靶rna的檢測、定量方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：靶rna的檢測、定量方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及靶RNA的檢測、定量方法和試劑盒，更具體而言，涉及組合了 DNA微陣 列技術和核酸擴增技術的RNA的檢測、定量方法以及RNA的檢測、定量試劑盒。
背景技術：
關于細菌的鑒定，除了以往一直在使用的通過培養的鑒定方法、通過染色進行的 鑒定方法、或測量ATP等涉及細菌的代謝的物質的方法之外，正在開發出例如使用DNA微陣 列技術的細菌鑒定方法。特別是合成相對于某細菌的基因序列具有特異性堿基序列的核酸 作為探針，并將其固定在基板上使其與由檢樣擴增的基因雜交的方法，由于使用各菌種所 具有的特異性堿基序列，因此可以進行準確檢測，目前各種形式的應用正在發展(參照專 利文獻1 3和非專利文獻1)。例如，作為定量解析方法中的一種，例如有采用實時PCR法的檢測方法。利用這種 實時PCR法時，可以用微量的檢樣量進行定量檢測，但檢驗需要時間，另外，為了重現性良 好地進行定量，需要預先調查每個模板或引物適合定量的循環數，操作繁瑣。此外，作為可以檢測出特定菌種或品種的方法，提出了作為RNA特異性核酸擴增 方法的基于核酸序列的擴增(Nucleic Acid SequenceBased Amplification, NASBA)法。 NASBA法是用2種引物在對象RNA上對互補的反義RNA進行擴增的方法，由于可以在41°C 的恒定溫度下，以RNA作為模板在短時間內進行核酸擴增，因此可以在常溫下進行反應，而 不需要溫度調節設備等。另外，由于也不需要考慮引物的Tm值等，因此可以簡便地檢測多 種核酸。此外，由于與RT-PCR不同，可以在DNA存在下進行RNA的擴增和檢測，因此可以通 過評價細菌的存活來排除由死亡細菌造成的假陽性的可能性。但是，NASBA法雖然可以同 時簡便地定性檢測多種核酸，但一直難以簡便地定量檢測多種核酸。另一方面，肺炎在日本人的以死因區分的死亡率(cause-specificdeath rate)中 位于第4位，作為癌癥等基礎疾病的并發癥經常發生，作為患者數量非常多的疾病而被人 們所知。以往作為成為肺炎原因的微生物(病原菌)的探索試驗而進行的培養檢驗至少需 要數天時間，如果再對培養后的病原菌進行藥物敏感性試驗則要花費近1周的時間，因此 不是十分有助于治療選擇的檢驗方法。有報告指出對于需要在重癥監護病房(ICU)住院的 重癥肺炎，迅速且準確地確定病原菌在治療選擇中極為重要，恰當的初期治療可以切實地 提高肺炎患者的獲救概率。但實際上，現狀是由于仍然未確立代替培養法的病原菌鑒定技 術，因而必須在病原菌不明的狀態下進行治療。因此，不得不根據經驗治療使用抗生素，結 果可能導致耐藥菌的出現。成為肺炎原因的病原菌中，發生頻率高的菌種占全部的近50%，包括病毒在內的 主要病原菌為20 30種左右。其中有無法用常用方法培養的病原菌，通過培養法難以確 定病原菌的情況也很多。另外，利用使用以往的DNA微陣列技術的微生物檢測方法時，對于 即使是微小的感染量也會引起肺炎的肺炎病原菌的檢測、或者同時檢測多種菌來說是有效 的，但在重現性良好地進行定量解析方面存在問題。特別是在需要依靠菌量來適當選擇抗生素進行治療的肺炎中，同時檢測多種肺炎病原菌、以及檢測信號的定量解析 是非常重要 的。此外，最佳治療藥物根據病原菌的種類不同而不同，但在確定病原菌前就開始治療的情 況在醫療倫理上也是不得已的實情。為了解決這些問題，有待開發可以從多種菌種中迅速 且定量地檢測特定菌的方法。專利文獻1 日本特開2002-512688號公報專利文獻2 日本特開2006-025791號公報專利文獻3 日本特開2006-061155號公報非專利文獻1 :Schena M.等，(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (20) 10614-9

發明內容
本發明的課題在于，提供在對一種或多種病原微生物進行檢測、定量等情況下，可 以從試樣中微量的RNA中簡便且迅速地檢測、定量靶RNA的方法和試劑盒。本發明人為了檢測多種菌類微量的基因，已經著眼于使用蛋白質合成器官即核糖 體的構成成分之一的16SrRNA序列作為引物。16SrRNA的堿基序列可以在所有細菌中得到， 另外，作為16SrRNA的特征，具有共有的堿基序列部分和菌特異性堿基序列部分，因此開發 了利用該特性設計用于檢測菌特異性序列的引物，使用多重PCR法同時使多個基因擴增， 再通過使用微陣列的PCR法對該擴增產物進行定量檢測的方法，從而提出了檢測10個菌種 的肺炎病原菌基因的方法(山口大學和住友《一々7 4卜共同開發，發明專利申請中日 本特愿2007-207966)。但是，該方法需要DNA擴增設備或微陣列掃描儀，因此中小型醫院或 診所大多難以進行檢驗。根據這樣的現狀，為了開發不使用特殊設備就可以簡便地進行檢 測的診斷設備，首先開發出了世界上首個可以同時對NASBA法的工序中制成的雙鏈DNA進 行擴增和定量檢測的核酸擴增定量法，這種方法在使用熒光測定裝置的測定系統中使用液 相引物和固相引物的3種引物，在恒定溫度下進行RNA擴增。但是，在該檢測系統中，只能 確認可以檢測一個菌種。另外，在以往的NASBA法中所用的逆轉錄引物是用于將臨床樣本 中的RNA轉換為DNA的引物，由于加入溶液中故濃度設定很重要。新的基因檢測法中的濃 度設定取決于混合了幾種逆轉錄引物，但檢測目的基因的種類如果增加則逆轉錄引物的種 類也必須增加，由于耐藥性基因沒有共有區域，因此必須追加與耐藥性基因數量相符的逆 轉錄引物。此次，本發明人得到了采用多重PCR法中所用的引物組(Primer set)，可以一次 檢測具有多種靶堿基序列的核酸的構思，嘗試使用NASBA法中的試劑和多個引物進行RNA 的檢測、定量，但是NASBA試劑下的多菌種擴增交叉反應多而無法得到優選的結果。因此， 發現通過在孔型微陣列基板上，用多種引物使NASBA法的工序中制成的雙鏈DNA擴增，可以 短時間且簡便地檢測、定量試樣檢樣中的多種DNA序列，從而完成了本發明。即本發明涉及[1]靶RNA的檢測、定量方法，其特征在于，包括以下的(a) (j) 的工序。(a)將含有與靶RNA的5’端靶特異性序列相對應的DNA序列的引物的5’末端固 定在基板表面，制備固相DNA(+)引物的工序；(b)在含有與靶RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚 合酶啟動子序列，制備液相cDNA(-)引物的工序；(b’ )根據需要，制備在標簽序列的5’末端附加RNA聚合酶啟動子序列的液相通用引物的工序；(c)制備含有靶RNA的3’端序列和5’端靶特異性序列的試樣RNA的工序；(d)使工序(b)中制備的液相cDNA㈠引物與工序(c)中制備的試樣RNA鏈在液 相中接觸，使液相cDNA(-)引物與試樣RNA雜交，然后通過逆轉錄酶使DNA(-)鏈延長，制備 cDNA鏈-RNA鏈復合體的工序；(e)使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于工序(d) 中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備單鏈DNA㈠的工序；(f)使工序(e)中制備的單鏈DNA㈠與工序(a)中制備的固相DNA⑴引物在液 相中接觸，使單鏈DNA(-)與固相DNA⑴引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚合酶活 性的酶使DNA(+)鏈延長制備雙鏈DNA的工序；(g)使RNA聚合酶作用于工序(f)中制備的雙鏈DNA，利用來自DNA㈠鏈的RNA 聚合酶啟動子序列使單鏈RNA(-)擴增，使擴增的單鏈RNA(-)與固相DNA⑴引物雜交，然 后通過逆轉錄酶使DNA(+)鏈延長制備cDNA鏈-RNA鏈復合體的工序；(h)使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于工序(g) 中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備固相單鏈DNA⑴的工序；⑴使工序(h)中制備的固相單鏈DNA(+)與工序(b)中制備的液相cDNA(-)弓丨物 或工序(b’ )中制備的液相通用引物在液相中接觸，使單鏈DNA⑴與液相cDNA㈠弓丨物或 液相通用引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶使DNA(-)鏈延長，制備 雙鏈DNA的工序；(j)對工序(f)和工序⑴中制備的雙鏈DNA進行定量的工序；另外，本發明涉及[2]上述[1]記載的檢測、定量方法，其特征在于重復兩次以上 工序(g) 工序(i) ； [3]上述[1]或[2]記載的檢測、定量方法，其特征在于在同一反應液 中進行工序(d) 工序(j) ； [4]上述[1] [3]中任一項記載的檢測、定量方法，其特征在 于在同一基板上對多個靶RNA進行檢測、定量；[5]上述[1] [4]中任一項記載的檢測、 定量方法，其特征在于在工序(i)中使用液相通用引物；[6]上述[5]記載的檢測、定量方 法，其特征在于液相通用引物的濃度為液相cDNA(-)引物濃度的10倍以上；[7]上述[1] [6]中任一項記載的檢測、定量方法，其特征在于液相cDNA(-)引物是通過標簽序列，在含 有與靶RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列 制成的液相嵌合引物；[8]上述[1] [7]中任一項記載的檢測、定量方法，其特征在于使 用RNA聚合酶啟動子序列是標記的啟動子序列的、液相通用引物或液相嵌合引物；[9]上 述[8]記載的檢測、定量方法，其特征在于標記的啟動子序列是生物素標記的啟動子序列； [10]上述[1] [7]中任一項記載的檢測、定量方法，其特征在于在標記試劑的存在下進行 工序(i) ； [11]上述[10]記載的RNA的檢測、定量方法，其特征在于標記試劑為熒光色素； [12]上述[1] [11]中任一項記載的檢測、定量方法，其特征在于使用逆轉錄酶作為具有 DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶；[13]上述[1] [12]中任一項記載的檢測、定量方法，其 特征在于靶RNA為16SrRNA中的菌特異性RNA鏈；[14]使用上述[1] [13]中任一項記 載的RNA的檢測、定量方法，對一種或多種病原微生物進行檢測、定量的方法。本發明還涉及[15]RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于具有將含有靶RNA的 5’端靶特異性序列的引物的5’末端固定在基板表面制成的固相DNA⑴引物、在含有與靶
6RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列制成的 液相cDNA(-)引物、逆轉錄酶、RNA聚合酶、和特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈 的RNA分解酶；[16]上述[15]記載的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于液相cDNA(-)弓丨 物是通過標簽序列，在含有與靶RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加 RNA聚合酶啟動子序列制成的液相嵌合引物；[17]上述[15]或[16]記載的RNA的檢測、定 量試劑盒，其特征在于還具有在標簽序列的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列制成的液 相通用引物；[18]上述[16]或[17]記載的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于RNA聚合 酶啟動子序列為標記的啟動子序列；[19]上述[18]記載的RNA的檢測、定量試劑盒，其特 征在于標記的啟動子序列為生物素標記的啟動子序列；[20]上述[15] [17]中任一項記 載的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于還含有標記試劑；[21]上述[20]記載的RNA的 檢測、定量試劑盒，其特征在于標記試劑為熒光色素；[22]上述[15] [21]中任一項記載 的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于還含有DNA依賴性DNA聚合酶；[23]上述[15] [22]中任一項記載的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于靶RNA為16SrRNA中的菌特異性 RNA 鏈。根據由本發明開發出的核酸的定量方法，通過通用引物對核酸進行定量擴增，即 使在因核酸擴增中使用的引物而使核酸擴增的效率不同的情況下，也可以通過使用同一通 用引物對核酸進行擴增，使引物間的擴增效率均勻，因此可以通過核酸擴增進行定量解析。 這樣，可以提供通過使用通用引物進行核酸擴增，不進行實時PCR就可以簡便且定量地進 行檢測的新微陣列技術。此外，即使在檢測新病原菌時，也可以通過追加具有對該病原菌 特異的序列的固相引物來進行檢測，因此與只能檢測限定的菌種的以往的基因檢測方法相 比，具有獨創性和通用性。另外，根據本發明的核酸的定量方法，可以對檢測出的信號進行 定量解析，因此對例如病癥因感染量不同而不同的病原菌或多種病原菌的檢測有效。特別 是還可以同時在短時間內準確地對多個耐藥性基因進行檢測、定量，因此開拓了構建新的 基因定量檢測系統的道路。另外，使用本發明 的核酸定量方法的基因檢測系統可以用作用 于對衣原體或立克次氏體等培養困難的病原微生物、耐藥菌等醫院內感染病原菌選擇適當 的治療方法的臨床診斷用簡易檢驗試劑。而且，本發明中基板使用了合成樹脂，可以提供操 作簡便并且可配合檢測用設備進行加工的高通用性系統。


圖1表示工序(a) (f)的示意圖。(a)表示將固相DNA⑴引物2固定在基板1 的表面la。(b)和(c)表示在工序(d)中，將固相DNA⑴引物2固定在基板1的表面Ia 后開始上述反應的情況。(d)表示工序(e)中的反應的示意圖。(e)表示工序(f)中的反 應的示意圖。圖2表示工序(g) (i)的示意圖。(a)表示在工序(g)中，通過雙鏈DNA6上存 在的啟動子序列8合成單鏈RNA9，再使其與固相DNA(+)引物2雜交的反應的示意圖。(b) 表示在工序(h)中，通過固相DNA⑴引物2合成cDNA鏈(+) 10，制成cDNA鏈-RNA鏈復合 體后、將該cDNA鏈-RNA鏈復合體的RNA鏈分解，得到單鏈DNA (+) 10的反應。(c)表示在 工序(i)中，使固相單鏈DNA⑴10與液相cDNA(-)引物或液相通用引物3b雜交，制備雙鏈 DNA的反應的示意圖。
圖3是對擴增產物(RNA)進行定量檢測的圖。圖4是為了確定最適引物量，對擴增后的DNA進行經時檢測的圖。橫軸表示時間、 縱軸表示熒光強度。圖5是對核酸擴增產物(DNA)進行定量、經時檢測的圖。圖6中i)表示工序(d)中的在靶RNA的3’端雜交的液相嵌合引物；ii)表示通 過逆轉錄合成的cDNA鏈-RNA鏈復合體。iii)表示工序(e)中的反應的示意圖。iv)表示 工序(f)中的反應的示意圖。ν)表示在工序(g)中，反義RNA擴增的情況。vi)表示在工 序(g)中，擴增的反義RNA與固相DNA⑴引物雜交的情況。vii)表示工序(g)中的cDNA 鏈-RNA鏈復合體。viii)表示在工序(h)中，cDNA鏈-RNA鏈復合體的RNA鏈分解的情況。 ix)表示在工序(i)中，使單鏈DNA(+)與液相cDNA(-)引物或液相通用引物雜交的反應的 示意圖。χ)表示工序⑴中的標記的雙鏈DNA，還表示工序⑴后對工序(g)的單鏈RNA(-) 進行擴增的情況。
具體實施例方式作為本發明的靶RNA的檢測、定量方法，只要是具有以下的(a) (j)的工序的方 法則沒有特別限制，靶RNA是指成為鑒定和/或定量的對象的RNA，如后所述，可優選列舉 16SrRNA中的菌特異性RNA鏈等。(a)將含有與靶RNA的5’端靶特異性序列相對應的DNA序列的引物的5’末端固 定在基板表面，制備固相DNA(+)引物的工序；(b)在含有與靶RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚 合酶啟動子序列，制備液相cDNA(-)引物的工序；(b’ )根據需要，制備在標簽序列的5’末端附加RNA聚合酶啟動子序列的液相通 用引物的工序；(c)制備含有靶RNA的3’端序列和5’端靶特異性序列的試樣RNA的工序；(d)使工序(b)中制備的液相cDNA(-)引物與工序(c)中制備的試樣RNA鏈在液 相中接觸，使液相cDNA(-)引物與試樣RNA雜交，然后通過逆轉錄酶使DNA (-)鏈延長，制備 cDNA鏈-RNA鏈復合體的工序；(e)使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于工序(d) 中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備單鏈DNA㈠的工序；(f)使工序(e)中制備的單鏈DNA(-)與工序(a)中制備的固相DNA⑴引物在液 相中接觸，使單鏈DNA(-)與固相DNA⑴引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚合酶活 性的酶使DNA (+)鏈延長制備雙鏈DNA的工序；(g)使RNA聚合酶作用于工序(f)中制備的雙鏈DNA，利用來自DNA(-)鏈的RNA 聚合酶啟動子序列使單鏈RNA(-)擴增，使擴增的單鏈RNA㈠與固相DNA⑴引物雜交，然 后通過逆轉錄酶使DNA (+)鏈延長制備cDNA鏈-RNA鏈復合體的工序；(h)使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于工序(g) 中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備固相單鏈DNA⑴的工序；⑴使工序(h)中制備的固相單鏈DNA(+)與工序(b)中制備的液相cDNA(-)弓丨物 或工序(b’ )中制備的液相通用引物在液相中接觸，使單鏈DNA⑴與液相cDNA(-)弓丨物或液相通用引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶使DNA (-)鏈延長，制備 雙鏈DNA的工序；(j)對工序(f)和工序⑴中制備的雙鏈DNA進行定量的工序；作為上述工序(C)中的試樣，只要是含有微生物、動物、植物等的細胞或組織等的 RNA，例如，原核生物中的16SrRNA或23SrRNA、真核生物中的18SrRNA或28SrRNA等rRNA、 mRNA等RNA的試樣則沒有特別限制，另外，還含有細胞溶解液等生物體試樣、由生物體試 樣所得的培養物或由RNA擴增所得的合成RNA。其中，可優選列舉已知基因的長度適當、 細胞內大量存在、序列的保守性高而另一方面也存在比較容易變異的部位的原核生物中的 16SrRNA、真核生物中的ISSrRNA。另外，作為上述微生物，除了難以確定病原菌的肺炎的病 原菌、MRSA之外，還可列舉衣原體、立克次氏體等培養困難的病原微生物。此外，制備含有 靶RNA的5’端序列和3’端靶特異性序列的試樣RNA是指，使用硫氰酸胍或市售試劑盒等 從試樣中提取RNA、或者對提取出的RNA進行適當的切割處理，制備含有一個或多個靶RNA 的5’端序列和3’端靶特異性序列的RNA，但即使在不含這些靶RNA的情況下，為了方便起 見也包含在試樣RNA的制備中。
作為上述工序(a)中的靶RNA的5’端靶特異性序列，只要是存在于靶RNA的5’ 端、可以將試樣中所含的靶RNA與其它RNA區別開并進行檢測、定量的靶RNA中的特異性 序列則沒有特別限制，在選擇所述靶RNA的5’端序列時，除可有效使用公知的數據庫之 夕卜，還可以將成為檢測對象的特定菌株的RNA作為模板，采用PCR法用引物進行擴增，用 市售的純化柱(QIAGEN公司制)等將擴增片段純化后，再用ABI PRIZM 377基因分析儀 (P. E. Biosystems公司制)等確定用4色染料終止子(dye terminator)法處理的序列，由 該序列信息選擇靶RNA的5’端序列。作為靶RNA的5 ’端靶特異性序列，具體可列舉序列表SEQ IDN0. 1表示的 以編碼肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae) 16SrRNA的基因區域的轉錄起始 部位作為1位時202位 223位的堿基序列、SEQ ID NO. 2表示的以編碼流感桿菌 (Hemophilusinfluenzae) 16SrRNA的基因區域的轉錄起始部位作為1位時165位 187 位的堿基序列、SEQ ID NO. 3表示的以編碼肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae) 16SrRNA 的基因區域的轉錄起始部位作為1位時1225位 1245位的堿基序列、SEQ ID N0. 4表 示的以編碼肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae) 16SrRNA的基因區域的轉錄起始部位作 為1位時994位 1017位的堿基序列、SEQ ID N0. 5表示的以編碼軍團桿菌(Legionella spp.) 16SrRNA的基因區域的轉錄起始部位作為1位時436位 459位的堿基序列、SEQ ID N0. 6表示的以編碼肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) 16SrRNA的基因區域的轉錄 起始部位作為1位時52位 71位的堿基序列、SEQ ID N0. 7表示的以編碼綠膿桿菌 (P. aereruginosae)16SrRNA的基因區域的轉錄起始部位作為1位時164位 185位的堿基 序列、SEQ ID N0. 8表示的以編碼粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrahalis) 16SrRNA的基 因區域的轉錄起始部位作為1位時453位 473位的堿基序列，這些序列可適用于為了確 定肺炎病原菌而進行的檢測。另外，與靶RNA的5’端靶特異性序列相對應的DNA序列是指，將靶RNA的5’端的 RNA序列中的U (尿嘧啶)改為T (胸腺嘧啶)的DNA序列。通過將含有與靶RNA的5，端靶 特異性序列相對應的DNA序列的引物的5’末端固定在基板表面，可以制備由固定有引物的基板構成的固相DNA⑴弓丨物。由于固相DNA⑴弓丨物中存在與靶RNA的5’端靶特異性序 列相對應的DNA序列，因此可以確定基板的部位特異性靶RNA，例如，使用具有多個孔的基 板時，#1孔中固定肺炎鏈球菌特異性序列、#2孔中固定流感桿菌特異性序列、#3孔中固定 肺炎支原體特異性序列，由每孔在工序(j)中的雙鏈DNA的定量結果可以進行靶RNA的檢 測、定量。這樣，在獨立的孔底面僅固定一種序列時，即使反應液(擴增試劑、嵌合引物、通 用引物、試樣RNA的混合液)是共通的，基因擴增也僅在對應的孔內進行，可以進行靶RNA 的檢測、定量。為了提高引物與基板表面的親和性，還可以在上述引物的DNA序列的5’端導入接 頭部，作為被導入的接頭部，例如，當基板表面上具有活性酯基時，從可以提高與該活性酯 基的反應性、高效率且牢固地固定在基板的表面上的觀點考慮，優選氨基。另外，作為基板 的材質，只要是不溶于水且可以結合引物的材質則沒有特別限制，可以列舉直鏈狀聚烯烴 樹脂、環狀聚烯烴樹脂、含氟樹脂等，從耐化學藥品性、低熒光性、透明性和成形性優異的觀 點出發，優選使用環狀烯烴。另外，作為基板的形狀，只要是可以同時對多種核酸進行定量的形狀 則沒有特 別限制，例如可列舉膜狀、管狀或板狀的基板，具體可優選列舉96孔等多孔板(multi plate)。當上述基板為多孔板狀時，基板的表面優選通過微細加工形成微小多孔板用結構。 此時，在基板表面形成多個凹部，將回相引物固定在該凹部，從通過形成凹部可以高效率地 使工序(g)中合成的單鏈RNA(-)與固相DNA(+)引物雜交的觀點出發優選。對于凹部，優 選形成深度為150 250 μ m、底部直徑為0. 5 1. 5mm的孔。作為將引物固定在基板表面的方式，沒有特別限制，例如可列舉共價鍵、離子鍵、 物理吸附、使固相引物結合在凝膠中的方式等，例如可優選列舉共價鍵，具體可列舉當基 板表面存在包含具有由構成磷脂親水部的磷酸酯衍生的基團的第一單元、以及具有羧酸衍 生基團的第二單元的高分子物質時，在所用的基板的表面，該高分子物質中所含的活性酯 基的一部分與5’端導入氨基作為接頭的引物反應，在引物之間形成共價鍵的方法。此處， 第一單元起到抑制引物的非特異性吸附的作用，第二單元起到第二單元所含的羧酸衍生基 團將引物化學固定的作用，引物在包含該高分子物質的涂層的羧酸衍生基團部位形成共價 鍵，被固定在該基板的表面。通過共價鍵將固相引物固定時，為了使在工序(g)中利用來自DNA(-)鏈的RNA 聚合酶啟動子序列生成的單鏈RNA(-)容易被固相DNA(+)引物捕捉，此外為了以固相引物 作為起點使工序(f)中制成的單鏈DNA(-)容易結合在固相DNA⑴弓丨物上，優選如圖1(a) 所示將引物豎著固定，作為固定所述固相引物的方法，例如可列舉通過溶解或分散有引物 的溶液將引物展開附著的方法，從可以使引物處于從孔內的基板表面突出的狀態的觀點考 慮，作為溶解或分散有引物的溶液的pH值，優選為中性至堿性，更優選pH為7. 6以上，具體 的可列舉TE緩沖液(pH8. 0)等。另外，展開附著后，為了將未被固定在基板表面的引物除去，優選用純水或緩沖液 等洗滌。洗滌后優選用堿化合物、或者具有伯氨基的化合物對除固定了引物之外的基板表 面的活性酯進行惰性處理，作為上述堿化合物，可以列舉氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳 酸氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、硼酸鈉、氫氧化鋰、磷酸鉀等，作為具有上述伯氨 基的化合物，例如可列舉甘氨酸、9- T ^ y T ^ T > (9-aminoaquadine)、氨基丁醇、4-氨基丁酸、氨基辛酸、氨基乙醇、5-氨基2，3- 二氫-1，4-戊醇、氨基乙硫醇鹽酸鹽、氨基乙硫醇硫酸、2-(2_氨基乙氨基)乙醇、磷酸二氫2-氨基乙酯、硫酸氫氨基乙酯、4-(2_氨基 乙基)嗎啉、5-氨基熒光素、6-氨基己酸、氨基己基纖維素、ρ-氨基馬尿酸、2-氨基-2-羥甲 基-1，3-丙二醇、5-氨基間苯二甲酸、氨基甲烷、氨基苯酚、2-氨基辛烷、2-氨基辛酸、1-氨 基2-丙醇、3-氨基-1-丙醇、3-氨基丙烯、3-氨基丙腈、氨基吡啶、11-氨基十一酸、氨基水 楊酸、氨基喹啉、4-氨基鄰苯二甲腈、3-氨基鄰苯二甲酰亞胺、ρ-氨基苯丙酮、氨基苯乙酸、 氨基萘等。其中可列舉氨基乙醇、甘氨酸。另外，為了切實地將本發明中所用的固相引物固定在基板上，更優選在洗滌后、于 75 85°C下加熱1小時，加熱處理后，照射120mJ/cm2的UV，由此進一步將引物固定。作為上述工序(b)中的靶RNA的3’端序列，只要是存在于靶RNA的3’端的序列 則沒有特別限制，可以是3’端靶特異性序列，通過形成含有多種靶RNA所共有的序列(共 有保守區域等)的引物，在對多種靶RNA進行檢測、定量時，可以使用共有液相嵌合引物等 液相cDNA(-)引物，其制作簡便非常有利。例如，增加液相cDNA(-)引物的種類可能會引起 非特異性反應，因此優選盡可能選擇試樣中RNA序列的共有區域序列，例如選擇用于檢測、 定量的菌的16SrRNA序列的共有區域序列來設計液相cDNA(-)引物，具體可列舉序列表 SEQ ID NO. 9表示的以編碼肺炎鏈球菌、流感桿菌、軍團桿菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌、粘膜炎 莫拉菌16SrRNA的基因區域的轉錄起始部位作為1位時502位 519位的堿基序列、序列 表SEQ ID NO. 10表示的以編碼肺炎支原體或肺炎衣原體16SrRNA的基因區域的轉錄起始 部位作為1位時1378位 1392位的堿基序列，這些序列可以在制備用于確定肺炎病原菌 的液相cDNA(-)引物時有效使用。另外，如果在含有與靶RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端附加 RNA聚合酶啟動子序列則可以制備液相cDNA(-)引物，優選通過標簽序列，在含有與靶RNA 的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列制成液相嵌 合引物。上述液相cDNA(-)引物、優選液相嵌合引物被用于工序(d)中，在工序(i)中適用 液相通用引物。液相通用引物不能在工序(d)中使用，而在工序(i)中使用液相通用引物 時，工序(b’ )成為必要工序，工序(b’ )中的液相通用引物可通過在標簽序列的5’末端附 加RNA聚合酶啟動子來制備。另外，液相通用引物中的RNA聚合酶啟動子序列可以與液相 cDNA(-)引物中的RNA聚合酶啟動子序列相同也可以不同。由于不具有靶RNA的3’端序列的液相通用引物具有共有序列(在標簽序列的5’ 末端進一步附加RNA聚合酶啟動子序列形成的序列)，因此無論靶RNA是否相同，都可以統 一因3’端序列的差異產生的不同的基因擴增效率。例如，如果將液相嵌合引物的混合量減 少至引起RNA擴增反應的限度，取而代之使液相通用引物的量增加，則擴增反應替換成只 有液相通用引物的反應，通過在啟動子序列上結合RNA聚合酶使RNA擴增進行，從而可以統 一因3’端序列的差異產生的不同的基因擴增效率。因此，在工序(i)中使用液相通用引物 時，使液相通用引物的濃度達到液相嵌合引物等液相cDNA(-)引物濃度的10倍以上，例如 優選為10 100倍。作為上述液相嵌合引物或液相通用引物中的啟動子序列，優選為存在可以通過該 啟動子對RNA進行特異性擴增的RNA聚合酶的啟動子序列，可以適當選擇使用公知序列，例 如可列舉，T7 聚合酶的啟動子序列(5，-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3，) [SEQ ID NO. 11]、T3RNA 聚合酶的啟動子序列(5，-TTATTAACCCTCACTAAAGGGAAG-3，)[SEQ ID NO. 12]、SP6RNA 聚合酶的啟動子序列(5，-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3‘ ) [SEQ ID NO. 13]等，其中從 RNA 擴增效率高的觀點考慮，優選T7聚合酶的啟動子序列。液相cDNA(-)引物可以按照常用 方法用DNA合成裝置合成。另外，作為啟動子序列可以有效利用標記的啟動子序列，并可 以利用該標記簡便地實施工序(j)中的雙鏈DNA的檢測、定量。作為用于所述標記的標記 物質，可以列舉過氧化物酶(例如，辣根過氧化物酶horseradishperoxidase)、堿性磷酸 酯酶、β -D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、 青霉素酶、過氧化氫酶、脫輔葡萄糖氧化酶、脲酶、熒光素酶或者乙酰膽堿酯酶等酶；異硫氰 酸熒光素、藻膽蛋白、稀土金屬螯合物、丹磺酰氯或四甲基若丹明異硫氰酸鹽(f卜，^ ★ A 口一夕·笑 乂 手才〉了才、一卜，tetramethylrhodamine isothiocyanate)等熒光物
質；3H、14C、125I或131I等放射性同位素；生物素、親和素、或者化學發光物質。例如，使用生 物素標記的啟動子序列時，可以使用親和素或者酶修飾親和素進行定量。例如，使用鏈親和 素_ β _半乳糖苷酶作為生物素的基質時，可以使用4-甲基-傘形酮基-β -D-半乳糖苷(4 -Methyl-umbelliferyl-^-D-galactoside)作為顯色物質，另外，使用鏈親和素-堿性磷 酸酯酶作為生物素的基質時，作為顯色物質可以通過觀察由5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸與 氯化4-氮藍四唑的相互作用而生成的藍色不溶性化合物來進行定量。作為上述液相嵌合引物或液相通用引物中的標簽序列，優選未與3’端序列或RNA 聚合酶啟動子序列雜交的序列，包含1 20個堿基、優選包含5 15堿基，優選富含AG的 序列，具體的可列舉在AGAAGG或AGAAGG中再附加富含AG的任意7個堿基形成的序列，例 如 AGAAGGAGCAGGA[SEQ ID NO. 14]等。本發明中，通過使用由固相DNA(+)引物和液相cDNA(-)引物構成的引物組而被 擴增的堿基對數量，可參考作為模板的核酸的堿基序列或所用的聚合酶的活性等來適當設 定，由于如果過長則擴增準確度可能會降低，故優選形成例如50 500堿基對長。以下，參照圖1、圖2和圖6，對在工序(d)中使用液相嵌合引物、在工序(i)中使 用液相通用引物的靶RNA的檢測、定量方法中的工序(d) (j)進行說明。圖1、圖2表示 在標記試劑的存在下使用無標記的液相通用引物的方法，圖6表示使用標記的液相通用引 物的方法。從以下說明可知，工序⑷ 工序(j)可以在同一反應液中進行。工序(d)是使工序(b)中制備的液相嵌合引物與工序(C)中制備的試樣RNA鏈 在液相中接觸，使液相與試樣RNA雜交，然后以試樣中所含的RNA鏈為模板通過逆轉錄酶 將cDNA(-)鏈從5’端向3’端延長制備cDNA鏈-RNA鏈復合體的工序，例如可以在脫氧核 苷酸的存在下，通過使逆轉錄酶發揮作用，合成cDNA鏈-RNA鏈復合體。作為上述逆轉錄 酶，可以列舉由AMV(Avian Myeloblastosys Virus)純化而成的AMV逆轉錄酶、或者由表達 M-MLV(Molony MurineLeukemiaVirus)逆轉錄酶的重組體克隆的大腸菌純化而成的M-MLV 逆轉錄酶等，優選使用具有比M-MLV逆轉錄酶高的延長活性、且活性溫度高的AMV逆轉錄 酶。反應溫度可參考所用的各種酶來適當決定，例如優選40°C 42°C。如圖1(a)所示，在 基板1的表面Ia固定固相引物2后開始上述反應(參照圖1(b)和(c)參照)。另外，圖 6i)中表示在靶RNA的3’ 端雜交的液相嵌合引物，圖6ii)中表示通過逆轉錄合成的cDNA 鏈-RNA鏈復合體。工序(e)是使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于工序(d)中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備單鏈DNA㈠的工序，作為工序(e)中使用 的RNA分解酶，優選使用不會抑制RNA聚合酶活性、特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的 RNA鏈的RNA分解酶，具體的可優選列舉RNaseH。反應的示意圖如圖1 (d)、圖6iii)所示。工序(f)是使工序(e)中制備的單鏈DNA(-)與工序(a)中制備的固相DNA⑴弓丨 物在液相中接觸，使單鏈DNA(-)與固相DNA⑴引物雜交，然后以單鏈DNA(-)為模板，通 過具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶使DNA⑴鏈從5，端向3，端延長制備雙鏈DNA的 工序，例如可列舉在脫氧核苷酸的存在下，使具有DNA聚合酶活性的酶反應，由此合成雙鏈 cDNA的方法。作為上述具有DNA聚合酶活性的酶，必須是具有DNA依賴性DNA聚合酶活性 的酶，優選像5’ -或3’ -的外切核酸酶活性這樣沒有脫氧核糖核酸酶(DNase)活性的酶。 另夕卜，已經在上述工序⑷中使用像上述AMV逆轉錄酶這樣兼具DNA依賴性DNA聚合酶活 性的酶時，不需要添加具有DNA聚合酶活性的酶。反應的示意圖如圖1(e)、圖6iv)所示。工序(g)是使RNA聚合酶作用于工序(f)中制備的雙鏈DNA，利用來自DNA(-)鏈 的RNA聚合酶啟動子序列，使單鏈RNA (-)、即反義RNA擴增，使擴增的單鏈RNA (-)的3 ’端 與固相DNA(+)引物雜交，然后在脫氧核苷酸的存在下，通過逆轉錄酶使DNA(+)鏈延長制備 cDNA鏈-RNA鏈復合體的工序，圖2 (a)中表示了通過存在于雙鏈cDNA6上的啟動子序列8 合成單鏈RNA9，與固相DNA⑴引物2雜交的反應的示意圖，另外，圖6iv)和ν)中表示反義 RNA擴增的情況，圖6vi)中表示擴增的反義RNA與固相DNA(+)引物雜交的情況，圖6vii) 中表示cDNA鏈-RNA鏈復合體。工序(h)是使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于工 序(g)中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備固相單鏈DNA⑴的工序，作為上述RNA分解 酶可優選列舉上述RNaseH。圖2 (b)中表示了通過固相DNA (+)引物2合成cDNA鏈(+) 10， 制備cDNA鏈-RNA鏈復合體后，使該cDNA鏈-RNA鏈復合體的RNA鏈分解，得到單鏈cDNAlO 的反應，另外，圖6viii)中表示cDNA鏈-RNA鏈復合體的RNA鏈分解的情況。工序⑴是使工序(h)中制備的固相單鏈DNA(+)與工序(b’)中制備的液相通用 引物在液相中接觸，使單鏈DNA⑴與液相通用引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚 合酶活性的酶使DNA(-)鏈和DNA⑴鏈分別從5，向3，端延長，制備雙鏈DNA的工序，作為 上述酶可以直接利用工序(f)中使用的酶。該工序(i)中，通過使液相通用引物的量增加 至與工序(d)的液相嵌合引物相比10倍以上，以擴增反應替換成只有液相通用引物的反應 并同時擴增多種基因為目的時，所有液相嵌合引物替換成了通用引物而可以實現具有定量 性的反應。圖2 (c)中表示使cDNA鏈10與液相引物3b雜交的反應，另外圖6ix)中表示單 鏈DNA⑴與標記的液相通用引物雜交的情況，圖6x)中表示標記的雙鏈DNA。將上述工序(g) 工序(i)重復兩次以上在提高定量準確度方面優選，如上所述， 由于工序(d) 工序(i)在同一反應液中進行，因此通過調節反應時間等反應條件，不需要 特別操作而是將工序(g) 工序(i)重復兩次以上。圖6x)中表示工序(i)后對工序(g) 的單鏈RNA(-)和DNA⑴鏈進行擴增的情況。工序(j)是對工序(f)和工序(i)中制備的雙鏈DNA進行定量的工序，作為對合 成的雙鏈DNA進行檢測、定量的方法不特別限定，可以列舉向反應液中加入標記雙鏈DNA 的標記試劑的方法、預先標記脫氧核 苷酸的方法、標記液相通用引物或液相嵌合引物中的 引物序列的方法等公知方法。另外，還可以通過實時PCR等，對用于定量的熒光色素的熒光量進行經時測定。通過累積由此所得的測定值，可以對所得的DNA擴增產物進行定量。作為上述標記試劑，可以使用標記雙鏈DNA的公知試劑，例如可列舉熒光色素或 顯色試劑。具體的而言，例如可列舉作為嵌入雙鏈DNA間的嵌入劑的SYBER Green (
八^才社制)。例如，通過向反應溶液中加入SYBER Green，在基板上形成雙鏈DNA時可以 嵌入SYBER Green，簡便地進行標記。使用SYBER Green作為標記試劑時，優選使用微陣列、 掃描儀，在485nm的激發光下，對525nm的熒光進行經時觀察。另外，還可以使用嵌入雙鏈 DNA間的溴化乙錠，在UV下顯色檢測雙鏈DNA。另外，作為預先標記脫氧核苷酸的方法，例如可列舉通過FITC或若丹明 (rhodamine)、Cy3或Cy5等花青等的熒光色素標記的方法，進一步地，可列舉用生物素、洋 地黃毒苷或RI等標記，用堿性磷酸酯酶或過氧化物酶等顯色試劑顯色的方法。這些經標記 的脫氧核苷酸用于形成基板上的雙鏈DNA，因此可以簡便地對形成的雙鏈DNA進行標記。例 如，使用生物素標記dUTP對雙鏈DNA進行檢測、定量時，優選在各反應溶液中使用[表1] 所示的用于生物素標記的酶反應溶液、以及[表2]所示的用于進行Cy3標記反應的試劑， 于37°C下反應15分鐘。[表 1] __ 終濃度
ΙΟμΜ dATP8μΕ~ ΙμΜ
ΙΟμΜ dGTP8μ ΙμΜ
ΙΟμΜ dCTPΙμΜ
ΙΟμΜ 生物素-dUTPΙμΜIOx Ex Taq 緩沖液Ix
IOx MPEX 緩沖液 AIx
去離子水23.2pL -
試樣 DNA1/10
TaKaRa Ex Tag__0.8μ __-
合計80μ 反應中需要70 μ L/片[表 2]
_JS記終濃度
Ο.ΟΙμβ/μΕ 鏈霉素-Cy3 8μ Ing/pL 「QQ77l1/100 鏈霉素-AP-1/1000
IOx MPEX 緩沖液 A8μ Ix
2χ MPEX 緩沖液 B40μ Ix
去離子水__24pL__-
合計~80μΕ反應中需要70 μ L/片在上述工序(d) (j)中，可以在每個工序中添加上述記載的酶等，更優選預先將 所有工序中所需的試劑作為同一反應溶液進行制備，導入基板上。如上所述，重復進行上述 工序(g) (i)合成雙鏈DNA，每次重復，不需要重新向反應系統中添加RNA分解酶、DNA聚 合酶等酶，可以迅速且簡單地進行DNA片段的復制、擴增。并且，在基板上導入反應溶液時， 優選將可以完全覆蓋設置在基板上的多個凹部的蓋子覆蓋在基板上，通過表面張力將反應 溶液導入各凹部。另外，通過使用蓋子，不僅節省了分注反應溶液的工時，而且可以抑制污染、減少反應溶液的總量，實現低成本化。此外該蓋子優選為透明的以使標記試劑的檢測容 易進行。通過本發明的靶RNA的檢測、定量方法，即使用微量的試樣RNA也可以對形成在基 板上的雙鏈DNA進行定量，從而可以簡便地在同一基板上對單一或多種靶RNA進行定量。 另外，在采用本發明的靶RNA的檢測、定量方法，對一種或多種病原微生物進行檢測、定量 的情況下，檢測時不需要培養，因此特別是可以簡便且迅速地對用常用方法無法培養的微 生物等進行檢測，所以在檢測來自病原微生物的RNA時也有效，并且，可以簡便地進行多重 化，因而可以簡便地用一個試樣一次對來自多種病原微生物的RNA進行定量。作為本發明的RNA的檢測、定量試劑盒，只要是具有將含有靶RNA的5’端靶特異性 序列的引物的5’末端固定在基板表面制成的固相DNA⑴引物、在含有與靶RNA的3’端序 列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列制成的液相cDNA(-)引 物、逆轉錄酶、RNA聚合酶、特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶的試 劑盒則沒有特別限制，上述液相cDNA(-)引物優選為通過標簽序列在含有與靶RNA的3’端 序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列制成的液相嵌合引物， 并且，優選具有在標簽序列的5’末端附加RNA聚合酶啟動子序列的液相通用引物。另外， 上述引物序列優選為生物素標記的啟動子序列等標記的啟動子序列、或者含有熒光色素等 標記試劑的序列。還可以含有DNA依賴性DNA聚合酶。如果使用本發明的RNA的檢測、定 量試劑盒，則可以簡便且迅速地對16SrRNA中的菌特異性RNA鏈等靶RNA進行檢測、定量。以下、通過實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明不僅限于以下實施例。(參考例1)使用液相通用弓I物的靶RNA的定量檢測進行NASBA法，討論具有靶RNA序列的RNA的定量是否可以進行。使用從 H. influenzae提取的RNA作為靶RNA，使用包含20個堿基對的聚T序列作為陰性對照。 另夕卜，作為靶RNA的引物，正向引物使用具有與H. influenzae的16SrRNA基因的165 位 187位堿基序列相同堿基序列的DNA。此外，作為反向引物，使用在具有與16SrRNA 基因的502位 519位堿基序列互補的堿基序列的5’端附加包含13堿基的標簽序列 (AGAAGGAGCAGGA)、再在標簽序列的5’端附加啟動子序列形成的引物。對于該啟動子序列， 使用T7RNA聚合酶的啟動子序列(5’ -TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’)。作為通用引物，使 用在包含13堿基的標簽序列(AGAAGGAGCAGGA)的5’端附加T7RNA聚合酶的啟動子序列形 成的引物。首先，在管表面涂布具有活性酯的聚合物，作為固相引物，使其具有與導入正向 引物5’末端的氨基結合的功能。然后，將H. influenzae的提取RNA懸浮在緩沖液(50mM Tris-HCl，ρΗ8· 3、6mM MgCl2、40mM KCl)中，分別制備含有該 RNA104、ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、108、IO9 拷 貝的溶液。在NASBA試劑專用Master Mix 10 μ 1 (Biomeru公司制)中混合0.05 μ M本發 明的液相嵌合引物、2 μ M本發明的液相通用引物、以及SYBER Green (夕力，社制)1000pg， 95 °C下加熱30秒。然后， 在65 °C下靜置5分鐘，制備提取RNA溶液。然后，向上述提取RNA 溶液中添加5μ 1的IOmM DTT、40單位AMV逆轉錄酶、0. 4單位RNaseH、20單位T7RNA聚合酶 的酶混合液(Biomeru公司制)，制備終容量為20 μ 1的反應溶液。然后，在設定為41°C的恒 溫槽中設置各管，通過NASBA法擴增RNA。接著為了確認通過NASBA法擴增的H. influenzae的RNA是否被定量擴增，進行擴增產物(RNA)的電泳來確認。其結果如圖3所示。圖3中， 橫軸表示堿基數、縱軸表示熒光強度。從圖3中觀察到隨著作為模板的基因組的拷貝數增 力口，RNA擴增產物(368nt)的熒光強度也增加。即，可以確認靶RNA被定量擴增。(參考例2)固相DNA(+)引物的最適固定量接著為了討論固相DNA⑴引物應該固定的量，使對應于H. influenzae的固相引 物的量為1.2511|1、2.511|1、511|1、1(^11，溶解于固定用的點樣溶液(住友《'一々，^卜社 制)、取 μ 滴加到各管中。滴加后，將各管在80°C下保溫1小時，將其作為檢測用管。然 后，制備使用IO8拷貝的H. influenzae的提取RNA和上述檢測用管的反應溶液，通過NASBA 法對RNA進行擴增。另外，使用包含20個堿基對的聚T序列作為陰性對照。RNA擴增時， 經60分鐘測定每1份在485nm的激發光下525nm的熒光，并對擴增的DNA進行經時檢測， 確定最適引物的量。其結果如圖4所示。圖4中，橫軸表示時間、縱軸表示熒光強度。從圖 4中觀察到固定在管內的引物的量為1.25 μ M時，靶核酸的擴增效率最佳。實施例1靶RNA的定量檢測然后，采用與參考例1相同的方式制備含有H. influenzae的提取核酸(RNA) 103、 ΙΟ4、ΙΟ5、106、IO7拷貝的試樣RNA溶液。將該RNA提取溶液加入到結合了 1. 25 μ M固相DNA(+) 引物的各管中，與參考例1同樣地，通過NASBA法對核酸進行擴增。另外，使用包含20個堿 基對的聚T序列作為陰性對照。核酸擴增時，經60分鐘測定每1份在485nm的激發光下 525nm的熒光，并對擴增的DNA進行經時檢測。其結果如圖5所示。圖5中，圖譜的縱軸表 示熒光強度，橫軸表示反應時間。圖5中，用各曲線的積分值表示由NASBA法得到的核酸擴 增產物(DNA)的總量。伴隨著提取RNA的拷貝數增加，觀察到核酸擴增產物的量也增加，還 觀察到在固定了固相DNA(+)引物的管中可以對具有靶特異性序列的RNA進行定量。實施例2[多種病原菌的檢測、定量]對于被認為患有肺炎的患者，為了對引起肺炎的菌進行檢測、定量，使用本發明的 靶RNA的檢測、定量方法。(固相引物的制備)將序列表中SEQ ID NO. 1表示的肺炎鏈球菌特異性堿基序列(#1)、SEQ ID NO. 2表 示的流感桿菌特異性堿基序列(#2)、SEQ ID NO. 3表示的肺炎支原體特異性堿基序列(#3)、 SEQ ID NO. 4表示的肺炎衣原體菌株特異性堿基序列(#4)、SEQ ID NO. 5表示的軍團桿菌特 異性堿基序列(#5)、SEQ ID NO. 6表示的肺炎桿菌特異性堿基序列(#6)、SEQ ID NO. 7表示 的綠膿桿菌特異性堿基序列(#7)、以及SEQ ID N0. 8表示的粘膜炎莫拉菌特異性堿基序列 (#8)作為具有與靶RNA的5’端靶特異性序列相對應DNA序列的引物，通過常用方法制作在 其5’末端導入氨基的引物，使用該引物制備固相DNA(+)引物。基板使用96孔的多孔板， 將上述8種的各引物溶解于固定用的點樣溶液中，制備0. 5 μ M濃度的DNA引物溶液。每種 弓丨物分配12個孔，將各引物溶液分別滴加到12個孔內后于80°C保溫1小時，將8種各引物 分別固定在12個孔內，作為#1 #8的多重固相DNA⑴弓丨物。
(液相嵌合引物的制備)
作為液相嵌合引物，將序列表中SEQ ID NO. 9表示的肺炎鏈球菌、流感桿菌、軍團 桿菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌、粘膜炎莫拉菌等菌特異性堿基序列，序列表中SEQ ID NO. 10表 示的肺炎支原體、或者肺炎衣原體等菌特異性堿基序列作為靶RNA的3’端序列，在含有與 它們互補的cDNA序列的引物的5，末端，附加SEQ ID NO. 14表示的標簽序列，再在標簽序 列的5’末端附加SEQ ID NO. 11表示的T7聚合酶的生物素標記的啟動子序列，制備液相嵌 合引物。(液相通用引物的制備)作為液相通用引物，在SEQ ID NO. 14表示的標簽序列的5，末端附加SEQ ID NO. 11 表示的T7聚合酶的生物素標記的啟動子序列，制備液相通用引物。然后，將流感桿菌、肺炎支原體和粘膜炎莫拉菌的RNA提取液懸浮在緩沖液(50mM Tris-HCl，ρΗ8· 3、6mM MgCl2、40mM KCl)中，分別制備含有該 RNA104、ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、108、IO9 拷 貝的溶液。在NASBA試劑專用Master Mix 10 μ 1 (Biomeru公司制)中混合0. 05 μ M液相 嵌合引物、2 μ M液相通用引物，95°C下加熱30秒。然后，在65°C下靜置5分鐘，向上述提取 RNA溶液中添加5 μ 1的IOmM DTT、40單位AMV逆轉錄酶、0. 4單位RNaseH、20單位T7RNA聚 合酶的酶混合液(Biomeru公司制)，制備終容量為20 μ 1的反應溶液。然后，在設定為41°C 的恒溫槽中設置基板使反應進行。反應開始后，每1份12分鐘依次使各反應停止，在#1 #8的各終反應液中使用鏈親和素_堿性磷酸酯酶作為生物素的基質，使用5-溴-4-氯-3 吲哚_磷酸和氯化4-氮藍四唑作為顯色物質進行顯色反應，觀察藍色。
權利要求
靶RNA的檢測、定量方法，其特征在于包括以下的(a)～(j)的工序(a)將含有與靶RNA的5’端靶特異性序列相對應的DNA序列的引物的5’末端固定在基板表面，制備固相DNA(+)引物的工序；(b)在含有與靶RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列，制備液相cDNA(-)引物的工序；(b’)根據需要，制備在標簽序列的5’末端附加RNA聚合酶啟動子序列的液相通用引物的工序；(c)制備含有靶RNA的3’端序列和5’端靶特異性序列的試樣RNA的工序；(d)使工序(b)中制備的液相cDNA(-)引物與工序(c)中制備的試樣RNA鏈在液相中接觸，使液相cDNA(-)引物與試樣RNA雜交，然后通過逆轉錄酶使DNA(-)鏈延長，制備cDNA鏈-RNA鏈復合體的工序；(e)使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于工序(d)中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備單鏈DNA(-)的工序；(f)使工序(e)中制備的單鏈DNA(-)與工序(a)中制備的固相DNA(+)引物在液相中接觸，使單鏈DNA(-)與固相DNA(+)引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶使DNA(+)鏈延長制備雙鏈DNA的工序；(g)使RNA聚合酶作用于工序(f)中制備的雙鏈DNA，利用來自DNA(-)鏈的RNA聚合酶啟動子序列使單鏈RNA(-)擴增，使擴增的單鏈RNA(-)與固相DNA(+)引物雜交，然后通過逆轉錄酶使DNA(+)鏈延長制備cDNA鏈-RNA鏈復合體的工序；(h)使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于工序(g)中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備固相單鏈DNA(+)的工序；(i)使工序(h)中制備的固相單鏈DNA(+)與工序(b)中制備的液相cDNA(-)引物或工序(b’)中制備的液相通用引物在液相中接觸，使單鏈DNA(+)與液相cDNA(-)引物或液相通用引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶使DNA(-)鏈延長，制備雙鏈DNA的工序；(j)對工序(f)和工序(i)中制備的雙鏈DNA進行定量的工序。
2.如權利要求1所述的檢測、定量方法，其特征在于重復兩次以上工序(g) 工序⑴。
3.如權利要求1或2所述的檢測、定量方法，其特征在于在同一反應液中進行工序 (d) 工序(j)。
4.如權利要求1 3中任一項所述的檢測、定量方法，其特征在于在同一基板上對多 個靶RNA進行檢測、定量。
5.如權利要求1 4中任一項所述的檢測、定量方法，其特征在于在工序(i)中使用 液相通用引物。
6.如權利要求5所述的檢測、定量方法，其特征在于液相通用引物的濃度為液相 cDNA㈠引物濃度的10倍以上。
7.如權利要求1 6中任一項所述的檢測、定量方法，其特征在于液相cDNA㈠弓丨物 是通過標簽序列，在含有與靶RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加 RNA聚合酶啟動子序列制成的液相嵌合引物。
8.如權利要求1 7中任一項所述的檢測、定量方法，其特征在于使用RNA聚合酶啟 動子序列是標記的啟動子序列的液相通用引物或液相嵌合引物。
9.如權利要求8所述的檢測、定量方法，其特征在于標記的啟動子序列是生物素標記 的啟動子序列。
10.如權利要求1 7中任一項所述的檢測、定量方法，其特征在于在標記試劑的存 在下進行工序(i)。
11.如權利要求10所述的RNA的檢測、定量方法，其特征在于標記試劑為熒光色素。
12.如權利要求1 11中任一項所述的檢測、定量方法，其特征在于使用逆轉錄酶作 為具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶。
13.如權利要求1 12中任一項所述的檢測、定量方法，其特征在于靶RNA為16SrRNA 中的菌特異性RNA鏈。
14.使用權利要求1 13中任一項所述的RNA的檢測、定量方法，對一種或多種病原微 生物進行檢測、定量的方法。
15.RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于具有將含有靶RNA的5’端靶特異性序列的 引物的5’末端固定在基板表面制成的固相DNA⑴引物、在含有與靶RNA的3’端序列互補 的cDNA序列的引物的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列制成的液相cDNA㈠引物、逆 轉錄酶、RNA聚合酶、特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶。
16.如權利要求15所述的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于液相cDNA(-)引物是 通過標簽序列，在含有與靶RNA的3’端序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附RNA聚 合酶啟動子序列制成的液相嵌合引物。
17.如權利要求15或16所述的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于還具有在標簽 序列的5’末端側附加RNA聚合酶啟動子序列制成的液相通用引物。
18.如權利要求16或17所述的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于RNA聚合酶啟動 子序列為標記的啟動子序列。
19.如權利要求18所述的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于標記的啟動子序列為 生物素標記的啟動子序列。
20.如權利要求15 17中任一項所述的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于還含 有標記試劑。
21.如權利要求20所述的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于標記試劑為熒光色素。
22.如權利要求15 21中任一項所述的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于還含 有DNA依賴性DNA聚合酶。
23.如權利要求15 22中任一項所述的RNA的檢測、定量試劑盒，其特征在于靶RNA 為16SrRNA中的菌特異性RNA鏈。
全文摘要
提供在對一種或多種病原微生物進行檢測、定量等情況下，可以從試樣中微量的RNA中簡便且迅速地檢測、定量靶RNA的方法或試劑盒。1)使用具有啟動子序列的液相引物和逆轉錄酶，由含有靶RNA的試樣合成cDNA，得到cDNA-RNA復合體；2)分解該復合體的RNA；3)通過上述2)得到的cDNA和上述固相引物，合成雙鏈DNA；4)由該雙鏈DNA合成RNA；5)通過上述4)得到的RNA和上述固相引物合成cDNA，得到cDNA-RNA復合體；6)分解上述5)得到的復合體的RNA；7)通過上述6)得到的cDNA和上述液相引物，合成雙鏈DNA；8)對上述3)和7)得到的雙鏈DNA進行定量。該方法可以在同一反應液中進行。
文檔編號C12Q1/68GK101835905SQ20088011305
公開日2010年9月15日 申請日期2008年11月4日 優先權日2007年11月1日
發明者橫山兼久, 白井睦訓, 福永肇, 藤原一彥, 藤本健太郎 申請人:國立大學法人山口大學