通過堿土金屬皂沉淀步驟的由得自包含醇、皂和/或脂肪酸的起始原料的脂質進行發酵的方法

專利名稱：通過堿土金屬皂沉淀步驟的由得自包含醇、皂和/或脂肪酸的起始原料的脂質進行發酵的方法
通過堿土金屬皂沉淀步驟的由得自包含醇、皂和/或脂肪 酸的起始原料的脂質進行發酵的方法本發明涉及用于由起始原料形成脂質或脂質的混合物的方法，所述起始原料包含 至少一種醇和皂或皂的前體。本發明還涉及用于由含醇液相形成脂質或脂質的混合物的方 法，所述液相包含至少一種醇。發明背景 生物柴油主要是脂肪酸甲酯，通過將長鏈脂肪酸與醇(甲醇)進行酯交換產生。天 然脂肪的脂肪酸酯主要由甘油三酯組成，因此，在酯交換時，不適宜作為生物柴油的水溶性 甘油從中釋放出來。從理論上講，由甘油三酯產生10%重量的甘油。根據工藝條件，皂的比 例可大幅變化，并且可上升至甘油三酯初始總量的百分之幾十。由于皂化合物分散于且部 分溶于形成中的甘油水溶液中，因此難以將其從水溶液中分離出來。皂破壞脂溶性脂肪酸 酯與水溶性甘油之間的相，并趨于形成不同程度的乳狀液，就分離技術而論，在大規模處理 時造成極富挑戰性的困難。醇(例如甲醇)的去除，也將需要昂貴的真空蒸餾。因此，可以 斷定，在現代技術中采用前述方法進行生物柴油的生產是一種原料的浪費。僅就甘油所需 的純化步驟而論，提高在該方法中所產生的甘油的值就已非常不合算。一些微生物在其細胞中積累脂肪。已知甘油可用作微生物(即使是對于積累 脂肪的微生物)的碳源(例如Microbial Lipids (微生物的脂質)，主編C. Ratledge 禾口 S.G.Wilkinson,第 1 卷，Academic Press, 1988 ；PapanikoIaou, S.禾口 Aggelis, G., Lipid production by Yarrowia Iipolyticagrowing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture (在一級連續培養中通過生長在工業用甘油中的亞羅 解脂酵母進行脂質生產)，Bioresource Technol. 82(2002)43-49)。另一方面，對于積累脂 肪的微生物以及由其產生的脂肪，在十年間都未取得突破，除大多用于一些特殊脂肪的小 規模生產以外。在來源于生物柴油工藝的甘油的利用中，尤其是在通過微生物形成的脂肪 中，這種甘油的普遍不良質量，例如就脂肪酸的堿金屬鹽(下文亦稱皂)和它含有的醇而 論，已成為問題。皂和醇阻止大多數生物的生長，因此，除去皂和醇對于微生物利用甘油是 必要的。大多數天然脂肪含有包含烴鏈的脂肪酸，所述烴鏈與醇基結合形成脂肪最富含能 量的部分。脂肪的這個最富含能量的部分可通過由其形成醇酯而釋放。在這個過程中，釋放 出甘油水溶液，其與醇和由脂肪的脂肪酸形成的皂化合物(下文亦稱皂)混合在一起。含 有甘油、醇和皂的這個部分是水溶性的，并且仍具有高的能量含量，尤其相對于皂而言。僅 就甘油而言，在生產脂肪酸醇酯時，主要含有甘油的這一水溶性部分從理論上講就已形成 10%以上的次要廢液流(minor wasteflow) 0甘油本身就已經不貴，而且其市場也已飽和。 因此，就在產生脂肪酸醇酯時形成的含雜質的甘油而言，沒有內在的能量高效用途，并且鑒 于現有技術，如果形成產生成本問題的次要液流(minor f low)，對此沒有能量高效(energy efficient)，因此也沒有產生附加值的有益技術能量高效。對通過化學技術從中獲得的甘油或產品在商業上有價值的可能用途進行了廣泛 研究。盡管如此，目前仍沒有可能較之前利用甘油的程度明顯較高且經濟上耐用的解決辦法。在Sarantila的研究中，總結了有關甘油作為化學工業原料的適宜性以及與其用途 有關的挑戰的多個方面(Sarantila，Maiju :Glyserolin hyodyntaminen, diplomityo, Teknillinen korkeakoulu,10. 11. 2006。[Sarantila,Maiju-Utilization ofGlycerol (甘 油的利用)，畢業論文，Helsinki University of Technology，2006 年 11 月 10 曰])。下 面，根據該論文，描述了目前已知的最實際可能的用于提高利用率和附加值的甘油用途。甘油分子的氧含量相對較高，而碳含量較低，因此導致熱量值較差。此外，甘油火 焰的溫度比傳統化石燃料的低。在實踐中，已知甘油的燃燒還需要特別安排，因為必需使它 達到非常小的液滴大小才能達到與氧氣充分混合。此外，在生產生物燃料時所釋放的甘油 含有水。甘油可按照多種不同的方法以化學方式衍生化。例如，甘油的酯化、醚化、乙酸甘 油酯和二醇的生產與油的聚合和氧化同樣為人所熟知。主要是對于這些方法的產物沒有大 規模應用，尤其是考慮到其生產需要程度高的甘油純度以及昂貴耗能的催化劑和反應器技 術(reactor technology) 0重整，即由甘油形成氫氣，是一項能夠處理甚至大量甘油的技術。然而，重整需要 專門的儀器、大量的能源投資，且該方法本身需要昂貴的催化劑。甘油在農業上也有一些應用。甘油可像動物飼料的組分一樣用作能源。然而，它 不含有蛋白質、脂肪或糖。即使就痕量元素而言，工業用甘油也不足，因此只能構成飼料混 合物中的次要亞組分。此外，在生產有機燃料時形成的甘油含有甲醇和皂，這就需要與相對 于飼料總成本結構不相稱的純化操作，例如用于除去醇或單獨除去脂肪的真空蒸餾。因此，顯而易見的是，對于將甘油、尤其是含有甘油的不均勻混合物作為成分轉化 為商用產品而言，不存在可顯著增加其需求的經濟上有利的解決方法。尤其當在化石原料 增長的同時興趣轉向可再生能源原料來源時，這項技術的缺點更突出。發明簡述本發明涉及用于由起始原料形成脂質或脂質的混合物的方法，所述起始原料包含 至少一種醇和皂或皂的前體。本發明還涉及用于由含醇液相形成脂質或脂質的混合物的方法，所述液相包含至 少一種醇，按照該方法，將產脂微生物接種到含有所述含醇液相的培養基中，使微生物產生 脂質，并回收細胞團塊(cellmass)或由細胞產生的脂質。更具體地講，本發明方法的特征在于權利要求1和4的特征部分的內容。同樣，本發明用途的特征在于權利要求23和24所述的內容。本發明提供與一種方法有關的問題的新的解決方法，其中，按照已確立的方法，通 過用堿金屬醇鹽處理脂質(例如甘油脂質(glycerolipids))，由脂質產生脂肪酸的酯類。 甘油是在該方法中產生的，并且在一個副反應中，釋放出醇以及堿金屬鹽、含有烴鏈的水溶 性脂肪酸的皂。該方法的主要問題在于對不純的甘油的利用以及將甘油形成為所述利用所 需的安全有益的化合物的純化。本發明的綜合優勢是它可通過簡單的方法步驟，以能量高效和環境友好的方式，由生物來源的含有較少能量的化合物(例如多元醇和一元醇)來產生富含能量的化合物脂 質，優選避免使用大量的水。含有醇的化合物和脂肪酸的未酯化鹽的次要液流，就能源經濟學而言難以利用，并且是從有機脂質中包含的脂肪酸酯的酯交換中釋放出來的，它們可被轉化成適用于產生 由脂肪酸構成的 甘油脂質的部分，所述甘油脂質可直接利用，或者可循環成為生物來源的 含有甘油脂質的其它材料。將在微生物中形成的脂質形成所需要的酯類的處理可發生在不 需要之前的微生物細胞的分解和隨后的脂肪分離的步驟。本發明的優勢還包括該方法所需要的儀器簡單，所涉及的有關制備和使用的技術 是已知的。本發明的方法不受生產規模的限制，卻可容易地逐步增加入將要處理的多元醇 部分所需要的量。實施該方法不需要耗能的加熱、加壓單元操作或化學催化劑，對于操作， 它只需要使用這類化學物質或加工這類可加入本發明方法的內部循環的生物材料。該方法 不需要增加成本的對多元醇部分的預純化，也不需要除去水份。由于除內部循環以外，在該 方法中所形成的無脂質生物量(biomass)可用于許多不同的目的，例如用于產生單一組分 或作為用于微生物生產的補充培養基，因此該方法的總成本效率得到提高。本發明還可消除因表面活性化合物的存在而引起的普遍已知的問題。眾所周知， 表面活性化合物，例如脂肪酸的皂類，抑制微生物的生長并只作為少數微生物的碳源。在微 生物的生產過程中，皂的存在降低了培養基的表面活性，產生泡沫，并且使將細胞與液體以 基于其比重的方法的分離變得復雜起來。在含有水和水不溶性油的混合物中，皂的存在還 抑制水相和油相的彼此分離。因此，含有皂樣化合物的多元醇不適于用微生物的方法生產， 同時抑制或削弱包含在生物柴油工藝中產生的皂的醇類次要液流的總體利用。通過本發 明，例如，在生產脂肪酸酯時形成富含甘油的副產物部分(side fraction)所含的有機化合 物可采用某種方法轉化回脂質，這種方法結合化學處理實現了微生物的脂質生產。通過本發明的方法，實現了通過微生物生產脂質的特殊的靈活性。含有多元醇而 無生長抑制性有害組分的部分是大多數微生物的天然碳源。因此，該方法的一個優勢還在 于可以在大范圍內選擇微生物，例如根據脂質生產的能力、生物量的產量、培養方法或培養 條件。還可按照許多不同的方式，以能量高效的方式使用脂質以外的其它微生物組分，因 此，提高了本發明方法的總成本效率。因此，與現有技術相比，本發明通過降低對來自其它來源的脂肪原料的需求，實現 了持續發展的原則，并具備了將生產成本與用戶可接受的水平相適應的先決條件。下面，參照附圖和發明詳述，對本發明進行更詳細的描述。附圖簡述

圖1表示本發明方法的主要實施步驟。圖2是酵母在本發明的起始原料或含醇液相中生長的曲線圖，其中存在的皂已按 照本發明的方法除去。圖3是酵母在純甘油(生產商J. T. Baker, USA)中生長的曲線圖。圖4是酵母在含有甘油和甲醇這兩者的培養基(substrate)中生長的曲線 圖。圖4a表示亞羅解脂酵母(Yarrowia liolytica)在培養基上的生長，所述培養基含 有5% /10%的甘油，加入或不加入甲醇(占甘油量的2%重量)，圖4b表示粘紅酵母 (Rhodotorula glutinis)在相應培養基中的生長。圖5是酵母在不含皂的甘油部分上生長的曲線圖，不含皂的甘油部分5%、12. 5% 或25%的量在YNB(酵母氮源(Yeast Nitrogen Base))培養基使用。圖6柱狀圖是當培養基(YNB)含有5%或12.5%的不含皂的生物柴油-甘油部分時，酵母在不同時間點上的脂肪含量。粘紅酵母和亞羅解脂酵母的脂肪含量分別見圖6a和 圖6b。圖7是在使用葡萄糖(A)、純甘油⑶或不含皂的甘油部分(C)作為碳源的培養 基上大地半乳糖霉(Galactomyces geotrichum)的生長圖。圖7a表示霉菌的生長曲線，圖 7b表示霉菌細胞的脂肪含量。發明詳述本發明涉及用于由起始原料形成脂質或脂質的混合物的方法，所述起始原料包含 至少一種醇和皂或皂的前體，所述方法還包括-將金屬離子形成劑(metalion forming agent)加入起始原料中，由此形成含有 不溶相(insoluble phase)和液相的混合物，-將不溶相由液相分離，-使產脂質微生物在培養基上與所述液相接觸，由此所述微生物細胞開始產生脂 質，和-收集脂質。優選起始原料包含多元醇或一元醇或者這兩者以及皂或皂的前體。本發明還涉及用于由含醇液相形成脂質或脂質的混合物的方法，所述液相包含至 少一種醇，所述方法還包括-使產脂微生物在培養基上與含醇液相接觸，由此所述微生物細胞開始產生脂質， 和-收集脂質。優選液相包含多元醇或一元醇或者這兩者。具體地講，本發明涉及用于從上述起始原料形成脂質或脂質的混合物的方法，其 中醇的量至少為起始原料的一半，優選70%重量 99%重量，或者涉及用于從上述含醇液 相形成脂質或脂質的混合物的方法，其中醇的量為所述液相的36%重量 100%重量，優
選70%重量 100%重量。根據本發明的一個優選實施方案，將含醇部分在該方法中用作起始原料以形成脂 質或脂質的混合物，所述含醇部分由甘油脂質組成的脂質使用甲醇鈉進行酯交換所形成。術語“脂質”是指脂肪物質，其分子的一部分通常為溶于有機溶劑但是難溶于水的 脂族烴鏈。在本發明中，微生物中形成的脂質主要是三酰甘油，即由甘油和脂肪酸形成的三 酯(甘油三酯)或留醇的酯，但是在細胞中也可形成其它脂質，例如磷脂、留醇、多萜醇、鞘 脂、糖脂和雙磷脂酰甘油。根據本發明的一個優選實施方案，由含醇液相形成甘油三酯或含有甘油三酯的混 合物，其中甚至還存在大量的例如留醇和游離氧的組分。術語“皂”是指脂肪酸的鹽。本發明主要包括一種基于天然平臺(natural substage)的方法，通過該方法由甘 油、其它醇(例如一元醇)和有機皂的混合物產生含有長鏈脂肪酸的脂肪(脂質)。因此， 本發明可用于將高度氧化的有機化合物轉化成具有高能量含量的還原性脂質，其通過進一 步提煉可適于應用不同的產能形式。
下面，為了簡單起見，本發明及其實施方案將甘油稱為多元醇，但是可用適于本發 明的其它多元醇代替甘油。甘油和一元醇適宜作為微生物的碳源，尤其是因為已知證實，它們作為混合物增 強兩種碳源的使用，并且通過選擇合適的微生物，這些化合物可通過生物合成而轉化成微 生物來源的由脂肪酸構成的脂質和轉化成可加以利用的其它生物材料，例如作為所述方法 內的營養物，用于分離可用于其它普通應用的有商業價值的化合物或生物量，例如作為飼 料和營養物。在酸催化制備的脂肪酸酯中形成的皂給基于微生物的脂質的產生帶來了問題。皂 減緩或甚至完全抑制微生物的生長，并因此降低或甚至完全抑制脂質的生物合成。皂還會 使將細胞由培養基的分離復雜化。按照本發明的方法，可通過將化學方法和微生物學方法結合，由含有甘油次要液 流的不純的皂通過微生物學的產生含有脂肪酸的脂質，其中含有甘油和其它化合物的部分 用于合成脂質的微生物的產生，并且所述微生物因此形成的脂質可以再次使用，例如用于 制備脂肪酸的醇酯。在本發明中，將適于工業用途的化學反應和生物學反應以新的方式結合到實際方 法中，通過該方法，可將在酸催化制備的脂肪酸酯中形成的甘油溶液中所包含的甘油、醇 (優選為一元醇)和其它有機化合物以能量高效的方式轉化成含脂肪酸的脂質。本發明優選包括以下步驟，其中經過濾從甘油部分中除去可能的固體物質組分， 之后用所需量的酸調節甘油部分的酸度，優選用形成可用作微生物的碳源的鹽的酸，更優 選用乙酸、甲酸或乳酸。過濾可通過例如使用意欲用于過濾的織物進行。按照一個優選的實施方案，用于形成脂質或脂質的混合物的方法包括以下步驟-任選將酸加入起始原料中，優選有機酸，更優選乙酸、甲酸或乳酸，以調節pH值 為3-8，優選值為6-8，-將作為固體或作為液體(例如水溶液)的金屬離子形成劑，例如堿土金屬的無 機鹽，優選形成Ca2+或Mg2+的形成劑，更優選氯化鈣或氯化鎂，最優選氯化鈣，以沉淀至少 40%皂的量，優選以形成相對于皂的量為化學計算量的金屬離子的量，最優選以超過化學 計算量(stoichiometric excess) 10%重量的量，加入混合物中，由此形成不溶相和液相， 其中不溶相包含皂，液相包含含有多元醇或一元醇的含醇溶液，即前述液相，-分離出不溶相，其中可能存在的皂前體已反應成為皂，優選經過濾或經傾析或通 過一般用于回收沉淀物的其它方法從液相中分離出來，-向培養基上提供液相和產脂質微生物，向培養基補充產生脂質所需要的營養物 或者補充含有所述營養物的裂解的微生物團塊，-使微生物細胞產生脂質，從而脂質在微生物細胞內部或外部積累，-任選裂解微生物細胞，-任選通過相分離或抽提來分離脂質，-優選經過濾或通過基于比重差異的方法(例如離心法)并隨后通過分離所形成 的部分(例如通過分離脂質、含脂質的部分或得自所回收的細胞團塊的細胞中的脂質混合 物)來回收細胞團塊或由所述細胞產生的脂質，和-優選使用細胞團塊或其部分作為脂質。
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特別優選將存在于任選過濾的甘油部分中的水溶性皂通過以下方法轉化為水不 溶性皂向所述混合物中加入二價堿土金屬的無機鹽，優選Ca2+，最優選CaCl2。所加入的鹽 最適宜為固體，從而可以避免使用大量的水。控制混合時間，直到基本上停止形成沉淀。經 過濾或經傾析或通過一般用于回收沉淀的其它方法，將所形成的不溶解部分(沉淀)與液 體部分(液相)分離開來。如下使用液體甘油部分與它可能含有的其它化合物通過以適 于微生物脂質生產的濃度，混合到微生物培養基中。在分離皂沉淀之后，其所含的C4以上的 烴部分可用若干種不同的方法處理，優選用于產生游離脂肪酸，最優選用于產生脂肪酸酯。在該方法不同階段加入的化合物，例如乙酸或CaCl2等二價堿土金屬鹽或這些化 合物形成的副產物部分，除NaCl和二氧化碳以外，都不全部從整個方法中除去，而是優選 在該方法中再循環，或形成獨立的在經濟上可利用的部分，因此，提高該方法的整體成本效 用。通過從在酯交換中形成的含醇副產物部分中除去表面活性化合物，建立使用這一 部分用于培養微生物并用于產生單細胞(one-cell)脂質的先決條件。然而，令人驚訝地發現，試劑純甘油不是一種非常高效的碳源。另一方面，甲醇強 化甘油的使用，即不需要除去甲醇，它可用來產生微生物來源的脂肪。上文表明基本上所有已處于相對氧化階段的有機碳化合物可以上述效率加以利 用以使得微生物能夠利用這種混合物形成脂質，所述有機碳化合物來自含有大量未經利用 的烴鏈的不純的甘油部分。用于本發明中的多元醇選自含有至少3個碳的多羥基脂族烷基醇。優選多元醇為 甘油、由磷脂形成的醇、或留醇。最適宜地，所述多元醇為甘油。另一方面，一元醇選自含有 1-4碳的烷基醇，優選甲醇、乙醇或1-丙醇。最適宜一元醇為甲醇。微生物選自天然或經改造的積累脂肪的微生物，優選選自酵母、霉菌、細菌和藻 類，更優選選自酵母和霉菌，最適宜選自酵母。重要的是所述微生物能夠產生脂質。適用于本發明的積累脂肪的酵母屬包括
假絲酵母屬(Candida)(尤其是彎假絲酉孝母(C. curvata))
西洋蓍霉屬(Yarrowia)(尤其是亞羅解脂酵母)
油脂酵母屬(Lipomyces)(尤其是油脂酉
紅酵母屬(Rhodotorula)(尤其是粘紅酉
相應的適用于本發明的積累脂肪的霉菌屬包括
被孢霉屬(Mortierella)
毛霉屬(Muco)
半乳糖霉屬(Galactomyces)
相應的積累脂肪的細菌屬包括
紅球菌屬(Rhodococcus)
顫藻屬(Oscillatoria)
同樣，積累脂肪的微藻類屬包括
隱甲藻屬(Crypthecodiniumi)
吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)
WM.M.MU (Schizochytrium)
根據本發明的一個優選實施方案，使用在其細胞中以如下量合成含有脂肪酸的脂質的微生物進行脂質的合成，所述量優選為細胞干重的12%重量-60%重量。按照本發明另一個優選的實施方案，使用能夠利用甘油和短鏈醇作為碳源的微生 物進行脂質的合成。按照本發明一個特別優選的實施方案，使用適用于微生物的方式處理過的在本發 明中形成的無脂質生物量作為培養基的營養物。除這些組分以外，可以向培養基補充有利 于所使用的微生物的組分。為了產生脂質，微生物一般尤其需要碳源，在本發明中它獲自起 始原料；氮源，例如無機銨鹽(例如硫酸銨)或有機氮源(例如氨基氮、酵母提取物或水解 的細胞團塊)；以及痕量元素源，例如磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物、維生素或陽離子源(例如Mg、 K、Na、Ca、Fe或Cu離子源)，必要時將這些組分加入培養基中。當應用本發明的方法時，培 養基的醇含量優選為2%重量-36%重量。為了從微生物中回收脂質，首先收集細胞，然后使細胞裂解，或者細胞例如因自溶 而裂解，從而將作為油相的脂質與水相分離開來，又或者，將微生物團塊本身或通過不同的 已知方法由微生物團塊獲得的部分用作脂質。微生物中包含的含有脂肪酸的脂質或者由 微生物產生的含有脂肪酸的脂質無需預先進行下述處理便可進行酯交換將脂質從細胞 中分離出來，或者將細胞裂解并用有機溶劑從破碎細胞中提取脂質。適用于本發明的脂 質回收方法參見例如由 Z.Jacob 出版的Yeast Lipids =Extraction, Quality Analysis, and Acc印tability (酵母脂質提取、質量分析與可接受性)，Critical Reviews in Biotechnology,12(5/6) ；463-491(1992)。當采用本發明的方法時，在細胞中形成的脂質的量可增加至高達細胞干物質的 60%。按照本發明方法產生的脂質或脂質的混合物可用于許多不同的應用當中。優選對 脂質、脂質混合物、含有脂質的細胞或其部分進行酯化(例如酯交換)或加氫處理。按照本發明一個特別優選的實施方案，所產生的脂質用于生產脂肪酸的醇酯。更 適宜將這些脂肪酸的醇酯進一步用于制造生物燃料，例如生物柴油。甚至更優選將這些脂 肪酸酯進一步用于制造生物柴油(甲酯或乙酯)或可再生柴油(renewable diesel)(動 物、植物或微生物的經氫化處理的脂質，其中微生物脂質可得自細菌、酵母、霉菌、藻類或其 它微生物)。相應地，優選從在制造例如生物柴油中所形成的含甲醇的甘油部分中獲得用 于本發明方法的起始原料，所述部分一般含有約2% -10%的皂。在反應中使水(以及一元 醇，例如甲醇)的量降到最低，因為水會引起皂化作用。將不超過20%、優選2%-10%的水 釋放到所述含甲醇的甘油部分中。在用于本發明方法的起始原料中，優選這一水分含量。包含脂肪酸的甘油三酯的植物油和動物脂肪一般用作柴油機燃料的原料。將這些 原料轉化成燃料包括例如以下方法酯交換、催化加氫處理、氫化裂解、催化裂解和熱裂解。 通常不使用甘油三酯本身，而是可在酯交換反應中，將其可轉化成相應的脂肪酸酯。例如，本發明的產物適于作為在上文中最近所提到的反應的原料，優選在脂肪酸 的酯化反應中或者對植物或動物來源的脂質進行氫化處理的方法中作為原料(feed)，最優 選在制造所謂的HV0( “氫化植物油”)的方法中作為原料。為了實現最終產物(即燃料)的有利的冷流性特性，有待用于酯交換中的本發明 的產物優選具有雙鍵。
在本發明中形成的脂質可含有0%重量-40%重量的游離脂肪酸，這是在例如甘 油三酯的酶促水解中形成的，或者與脂肪的純化有關。這些脂肪酸還可用于制造生物燃料， 或者所述脂肪酸或者所述酸和甘油三酯可以酯化成甲酯，而所述甲酯又可用于生物柴油。根據EU 標準 2003/30/EY(EU-directive 2003/30/EY)，“生物柴油”是指“一種具 有用作生物燃料的柴油品質的從植物油或動物油中產生的甲酯”。在分離脂質之后剩下的從微生物中形成的生物量是可處理的，并且可以許多不同 的方式加以 利用，例如將其再一次在微生物生長所需的培養基中使用、直接使用或者在酶、 化學或物理(包括機械)加工之后使用。或者，將無脂質細胞團塊分成不同的組成部分。優 選的另選的方法是直接在細胞團塊上進行酸催化水解，之后可通過例如相分離，將脂質與 其它水解的細胞團塊分離開來，其余的生物量可用于培養微生物。另一個任選的方法是使 用無脂質細胞團塊以分離出有商業重要性的組分。這些包括蛋白質、蛋白質水解產物、從蛋 白質得到的肽，尤其是當使用酵母時，除上述的以外，還有葡聚糖、黃原膠、維生素、維 生素前體和留醇。優選的脂質應用是含有脂質的微生物團塊直接用作例如脂質原料以產生 脂肪酸酯。下面的實施例是旨在說明本發明，不應以任何方式將其視作對本發明的限制。本 發明也絕不限于所使用的微生物的菌株。除所采用菌株以外，也可借助于相同種或屬的其 它菌株來實施本發明。產脂質微生物(藻類同樣)是普遍可獲得的，保存在幾個菌株保藏 中心，例如ATCC、DSM等。產脂質微生物和使用微生物(也可用藻類)的脂質生產方法可 參見文獻資料的有關研究，例如Single Cell Oils (單細胞油類)，Ζ. Cohen和C. Ratledge 編輯，AOCS Press，2005 ；以及 Microbial Lipids (微生物脂質)，編輯 C. Ratledge 和 S. G. Wilkinson,第 1 卷和第 2 卷，Academic Press, 1988。
實施例實施例1.酵母在本發明的起始原料上的生長將亞羅解脂酵母ATCC 20373和粘紅酵母TKK 3031的酵母在YNB培養基上培 養，培養基補充了5% (重量/體積)含有皂的生物柴油甘油部分(即本發明的起始原 料)或其中的皂已按照本發明除去的生物柴油甘油部分，使之在250rpm、3(TC下振蕩，用 Klett-Summerson比色計通過不透明度的增加來監測生長。生長曲線見圖2。從圖中可發 現，酵母在含有皂的甘油部分上生長得非常差。值得注意的是，在不含皂的甘油部分上培養 的酵母的生長相對于培養時間幾乎呈線性，這對于這種培養方式是不常見的，而且不透明 度的增加可能是皂與混合物的其它組分產生的乳狀液的結果。即使通過離心法都不可能回 收細胞，這表明細胞的殘余量與皂有關，這些組合在一起抵抗通過相分離產生的離心引力 的影響。因此，也不能測定細胞的脂肪含量。上述實驗表明，在脂肪酸酯的酸催化制備中形成的甘油部分(含有皂的生物柴 油_甘油部分)不適用于微生物的甘油脂質生產。實施例2.酵母在純甘油上的生長將實施例1的酵母在YNB培養基上培養，培養基具有5%或10% (重量/體積) 的純(達99%以上)甘油(生產商J. T. Baker，USA)作為碳源。在室溫、250rpm振蕩下進 行培養。酵母的生長曲線見圖3。酵母生長非常緩慢，或僅達中等細胞含量。特別是粘紅酵母的生長不良，在10%甘油上根本不生長。因此，可以斷定，相對于按照本發明已除去皂的甘油的部分，不含甲醇的純甘油不 是產生微生物團塊的有效碳源，因此，也不是產生甘油脂質的有效碳源。
實施例3.甲醇對生長的作用當將甘油量的2%重量的甲醇加入實施例2的培養基中并監測酵母的生長時，觀 察到甲醇的存在促進酵母的生長或根本不影響生長(圖4)。因此，這些實驗表明，在甘油部分中醇的存在對于甘油部分的完全利用而言是有 利的。實施例4.在按照本發明已除去皂的甘油部分上酵母的生長和脂肪的產生使亞羅解脂酵母和粘紅酵母的酵母在YNB培養基上生長，培養基補充了 5%、 12. 5%或25% (重量/體積)的甘油部分(已從中除去皂)。在室溫、250rpm振蕩下進行培 養。生長曲線見圖5。由圖可知，酵母生長迅速，在含有5%和12. 5%甘油部分的培養基上 幾乎一樣好，但是25%甘油部分明顯減緩生長。在該實驗中，粘紅酵母同樣在含有12. 5% 甘油部分的培養基上生長。然而，應當注意的是，在含有5%甘油部分的培養基的情況下，使 用了 2%的置換物(displacement)，而具有較高甘油濃度的置換物的大小為1%。然而，不 認為這對所獲得的細胞濃度或脂肪的量有影響。通過氣相層析法，在不同時間點上對在不含皂的生物柴油-甘油(5% /12. 5%甘 油部分)上培養的細胞進行了脂肪含量的測定。結果見圖6a_b。由圖可知，使用較低甘油 濃度的酵母細胞的脂肪含量較高。在該研究條件下，粘紅酵母比亞羅解脂酵母含有多得多 的脂肪。實施例5.不含皂的甘油上霉菌的培養使大地半乳糖霉(Geotrichum candidum)DSM 1240霉菌在50ml培養基(酵母提 取物3g/l、KH2PO4 3g/l、MgSO4 5g/l)中培養，所述培養基中含有已按照本發明從中除去皂 的生物柴油甘油部分或純甘油(J.T. Baker) 25g/l。在對比實驗中，將葡萄糖(20g/l)用作 碳源。將細胞在20°C溫度、200rpm振蕩下培養48小時。用Klett-Summerson比色計監測 生長。在不同碳源上培養的細胞的生長曲線見圖7a。由圖可知，已按照本發明從中除去皂 的生物柴油-甘油作為霉菌的優良碳源，與培養在葡萄糖上的細胞的生長速度相比，未觀 察到細胞生長速度有顯著差異。未觀察到包含在生物柴油甘油部分中的甲醇對霉菌生長有 任何抑制作用，但也為觀察到任何促進作用。在24小時和48小時的時間點上測定了霉菌細胞的脂肪含量。從圖7b中清楚可 見，與使用用其它所研究的碳源相比，生物柴油甘油部分作為碳源使得在細胞中產生的脂 肪含量更高(在48小時時間點，差異有統計顯著性P < 0. 005)。此外，必須注意的是，通過 延長培養時間，霉菌細胞的脂肪含量可能上升得甚至更高。實施例6.在甘油上培養的藻類使用已按照本發明從中除去皂的生物柴油_甘油部分作為碳源部分，對三角褐 指藻(Phaeodactylum tricornutum)這種硅藻進行混合營養型培養。純甘油(生產商 J. T. Baker)用作對照碳源。培養基(無菌海水)中甘油的濃度為8g/l。在1升錐形燒瓶進 行培養，使通過無菌過濾器吹入的空氣攪拌培養物，并用熒光燈連續照明。將細胞培養250 小時后，生物柴油_甘油部分的細胞產量為2. Og干細胞團塊/1，對于純甘油為1. 8g/l。所得到的細胞脂肪含量，對于生物柴油-甘油部 分為121mg/g干物質，對于純甘油為128mg/g 干物質。
權利要求
一種用于由起始原料形成脂質或脂質的混合物的方法，所述起始原料包含至少一種醇和皂或皂前體，所述方法的特征在于-將金屬離子形成劑加入所述起始原料中，由此形成含有不溶相和液相的混合物，-將所述不溶相由所述液相分離，-使產脂微生物在培養基上與所述液相接觸，由此所述微生物細胞開始產生脂質，和-收集脂質。
2.權利要求1的方法，其特征在于所述起始原料包含多元醇或一元醇或者這兩者以 及皂或皂的前體，優選所述起始原料是由于脂質的酯交換而產生的部分。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于所述醇的量是所述起始原料的至少一半，優選 70%重量-99%重量。
4.一種用于由含醇液相形成脂質或脂質的混合物的方法，所述液相包含至少一種醇， 所述方法包括-使產脂微生物在培養基上與所述含醇液相接觸，由此所述微生物細胞開始產生脂質，禾口-收集脂質，所述方法的特征在于所述醇的量是所述液相的36%重量-100%重量。
5.權利要求4的方法，其特征在于所述液相包含多元醇或一元醇或者這兩者。
6.權利要求4或5的方法，其特征在于所述醇的量是所述液相的70%重量-100%重量。
7.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述多元醇是甘油、由磷脂形成的醇、或甾醇。
8.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述一元醇是甲醇、乙醇或1-丙醇，優 選甲醇。
9.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述不溶相包含皂。
10.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述液相包含權利要求4的含醇液相。
11.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于在加入所述金屬離子形成劑之前將 酸加入混合物中以調節PH值為3-8，優選值為6-8。
12.權利要求11的方法，其特征在于所述酸是有機酸，優選乙酸、甲酸或乳酸。
13.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于；所述金屬離子形成劑是氯化鈣或氯 化鎂，優選氯化鈣。
14.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述金屬離子形成劑作為固體或作 為液體加入，優選作為固體加入。
15.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述金屬離子形成劑以沉淀至少 40%的皂的量加入，優選所述形成劑以形成相對于皂的量為化學計算量的金屬離子的量加 入，最優選以化學計算量過量10%的量加入。
16.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于在所述培養基中的醇含量為2%重 量-36%重量。
17.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述微生物是酵母、霉菌、細菌或藻類，優選酵母或霉菌，最優選酵母。
18.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于收集微生物的細胞團塊或由細胞產 生的脂質后，優選從所收集的細胞團塊的細胞中分離出脂質、含脂質部分或脂質混合物。
19.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于對脂質、脂質混合物、含有脂質的細 胞或其部分進行酯化或加氫處理。
20.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于在培養基中再次利用所收集的細胞 團塊或已從中分離出脂質的細胞團塊。
21.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于在使用所述細胞團塊之前對其進行 酶加工、化學加工或物理加工。
22.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于從含有脂質的細胞中分離出組分，例 如蛋白質、蛋白質水解產物、來源于蛋白質的肽、β _葡聚糖、黃原膠、維生素、維生素前體或 甾醇或者它們中的幾種。
23.按照權利要求1-22中任一項的方法產生的脂質或脂質的混合物在作為脂肪酸酯 化的原料或將脂質氫化的方法的原料中的用途。
24.生物柴油制備中形成的醇混合物在用于使用權利要求1-22中任一項的方法產生 脂質或脂質的混合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及用于由起始原料形成脂質或脂質的混合物的方法，所述起始原料包含至少一種醇和皂或皂前體，所述方法包括將金屬離子形成劑加入起始原料中，由此形成含有不溶相和液相的混合物；將不溶相由液相分離；使產脂微生物在培養基上與所述液相接觸，由此開始產生脂質；以及收集脂質。本發明還涉及用于由含醇液相形成脂質或脂質的混合物的方法，所述液相包含至少一種醇。
文檔編號C12P7/64GK101849015SQ200880115912
公開日2010年9月29日 申請日期2008年9月5日 優先權日2007年9月7日
發明者M·瓦瓦塞爾卡, O·帕斯蒂南, S·拉克索, S·霍卡南 申請人:阿爾托大學基金會