生產(chǎn)醇的工藝的制作方法

專利名稱：生產(chǎn)醇的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及提高通過氣體和/或溶解氣和/或糖類的微生物發(fā)酵來生產(chǎn) 產(chǎn)品的工藝效率的方法，具體地但不限于涉及通過包含一氧化碳的氣體物質(zhì)的微生物發(fā) 酵來生產(chǎn)乙醇的工藝。
背景技術(shù)：
乙醇正迅速成為全球主要的富氫液體運輸燃料。2005年全球乙醇消費量約為 122億加侖。預(yù)計燃料乙醇工業(yè)的全球市場在未來會繼續(xù)急劇增長，因為歐洲、日本、美 國和多個發(fā)展中國家對乙醇的需求增長。例如，在美國，乙醇用于生產(chǎn)E10，一種汽油中的10%乙醇混合物。在ElO混 合物中，乙醇成分作為補(bǔ)氧劑，以提高燃燒效率并降低空氣污染。在巴西，乙醇作為汽 油中混合的補(bǔ)氧劑或單獨作為純?nèi)剂蠞M足了約30%的運輸燃料需求。此外，在歐洲，溫 室氣體(GHG)排放后果的環(huán)境問題已促使歐盟(EU)為成員國制訂了消費可持續(xù)運輸燃 料例如生物乙醇的任務(wù)目標(biāo)。絕大多數(shù)燃料乙醇通過傳統(tǒng)的基于酵母的發(fā)酵工藝生產(chǎn)，所述工藝使用作物來 源的糖類，例如甘蔗中提取的蔗糖或谷物中提取的淀粉，作為主要碳源。然而，這些糖 類原料的成本受其作為人類糧食或動物飼料的價格影響，并且用于乙醇生產(chǎn)的產(chǎn)淀粉或 蔗糖作物的種植不能在所有地形上經(jīng)濟(jì)地持續(xù)。因此，需要開發(fā)將低成本和/或更充足 碳源轉(zhuǎn)化成燃料乙醇的技術(shù)。CO是有機(jī)材料例如煤炭或石油或石油衍生產(chǎn)品不完全燃燒產(chǎn)生的主要的免費 的富含能源的副產(chǎn)品。例如，據(jù)報道澳大利亞鋼鐵工業(yè)每年產(chǎn)生并向空氣中釋放超過 500,000 噸 COo催化工藝可用于將主要包含CO和/或CO和氫氣(H2)的氣體轉(zhuǎn)化為多種燃料 和化學(xué)品。微生物也可用于將這些氣體轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)品。這些生物進(jìn)程雖然通常比 化學(xué)反應(yīng)慢，但與催化工藝相比具有多個優(yōu)勢，包括更高的特異性、更高的產(chǎn)量、更低 的能量消耗和更大的耐毒性。微生物以CO作為唯一碳源生長的能力于1903年首次發(fā)現(xiàn)。這后來被確定為采 用自養(yǎng)生長的乙酰輔酶A(乙酰CoA)生化路徑(也稱為Woods-Ljungdahl路徑和一氧化 碳脫氫酶/乙酰輔酶A合成酶(CODH/ACS)路徑)的生物的一種特性。已經(jīng)表明，很 多厭氧生物包括一氧化碳營養(yǎng)生物、光合作用生物、產(chǎn)甲烷生物和產(chǎn)乙酸生物均將CO代 謝成多種最終產(chǎn)物，即C02、H2,甲烷、正丁醇、乙酸鹽和乙醇。當(dāng)使用CO作為唯一 碳源時，所有此類生物生產(chǎn)這些最終產(chǎn)物中的至少兩種。厭氧細(xì)菌，例如梭菌屬的細(xì)菌，已證實通過乙酰CoA生化路徑從CO、CO2> 和H2生產(chǎn)乙醇。例如，從氣體生產(chǎn)乙醇的Clostridium Ijungdahlii的多個菌株在WO 00/68407，EP 117309,美國專利 5,173,429、5,593,886 和 6,368,819，WO 98/00558 和 WO 02/08438中有描述。細(xì)菌菌種Clostridiumautoethanogenum也已知從氣體生產(chǎn)乙醇(Abrini等，Archives ofMicrobiologyl61, pp 345-351 (1994))。然而，微生物通過氣體發(fā)酵生產(chǎn)乙醇通常伴隨乙酸鹽和/或乙酸的副產(chǎn)品產(chǎn) 生。由于部分可用碳轉(zhuǎn)化為乙酸鹽和/或乙酸而不是乙醇，因此使用此類發(fā)酵工藝生產(chǎn) 乙醇的效率可能低于所需。此外，除非所述乙酸鹽和/或乙酸副產(chǎn)品可用于某種其它用途，否則其可能會 產(chǎn)生廢物處理問題。乙酸鹽和/或乙酸通過微生物轉(zhuǎn)化為甲烷，并因此有可能導(dǎo)致GHG 排放。W02007/117157描述了一種通過包含一氧化碳的氣體的厭氧發(fā)酵來生產(chǎn)醇尤其 是乙醇的工藝。作為所述發(fā)酵工藝副產(chǎn)品生成的乙酸鹽被轉(zhuǎn)化為氫氣和二氧化碳?xì)怏w， 該氫氣和/或二氧化碳可用于該厭氧發(fā)酵工藝。美國專利7,078,201和WO 02/08438也 描述了生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝，其改變了進(jìn)行發(fā)酵的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的多種條件(例如pH 和氧化還原電位)。可能考慮需要提供改進(jìn)的方法以控制或調(diào)節(jié)生產(chǎn)醇的發(fā)酵反應(yīng)的條件。本發(fā)明的一個目標(biāo)是滿足這種需要和/或為通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)醇提供改進(jìn)的 方法，或至少為公眾提供一種有用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明提供了一種通過包含CO的底物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵來生產(chǎn)一種 或多種醇的工藝，所述工藝包括(a)在生物反應(yīng)器中在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種菌株，并向該生物反應(yīng) 器供應(yīng)所述底物；(b)監(jiān)測所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的氧化還原電位；和(c)控制所述氧化還原電位以使其基本保持在醇生產(chǎn)的最佳范圍之內(nèi)。在某些實施方案中，所述工藝進(jìn)一步包括(a)監(jiān)測所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH ；和(b)控制pH以使其基本保持在最佳生長pH之上。在第二方面，本發(fā)明提供了一種通過包含CO的底物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵來生產(chǎn)一種 或多種醇的工藝，所述工藝包括(a)在生物反應(yīng)器中在最佳生長pH下在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種菌 株，和向該生物反應(yīng)器供應(yīng)所述底物以使微生物生長；(b)i)在需要的時間點調(diào)節(jié)所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH到最佳生長pH之上的水平 或范圍，或ii)在需要的時間點調(diào)節(jié)所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的氧化還原電位到最佳水平或范 圍；(c)監(jiān)測所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH和/或氧化還原電位；和(d)控制pH以使其基本保持在最佳生長pH之上，和/或控制氧化還原電位以使 其基本保持在最佳水平或范圍。在第三方面，本發(fā)明提供了一種通過乙酸鹽和包含CO的底物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵來 生產(chǎn)一種或多種醇的工藝，其中所述工藝包括(a)在第一生物反應(yīng)器中，發(fā)酵包含碳和能量源的底物以生產(chǎn)乙酸鹽；
(b)在第二生物反應(yīng)器中，在生物反應(yīng)器中在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種 厭氧細(xì)菌菌株，并向所述生物反應(yīng)器供應(yīng)由所述發(fā)酵(a)所生產(chǎn)的乙酸鹽和所述底物，其 中所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH和/或氧化還原電位保持在允許乙酸鹽和所述包含CO的底 物通過所述細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)一種或多種醇的水平。在每個所述方面的實施方案中，所述最佳氧化還原電位范圍約為-450 到 _550mV。在每個所述方面的實施方案中，pH保持在約5.7到約7.0。在每個所述方面的實施方案中，氧化還原電位通過下述方法中的一種或多種進(jìn) 行控制(a)加入一種或多種氧化劑，(b)加入一種或多種還原劑，(C)調(diào)節(jié) pH。在每個所述方面的實施方案中，所述還原劑為甲基紫精或半胱氨酸。在每個所述方面的實施方案中，pH通過加入酸和/或堿進(jìn)行控制或調(diào)節(jié)。在第四方面，本發(fā)明提供了一種提高發(fā)酵工藝效率的方法，所述方法包括(a)檢測所述發(fā)酵工藝中使用的微生物的細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位的變化；和(b)基于在步驟(a)中是否檢測到變化，控制所述發(fā)酵工藝的至少一個參數(shù)。在具體實施方案中，所述檢測變化的步驟(a)包括從生物反應(yīng)器中提取所述微生 物的樣品，其中所述發(fā)酵工藝是，至少部分是，在所述生物反應(yīng)器中進(jìn)行的。在某些實 施方案中，所述檢測變化的步驟(a)重復(fù)一次或多次以獲得多個測量數(shù)據(jù)，優(yōu)選地，在預(yù) 定間隔時間之后重復(fù)。需要注意的是，所述間隔時間對于具體工藝可以相同或不同，并 且對于不同工藝可以變化，這根據(jù)本公開對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。所控制的參數(shù)可包括下列參數(shù)中的任何一個或多個壓力、溫度、氣體流速、 液體流速、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)基氧化還原電位、攪拌速率、接種水平、最大氣體底物濃 度、最大產(chǎn)物濃度和產(chǎn)物回收的起始點。本領(lǐng)域已知的任何方法都可用于檢測細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位的變化。然而，在某 些實施方案中，提供了流式細(xì)胞術(shù)方法，其中將一種是細(xì)菌還原酶活性指示劑的試劑加 入到所述樣品中并然后滲入到所述細(xì)菌中。還原之后，所述試劑產(chǎn)生熒光信號，該熒光 信號根據(jù)細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位變化并可用流式細(xì)胞儀分析。在具體實施方案中，所述步驟(b)的控制包括，基于在步驟(a)中是否檢測到細(xì) 胞內(nèi)氧化還原電位的變化，確定是否改變所述發(fā)酵工藝的至少一個參數(shù)、和/或保持至 少一個參數(shù)在其當(dāng)前值、和/或基于步驟(a)的結(jié)果不采取行動改變參數(shù)。需要注意的是，當(dāng)基于步驟(a)的結(jié)果不采取行動時，根據(jù)本公開技術(shù)人員應(yīng)該 知道仍可進(jìn)行常規(guī)形式的控制和調(diào)節(jié)，例如保持pH在預(yù)定范圍內(nèi)。在具體實施方案中，所述發(fā)酵工藝通過一種或多種厭氧細(xì)菌菌株厭氧發(fā)酵包含 CO的底物生產(chǎn)乙酸鹽和/或一種或多種醇。在某些實施方案中，步驟(a)包含在生物反應(yīng)器中在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種 或多種厭氧細(xì)菌菌株，和向該生物反應(yīng)器供應(yīng)包含CO的氣體底物，并保持所述液體營養(yǎng) 培養(yǎng)基的pH和氧化還原電位在允許所述細(xì)菌生長并生產(chǎn)乙酸鹽的水平。
在某些實施方案中，所述確定步驟基于是否檢測到細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位升高。 另外地或替代性地，所述確定步驟可基于是否檢測到細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位降低。在檢測 到細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位降低的情況下，所述步驟(b)的控制可包括停止所述發(fā)酵工藝， 和/或向所述發(fā)酵罐的內(nèi)容物中加入微生物，和/或去除一部分所述發(fā)酵罐的所述內(nèi)容 物，和/或改變所述發(fā)酵工藝的一個或多個參數(shù)(參見上文所列)。在具體實施方案中，本發(fā)明的方法適合用于通過氣體尤其是包含一氧化碳的氣 體的厭氧發(fā)酵來生產(chǎn)醇尤其是乙醇和/或丁醇和/或異丙醇的工藝。然而，本發(fā)明不限 于此并可應(yīng)用于其它用途，包括需氧發(fā)酵，以及不含CO或只含少量CO (例如6% CO)的 底物的發(fā)酵，尤其是當(dāng)所述底物包含CO2和/或壓時。本發(fā)明的實施方案包括例如且不 限于糖類發(fā)酵，以及另外地或替代性地，生產(chǎn)酸(和/或其鹽)和/或H2。根據(jù)第五方面，本發(fā)明提供了進(jìn)行發(fā)酵工藝的發(fā)酵系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括(a)用于檢測所述發(fā)酵工藝中所使用的微生物的細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位變化的裝 置；和(b)用于基于是否通過所述檢測裝置檢測到變化來控制所述發(fā)酵工藝的至少一個 參數(shù)的裝置。所述系統(tǒng)可配置為進(jìn)行厭氧和/或需氧發(fā)酵工藝。在一種實施方案中，本發(fā)明 涉及厭氧發(fā)酵。每個不同方面的實施方案在發(fā)酵包含CO的底物來生產(chǎn)酸和/或醇中具有具體應(yīng) 用。在具體實施方案中，所述包含CO的底物為氣體。所述氣體底物可包含作為工業(yè)工藝 的副產(chǎn)品獲得的氣體。在某些實施方案中，所述工業(yè)工藝選自黑色金屬產(chǎn)品制造、有 色產(chǎn)品制造、石油精煉工藝、生物質(zhì)氣化、煤炭氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、 甲醇生產(chǎn)和焦炭生產(chǎn)。優(yōu)選地，所述氣體底物包含從鋼廠獲得的氣體。在每個不同方面的某些實施方案中，所述氣體底物包含以體積計15% CO到 100% CO,例如以體積計20%到95%，例如以體積計75% CO到95% CO，例如以體積計 80%到90% CO?？梢允褂酶偷腃O水平，例如6%，只要該底物也包含CO2和壓。 在每個不同方面的實施方案中，所述發(fā)酵工藝生產(chǎn)的醇為乙醇。所述發(fā)酵反應(yīng)還可生產(chǎn) 乙酸鹽和/或丁醇和/或異丙醇。在每個不同方面的具體實施方案中，所述發(fā)酵反應(yīng)通過一種或多種產(chǎn)乙酸 細(xì)菌的菌株進(jìn)行。在每個不同方面的實施方案中，所述厭氧的產(chǎn)乙酸細(xì)菌選自梭 菌(Clostridium)、穆爾氏菌(Moorella)、氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus)、產(chǎn)醋菌 (Acetogenium)、醋酸桿菌(Acetobacterium)、厭氧醋菌(Acetoanaerobium)、丁酸桿 菌(Butyribacterium)和Peptostreptococcus。 在具體實施方案中，所述產(chǎn)乙酸細(xì)菌為 Clostridium autoethanogenum 或 Clostridium carboxydivorans。雖然本發(fā)明如上面概括定義，本發(fā)明不限于此并還包括下面描述提供實施例的 實施方案。


本發(fā)明將詳細(xì)描述，并參考附圖，其中圖1為顯示Clostridium autoethanogenum典型生命周期的圖表；
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圖2為顯示以甲基紫精處理的培養(yǎng)物與未處理的培養(yǎng)物相比較其中RS陽性細(xì)胞 比例的變化對時間的作圖；圖3為顯示在最佳生長pH及升高的pH下Clostridium autoethanogenum的乙酸鹽
和乙醇產(chǎn)生對時間的作圖。發(fā)明的詳細(xì)描述以下為本發(fā)明的概括描述，包括本發(fā)明的多個實施方案。本發(fā)明在本文下述 標(biāo)題“實施例”之下的公開中進(jìn)一步說明，所述公開提供了關(guān)于產(chǎn)生、使用、和實施本 發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)，本發(fā)明的方面和實施方案的特定實施例，以及實施本發(fā)明的說明性方法。定義除非另有定義，本說明書中使用的下列術(shù)語如下定義術(shù)語“提高所述效率”、“提高效率”等等，當(dāng)與發(fā)酵過程相關(guān)時，包括但不 限于，提高下列各項中的一個或多個催化所述發(fā)酵的微生物的生長率、消耗單位體積 底物(例如一氧化碳)產(chǎn)生的所需產(chǎn)品(例如醇)體積、所需產(chǎn)品的生產(chǎn)率或生產(chǎn)水平、 以及生產(chǎn)的所需產(chǎn)品與所述發(fā)酵的其它副產(chǎn)品相比較的相對比例。術(shù)語“包含一氧化碳的底物”包括可存在于或引入發(fā)酵生物反應(yīng)器的任何包含 CO的固體、液體、或氣體材料。術(shù)語“共底物”系指不必然作為產(chǎn)物合成的主要能量和材料來源，但當(dāng)另外加 入另一種底物例如主要底物時可用于產(chǎn)物合成的底物。術(shù)語“乙酸鹽”既包括單獨的乙酸鹽，也包括分子或游離乙酸和乙酸鹽的混合 物，例如存在于本文所述的發(fā)酵液中的乙酸鹽和游離乙酸的混合物。所述發(fā)酵液中乙酸 與乙酸鹽的分子比例取決于所述系統(tǒng)的pH。術(shù)語“生物反應(yīng)器”包括任何由一個或多個容器和/或塔或管系組成的發(fā)酵 裝置，包括連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器(CSTR)、固定化細(xì)胞反應(yīng)器(ICR)、滴流床反應(yīng)器 (TBR)、鼓泡塔、氣舉發(fā)酵罐、靜止混合器、或適合氣-液接觸的其它容器或其它裝置。術(shù)語“最佳生長pH”等等包括促進(jìn)和/或支持細(xì)菌生長的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH 水平或pH范圍。應(yīng)理解最佳生長pH可以根據(jù)所使用的微生物和/或其它發(fā)酵條件而變 化。術(shù)語“最佳氧化還原電位”或“最佳ORP”等等包括促進(jìn)和/或支持醇生產(chǎn)的 液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的ORP水平或ORP范圍。應(yīng)理解最佳ORP可以根據(jù)所使用的微生物和 /或其它發(fā)酵條件而變化。術(shù)語“極限濃度”意為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中某種特定成分的初濃度，其足夠低 以確保其在所述發(fā)酵的某個階段耗盡。術(shù)語“碳捕獲”用于本文時系指從包含(02和/或CO的流中吸集碳化合物包 括CO2禾口 /或CO，以及(a)將所述CO2和/或CO轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品；或者(b)將所述CO2和/或CO轉(zhuǎn)化成適合長期儲存的物質(zhì)；或者(c)將所述CO2和/或CO捕獲進(jìn)適合長期儲存的物質(zhì)；或者這些過程的組合。
除非上下文另有需要，短語“發(fā)酵”、“發(fā)酵工藝”、或“發(fā)酵反應(yīng)”等等用 于本文時，傾向于包括涉及微生物生長和/或由微生物生物合成產(chǎn)物的工藝的生長期和 產(chǎn)物生物合成期。本發(fā)明總體涉及通過包含一氧化碳(CO)的氣體底物發(fā)酵生產(chǎn)醇的工藝。本發(fā) 明的方法還總體涉及碳捕獲的改進(jìn)，其中CO和任選的(02被轉(zhuǎn)化成有用的產(chǎn)品，即醇。本領(lǐng)域已知通過作為碳和能量源的包含CO的氣體底物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)醇的 工藝。這些發(fā)酵工藝除生產(chǎn)所需醇產(chǎn)物外，還可生產(chǎn)乙酸鹽作為副產(chǎn)品。因此，從CO 中可用碳轉(zhuǎn)化為所需醇產(chǎn)物的效率小于最佳。不受理論限制，在發(fā)酵工藝中通常有兩個代謝階段，產(chǎn)酸階段，其中所述 細(xì)菌生長并生產(chǎn)酸，和產(chǎn)溶劑階段，其中生產(chǎn)溶劑例如醇。舉例來說，在使用梭菌 (Clostridium)菌種生產(chǎn)溶劑的發(fā)酵工藝中，兩個代謝階段已知并如圖1所示。所述產(chǎn)乙 酸階段與細(xì)菌生長相關(guān)，在該階段梭菌(Clostridium)菌種生產(chǎn)例如H2、CO2和/或有機(jī) 酸，例如丁酸鹽和乙酸鹽。雖然溶劑例如醇可任選地在產(chǎn)乙酸階段生產(chǎn)，但其產(chǎn)量通常 微不足道。產(chǎn)乙酸階段之后是產(chǎn)溶劑階段，在該階段所述細(xì)胞的新陳代謝轉(zhuǎn)換為有利于溶 劑產(chǎn)生。典型地，在此階段有機(jī)酸產(chǎn)生和微生物生長減少或停止。對于所述細(xì)菌，優(yōu)選 的不同環(huán)境參數(shù)(例如所述培養(yǎng)基的pH、氧化還原電位等)取決于該細(xì)菌所處的階段。發(fā)明者驚人地發(fā)現(xiàn)，提高厭氧產(chǎn)乙酸細(xì)菌培養(yǎng)物的pH到最佳生長pH之上，同 時保持所述培養(yǎng)物的氧化還原電位在低水平(約-450mV或以下)，所述細(xì)菌生產(chǎn)醇和任 選的乙酸鹽。在此條件下，醇和任選的乙酸鹽以至少約1 1的摩爾比，優(yōu)選地以有利 于醇的摩爾比產(chǎn)生。在一具體實施方案中，醇與乙酸鹽的摩爾比約為1.4 1。另外， 所述細(xì)菌將至少一部分作為所述發(fā)酵副產(chǎn)品產(chǎn)生的乙酸鹽以比通常在該種發(fā)酵工藝中所 使用的低pH條件更高的比率轉(zhuǎn)化為乙醇。另外，還驚人地發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵工藝中，當(dāng)從產(chǎn)乙酸階段轉(zhuǎn)到產(chǎn)溶劑階段時，微 生物尤其是Clostridiumautoethanogenum的細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位顯著降低。因此，廣義來
講，本發(fā)明的某些方面涉及使用所述微生物的細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位的一種或多種指征檢 測發(fā)酵工藝中微生物的狀態(tài)或狀態(tài)變化。雖然以下描述集中于本發(fā)明的某些實施方案，即使用CO作為主要底物生產(chǎn)乙 醇，但是應(yīng)理解，與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員考慮到本公開可知道，本發(fā)明可應(yīng)用于 生產(chǎn)其它醇和使用其它底物。同樣地，雖然具體提到使用產(chǎn)乙酸細(xì)菌例如Clostridium autoethanogenum禾口 Clostridium carboxydivorans進(jìn)行發(fā)酵，但本發(fā)明也適用于在相同或不 同工藝中可用的其它微生物，包括可用于生產(chǎn)有用產(chǎn)品，包括但不限于丁醇的其它梭菌 (Clostridia)菌種。因此，在一方面，本發(fā)明涉及通過作為碳和能量源的包含CO氣體底 物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵來生產(chǎn)醇例如丁醇，例如正丁醇的工藝。本發(fā)明的工藝典型地涉及在包含液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)一種或多 種可從包含CO的氣體底物生產(chǎn)醇和任選的乙酸鹽的厭氧細(xì)菌菌株，以及向所述生物反應(yīng) 器供應(yīng)所述氣體底物。所述發(fā)酵生產(chǎn)一種或多種所需醇，通常也生產(chǎn)乙酸鹽。在一具體實施方案中，所述工藝包括控制所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的氧化還原電位 以使其保持在最佳水平或范圍，具體為約_450mV或更低，例如_450mV到約_550mV。在一具體實施方案中，所述工藝還包括控制所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH的步驟以使其保持 在升高的水平(即高于最佳生長pH)，具體為約5.7到約7.0，或約5.8到約6.5。在一具 體實施方案中，所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基保持在適宜的氧化還原條件下，或適宜的pH和氧化 還原條件下，持續(xù)至少一段時間足以允許所述細(xì)菌以至少為1 1的摩爾比或有利于醇的 更高比例生產(chǎn)一種或多種醇和任選的乙酸鹽。所述條件進(jìn)一步促進(jìn)所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基 中存在的任何乙酸鹽發(fā)酵成所需醇，例如乙醇或正丁醇。所述乙酸鹽向醇的轉(zhuǎn)化提高了 所述發(fā)酵工藝的乙醇產(chǎn)量，由此進(jìn)一步改進(jìn)了乙醇與乙酸鹽的比例。根據(jù)需要，所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的氧化還原電位可通過加入一種或多種適合的 還原劑或氧化劑進(jìn)行調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適于降低ORP的還原劑。然而，舉例 來說，亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、二氧化硫、氨、胼或還原氣體例如氫氣或甚至CO均可用 于降低ORP。在本發(fā)明的具體實施方案中，適合用于本發(fā)明工藝的還原劑包括甲基紫精 和半胱氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適于升高ORP的氧化劑，但是舉例來說，包括過氧化 氫、臭氧、二鹵化物(氯、溴或碘)、二氧化氯、高錳酸鉀、空氣或氧氣。本領(lǐng)域技術(shù)人 員還理解，還可通過分別升高或降低所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH來降低或升高ORP。例 如，理論水性體系的pH每升高IpH單位，ORP將降低59mV。所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH可根據(jù)需要通過加入一種或多種合適的pH調(diào)節(jié)劑或 緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，根據(jù)需要，堿例如NaOH和酸例如硫酸可用于分別升高或降低 pH。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用于調(diào)節(jié)所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基pH的酸和/或堿。本領(lǐng)域技術(shù)人員還理解，本發(fā)明的方法因而典型地涉及一個或多個測量所述發(fā) 酵培養(yǎng)基的pH和/或氧化還原電位的步驟。 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述生物反應(yīng)器包括用于連續(xù)地或間斷地測定液 體營養(yǎng)培養(yǎng)基pH和/或ORP的裝置。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解用于監(jiān)測這些參數(shù)的合適裝 置或傳感器，但是舉例來說，通過將ORP探針浸入所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基可連續(xù)地或間斷 地監(jiān)測ORP。相似地，通過將pH探針浸入所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基可監(jiān)測pH。所述pH和/或ORP測定裝置提供的反饋允許監(jiān)測所述生物反應(yīng)器中的條件。 所述反應(yīng)器中的條件可根據(jù)所述反饋或其它的結(jié)果通過改變特定的參數(shù)或加入特定的試 劑控制?？赏ㄟ^向所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基加入還原劑或氧化劑控制ORP。例如，如果ORP 升高或降低高于或低于最佳ORP，可向所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基加入還原劑或氧化劑以保持 所述培養(yǎng)基在最佳ORP范圍內(nèi)。或者，可通過向所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基插入電極控制ORP 以保持或達(dá)到所需ORP。相似地，也可控制pH。例如，如果pH升高高于或降低低于所需pH范圍，可 向所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基加入酸或堿以保持所述培養(yǎng)基在所需pH范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，所述氧化或還原劑或者酸或堿可根據(jù)與最佳條件的差異 人工加入。例如，可激活一種或多種警報以提醒操作員需要加入某種試劑。然而，在某 些實施方案中，連續(xù)地或間斷地監(jiān)測pH和/或ORP，并且根據(jù)與最佳條件的差異自動加 入合適的試劑。例如，pH和/或ORP探針向監(jiān)測所述生物反應(yīng)器條件的中央處理器提供 反饋。如果ORP升高高于預(yù)定閾值，所述處理器將啟動導(dǎo)入還原劑直到保持所需ORP。 可替換地或另外地，如果pH降低低于預(yù)定閾值，則所述處理器啟動導(dǎo)入堿直到保持所需pH。在本發(fā)明的一種實施方案中，連續(xù)地監(jiān)測并隨后保持pH和ORP在所需范圍已可 連續(xù)生產(chǎn)乙醇超過9天。預(yù)計以這種方式監(jiān)測并保持液體營養(yǎng)培養(yǎng)基條件將會連續(xù)生產(chǎn) 醇數(shù)周或數(shù)月。在另一方面，本發(fā)明涉及使用微生物的細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位的一種或多種指征 檢測發(fā)酵工藝中微生物的狀態(tài)或狀態(tài)變化。細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位很大程度上與所述液體 營養(yǎng)培養(yǎng)基的ORP無關(guān)，并可用作生物反應(yīng)器中的微生物群的生存力和/或狀態(tài)的間接 量度。基于所檢測的狀態(tài)，可控制容納所述微生物的生物反應(yīng)器的條件以根據(jù)所檢測的 狀態(tài)優(yōu)化所述條件，由此提高所述工藝的效率。例如，就產(chǎn)乙酸微生物來說，如果檢測 到所述微生物在生長或產(chǎn)乙酸階段，可控制參數(shù)以利于最佳生長?；蛘?，如果微生物在 產(chǎn)醇或產(chǎn)溶劑階段，則可為醇生產(chǎn)優(yōu)化條件。例如，在產(chǎn)醇階段，可保持pH和/或ORP 在最佳范圍內(nèi)以促進(jìn)醇生產(chǎn)。在此類工藝中非常需要優(yōu)化生物反應(yīng)器條件。具體地，在商業(yè)工藝，例 如從包含CO的氣體生產(chǎn)乙醇中，非常需要更快速地積累細(xì)菌細(xì)胞生物量，例如 C.autoethanogenum。這是因為細(xì)菌生物量積累的提高可以縮短發(fā)酵工藝中細(xì)菌濃度達(dá)到 一定細(xì)菌細(xì)胞密度所需的時間，這使單位體積輸入氣體、單位體積反應(yīng)器培養(yǎng)基的工藝 生產(chǎn)率最大化。該時間縮短關(guān)系到運營成本的降低和非生產(chǎn)停機(jī)時間的減少?；蛘?，或除上述之外，生物反應(yīng)器條件的優(yōu)化包含基于是否檢測到細(xì)胞內(nèi)氧化 還原電位的變化，確定是否改變所述發(fā)酵工藝的至少一個參數(shù)、和/或保持至少一個參 數(shù)在其當(dāng)前值、和/或基于步驟(a)的結(jié)果不采取行動改變參數(shù)。所控制的參數(shù)可包含下列參數(shù)中的任何一個或多個壓力、溫度、氣體流速、 液體流速、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)基氧化還原電位、攪拌速率、接種水平、最大氣體底物濃 度、最大產(chǎn)物濃度、和產(chǎn)物回收的開始或停止。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，從生物反應(yīng)器中提取微生物樣品并檢測其 細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位是否有變化?？墒褂萌魏我阎椒z測所述微生物的細(xì)胞內(nèi)氧化還 原電位，包括涉及使用分光光度計的方法。優(yōu)選地每隔一定間隔取樣，盡管所述間隔可 根據(jù)具體反應(yīng)的已知特性有所變化。例如，如果已知某種微生物具有最短生長期，則在 起始階段少取樣或不取樣，隨后階段定期取樣直到檢測到變化。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位 出現(xiàn)顯著變化時，就有可能得出其狀態(tài)，并使用這一信息優(yōu)化所述微生物的條件?？赏ㄟ^測定氧化還原對的濃度來分析細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，所述氧化還原對例 如NAD+/NADH、NADP+/NADPH、和胱氨酸/半胱氨酸、以及谷胱甘肽和金屬酶的氧 化和還原形式。用于完成此類測定的工具包括使用熒光(流式細(xì)胞術(shù)、顯微術(shù)和熒光測 定)、色度學(xué)測定、放射性同位素標(biāo)記、和磁共振成像。在本發(fā)明的一種特定的實施方案中，流式細(xì)胞術(shù)用于檢測從所述生物反應(yīng)器提 取的細(xì)菌樣品的還原酶活性。可使用任何已知的細(xì)菌還原酶活性指征。然而，舉例來 說，RedoxSensor Green試劑(RS)是用于本發(fā)明的某些實施方案的合適的細(xì)菌還原酶活 性指征。因而，還原酶活性是電子傳遞鏈功能變化的可靠標(biāo)記。還原之后，RS將在10 分鐘內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的綠色熒光信號。當(dāng)細(xì)胞用打斷電子傳遞的試劑例如疊氮化鈉、或羰基 氰化氯苯腙處理時，染色強(qiáng)度會變化。
發(fā)酵本發(fā)明具體地適用于改進(jìn)從包含CO的底物生產(chǎn)乙醇和/或其它醇例如丁醇和/ 或異丙醇。在具體實施方案中，所述包含CO的底物為氣體。所述氣體底物可以是作為 工業(yè)工藝副產(chǎn)品獲得的包含CO的廢氣。本發(fā)明的方面也適用于生產(chǎn)多種類型的酸和/ 或醇的反應(yīng)。例如，通過梭菌(Clostridia)菌種例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、 C.bejerenkii、和C.saccarolyticum生產(chǎn)丁酸鹽、乙酸鹽、丁醇、丙酮、乙醇或異丙醇，包 括在纖維素、水解纖維素、淀粉、水解淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、 甘油和乳糖上發(fā)酵來生產(chǎn)。已知從氣體底物(例如上述氣體底物)生產(chǎn)乙醇和其它醇的工藝。示范性工藝 包括例如 W02007/117157 和 US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722、 和US 5,821,111所述的工藝。已知很多厭氧細(xì)菌可進(jìn)行從CO生產(chǎn)醇包括正丁醇和乙醇、以及乙酸的發(fā)酵，并 適用于本發(fā)明的工藝。適用于本發(fā)明的此類細(xì)菌的示例包括梭菌屬的細(xì)菌，例如Clostridiumljungdahlii 菌株，包括 WO 00/68407，EP 117309,美國專利 5,173,429、5,593,886、和 6,368,819， WO 98/00558 和 WO 02/08438 所述的細(xì)菌；Clostridiumautoethanogehum (Abrini 等， Archives of Microbiology 161 pp 345-351)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇 梭菌(Clostridiumacetobutylicum)禾口熱醋梭菌(Clostridium thermoaceticum)。其它有用的 細(xì)菌包括凱伍產(chǎn)醋菌(Acetogenium kivui)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)、潮濕 厭氧醋菌(Acetoanaerobiumnoterae)、食甲基丁酸桿菌(Butyribacteriummethylotrophicum) 和Peptostreptococcus productus。其它合適的細(xì)菌包括穆爾氏菌(Moorella)屬的細(xì)菌，包 括 Moorella 菌種 HUC22-1，(Sakai 等，Biotechnology Letters 29 ppl607_1612)，以及氧 化碳嗜熱菌(Carboxydothermus)屬的細(xì)菌(Svetlichny，V.Α., Sokolova, T.G.等(1991)， Systematic and Applied Microbiology 14 254-260)。另夕卜，其它厭氧細(xì)菌，尤其是產(chǎn)乙酸 細(xì)菌，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇用于本發(fā)明的工藝。應(yīng)該理解，兩種或多種細(xì)菌的混合 培養(yǎng)物可用于本發(fā)明的工藝。適用于本發(fā)明的一種示例性微生物為Clostridium autoethanogenum。在一種實施 方案中，所述Clostridium autoethanogenum為具有以鑒別保存編號19630存放于德國生物 材料資源中心(DSMZ)的菌株的鑒別特征的Clostridiumautoethifflogenum。在另一種實施 方案中，所述Clostridium autoethanogenum為具有DSMZ保存編號DSMZ 10061的鑒別特 征的 Clostridiumautoethanogenum。 另一禾中合適的微生物為 Clostridium carboxydivorans， 可購自DSMZ并具有15243的鑒別特征。培養(yǎng)本發(fā)明的方法中使用的細(xì)菌可使用任何本領(lǐng)域已知的用于用厭氧細(xì)菌培養(yǎng) 和發(fā)酵底物的任何工藝進(jìn)行。示例性技術(shù)在下面實施例章節(jié)中提供。進(jìn)一步舉例說明， 可使用下述使用氣體底物發(fā)酵的文章中一般描述的工藝K.T.Klasson，M.D.Ackerson, E.C.Clausen 禾口 J丄 Gaddy (1991) .Bioreactorsfor synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5 ； 145-165 ； K.T.Klasson, M.D.Ackerson, E.C.Clausen 禾口 J丄 Gaddy (1991) .Bioreactordesign for synthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614 ； K.T.Klasson, M.D.Ackerson, E.C.Clausen 禾口 J.L Gaddy (1992) .Bioconversionof synthesis gas intoliquid or gaseous fuels.Enzyme and Microbial Technology. 14 ； 602-608 ； J.L Vega, G.M.Antorrena, E.C.Clausen 禾Π J.L Gaddy (1989) .Study ofGaseous SubstrateFermentation Carbon Monoxide Conversion to Acetate.2.Continuous Culture. Biotech.Bioeng.34.6.785—793 ； J.L Vega， E.C.Clausen 禾口 J.L.Gaddy (1989) .Study of gaseous substrate fermentations Carbon monoxide conversion to acetate. 1.Batch culture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784 ； 以及 J.LVega，E.C.Clausen 禾Π IL Gaddy (1990). Design of Bioreactors for CoalSynthesis Gas Fermentations.Resources, Conservation and Recycling.3.149-160。所述發(fā)酵可在任何合適的生物反應(yīng)器中進(jìn)行，例如連續(xù)攪拌釜式反 應(yīng)器(CSTR)、固定化細(xì)胞反應(yīng)器、氣舉反應(yīng)器、鼓泡塔反應(yīng)器(BCR)或滴流床反應(yīng)器 (TBR)。如上所述，所述發(fā)酵反應(yīng)的碳源為包含CO的底物。在具體實施方案中，所述 包含CO的底物為氣體。所述氣體底物可以是作為工業(yè)工藝副產(chǎn)品獲得的包含CO的廢 氣，或來自某種其它來源，例如來自汽車排出的廢氣。在某些實施方案中，所述工業(yè)工 藝選自黑色金屬產(chǎn)品制造例如鋼廠、有色產(chǎn)品制造、石油精煉工藝、煤炭氣化、電力 生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)、甲醇裂化和焦炭生產(chǎn)。在這些實施方案中，所述 包含CO的氣體可使用任何方便的方法在其排放到空氣中之前從所述工業(yè)工藝中捕獲。取 決于所述包含CO的氣體底物的成分，可能還需要在將其引入所述發(fā)酵之前進(jìn)行處理以去 除任何不需要的雜質(zhì)，例如灰塵顆粒。例如，可使用已知的方法過濾或凈化所述氣體底 物?；蛘?，所述包含CO的氣體底物可來源于生物質(zhì)氣化。所述氣化工藝涉及在有 限供應(yīng)的空氣或氧氣中不完全燃燒生物質(zhì)。所得氣體典型地主要包含CO和H2,以及極 少量的co2、甲烷、乙烯和乙烷。例如，可氣化在食品提取和加工中獲得的生物質(zhì)副產(chǎn) 品，例如來自甘蔗的糖、或者來自玉米或谷物的淀粉、或者通過森林工業(yè)產(chǎn)生的非食物 生物質(zhì)廢料，以生產(chǎn)適合用于本發(fā)明的包含CO的氣體。所述包含CO的氣體底物理想地包含顯著比例的CO，例如以體積計至少約70 % 到約95% CO。然而，CO比例可以以體積計為約15%到約100% CO、以體積計約20% 到約95 % CO、以體積計約40 %到約95 % CO、以體積計約60 %到約90 % CO和以體積計 約70%到約90% CO。在一實施方案中，所述氣體底物包含以體積計約80% CO。如果 壓和(02也存在，所述含量可能低于15%，例如6%。例如，涉及使用生物質(zhì)合成氣的 本發(fā)明的應(yīng)用可以包含約20%或更少的CO。雖然所述氣體底物不必然包含任何氫氣， 但根據(jù)本發(fā)明的方法，氫氣的存在一般對產(chǎn)品形成無害。然而，在本發(fā)明的某些實施方 案中，所述氣體底物基本不含氫氣(少于1%)。所述氣體底物也可包含一些CO2,例如 以體積計約到約30%，例如約5%到約10% CO2。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述包含CO的底物源于含碳廢料，例如工業(yè)廢 氣，或源于其它廢料的氣化。在這種情況下，本發(fā)明的方法代表了捕獲會以各種方式排 放到環(huán)境中的碳的有效工藝。在某些實施方案中，所述方法提供了通過轉(zhuǎn)化為有用產(chǎn)品 例如醇的捕獲CO和任選的CO2的改進(jìn)工藝。典型地，一氧化碳將以氣體形態(tài)加入到所述發(fā)酵反應(yīng)中。然而，本發(fā)明的方法 不限于以這種形態(tài)加入底物。例如，一氧化碳可以以液體形式提供。例如，液體可用包含一氧化碳的氣體飽和，并將該液體加入到所述生物反應(yīng)器中。這可使用標(biāo)準(zhǔn)方法實 現(xiàn)。 例如，微泡分布發(fā)生器(Hensirisak 等，Scale~upof microbubble dispersion generator for aerobic fermentation ； AppliedBiochemistrv and BiotechnoloRv Volume 101，Number 3/ October, 2002)可用于該目的。考慮到本公開應(yīng)理解，為了使所述細(xì)菌生長并使CO到 乙醇的發(fā)酵發(fā)生，除所述包含CO的底物氣體以外，還需要向所述生物反應(yīng)器供應(yīng)合適的 液體營養(yǎng)培養(yǎng)基。營養(yǎng)培養(yǎng)基包含足以允許使用的微生物生長的維生素和礦物質(zhì)。本領(lǐng) 域已知適合使用CO作為唯一碳源的乙醇發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)基。例如，上文所述的美國專 利5,173,429和5,593,886以及WO 02/08438所述的合適培養(yǎng)基。所述發(fā)酵應(yīng)在適合CO到乙醇發(fā)酵發(fā)生的條件下進(jìn)行。除保持pH和氧化還原電 位在上文所述的范圍內(nèi)足夠時間以生產(chǎn)醇和/或允許乙酸鹽副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為乙醇發(fā)生外， 其它應(yīng)考慮并可監(jiān)測和控制的反應(yīng)條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、攪拌速 率(如果使用連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器)、和接種水平、以及最大產(chǎn)物濃度(例如，為了防止 產(chǎn)物抑制)。最佳反應(yīng)條件部分取決于使用的具體微生物。然而，一般來說，在高于環(huán)境壓 力的壓力下進(jìn)行所述發(fā)酵可能是有利的。在升高的壓力下進(jìn)行可顯著增加CO從氣相轉(zhuǎn) 化為液相的比率，在液相中CO可被所述微生物作為碳源吸收用于生產(chǎn)乙醇。因而，這 意味著當(dāng)生物反應(yīng)器保持在升高的壓力下而不是大氣壓下時可縮短保持時間(定義為生 物反應(yīng)器中的液體體積除以輸入氣體流速)。此外，因為給定的CO到乙醇轉(zhuǎn)化率部分上是底物保持時間的函數(shù)，并且達(dá)到所 需保持時間決定了需要的生物反應(yīng)器容積，使用耐壓系統(tǒng)可大大減少需要的生物反應(yīng)器 容積，并因而減少發(fā)酵設(shè)備的資本成本。根據(jù)美國專利5,593,886提供的實施例，反應(yīng)器 容積減少與反應(yīng)器運行壓力增加呈線性比例，即在10個大氣壓下運行的生物反應(yīng)器只需 要在1個大氣壓下運行的生物反應(yīng)器容積的十分之一。其它文章也描述了在升高的壓力下進(jìn)行氣體到乙醇發(fā)酵的益處。例如，WO 02/08438描述了在30psig和75psig壓力下進(jìn)行氣體到乙醇發(fā)酵，所得乙醇產(chǎn)率分別為 150g/l/日和369g/l/日。然而，使用相同培養(yǎng)基和輸入氣體成分在大氣壓下進(jìn)行的示例 發(fā)酵發(fā)現(xiàn)每升每天生產(chǎn)的乙醇少10到20倍。還需要包含CO的底物的引入速率可確保 液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中CO的濃度不產(chǎn)生限制。這是因為CO受限條件的后果可能是醇產(chǎn)品被 培養(yǎng)物消耗。醇回收在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明上述的發(fā)酵工藝可在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生包 含一種或多種醇例如乙醇以及細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵液。在本發(fā)明的一種實施方案中，乙醇 是所述發(fā)酵的優(yōu)選的所需終產(chǎn)物。所述乙醇可通過本領(lǐng)域已知的方法從所述發(fā)酵液中回 收，例如分餾或蒸發(fā)，以及萃取發(fā)酵。從發(fā)酵液蒸餾乙醇可產(chǎn)生乙醇和水的共沸混合物(即95%乙醇和5%水)。然后 可通過使用本領(lǐng)域熟知的分子篩乙醇脫水技術(shù)獲得無水乙醇。萃取發(fā)酵過程涉及使用對發(fā)酵微生物具有低毒性風(fēng)險的水溶性溶劑以從稀釋的 發(fā)酵液中回收乙醇。例如，油醇可在此類萃取工藝中用作溶劑。不斷地將油醇加入到發(fā) 酵罐，然后該溶劑上升到所述發(fā)酵罐頂部形成一層，不斷萃取該層并輸出通過離心機(jī)。
14然后水和細(xì)胞很容易地與所述油醇分離并將其返回所述發(fā)酵罐，而將包含乙醇的溶劑輸 出到閃蒸單元。大部分所述乙醇被蒸發(fā)并濃縮，而所述油醇是不揮發(fā)的，將其回收用于 所述發(fā)酵的再次使用。培養(yǎng)基條件調(diào)節(jié)在具體實施方案中，本發(fā)明的工藝在單個生物反應(yīng)器中進(jìn)行，并且調(diào)節(jié)液體營 養(yǎng)培養(yǎng)基的pH和/或氧化還原電位以允許使用包含CO的氣體的細(xì)菌培養(yǎng)物的代謝活動 在多種狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。如上所述，連續(xù)地或間斷地監(jiān)測并保持pH和/或ORP在所需范 圍內(nèi)會促進(jìn)醇生產(chǎn)。因此，在某些實施方案中，所述工藝涉及使所述細(xì)菌培養(yǎng)物在生長 期和醇生產(chǎn)期之間轉(zhuǎn)換，在生長期微生物生長和/或乙酸鹽生產(chǎn)得到促進(jìn)，在醇生產(chǎn)期 從乙酸鹽和/或包含CO的底物生產(chǎn)醇。在具體實施方案中，所述培養(yǎng)物在下列狀態(tài)之 間轉(zhuǎn)換(1)生長和乙酸鹽生產(chǎn)。在一種實施方案中，所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH保持 在約5.0到約5.7范圍內(nèi)，并且氧化還原電位為約_450mV或更高，例如約_400mV到 約 _250mV。(2)從乙酸鹽和/或包含CO的氣體生產(chǎn)乙醇。在一種實施方案中，所述液體營 養(yǎng)培養(yǎng)基的pH保持在約5.8到約6.5范圍內(nèi)，并且氧化還原電位為約-450mV或更低。所 述培養(yǎng)基保持在這些條件下足夠時間以允許所述細(xì)菌以至少約11的有利于乙醇的比例 生產(chǎn)乙醇和任選的乙酸鹽，和/或?qū)⒌谝环N狀態(tài)(1)中生產(chǎn)的待轉(zhuǎn)化乙酸鹽轉(zhuǎn)化為乙醇。如上所述，可使用pH調(diào)節(jié)劑、氧化劑和還原劑根據(jù)需要調(diào)節(jié)所述液體營養(yǎng)培養(yǎng) 基的pH和/或氧化還原電位，以使所述細(xì)菌培養(yǎng)物的代謝活動在上述狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。二階段發(fā)酵在另一方面，本發(fā)明涉及通過乙酸鹽和包含CO的氣體底物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵來生 產(chǎn)一種或多種醇例如乙醇的工藝。所述工藝涉及在生物反應(yīng)器中以液體營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng) 一種或多種厭氧細(xì)菌菌株，和向所述生物反應(yīng)器中提供外源乙酸鹽和所述氣體底物。所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH和氧化還原電位保持在允許加入的乙酸鹽和所述氣體 底物均通過所述細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)一種或多種醇的水平。在多種實施方案中，pH和氧化還原 電位分別保持在約5.0到約7.0和等于或低于約-450mV范圍內(nèi)，以允許所述細(xì)菌將加入 的乙酸鹽(以及在所述CO到醇發(fā)酵中生產(chǎn)的任何乙酸鹽)轉(zhuǎn)化為醇。此工藝可方便地涉及在分開的生物反應(yīng)器中進(jìn)行的兩個發(fā)酵。在此類實施方案 中，所述工藝包括用于從合適的碳和能量源生產(chǎn)乙酸的第一階段發(fā)酵。在多種實施方案 中，所述第一階段發(fā)酵涉及將包含CO的氣體底物轉(zhuǎn)化為乙酸鹽，其使用的厭氧產(chǎn)乙酸細(xì) 菌選自例如上文所述的適合所述CO到醇發(fā)酵的細(xì)菌。所述第一階段發(fā)酵的培養(yǎng)基條件 對于細(xì)菌生長和乙酸生產(chǎn)應(yīng)該是最優(yōu)的。在此實施方案中，所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH保 持在約5.0到約5.7范圍內(nèi)，并且氧化還原電位為約_450mV或更高，例如約_400mV到 約-250mV。所述乙酸鹽產(chǎn)物從所述第一階段發(fā)酵中回收并與包含CO的氣體共同引入到 第二生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器的條件對于通過一種或多種適于將乙酸鹽轉(zhuǎn)化為醇的微生物 從乙酸鹽和/或包含CO的氣體生產(chǎn)乙醇是最優(yōu)的。所述第二個發(fā)酵罐中液體的pH保持 在最佳生長pH之上，并且ORP保持在約-450mV以下。在一具體實施方案中，所述液 體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH保持在約5.8到約6.5范圍內(nèi)，并且氧化還原電位在約-450mV或更
15低。乙酸鹽回收可使用本領(lǐng)域已知的方法從第一階段發(fā)酵生物反應(yīng)器中連續(xù)回收乙酸鹽。這些 方法包括但不限于，蒸餾、使用可滲透酸和/或乙酸鹽選擇性膜、和/或使用吸附柱。例如，可使用包括活性炭過濾器的吸附系統(tǒng)。在本發(fā)明的此實施方案中，首先 使用合適的分離裝置從發(fā)酵液中去除細(xì)菌細(xì)胞。本領(lǐng)域已知多種基于過濾的用于產(chǎn)品回 收的產(chǎn)生無細(xì)胞發(fā)酵液的方法。然后將所述無細(xì)胞包含乙酸鹽的滲透液通過包含活性炭 的柱以吸附所述乙酸鹽。乙酸鹽的酸形式(乙酸)比鹽(乙酸鹽)形式更容易被活性炭 吸附。因此在通過所述活性炭柱之前所述發(fā)酵液(培養(yǎng)基)的pH通常地降低到約3以 下，以將大部分所述乙酸鹽轉(zhuǎn)化為乙酸形式。吸附到所述活性炭的乙酸可使用本領(lǐng)域已知的方法通過洗脫回收。例如，可使 用乙醇洗脫結(jié)合的乙酸鹽。因為乙醇的沸點為78.8°C，乙酸的沸點為107°C，乙醇和乙酸 鹽可使用基于揮發(fā)性的方法例如蒸餾容易地相互分離。在本發(fā)明的某些實施方案中，通過如下步驟從所述發(fā)酵液中回收乙酸鹽不斷 地從所述發(fā)酵生物反應(yīng)器中移出一部分發(fā)酵液，從該發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞(方便地 通過過濾)，和從該發(fā)酵液中回收乙酸鹽?？墒褂蒙鲜龇椒ㄍㄟ^活性炭吸附回收所述乙酸 鹽。然后所述分離的微生物細(xì)胞可返回到所述發(fā)酵生物反應(yīng)器。去除乙酸鹽后剩余的無 細(xì)胞滲透液也通常地返回到所述發(fā)酵生物反應(yīng)器。在返回到所述生物反應(yīng)器之前，所述 無細(xì)胞滲透液中可加入另外的營養(yǎng)物(例如維生素B)以補(bǔ)充所述培養(yǎng)基。此外，如果所 述發(fā)酵液的pH如上文所述被調(diào)節(jié)以增強(qiáng)乙酸的活性炭吸附，在返回到所述生物反應(yīng)器之 前，重新調(diào)節(jié)pH到與所述發(fā)酵生物反應(yīng)器中發(fā)酵液pH相近的pH。本發(fā)明現(xiàn)將參考下 述非限制性實驗章節(jié)詳細(xì)說明。
實施例材料與方法培養(yǎng)基* 在 H2O (IL)中混合 NaH2PO4 (13.2g)和 Na2HPO2 · 7H20 (l.lg)。
權(quán)利要求
1.一種通過包含CO的底物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵來生產(chǎn)一種或多種醇的工藝，該工藝包括(a)在生物反應(yīng)器中在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種菌株，和向該生物反應(yīng)器供 應(yīng)所述底物；(b)監(jiān)測所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的氧化還原電位；和(c)控制所述氧化還原電位以使其基本保持在醇生產(chǎn)的最佳范圍之內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中該工藝進(jìn)一步包括(a)監(jiān)測所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH；和(b)控制所述pH以使其基本保持在最佳生長pH之上。
3.—種通過包含CO的底物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵來生產(chǎn)一種或多種醇的工藝，該工藝包括(a)在生物反應(yīng)器中在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中在最佳生長pH下培養(yǎng)一種或多種菌株，和 向該生物反應(yīng)器供應(yīng)所述底物以促進(jìn)微生物生長；(b)i)在需要的時間點調(diào)節(jié)所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH到最佳生長pH之上的水平或 范圍，或者ii)在需要的時間點調(diào)節(jié)所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的氧化還原電位到最佳水平或范 圍；(c)監(jiān)測所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的所述pH和/或氧化還原電位；和(d)控制所述pH以使其基本保持在最佳生長pH之上，和/或控制所述氧化還原電位 以使其基本保持在最佳水平或范圍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項所述的工藝，其中所述最佳氧化還原電位范圍為 約-450 到約-550mV。
5.根據(jù)權(quán)利要求2到4中任一項所述的工藝，其中所述pH保持為約5.7到約7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項所述的工藝，其中所述氧化還原電位通過下述方法中 的一種或多種進(jìn)行控制(a)加入一種或多種氧化劑，(b)加入一種或多種還原劑，(c)調(diào)節(jié)pH。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工藝，其中所述還原劑為甲基紫精或半胱氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求2到7中任一項所述的工藝，其中所述pH通過加入酸和/或堿進(jìn)行 控制或調(diào)節(jié)。
9.一種通過乙酸鹽和包含CO的底物的厭氧細(xì)菌發(fā)酵來生產(chǎn)一種或多種醇的工藝，其 中該工藝包括(a)在第一生物反應(yīng)器中，發(fā)酵包含碳和能量源的底物以生產(chǎn)乙酸鹽；(b)在第二生物反應(yīng)器中，在生物反應(yīng)器中在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種厭氧 細(xì)菌菌株，并向所述生物反應(yīng)器供應(yīng)所述發(fā)酵(a)生產(chǎn)的乙酸鹽和所述包含CO的底物， 其中所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH和/或氧化還原電位保持在允許乙酸鹽和所述包含CO的 底物通過所述細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)一種或多種醇的水平。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項所述的工藝，其中所述工藝進(jìn)一步包括向?qū)⒁宜猁} 導(dǎo)入所述生物反應(yīng)器。
11.一種提高發(fā)酵工藝效率的方法，該方法包括(a)檢測所述發(fā)酵工藝中使用的微生物的細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位的變化；和(b)基于在步驟(a)中是否檢測到變化，控制所述發(fā)酵工藝的至少一個參數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述檢測變化的步驟(a)包括從生物反應(yīng)器中 移除所述微生物的樣品，其中所述發(fā)酵工藝至少部分在該生物反應(yīng)器中進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述步驟(b)的控制包括，基于在步驟 (a)中是否檢測到細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位的變化，確定是否改變所述發(fā)酵工藝的至少一個參 數(shù)、和/或保持至少一個參數(shù)在其當(dāng)前值、和/或基于步驟(a)的結(jié)果不采取行動來改變 參數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一項所述的方法，其中所述發(fā)酵工藝通過一種或多種 產(chǎn)乙酸細(xì)菌菌株厭氧發(fā)酵包含CO的底物生產(chǎn)乙酸鹽和/或一種或多種醇。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一項所述的工藝，或根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其 中所述包含CO的底物為氣體底物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的工藝或方法，其中所述包含CO的底物包含以體積計至少 約 15%到約 100% COo
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的工藝或方法，其中所述包含CO的底物包含以體積 計至少約70%到約95% CO。
18.根據(jù)權(quán)利要求15到17中任一項所述的工藝或方法，其中所述底物包含從鋼廠獲 得的氣體。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到10或14到18中任一項所述的工藝或方法，其中所述醇為乙
20.根據(jù)權(quán)利要求1到10或14到19中任一項所述的工藝或方法，其中所述細(xì)菌為 選自梭菌(Clostridium)、穆爾氏菌(Moorella)、氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus)、產(chǎn)醋 菌(Acetogenium)、醋酸桿菌(Acetobacterium)、厭氧醋菌(Acetoanaerobium)、丁酸桿菌 (Butyribacterium)禾口 Peptostreptococcus 的產(chǎn)乙酸細(xì)菌。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的工藝或方法，其中所述產(chǎn)乙酸細(xì)菌為Clostridium autoethanogenum 或 Clostridium carboxydivorans。
22.一種進(jìn)行發(fā)酵工藝的發(fā)酵系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括(a)用于檢測所述發(fā)酵工藝中使用的微生物的細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位變化的裝置；和(b)基于通過所述檢測裝置是否檢測到變化，用于控制所述發(fā)酵工藝的至少一個參數(shù) 的裝置。
全文摘要
描述了提高通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)品的工藝效率的方法，包括測量和控制pH和/或氧化還原電位的方法。
文檔編號C12M1/34GK102016052SQ200880111599
公開日2011年4月13日 申請日期2008年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月15日
發(fā)明者理查德·盧埃林·雪莉·福斯特, 約書亞·杰里米·康諾利, 肖恩·丹尼斯·辛普森, 芳良·陳, 馬修·詹姆士·羅 申請人:蘭扎泰克新西蘭有限公司