了設備，其除了施加磁場的裝置之外，還 包括移動磁性或可磁化顆粒朝向第二檢測區(qū)域的裝置。在包含第一和第二檢測區(qū)域的設備中，第一和第二檢測區(qū)域可以位于設備中不同 的位置，只要在一個檢測區(qū)域中標記物的檢測不受另一個檢測區(qū)域中標記物的存在的影 響。典型的布置是檢測區(qū)域處在反應室的對側，或鄰近(即，在同一平面中)但相互足夠地 遠離的放置。在可選擇的實施方式中，提供了僅包含上文描述的第二檢測區(qū)域的設備，所述第 二檢測區(qū)域遠離所述反應表面。在特定的實施方式中，提供了包含反應室的設備，其中所述反應室包括第一區(qū) 域，其包含反應表面和保證第一檢測區(qū)域能夠檢測結合到所述反應表面的標記物的傳感 器，和遠離所述第一區(qū)域的第二區(qū)域，包含能夠檢測遠離所述第一區(qū)域的區(qū)域中的標記物 的第二傳感器(和相應的檢測區(qū)域)。這樣的設備進一步包括在所述第一區(qū)域和所述第二 區(qū)域之間施加磁場的裝置，以確保顆粒從/到所述表面和/或從/到遠離所述表面的檢測 區(qū)域的移動。在進一步特定的實施方式中，提供了設備，其包括_反應室，包括所述反應室的第一區(qū)域，其包含反應表面(4)和傳感器(61)，所述傳感器保證在 所述反應表面附近的第一檢測區(qū)域檢測結合到所述反應表面的磁性或可磁化顆粒(3)反應室的遠離所述第一區(qū)域的第二區(qū)域，包括第二傳感器(62)，所述第二傳感器
13保證第二檢測區(qū)域檢測從所述反應表面釋放的磁性或可磁化顆粒，和-施加從所述第一區(qū)域到所述第二區(qū)域的磁場(F)的裝置。如上文詳述的，所述第一和/或第二傳感器可以是檢測磁性或可磁化顆粒的磁 性、光學或電學特征的相同或不同的傳感器，和/或檢測磁性或可磁化顆粒上直接存在、磁 性或可磁化顆粒內(nèi)的、或通過探針的部分間接結合到所述磁性或可磁化顆粒的其他標記物 的傳感器。在特定的實施方式中，設備可以隨時可使用地提供，S卩，包括附著到反應表面的適 合的核酸探針(2)，從而所述探針攜帶磁性或可磁化顆粒。在特定的實施方式中，傳感器具備能夠檢測結合到反應表面的標記物的檢測區(qū) 域。在進一步特定的實施方式中，所述反應表面可以處在透明材料，例如玻璃或塑料(例 如，聚苯乙烯或聚碳酸酯)中，其容許結合到附著于玻璃反應表面的探針的光學(例如，熒 光)標記物的檢測。在特定的實施方式中，能夠檢測結合到所述反應表面的標記物的傳感器僅特異性 檢測緊密接近于或處于反應表面上的區(qū)域中的標記物，而不是檢測靠近所述反應表面的區(qū) 域中存在的主體(bulk)溶液。如上所指出的，根據(jù)所述磁性或可磁化顆粒本身的任何性 質，傳感器可以是適合于檢測所述反應表面上磁性標記的核酸顆粒的存在的任何傳感器， 例如，它可以通過磁方法(例如，磁阻的、Hall、線圈)、光學方法，例如FTIR(受抑的全內(nèi)反 射)、聲波的檢測(表面聲波，體聲波、懸臂、石英晶體等等)或電檢測(例如，傳導、阻抗、電 流計、氧化還原循環(huán))來檢測。在特定的實施方式中，所述磁性顆粒通過FTIR來檢測。在 此，傳感器表面用對給定光譜范圍的光線具有高透明度的材料制成(例如，玻璃或某些透 明塑料)。這種材料的折射率大于鄰近傳感器表面的樣品的折射率。傳感器表面以一定角 度用光束(來自，例如，激光或LED)照明，從而這完全內(nèi)部反映了傳感器表面和樣品之間的 界面。在控制條件下，所有光線將被反射到這個界面。僅當顆粒在靠近界面處結合時(例 如，具有磁性顆粒的高指數(shù)聚苯乙烯)，全內(nèi)反射通過光的吸收或散射被破壞，可以測量到 反射強度的降低。另外或作為選擇，所述傳感器是適合于通過例如成像、熒光、化學發(fā)光、吸收、散 射、表面細胞質基因組共振、Raman等等，或上文描述的方法之一來檢測直接或間接附著其 上的標記物的傳感器。在特定的實施方式中，所述第一或第二傳感器能夠檢測超過一種標記物和/或超 過一種類型的標記物。這在此處描述的方法中進行多路化的情況中是令人感興趣的。在進一步特定的實施方式中，反應表面和相應的第一檢測區(qū)域被分格，容許在所 述反應表面上的不同區(qū)域中信號的差異化檢測。這還容許在本發(fā)明的方法中的多路化。下 文詳述了進行多路化的方法。利用本發(fā)明的方法多路化是通過使用附著于反應表面的不同的探針(即，針對不 同的目標)來進行的。這些探針可以被同樣地標記(例如，標記物是在所有探針上存在相 同的磁性或可磁化顆粒)或不同地標記。在第一實施方式中，所述不同的探針被相同地標記(例如不同的探針被施加到反 應表面的獨立的區(qū)域(例如，篩格內(nèi))，其可以由傳感器在檢測區(qū)域內(nèi)區(qū)分。信號強度方面 的降低對篩格內(nèi)的每個區(qū)域同時地(或接連地)測量。
多路化的更精致的方法利用各自具有不同的可檢測標記物的不同的探針。其實例 有攜帶包含磁性材料和不同的熒光標記物的珠子的探針，所述標記物可以相互區(qū)別。在這 種架構中，不同的探針可以任意地附著到反應表面，在顆粒從表面釋放時，在檢測表面處標 記物的降低和/或在遠離反應表面的第二檢測區(qū)域中標記物的提高可以被檢測，從而來自 不同的探針的磁性或可磁化顆粒根據(jù)不同的熒光標記物來區(qū)分。各種身體樣品中目標的定性和/或定量測量已經(jīng)應用于例如各種疾病如遺傳性 疾病或傳染性失調的診斷。對于常規(guī)分析，可以將試劑作為準備使用的反應室或反應室的部分來提供，在其 中探針、酶和緩沖劑作為干燥的或冷凍的成分保存。實現(xiàn)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的其他方案對于本領域技術人員是明顯的。要理解的是，雖然對于根據(jù)本發(fā)明的設備已經(jīng)在此討論了優(yōu)選的實施方式、特定 的結構和配置以及材料，可以進行形式和細節(jié)上各種變化和修改而不背離本發(fā)明的范圍和 精神。
實施例實施例1 探針/目標結合的核酸酶依賴件檢測本實施例說明了本發(fā)明的實施方式。核酸探針(2)用磁性或可磁化顆粒(3)標記 并附著到表面(4)。附圖1的畫面A顯示了使探針⑵與包含目標核酸⑴的樣品接觸的 步驟。畫面B顯示了探針(2)與目標(1)的特異性結合。畫面C顯示了裂解目標和探針核 酸之間的雜化物的酶(E)的作用。探針DNA的裂解引起磁性或可磁化顆粒(即，標記物) (3)的釋放。畫面D到E顯示了不與DNA目標結合的過量探針的結局。在探針和目標之間 不形成雜化物(畫面E)。在酶(E)的作用時，不發(fā)生裂解。結果，磁性或可磁化顆粒(即， 標記物)(3)不從表面上釋放(畫面F)。在分析期間，磁力(F)被施加遠離所述表面，從而由于酶裂解而游離的標記物被 快速和連續(xù)地從所述表面移除。實施例2 信號擴增的實時定量的檢測該實施例由附圖2說明。具有磁性或可磁化顆粒(3)的探針(2)附著到表面(4)， 并暴露于含有目標(1)的樣品。目標(1)和探針(2)是互補的，并且相互特異性地結合。 酶(E)可以消化探針核酸(2)，但是不消化目標核酸(1)，但是僅僅是在探針結合到目標的 條件之下。在消化時，磁性或可磁化顆粒(即，標記物)(3)和原封不動的目標被釋放。原 封不動的目標因而可以再次與反應表面上存在的另一個探針(2)雜化。這再次導致新的探 針對消化敏感，釋放另一個標記物(3)。結果，在樣品中一個單獨的目標核酸的存在可以導 致幾個標記物的釋放。例如，可利用RNA探針和DNA目標，使用RNAse A作為酶來進行這個實施例的方法， 這種酶特異性地降解RNA:DNA雜化物中的RNA，并且將不降解DNA或未雜化的RNA。
權利要求
一種檢測樣品中的目標核酸分子(1)的方法，其包括步驟a)提供包含與所述目標核酸分子(1)互補的序列的核酸探針(2)，其中所述探針(2)與磁性或可磁化顆粒(3)連接，并附著到表面(4)，b)在容許所述探針(2)與所述目標核酸(1)的結合的條件下使所述樣品與所述探針接觸，從而形成探針/目標雜化物，c)施加或活化核酸裂解酶(E)，其區(qū)別未結合的探針和結合的探針/目標雜化物，d)至少在步驟(c)期間，施加磁場(F)以操作未結合的磁性或可磁化顆粒朝向遠離所述表面的區(qū)域，e)在一個或更多個時間點檢測在所述表面(4)上磁性或可磁化顆粒的濃度，和/或在遠離所述表面的區(qū)域中磁性或可磁化顆粒的濃度，其中所述檢測通過測量附著到所述磁性或可磁化顆粒的可檢測標記物來進行。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述磁性或可磁化顆粒是包含磁性材料和熒光標記物 的顆粒。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶至少裂解所述探針/目標雜化物中的 探針。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中在所述核酸裂解酶之前添加切口酶。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶是形成所述探針(2)的一部分的 DNAzyme 或 RNAzyme。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶在所述目標核酸分子(1)的PCR擴增 期間被摻入到所述目標核酸分子(1)中。
7.一種用于磁性或可磁化顆粒的檢測的設備，包括-反應表面(4)，-具有能夠檢測與所述反應表面(4)結合的標記物的第一檢測區(qū)域的第一傳感器 (61)，-用于施加從所述檢測表面到遠離所述檢測表面的區(qū)域的磁場(F)的裝置，-具有遠離所述檢測表面的第二檢測區(qū)域的第二傳感器(62)，和-任選地，用于將磁性或可磁化顆粒移動朝向所述第二檢測區(qū)域的裝置。
8.權利要求7的設備，包括反應室，其中所述反應室包括-包括所述反應表面(4)和所述能夠檢測結合到所述反應表面(4)的標記物的第一檢 測區(qū)域的第一區(qū)域，_遠離所述第一區(qū)域的第二區(qū)域，其包括能夠檢測所述遠離第一區(qū)域的區(qū)域中的標記 物的所述第二檢測區(qū)域，和-施加從所述第一區(qū)域到所述第二區(qū)域的磁場(F)的裝置。
9.根據(jù)權利要求8的設備，其中所述第一和/或第二傳感器能夠檢測不同的標記物。
10.根據(jù)權利要求9的設備，進一步包括具有附著到所述反應表面的磁性或可磁化顆 粒的多種不同的探針，其中每種探針包含不同的可檢測標記物。
11.根據(jù)權利要求8的設備，其中所述第一和第二區(qū)域在所述反應室的對側上。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于核酸雜化的核酸酶依賴性檢測的方法和工具。在這些方法中，磁性或可磁化顆粒被用于區(qū)分雜化的和未雜化的DNA。
文檔編號C12Q1/68GK101855366SQ200880116004
公開日2010年10月6日 申請日期2008年11月10日 優(yōu)先權日2007年11月14日
發(fā)明者W·U·迪特默 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司