專利名稱：通過靶向dnmt3a和dnmt3b恢復甲基化的方法
通過靶向DNMT3A和DNMT3B恢復甲基化的方法交叉引用相關申請本申請要求2007年7月31日提交的美國臨時申請案60/962，795和2008年xxxxx 提交的PCT/US2008/XXXXX的權益，其全部公開內容明確地通過引用合并入本文。關于聯邦政府支助的研究的聲明本發明是在無任何政府支助的情況下進行的，因此政府在本發明中不具有權利。背景肺癌是美國癌癥死亡率的首要病因，其發病率為每年大約213，000例新發病例并 且具有很高的死亡率15。盡管使用新型藥物和治療方案，但在過去20年中肺癌患者的預后 一直沒有顯著改變，因此強調了對新型治療策略的需要。靶向表觀基因組(epigenome)代 表了極具前景的癌癥治療策略16。異常的DNA甲基化已顯示在肺癌中起著重要作用17 1)啟動子甲基化是負責沉默 TSGS18_2° 例如 CDKN2A、CDH13、FHIT、WWOX、CDH1 和 RASSF1A的機制之一；2)維持和從頭(de novo) DNA甲基轉移酶WMTl和DNMT3B的mRNA表達據報導分 別在102例NSCLC的53%和58%中升高，并且顯示DNMT1 mRNA水平是存活的獨立預后因
子13;3)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表達相對于正常肺組織在肺腫瘤中升高12 ；4)人DNMT3B啟動子中顯著增加啟動子活性的特定多態性與增加的肺癌風險相關
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5)DNMT1-介導的DNA甲基化的抑制在小鼠中使煙草致癌物誘導的肺癌減少50%
以上22。MicroRNA(miRNA) (19-25個核苷酸的非編碼RNA，其通過對部分或全部互補位點 的堿基配對而誘導它們的靶mRNA的翻譯抑制或切割，從而調控基因表達)參與至關重要的 生物過程，包括發育、細胞分化、細胞凋亡和增殖u。最近，已確定了特定癌癥的具有診斷和 預后意義的特定miRNA表達特征譜(關于綜述，參考文獻3-5)。值得注意的是，通過使用不 同的 miRNA 靶基因預測算法(PicTar8，TargetScan3. l9，MiRanda1Q 和 miRGen11)，已用計算機 (in silico)預測了之前顯示在NSCLC中被下調6’7的miR-29家族的成員與DNMT3A和B基 因的;V非翻譯區(3' UTR)中的位點互補(
圖1)。在報導的在肺癌中被下調的miRNA中，miR-29家族(29a，29b和29c)具有吸引人 的對DNMT3A和3B (從頭甲基轉移酶)的3'非翻譯區(UTR)的互補性8_"，所述酶是在肺癌 中經常被上調12并且與不良預后相關13的參與DNA甲基化的兩個至關重要的酶。雖然現在認為miRNA在癌發生中起作用，但miRNA的表達在肺癌中(相對于其正 常對應物(counterpart))是不同的。此外，對該異常表達的重要性理解甚少。因此，存在確定miR-29是否可靶向MMT3A和DNTM3B以及確定miR-29的恢復是 否可使肺癌例如非小細胞肺癌(NSCLC)中的異常甲基化模式恢復正常的需要。發明概述
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在一個廣泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受試者中恢復期望的DNA 甲基化模式的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一種或多種的一種 或多種miR-29。在另一個廣泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受試者中誘導甲基化沉 默的腫瘤抑制基因(TSG)的再表達的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B 中的一種或多種的一種或多種miR-29。在某些實施方案中，TSG包括HUT和WW0X中的一 種或多種。在另一個廣泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受試者中體外和體內抑 制致瘤性的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一種或多種的一種或 多種 miR-29。本文所描述的方法可用于患有惡性腫瘤例如肺癌的受試者。在另一個方面，本文描述了用于非小細胞肺癌(NSCLC)的表觀遺傳調控的方法。在某些實施方案中，內源miR-29b用作起始DNMT3B mRNA的逆轉錄的引物。在另一個方面，在本文中描述了用于降低總DNA甲基化的方法，包括施用有效量 的一種或多種靶向DNMT3A和DNMT3B的miR-29，其中miR-29的表達促成癌細胞中DNA的表 觀遺傳修飾。在另一個方面，在本文中描述了用于通過組合至少一種核苷類似物與一種或多種 足以阻斷從頭和維持DNMT途徑的miR-29來獲得DNA低甲基化的方法。在某些實施方案中， 核苷類似物包括地西他濱。在另一個方面，在本文中描述了用于增加腫瘤抑制基因(TSG)的表達的方法，包 括用一種或多種mi-R29轉染細胞。在某些實施方案中，TSG包括H1IT和WW0X蛋白中的一 種或多種。在另一個方面，本文描述了用于在細胞中體外抑制細胞生長和/或誘導細胞凋亡 (相對于混雜(scrambled)對照)的方法，包括用一種或多種miR-29轉染一種或多種細胞。在另一方面，在本文中描述了用于下調raiT和/或WW0X酶的表達水平的方法，包 括通過用一個或多個miR-29家族成員轉染細胞來調控DNMT3A和/或DNMT3B。在某些實施 方案中，細胞是肺癌細胞。在另一個方面，本文中描述了用于減少總DNA甲基化的方法，包括在肺癌細胞中 誘導mi-R29的表達。在另一個方面，本文中描述了用于恢復TSG的表達的方法，包括在肺癌細胞中誘 導mi-R29的表達。在另一個方面，本文描述了用于體外和體內抑制致瘤性的方法，包括在肺癌細胞 中誘導mi-R29的表達。在另一個方面，本文中描述了開發單獨地或與其他療法組合使用合成的miR-29 的表觀遺傳療法的方法，以在癌細胞中重新激活腫瘤抑制基因和使異常的甲基化模式恢復 正常。在某些實施方案中，癌細胞是肺癌細胞。在另一個方面，本文中描述了診斷受試者是否患有肺癌相關疾病，處于發生其的 風險中，或對于其具有減少的存活預后的方法，包括測量受試者的測試樣品中至少一種miR 基因產物的水平；其中測試樣品中miR基因產物的水平相對于對照樣品中相應miR基因產物的水平的改變表示受試者患有肺癌相關疾病，或處于發生其的風險中；以及其中至少一 種miR基因產物選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合。在其他方面，在本文中描述了與各種細胞的誘導肺癌的狀態相關的標志物。已發 現高于任何此類標志物或此類標志物的組合的正常表達水平與患者中肺癌相關疾病的存 在相關。提供了檢測樣品中肺癌相關疾病的存在；樣品中所述疾病的不存在；肺癌相關疾 病的分期；以及與患者中肺癌相關疾病的評估、預防、診斷、表征和治療相關的肺癌相關疾 病的其他特征的方法。還提供了治療肺癌相關疾病的方法。在其他方面，在本文中描述了用于治療患有肺癌相關疾病或處于發生肺癌相關疾 病的風險中的患者的方法。此類方法可包括減少標志物的表達和/或干擾標志物的生物學 功能。在一個實施方案中，方法包括給患者提供與標志物核酸或其區段互補的反義寡核苷 酸或多核苷酸。例如，可通過遞送表達標志物核酸或其片段的反義多核苷酸的載體來給患 者提供反義多核苷酸。在另一個實施方案中，方法包括給患者提供特異性結合標志物蛋白 或所述蛋白的片段的抗體、抗體衍生物或抗體片段。當根據附圖進行閱讀時，根據下列優選實施方案的詳細描述，本發明的各種目的 和有利方面對于本領域技術人員將變得顯然。附圖概述本專利或申請文件包含至少一個以彩色制成的圖。具有彩色附圖的本專利或專利 申請公開案的拷貝將應請求且支付必要的費用后由Office提供。圖1. DNMT3A和3B的3' UTR區中對于miR-29的互補位點
Hsa-mi-R29a [SEQ ID NO 1]
Hsa-mi-R29b [SEQ ID NO 2]
Hsa-mi-R29c [SEQ ID NO 3]
845-869 DNMT3A [SEQ ID NO4]
843-869 DNMT3A [SEQ ID NO5]
846-869 DNMT3A [SEQ ID NO6]
1184-1209 DNMT3B [SEQ ID NO 7]
244-267 DNMT3B [SEQ ID NO8]
1374-1398 DNMT3B [SEQ ID NO 9]
1182-1209 DNMT3B [SEQ ID NO: 10]
1185-1209 DNMT3B [SEQ ID NO: 11]
根據TARGETSCAN 3. 1軟件，大寫和粗體字母標識完全堿基配對。PICTAR軟件在
miR-29a與DNMT3B之間鑒別出兩個額外的配對區域，用星號*標出。圖 2. MiR-29 直接靶向 DNMT3A 和 B。圖2a).在用miR-29轉染后A549細胞中DNMT3表達的螢光素酶測定的結果。圖2b).上圖，在用miR-29或陰性對照轉染A549細胞后，通過qRT_PCR對DNMT3A 和DNMT3B mRNA的表達的評估；下圖，利用反義分子(AS)沉默miR-29誘導了增加的DNMT3A 和DNMT3B mRNA的表達。圖2c).從用DNMT3A和B_3 ‘ UTR的GFP抑制載體+miR 29或混雜寡核苷酸共轉 染的A549細胞提取的蛋白質的Western印跡。
圖2d).miR-29b用作逆轉錄其預測的DNMT3B mRNA靶的內源引物。黑色字體 DNMT3B cDNA(RefSeq# NM_175848)；藍色字體實驗獲得的經克隆和測序的cDNA (分析了 8 個克隆)；紅色字體推導的RNA序列和相應的miR-29b。3' UTR-DNMT3B 1178-1217 TTTAACACCTTTTACTCTTCTTAC- TGGTGCT ATTTTGTAG[SEQ ID NO 12]cDNA (8) TTTAACACCTTTTACTCTTCTTAA :T GGTGCT A-ADAPTER [SEQID NO : 13]RNA 3' AAAUGAGAAGAAUU :A CCACGA U 5，[SEQ ID NO: 14]Hsa-miR-29b 3' UUGUGACUAAAGUUUA CCACGA U 5，[SEQ ID NO 2]上方下劃線標示的黑色和藍色核苷酸在靶和實驗的cDNA之間不具有同源性。下 方下劃線標示的紅色核苷酸代表與miR-29b序列缺少同源性的與cDNA互補的RNA序列。粗 體的核苷酸代表PICTAR預測的配對位點。圖3. miR-29對癌細胞表觀基因組的恢復作用。圖3a).由miR-29對A549細胞(在轉染后48和72小時收獲)誘導的總DNA甲 基化改變。將結果與未轉染的細胞(模擬)和用混雜寡核苷酸轉染的細胞(Scr)相比較。 利用LC/MS-MS確定總DNA甲基化狀態。圖3b).通過qRT PCR進行的用miR_29或陰性對照轉染后48小時的A549和H1299 細胞中FHIT和WWOX mRNA水平的測定；miR-29誘導FHIT和WWOX mRNA的再表達。圖3c).在用miR-29或陰性對照轉染后72小時，A549和H1299細胞中的H1IT和 WW0X蛋白的免疫印跡；至72小時時，miR-29誘導增加的H1IT和WW0X蛋白的表達。免疫印 跡圖像上方的數字表示相對于GAPDH基因的條帶強度(上行FHIT ；下行ffffOX)。圖3d).使用MassARRAY系統的H1IT和WW0X啟動子區域的定量DNA甲基化數據 的圖示。各方塊表示被分析的單個CpG或CpG組，并且各箭頭表示樣品。以從亮綠(較低 甲基化頻率)延伸至亮紅(較高的甲化頻率)的色碼顯示各實驗的甲基化頻率。圖4. miR-29對A549細胞的致瘤性的作用。圖4a).用miR-29、混雜(Scr)寡核苷酸體外轉染的或模擬轉染的(模擬)A549細 胞的生長曲線。曲線表示3個不同實驗的平均細胞數目。圖4b).測量用混雜(Scr)寡核苷酸或miR-29寡核苷酸(lOOnM終濃度)轉染的 A549細胞中的活細胞百分數。24小時后，收獲細胞，將其懸浮于具有膜聯蛋白V-FITC和碘 化丙啶的結合緩沖液中，然后通過流式細胞術估量細胞死亡。誤差棒表示SD。圖4c).注射了預先用miR-29、scr寡核苷酸轉染的或模擬轉染的(注射前48小 時)A549細胞的裸小鼠中移植瘤的生長曲線。圖4d).在注射后21天在裸鼠中，模擬_、Scr-和miR-29-轉染的A549細胞的腫 瘤移植物的大小的比較。圖像顯示來自每一個類別的5只小鼠中的平均大小的腫瘤。圖4e).裸小鼠的腫瘤重量士 SD。圖5. NSCLC中DNMT3A蛋白表達水平與總存活負相關。Kaplan-Meier曲線顯示172 個在腫瘤中具有不同的DNMT3A表達水平(相對于鄰近正常肺)的NSCLC患者的存活。具 有更高的DNMT3A表達的患者具有更短的總存活(P = 0. 029)。DNMT3B蛋白表達水平與存 活存在朝向相似的相關性的趨勢，但對于DNMT1不存在這樣的相關性。圖6.內源miR-29水平與DNMT3A/B mRNA水平的相關性。通過qRT PCR在14個
11NSCLC中測定的DNMT3A、3B的內源mRNA水平與miR-29的內源水平之間的負相關性。R = 回歸系數。□=回歸線； =實際樣品相關性。實施方案的描述在整個本公開內容中，通過標識引用來引用各種公開物、專利和公開的專利說明 書。這些公開物、專利和公開的專利說明書的公開內容通過引用合并入本文以更全面地描 述本發明涉及的現有技術。除非另外定義，否則本文中所用的所有技術和科學術語具有與本領域(例如，細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學領域)技術人員通常所理解的意義相 同的意義。標準技術用于在本領域技術人員的能力范圍之內的分子、遺傳學和生物化學方 法。此類技術在文獻中得到詳盡的解釋。參見，例如，Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 2 版，由 Sambrook,Fritsch禾口 Maniatis 編著(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) ；DNA Cloning,第 I 和 II 卷(Glover ed.，1985) ；Oligonucleotide Synthesis (Gait ed.，1984) ;Mullis 等，美國專 ^lJ 4, 683, 195 ；Nucleic Acid Hybridization(Hames & Higgins eds. ,1984) ；Transcription And Translation(Hames & Higgins eds. ,1984) ；Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) ；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press,1986) ；Perbal, A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984) ；the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N. Y. ) ；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells (Miller 禾口 Calos eds. ,1987, Cold Spring HarborLaboratory) ；Methods In Enzymology，第 154 禾口 155 卷(Wu 等 eds.)， Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer 禾口 Walker, eds., Academic Press,London,1987) ；Handbook OfExperimental Immunology,第 I-IV卷(Weir 禾口 Blackwell, eds. , 1986) ；The Laboratory Rat,主編:Mark A. Suckow ；作者Sharp 禾口 LaRegina. CRC Press，Boston，1988，所述文獻通過引用合并入本文)和化學方法。如說明書和權利要求中所使用的，除非上下文清楚地指出，否則單數形式“a”“an” 和“the”包括復數指示物。例如，術語“a cell”包括多個細胞，包括其混合物。如在本文中可互換使用的，“miR基因產物”、“micr0RNA”、“miR”或“miRNA”是指 來自miR基因的未加工的(例如，前體)或已加工的(例如，成熟)RNA轉錄物。由于miR 基因產物不翻譯成蛋白質，因此術語“miR基因產物”不包括蛋白質。未加工的miR基因轉 錄物也稱為“miR前體”或“miR prec",其通常包括長度大約70-100個核苷酸的RNA轉錄 物。可通過用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut或RNA酶III (例如大腸桿菌(E. coli) RNA 酶III))將其消化成具有活性的19至25個核苷酸的RNA分子來加工miR前體。該具有活 性的19-25個核苷酸的RNA分子也稱為“已加工的” miR基因轉錄物或“成熟的” miRNA。“標志物”是與其在正常或健康組織或細胞中的表達水平相比，其在組織或細胞中 改變的表達水平與疾病狀態相關的基因或蛋白質。標志物的“正常”的表達水平是標志物在未患肺癌相關疾病的人受試者或患者的 肺細胞中的表達水平。標志物的“過表達”或“顯著更高的表達水平”是指測試樣品中的表達水平，所述 表達水平高于用于估量表達的測定的標準誤，在某些實施方案中，至少2倍，在其他實施方 案中，3、4、5或10倍于對照樣品(例如，來自未患有標志物相關疾病的健康受試者的樣品)中的標志物的表達水平和在某些實施方案中幾個對照樣品中的標志物的平均表達水平。標志物的“顯著更低的表達水平”是指測試樣品中的表達水平，所述表達水平比對 照樣品(例如，來自未患有標志物相關疾病的健康受試者的樣品)中的標志物的表達水平 和在某些實施方案中幾個對照樣品中的標志物的平均表達水平低至少2倍，在其他實施方 案中低3、4、5或10倍。“試劑盒”是包含至少一種試劑，例如用于特異性檢測標志物的表達的探針的任何 產品(例如，包裝或容器)。可以以用于進行本發明的方法的單位的形式推銷(promote)、 分配或銷售試劑盒。
“蛋白質”包括標志物蛋白和它們的片段；變異標志物蛋白和它們的片段；包含標 志物或變異標志物蛋白的至少15個氨基酸的區段的肽和多肽；以及包含標志物或變異標 志物蛋白，或標志物或變異標志物蛋白的至少15個氨基酸的區段的融合蛋白。在第一廣泛的方面，本文中提供了其表達在與不同肺癌相關的癌細胞中，相對于 正常對照細胞，發生改變的特定microRNA的鑒定。可通過天然加工途徑(例如使用完整的細胞或細胞裂解物)或通過合成加工途徑 (例如使用分離的加工酶，例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)從miR前體獲得具 有活性的19-25個核苷酸的RNA分子。應理解，還可通過生物或化學合成(而不用從miR 前體加工)直接產生具有活性的19-25個核苷酸的RNA分子。當在本文中通過名稱提及 microRNA時，除非另外指出，否則所述名稱相應于前體和成熟形式。在一個方面，在本文中提供了診斷受試者是否患有肺癌或處于發展肺癌的風險中 的方法，該方法包括測量來自受試者的受試樣品中至少一種miR基因產物的水平和將受試 樣品中的miR基因產物水平與對照樣品中的相應miR基因產物水平相比較。如本文所使用 的，“受試者”可以是患有或懷疑患有肺癌的任何哺乳動物。在優選的實施方案中，受試者是 患有或懷疑患有肺癌的人。在一個實施方案中，測試樣品中測量的至少一種miR基因產物選自miR29a、 miR-29b、miR-29c和其組合。在特定實施方案中，miR基因產物是miR_29b。肺癌相關疾病可以是起于肺組織的任何障礙或癌癥。此類癌癥通常與腫瘤塊的形 成和/或存在相關，并且可以是例如任何形式的肺癌，例如不同組織學的肺癌(例如，腺癌、 鱗狀細胞癌)。此外，肺癌可以與特定的預后(例如，低存活率、快速進展)相關。可在從受試者獲得的生物樣品(例如，細胞、組織)中測量至少一種miR基因產物 的水平。例如，可通過常規的活組織檢查技術從懷疑患有肺癌相關疾病的受試者中取出組 織樣品(例如，來自腫瘤)。在另一個實施方案中，可從受試者中取出血液樣品，并且可通 過標準技術分離血細胞(例如，白細胞)以用于DNA提取。優選在開始放射療法、化學療法 或其他療法之前從受試者獲得血液或組織樣品。可從受試者的未受影響的組織、從正常人 個體或正常個體的群體或從相應于受試者的樣品的大部分細胞的培養細胞獲得相應的對 照組織或血液樣品。然后將對照組織或血液樣品與來自受試者的樣品一起進行處理，以便 可將從受試者的樣品的細胞中給定的miR基因產生的miR基因產物的水平與來自對照樣品 的細胞的相應的miR基因產物的水平進行比較。生物樣品的參照miR表達標準也可用作對 照。與對照樣品中相應的miR基因產物的水平相比，從受試者獲得的樣品中miR基因產物水平的改變(例如，增加或減少)表示受試者中存在肺癌相關疾病。在一個實施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產物水平高于對照樣品中相應 的HliR基因產物的水平(即，HliR基因產物的表達“上調”)。如本文中所使用的，當來自受 試者的細胞或組織樣品中miR基因產物的量大于對照細胞或組織樣品中相同基因產物的 量時，miR基因產物的表達“上調”。在另一個實施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產物水平低于對照樣品中相 應miR基因產物的水平(即，miR基因產物的表達“下調”)。如本文中所使用的，當從來自 受試者的細胞或組織樣品中的該基因產生的miR基因產物的量低于從對照細胞或組織樣 品中的相同基因產生的量時，miR基因的表達“下調”。可根據一個或多個RNA表達標準確定對照和正常樣品中相對miR基因表達。所述 標準可包括例如0 miR基因表達水平、標準細胞系中的miR基因表達水平、受試者的未受影 響的組織中miR基因的表達水平或之前獲得的正常人對照的群體的miR基因表達的平均水平。可使用適合用于檢測生物樣品中RNA表達水平的任何技術測量樣品中miR基因產 物的水平。用于測定生物樣品(例如，細胞、組織)中的RNA表達水平的合適技術(例如， Northern印跡分析、RT-PCR、原位雜交)對于本領域技術人員來說是熟知的。在特定的實施 方案中，使用Northern印跡分析檢測至少一種miR基因產物的水平。例如，可通過在核酸 提取緩沖液存在的情況下進行勻漿，接著進行離心來從細胞純化總的細胞RNA。沉淀核酸， 然后通過用DNA酶處理和沉淀來除去DNA。然后按照標準技術在瓊脂糖凝膠上通過凝膠電 泳分離RNA分子，并將其轉移至硝酸纖維素濾器。然后通過加熱將RNA固定在濾器上。使 用適當標記的與所述RNA互補的DNA或RNA探針進行特定RNA的檢測和定量。參見，例如， Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.，第 2 片反，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，Chapter 7，其全部公開內容通過引用合并入本文。用于給定的miR基因產物的Northern印跡雜交的合適的探針可根據核酸序列產 生，其包括但不限于與目的miR基因產物具有至少大約70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %， 98%，99%或完全的互補性的探針。用于制備標記的DNA和RNA探針的方法以及用于其與靶 核苷酸序列的雜交的條件描述于 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.，第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapters 10 禾口 11，其 公開內容通過引用合并入本文。在一個非限定性實例中，可用例如放射性核素例如3H、32P、33P、14C或35S ；重金屬； 能夠用作已標記的配體的特異性結合對成員的配體(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗 體)；熒光分子；化學發光分子；酶等來標記核酸探針。可通過Rigby 等人(1977)，J. Mol. Biol. 113 :237_251 的切口 平移法(nick translation method) Fienberg ^A (1983), Anal. Biochem. 132 6-13 白勺 Ρ Ι弓L夕去 (其全部公開內容通過引用合并入本文)將探針標記至高比放射性(specific activity)。 后者是選擇用于從單鏈DNA或從RNA模板合成高比放射性的32P-標記的探針的方法。例如， 按照切口平移法通過用高放射性的核苷酸置換預先存在的核苷酸，可能制備具有大大超過 IO8Cpm/微克的比放射性的32P-標記的核酸探針。然后可通過將雜交濾器暴露于照相膠片 來進行雜交的放射自顯影檢測。暴露于雜交濾器的照相膠片的光密度掃描提供了 miR基因轉錄物水平的精確測量。使用另一個方法，可通過計算機化的成像系統例如可從Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 獲.f 導白勺 Molecular Dynamics 40Q-B 2D PhosphorimaRer fe 量miR基因轉錄物水平。當不能進行DNA或RNA探針的放射性核素標記時，可使用隨機引物法將類似物例 如dTTP類似物5- (N- (N-生物素基-ε -氨基己酰基)_3_氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸摻 入探針分子。可通過與偶聯至熒光染料或產生顏色反應的酶的結合生物素的蛋白質例如抗 生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和抗體(例如抗生物素抗體)反應來檢測生物素化的探針 寡核苷酸。除了 Northern和其他RNA雜交技術外，可使用原位雜交技術來測定RNA轉錄物的 水平。該技術需要比Northern印跡技術更少的細胞，其包括將整個細胞置于顯微鏡蓋玻片 上和用含有放射性標記的或另外標記的核酸(例如，cDNA或RNA)探針的溶液探測細胞的 核酸含量。該技術特別適合用于分析來自受試者的組織活檢樣品。原位雜交技術的實施在 美國專利5，427，916 (其全部公開內容通過引用合并入本文)中進行了更詳細的描述。在一個非限定性實例中，用于給定的miR基因產物的原位雜交的合適的探針可從 核酸序列產生。并且包括但不限于與目的miR基因產物具有至少大約70%，75%，80%， 85%,90%,95%,98%,99%或完全的互補性的探針，如上所述的。細胞中miR基因轉錄物的相對數目還可通過對miR基因轉錄物進行逆轉錄，然后 通過聚合酶鏈式反應擴增經逆轉錄的轉錄物(RT-PCR)來進行測定。可通過與內部標準例 如來自存在于相同樣品中的“持家”基因的mRNA的水平相比較來定量miR基因轉錄物的 水平。用作內部標準的合適的“持家”基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (G3PDH)。用于進行定量和半定量RT-PCR的方法和其變型對于本領域技術人員來說是熟知 的。在一些情況下，可能期望同時測定樣品中多個不同miR基因產物的表達水平。在 其他情況下，可能期望測定與癌癥關聯的所有已知miR基因的轉錄物的表達水平。評估數 百種miR基因或基因產物的癌癥特異性表達水平非常費時并且需要大量的總RNA (例如，對 于每一個Northern印跡需要至少20 μ g)和需要放射性同位素的放射自顯影技術。為了克服這些限制，可構建以微芯片形式(即，微陣列)存在的寡核苷酸文庫 (oligolibrary)，該文庫包含特異于一組miR基因的一組寡核苷酸(例如，寡脫氧核苷酸) 探針。使用該微陣列，可通過逆轉錄RNA以產生一組靶寡脫氧核苷酸，且將它們與微陣列上 的探針寡核苷酸雜交以產生雜交特征譜或表達特征譜來測定生物樣品中多個microRNA的 表達水平。然后將受試樣品的雜交特征譜與對照樣品的雜交特征譜比較，從而確定在肺癌 細胞中具有改變的表達水平的microRNA。如本文中所使用的，“探針寡核苷酸”或“探針寡脫氧核苷酸”是指能夠與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脫氧核苷酸”是指待檢測(例如，通過雜交)的 分子。“miR-特異性探針寡核苷酸”或“特異于miR的探針寡核苷酸”是指具有選擇用于與 特定miR基因產物或特定miR基因產物的逆轉錄物雜交的序列的探針寡核苷酸。特定樣品的“表達特征譜”或“雜交特征譜”本質上是樣品的狀態指紋；雖然兩種 狀態可能具有相似表達的任何特定基因，但同時評價大量基因允許產生對于細胞的狀態是 獨特的基因表達特征譜。即，正常組織可與癌(例如，腫瘤)組織相區別，并且在癌組織中，可確定不同的預后狀態(例如，良好的或不良的長期存活希望)。通過比較不同狀態中癌組 織的表達特征譜，獲得關于哪個基因在這些狀態的各狀態中是很重要(包括基因的上調和 下調)的信息。在癌組織中差異表達的序列的鑒定以及導致不同預后結果的差異表達的鑒 定允許以許多方法使用該信息。 在一個非限定性實例中，可評估特定的治療方案(例如，以確定化療藥物是否改 善特定患者的長期預后)。類似地，可通過將患者樣品與已知的表達特征譜比較來進行或確 認診斷。此外，這些基因表達特征譜(或個體基因)允許篩選抑制肺癌表達特征譜或將不 良預后特征譜轉變成更好的預后特征譜的藥物候選物。因此，本文中還提供了診斷受試者是否患有肺癌或處于發展肺癌的風險中的方 法，該方法包括逆轉錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將靶寡 脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交特征 譜，和將受試樣品雜交特征譜與從對照樣品或參照標準產生的雜交特征譜比較，其中至少 一種miRNA的信號的改變表示受試者患有肺癌或處于發展肺癌的風險中。在一個實施方案中，微陣列包含大部分所有已知的人miRNA的miRNA特異性探針 寡核苷酸。在特定的實施方案中，微陣列包含一種或多種選自miR29a、miR-29b、miR-29C和 其組合的miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。可利用基因特異性寡核苷酸探針(所述探針從已知的miRNA序列產生)制備微陣 列。對于各miRNA，陣列可包含兩種不同的寡核苷酸探針，一種探針包含活性成熟序列，而 另一種探針特異于miRNA的前體。陣列還可包含可用作雜交嚴格性條件的對照的對照，例 如與人直系同源物只相異于少數幾個堿基的一個或多個小鼠序列。還可將來自兩個物種的 tRNA或其他RNA(例如，rRNA.mRNA)印制在微芯片上，從而為特異性雜交提供內部的、相對 穩定的陽性對照。還可將用于非特異性雜交的一個或多個合適的對照包含在微芯片上。為 了該目的，基于與任何已知的miRNA不存在任何同源性選擇序列。可使用本領域內已知的技術制備微陣列。例如，在位置C6上對合適長度例如 40個核苷酸的探針寡核苷酸進行5'-胺修飾，并且使用可商購獲得的微陣列系統例如 GeneMachine OmniGrid IOOMicroarrayer 和 Amersham CodeLink 活化的載玻片進行印 制。通過用標記的引物逆轉錄靶RNA來制備相應于靶RNA的標記的cDNA寡聚物。在第一 鏈合成后，使RNA/DNA雜交物變性以降解RNA模板。然后將所制備的標記的靶cDNA在雜 交條件(例如在25°C下于6X SSPE/30%甲酰胺中進行18小時，然后在37°C下于0. 75X TNT(TrisHCl/NaCl/Tween 20)中清洗40分鐘)下與微陣列芯片雜交。在陣列上的其中固 定的探針DNA識別樣品中的互補靶cDNA的位置上，發生雜交。標記的靶cDNA標記陣列上 的其中發生結合的確切位置，從而允許自動檢測和定量。輸出信號由一列雜交事件組成，其 標示了特定cDNA序列的相對豐度，從而標示了患者樣品中相應的互補miR的相對豐度。根據一個實施方案，標記的cDNA寡聚物是從生物素標記的引物制備的生物素標 記的cDNA。然后通過使用例如鏈霉抗生物素蛋白-AleXa647綴合物直接檢測包含生物素的 轉錄物來處理微陣列，和使用常規掃描方法掃描微陣列。陣列上的各點的圖像強度與患者 樣品中相應的miR的豐度成比例。使用陣列對于miRNA表達的檢測具有幾個有利方面。第一，可在一個時間點上鑒 定相同樣品中的數百個基因的整體表達。第二，通過寡核苷酸探針的仔細設計，可鑒定成熟分子和前體分子的表達。第三，與Northern印跡分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用 2. 5yg總RNA可提供可重現的結果。數目相對有限的miRNA (每物種數百個)允許對數個 物種構建共同的微陣列，其中對每一物種使用不同的寡核苷酸探針。這樣的工具允許分析 各已知的miR在不同條件下的跨物種表達。除了用于特定miR的定量表達水平測定外，包含相應于miRNome的大部分(優選 整個miRNome)的miRNA-特異性探針寡核苷酸的微芯片可用于進行miR基因表達特征譜分 析，以分析miR的表達模式。可使不同的miR特征與已建立的疾病標志物關聯或直接與疾 病狀態關聯。按照本文中描述的表達特征譜分析法，對來自懷疑患有肺癌相關疾病的受試者的 樣品的總RNA進行定量逆轉錄以提供一組與樣品中的RNA互補的標記的靶寡脫氧核苷酸。 然后將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供樣品 的雜交特征譜。結果是顯示樣品中miRNA的表達模式的樣品的雜交特征譜。雜交特征譜包 括來自靶寡脫氧核苷酸(其來自樣品)與微陣列中的miRNA-特異性探針寡核苷酸結合的 信號。所述特征譜可記錄為結合的存在或不存在(信號對0信號)。更優選地，記錄的特征譜包括來自各雜交的信號的強度。將所述特征譜與從正常 的(即非癌的)對照樣品產生的雜交特征譜相比較。信號的改變表示受試者中存在癌癥或 發生癌癥的傾向。用于測量miR基因表達的其他技術也在本領域技術人員的能力范圍之內，并且包 括用于測量RNA轉錄和降解的速率的各種技術。本文中還提供了測定患有肺癌的受試者的預后的方法，該方法包括測量受試者的 測試樣品中至少一種miR基因產物的水平，所述水平與肺癌相關疾病的特定預后(例如，良 好或積極的預后，不良或不利的預后)相關。根據這些方法，與對照樣品中相應的miR基因產物的水平相比較，測試樣品中與 特定預后相關的miR基因產物的水平的改變表明受試者患有具有特定預后的肺癌。在一個 實施方案中，miR基因產物與不利的(即，不良的)預后相關。不利預后的實例包括但不限 于低存活率和快速疾病發展。在某些實施方案中，這樣測量至少一種miR基因產物的水平， 即通過逆轉錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將該靶寡脫氧核 苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供受試樣品的雜交特征譜， 然后將受試樣品的雜交特征譜與從對照樣品產生的雜交特征譜相比較來進行測量。不希望受任何理論束縛，據信，細胞中一種或多種miR基因產物水平的改變可導 致這些miR的一種或多種預期的靶失調，這可導致肺癌形成。因此，改變miR基因產物水平 (例如，通過減少在肺癌細胞中被上調的miR基因產物的水平，通過增加在肺癌細胞中被下 調的miR基因產物的水平)可成功地治療肺癌。因此，本文中還提供了抑制受試者中的腫瘤發生的方法，所述受試者患有或懷疑 患有肺癌，其中至少一種miR基因產物在受試者的癌細胞中失調(例如，下調，上調)。當至 少一種分離的miR基因產物(例如，miR-29家族)在癌細胞中被下調時，方法包括施用有 效量的至少一種分離的miR基因產物，或其分離的變體或生物活性片段，以便在受試者中 抑制癌細胞的增殖。例如，當miR基因產物在受試者的癌細胞中被下調時，對受試者施用有效量的分離的miR基因產物可抑制癌細胞的增殖。對受試者施用的分離的miR基因產物可與在癌細 胞中被下調的內源野生型miR基因產物(例如，miR基因產物)相同或其可以是其變體或 生物活性片段。如本文所定義的，miR基因產物的“變體”是指與相應的野生型miR基因產物具有 低于100%的同一性并且具有相應的野生型miR基因產物的一種或多種生物活性的miRNA。 這樣的生物活性的實例包括但不限于靶RNA分子的表達的抑制(例如，抑制靶RNA分子的 翻譯，調節靶RNA分子的穩定性，抑制靶RNA分子的加工)和與肺癌相關的細胞過程(例如， 細胞分化、細胞生長、細胞死亡)的抑制。此類變體包括物種變體和其為miR基因中一個或 多個突變(例如，置換、缺失、插入)的結果的變體。在某些實施方案中，變體與相應的野生 型miR基因產物至少大約70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%或99%的同一。如本文所定義的，miR基因產物的“生物活性片段”是指miR基因產物的RNA片段， 其具有相應的野生型miR基因產物的一個或多個生物活性。如上所述，此類生物活性的實 例包括但不限于靶RNA分子的表達的抑制和與肺癌相關的細胞過程的抑制。在某些實施方 案中，生物活性片段的長度是至少大約5、7、10、12、15或17個核苷酸。在特定的實施方案中，可將分離的miR基因產物與一種或多種另外的抗癌療法組 合來對受試者施用。適當的抗癌療法包括但不限于化學療法、放射療法和其組合(例如，放 化療(chemoradiation))。當至少一種分離的miR基因產物在癌細胞中被上調時，方法包括對受試者施用有 效量的至少一種用于抑制至少一種miR基因產物的表達的化合物(在本文中稱為miR基 因表達_抑制化合物)，以便癌細胞的增殖被抑制。在特定的實施方案中，至少一種miR表 達_抑制化合物特異于選自miR29家族的miR基因產物(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c 和其組合)。如本文中所使用的，術語“治療”、“醫治”和“療法”是指改善與疾病或病況例如肺 癌相關的癥狀，包括預防或延遲疾病癥狀的發作，和/或減少疾病或病況的癥狀的嚴重性 或頻率。術語“受試者”、“患者”和“個體”在本文中定義為包括動物例如哺乳動物，包括但 不限于靈長類動物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊科、馬 科、犬科、貓科、嚙齒目或鼠科物種。在優選實施方案中，動物是人。如本文中所使用的，分離的miR基因產物的“有效量”是足以在患有肺癌的受試者 中抑制癌細胞增殖的量。通過考慮因素例如受試者的大小和體重；疾病侵入的程度；受試 者的年齡、健康和性別；施用的途徑以及施用是局部的還是全身性的，本領域技術人員可容 易地確定對給定的受試者施用的miR基因產物的有效量。例如，分離的miR基因產物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的大致重量。腫瘤塊 的大致重量可通過計算腫瘤塊的大致體積來測定，其中1立方厘米的體積大約等于1克。基 于腫瘤塊的重量的分離的miR基因產物的有效量可在大約10至500微克/克腫瘤塊的范 圍之內。在某些實施方案中，腫瘤塊可以是至少大約10微克/克腫瘤塊，至少大約60微克 /克腫瘤塊或至少大約100微克/克腫瘤塊。分離的miR基因產物的有效量還可基于待治療的受試者的大致或估計的體重。優 選，如本文中所描述的，胃腸外或腸內施用這樣的有效量。例如，對受試者施用的分離的miR 基因產物的有效量可在大約5至大約3000微克/kg的體重，大約700至1000微克/kg的體重的范圍內，或大于大約1000微克/kg的體重。本領域技術人員還可容易地確定用于對給定的受試者施用分離的miR基因 產物的合適的給藥方案。例如，可對受試者施用一次(例如，作為單次注射或沉積 (cbp0Siti0n))miR基因產物。可選擇地，可以每天1次或2次對受試者施用miR基因產物， 進行大約3至大約28天，特別地大約7至大約10天的時期。在特定的給藥方案中，每天1 次施用miR基因產物，進行7天。當給藥方案包括多次施用時，應理解，對受試者施用的miR 基因產物的有效量可包括在整個給藥方案期間施用的基因產物的總量。如本文中使用的，“分離的”miR基因產物是合成的或通過人工介入從天然狀態改 變或取出的miR基因產物。例如，合成的miR基因產物，或部分或完全從其天然狀態的共存 材料分離的miR基因產物被認為是“分離的”。分離的miR基因產物可以以大體上純化的形 式存在，或可以存在于已將所述miR基因產物遞送入其中的細胞中。因此，有意地被遞送至 細胞或在細胞中表達的miR基因產物被認為是“分離的”miR基因產物。在細胞內從miR前 體分子產生的miR基因產物也被認為是“分離的”分子。根據一個特定的實施方案，本文所 描述的分離的miR基因產物可用于制造用于治療受試者(例如，人)中的肺癌的藥物。分離的miR基因產物可使用許多標準技術獲得。例如，可使用本領域已知的方法 化學合成或重組產生miR基因產物。在一個實施方案中，使用適當保護的核糖核苷亞磷酰 胺和常規的DNA/RNA合成儀化學合成miR基因產物。合成RNA分子或合成試劑的提供商包 括例如 Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A. )、Pierce Chemical(part of Perbio Science,Rockford,IL,U. S. A. )>Glen Research(Sterling,VA, U. S. A. ) > ChemGenes (Ashland, MA, U. S. A.)禾口 Cruachem (Glasgow, UK)。可選擇地，可使用任何合適的啟動子從重組環形或線性DNA質粒表達miR基因產 物。用于從質粒表達RNA的合適的啟動子包括例如TO或HI RNA pol III啟動子序列或巨 細胞病毒啟動子。其他合適啟動子的選擇在本領域技術人員的能力之內。本發明的重組質 粒還可包括用于在癌細胞中表達miR基因產物的誘導型或可調控的啟動子。可通過標準技術從培養的細胞表達系統分離從重組質粒表達的miR基因產物。還 可將從重組質粒表達的miR基因產物遞送至癌細胞并且在其中直接表達。下面更詳細地論 述重組質粒將miR基因產物遞送至癌細胞的用途。miR基因產物可從分開的重組質粒表達，或它們可從相同的重組質粒表達。在一個 實施方案中，miR基因產物從單個質粒表達為RNA前體分子，然后通過合適的加工系統(包 括但不限于癌細胞中現有的加工系統)將該前體分子加工成功能性miR基因產物。其他合 適的加工系統包括例如體外果蠅細胞裂解物系統(例如，如屬于Tuschl等人的美國公開專 利申請2002/0086356中所描述的，其全部公開內容通過引用合并入本文)和大腸桿菌RNA 酶III系統(例如，如屬于Yang等人的美國公開專利申請2004/0014113中所描述的，其全 部公開內容通過引用合并入本文)。適合用于表達miR基因產物的質粒的選擇、用于將核酸序列插入質粒以表達基 因產物的方法以及將重組質粒遞送至目的細胞的方法在本領域技術人員的能力之內。參 見，例如，Zeng 等(2002)，MolecularCell 9 :1327_1333 ；Tuschl (2002)，Nat. Biotechnol, 20 446-448 ；Brummelkamp 等(2002)，Science 296 :550_553 ；Miyagishi 等(2002)，Nat. Biotechnol. 20 497-500 ；Paddison 等(2002)，Genes Dev. 16948-958 ；Lee 等(2002)，Nat. Biotechnol. 20 :500_505 ；和 Paul 等(2002)，Nat. Biotechnol. 20 :505_508，其全部公 開內容通過引用合并入本文。在一個實施方案中，表達miR基因產物的質粒包含在CMV立即早期啟動子 (intermediate-early promoter)控制下編碼miR前體RNA的序列。如本文中所使用的， “在啟動子的控制下”是指編碼miR基因產物的核酸序列位于啟動子的3'端，以便啟動子 可起始miR基因產物編碼序列的轉錄。miR基因產物還可從重組病毒載體表達。預期miR基因產物可從兩個分開的重組 病毒載體或從相同的病毒載體表達。可通過標準技術從培養的細胞表達系統分離從重組病 毒載體表達的RNA或所述RNA可在癌細胞中直接表達。下面更詳細地論述重組病毒載體將 miR基因產物遞送至癌細胞的用途。 本發明的重組病毒載體包含編碼miR基因產物的序列和用于表達RNA序列的任何 合適的啟動子。合適的啟動子包括但不限于U6或H1RNA pol III啟動子序列，或巨細胞病 毒啟動子。其他合適的啟動子的選擇在本領域技術人員的能力之內。本發明的重組病毒載 體還可包含用于在癌細胞中表達miR基因產物的誘導型或可調控的啟動子。可使用能夠接受miR基因產物的編碼序列的任何病毒載體；例如，來源于腺病毒 (AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉錄病毒(例如，慢病毒(LV)、彈狀病毒(Rhabdoviruses)、鼠白 血病病毒)、皰疹病毒等的載體。可通過用來自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化 載體或通過置換不同的病毒衣殼蛋白(如果合適)來改變病毒載體的趨向性。例如，可用來自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies)、埃博拉病毒 (Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本發明的慢病毒載體。可通過對載體 進行工程改造以表達不同的衣殼蛋白血清型來制備本發明的AAV載體，使之靶向不同的細 胞。例如，在血清型2型基因組上表達血清型2型衣殼的AAV載體稱為AAV 2/2。AAV 2/2 載體中的該血清型2型衣殼基因可用血清型5型衣殼基因替換，從而產生AAV 2/5載體。用 于構建表達不同衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術在本領域技術人員的能力之內；參見， 例如，Rabinowitz，J. E.，等(2002)，J. Virol. 76 :791_801，其全部公開內容通過引用合并 入本文。適合用于本發明的重組病毒載體的選擇、用于將用于表達RNA的核酸序列 插入載體的方法、將病毒載體遞送至目的細胞的方法和表達的RNA產物的回收在本 領域技術人員的能力之內。參見，例如，Dornburg(1995)，Gene Therapy 2:301-310; Eglitis(1988),Biotechniques 6:608-614 ；Miller(1990)，Hum. Gene Therapy1 :5_14 ；禾口 Anderson(1998)，Nature 392 :25_30，其全部公開內容通過引用合并入本文。特別合適的病毒載體是來源于AV和AAV的載體。用于表達miR基因產物的合適 的AV載體、用于構建重組AV載體的方法以及用于將載體遞送至靶細胞的方法描述于Xia 等(2002)，Nat. Biotech. 20 :1006-1010，其全部公開內容通過引用合并入本文。用于表達 miR基因產物的合適的AAV載體、用于構建重組AAV載體的方法以及用于將載體遞送至靶細 胞的方法描述于 Samulski 等(1987)，J. Virol. 61 :3096_3101 ；Fisher 等(1996)，J. Virol, 70 520-532 ；Samulski 等(1989)，J. Virol. 63 :3822_3826 ；美國專利 5，252，479 ；美國專利 5，139,941 ；國際專利申請W0 94/13788 ；和國際專利申請W093/24641，其全部公開內容通 過引用合并入本文。在一個實施方案中，從包含CMV立即早期啟動子的單個重組AAV載體表達miR基因產物。在某些實施方案中，本發明的重組AAV病毒載體包含在人TO RNA啟動子控制下的 與polyT終止序列有效連接的編碼miR前體RNA的核酸序列。如本文中所使用的，“與polyT 終止序列有效連接”是指編碼有義或反義鏈的核酸序列以5 ‘方向與polyT終止信號緊密 鄰接。在從載體轉錄miR序列的過程中，polyT終止信號用于終止轉錄。在本發明的治療方法的其他實施方案中，可對受試者施用有效量的至少一種抑制 miR表達的化合物。如本文中所使用的，“抑制miR表達”是指治療后miR基因產物的前體 和/或活性成熟形式的產量低于治療前產生的量。通過使用例如上述用于診斷方法的測定 miR轉錄物水平的技術，本領域技術人員可容易地確定miR的表達在癌細胞中是否已被抑 制。抑制可在基因表達的水平上(即，通過抑制編碼miR基因產物的miR基因的轉錄)或 在加工的水平上(例如，通過抑制miR前體至成熟的活性miR的加工)發生。如本文中所使用的，抑制miR表達的化合物的“有效量”是足以在患有癌癥(例如， 肺癌)的受試者中抑制癌細胞的增殖的量。通過考慮因素，例如受試者的大小和體重；疾病 侵入的程度；受試者的年齡、健康和性別；施用的途徑以及施用是局部的還是全身性的，本 領域技術人員可容易地確定對給定的受試者施用的miR表達抑制化合物的有效量。例如，表達抑制化合物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的大致重量，如本文中所 描述的。抑制miR表達的化合物的有效量還可基于待治療的受試者的大致的或估計的體 重，如本文中所描述的。本領域技術人員還可容易地確定用于對給定的受試者施用抑制miR表達的化合 物的適當的給藥方案。用于抑制miR基因表達的合適的化合物包括雙鏈RNA(例如短或小干擾RNA或 “siRNA”)、反義核酸和酶促RNA分子例如核酶。這些化合物中的每一種可被靶向給定的miR 基因產物并且干擾靶miR基因產物的表達(例如，抑制其翻譯，誘導其切割或破壞)。例如，給定的miR基因的表達可通過用分離的雙鏈RNA( “dsRNA”)分子誘導miR 基因的RNA干擾來抑制，所述雙鏈RNA分子與miR基因產物的至少一部分具有至少90%、例 如至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同源性。在特定的實施方案中，dsRNA分 子是“短或小干擾RNA”或“siRNA”。用于本方法的siRNA包括長度大約17個核苷酸至大約29個核苷酸、優選長度大 約19至大約25個核苷酸的短雙鏈RNA。siRNA包含通過標準Watson-Crick堿基配對相互 作用(在下文中稱為“堿基配對”)退火在一起的有義RNA鏈和互補反義RNA鏈。有義鏈包 含與靶miR基因產物內包含的核酸序列大體上同一的核酸序列。如本文中所使用的，siRNA中與靶mRNA內包含的靶序列“大體上同一”的核酸序列 是與靶序列同一的核酸序列或與靶序列相異于1或2個核苷酸的核酸序列。siRNA的有義 和反義鏈可包括兩個互補的單鏈RNA分子或可包括其中兩個互補部分堿基配對并且通過 單鏈“發夾結構”區域共價連接的單個分子。siRNA還可以是與天然存在的RNA相異于一個或多個核苷酸的添加、缺失、置換和 /或改變的經改變的RNA。這樣的改變可包括非核苷酸材料的添加(例如至siRNA的末端 或至siRNA的一個或多個內部核苷酸的添加)，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修飾或用脫氧 核糖核苷酸對siRNA中的一個或多個核苷酸的置換。
siRNA的一條或兩條鏈還可包含3'懸突。如本文中所用的，“3'懸突”是指從雙 鏈RNA鏈的3'-末端延伸的至少一個未配對的核苷酸。因此，在某些實施方案中，siRNA 包含至少一個長度為1至大約6個核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)、長度為 1至大約5個核苷酸、長度為1至大約4個核苷酸或長度為大約2至大約4個核苷酸的3 ‘ 懸突。在特定的實施方案中，3'懸突存在于siRNA的兩條鏈上，且其長度為2個核苷酸。例 如，siRNA的各條鏈可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“im”)的3'懸突。siRNA可通過化學或生物方法產生，或可從重組質粒或病毒載體表達，如上文對分 離的miR基因產物所描述的。用于產生和檢測dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于 屬于Gewirtz的美國公開專利申請2002/0173478和屬于Reich等人的美國公開專利申請 2004/0018176，兩者的全部公開內容通過引用合并入本文。給定的miR基因的表達還可通過反義核酸抑制。如本文中所使用的，“反義核酸” 是指通過RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用與靶RNA結合的核酸分子，其改變靶 RNA的活性。適合用于本方法的反義核酸是通常包含與miR基因產物中的連續核酸序列互 補的核酸序列的單鏈核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合物、肽核酸(PNA))。反義核酸可 包含與miR基因產物中的連續核酸序列50-100%互補、75-100%互補或95-100%互補的核 酸序列。不希望受任何理論束縛，據信，反義核酸激活RNA酶H或降解miR基因產物/反義 核酸雙鏈體的另一種細胞核酸酶。反義核酸還可包含對核酸主鏈或對糖和堿基部分(或它們的等價物)的修飾，從 而增加靶特異性、核酸酶抗性、遞送或與分子的功效相關的其他性質。此類修飾包括膽固醇 部分、雙鏈體嵌入劑例如吖啶或一種或多種抗核酸酶基團。反義核酸可通過化學或生物方法產生，或可從重組質粒或病毒載體表達，如上文 對分離的miR基因產物所描述的。用于產生和檢測的示例性方法在本領域技術人員的能力 之內；參見，例如，Stein和Cheng(1993)，Science 261 1004以及屬于Woolf等人的美國專 利5，849，902，其全部公開內容通過引用合并入本文。給定的miR基因的表達還可通過酶促核酸(enzymatic nucleicacid)抑制。如本 文中所使用的“酶促核酸”是指包含與miR基因產物的連續核酸序列具有互補性的底物結 合區并且能夠特異性切割miR基因產物的核酸。酶促核酸底物結合區可以例如與miR基因 產物中的連續核酸序列50-100%互補、75-100%互補或95-100%互補。酶促核酸還可包括 在堿基、糖和/或磷酸基團上的修飾。用于本方法的示例性酶促核酸包括從頭甲基轉移酶包括DNMT3A和DNMT3B，如本 文中的實施例中所描述的。酶促核酸可通過化學或生物方法產生，或可從重組質粒或病毒載體表達，如上 文對分離的miR基因產物所描述的。用于產生和檢測dsRNA或siRNA分子的示例性 方法描述于 Werner 和 Uhlenbeck (1995)，Nucl. Acids Res. 23 2092-96 ；Hammann 等人 (1999)，Antisense andNucleic Acid Drug Dev. 9 :25_31 ；以及屬于 Cech 等人的美國專利 4，987，071，其全部公開內容通過引用合并入本文。至少一種miR基因產物或至少一種用于抑制miR表達的化合物的施用將在患有肺 癌的受試者中抑制癌細胞的增殖。
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如本文中所使用的，“抑制癌細胞的增殖”是指殺死細胞或永久性或暫時地阻止或 減緩細胞的生長。如果受試者中癌細胞的數目在施用miR基因產物或miR基因表達抑制化 合物后保持恒定或減少，那么可推斷癌細胞增殖被抑制。如果癌細胞的絕對數目增加但腫 瘤生長的速度下降，則也可推斷癌細胞增殖被抑制。受試者體內的癌細胞數目可通過直接測量或通過對原發性或轉移性腫瘤塊的大 小的估計來確定。例如，受試者中癌細胞的數目可通過免疫組織學方法、流式細胞術或經設 計用于檢測癌細胞的特征表面標志物的其他技術來測量。腫瘤塊的大小可通過直接目測觀察或通過診斷成像法例如X射線、磁共振成像、 超聲和閃爍造影術(scintigraphy)來測定。可在使用造影劑或不使用造影劑的情況下使 用用于測定腫瘤塊的大小的診斷成像法，這在本領域內是已知的。腫瘤塊的大小還可通過 物理方法例如組織塊的觸診或利用測量儀器例如測徑器測量組織塊來測定。可通過適合用于將此類化合物遞送至受試者的癌細胞的任何方法來對受試者施 用miR基因產物或miR基因表達抑制化合物。例如，可通過適合于用此類化合物或用包含 編碼此類化合物的序列的核酸轉染受試者的細胞的方法來施用miR基因產物或miR表達抑 制化合物。在一個實施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產物或miR基因表達抑制化合 物的序列的質粒或病毒載體轉染細胞。用于真核細胞的轉染方法在本領域內是熟知的，包括例如核酸至細胞的細胞核或 前核(pronucleus)的直接注射、電穿孔、脂質體轉移或由親脂材料介導的轉移、受體介導 的核酸遞送、基因槍或微粒加速、磷酸鈣沉淀以及由病毒載體介導的轉染。例如，細胞可用質脂體轉移化合物例如DOTAP (N- [ 1- (2，3_ 二油酰氧基)丙基]-N， N，N-三甲基-甲基硫酸銨，Boehringer-Mannheim)或等價物例如LIP0FECTIN進行轉染。使 用的核酸的量對于實施本發明不是至關重要的；可接受的結果可用0. 1-100微克核酸/IO5 個細胞來獲得。例如，可使用在3微克DOTAP中的大約0. 5微克質粒載體/IO5個細胞的比 例。還可通過任何合適的腸內或胃腸外施用途徑對受試者施用miR基因產物或miR基 因表達抑制化合物。用于本方法的合適的腸內施用途徑包括例如口服、直腸或鼻內遞送。合 適的胃腸外施用途徑包括例如血管內施用(例如，靜脈內團注(bolus injection)、靜脈內 輸注、動脈內團注、動脈內輸注和至脈管系統內的導管滴注)；組織外周(peri-tissue)和 組織內注射(例如，腫瘤外周和腫瘤內注射，視網膜內注射或視網膜下注射)；皮下注射或 沉積，包括皮下輸注(例如通過滲透泵)；對目的組織的直接施用，例如通過導管或其他安 置裝置(例如，視網膜丸劑(retinal pellet)或栓劑或包含多孔的、無孔的或凝膠狀材料 的植入物)；以及吸入。特別合適的施用途徑是注射、輸注和直接注射入腫瘤。在本方法中，miR基因產物或miR基因產物表達抑制化合物可以以裸露的RNA形 式、與遞送試劑一起或以包含表達miR基因產物或miR基因產物表達抑制化合物的序列的 核酸(例如，重組質粒或病毒載體)的形式對受試者進行施用。合適的遞送試劑包括例如 Mirus TransitTKO 親脂試劑、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚陽離子(例如， 多聚賴氨酸)和脂質體。含有表達miR基因產物或miR基因表達抑制化合物的序列的重組質粒和病毒載體以及用于將此類質粒和載體遞送至癌細胞的技術在本文中進行了論述和/或在本領域內 是熟知的。 在特定的實施方案中，脂質體用于將miR基因產物或miR基因表達抑制化合物 (或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至受試者。脂質體還可增加基因產物或核酸的血 液半衰期。可從標準的形成小囊泡的脂質形成用于本發明的合適的脂質體，所述脂質通常 包括中性的或帶負電荷的磷脂和固醇例如膽固醇。脂質的選擇通常通過考慮因素例如期 望的脂質體大小和脂質體在血流中的半衰期來進行指導。已知許多用于制備脂質體的方 法，例如如 Szoka 等人(1980)，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 467 ；和美國專利 4，235，871、 4，501，728,4, 837，028和5，019，369 (其全部公開內容通過引用合并入本文)中所描述的方 法。用于本方法的脂質體可包含將脂質體靶向癌細胞的配體分子。結合在癌細胞中普 遍的受體的配體例如結合腫瘤細胞抗原的單克隆抗體是優選的。用于本方法的脂質體還可進行修飾以避免被單核巨噬細胞系統(“匪S”)和網狀 內皮系統(“RES”)清除。此類經修飾的脂質體在表面具有調理作用-抑制部分或所述部 分被整合入脂質體結構。在特別優選實施方案中，本發明的脂質體可包含調理作用-抑制 部分和配體。用于制備本發明的脂質體的調理作用-抑制部分通常是與脂質體膜結合的巨大 的親水聚合物。如本文中所使用的，調理作用-抑制部分，當其通過化學或物理方式(例如 通過將脂溶性錨嵌入膜本身或通過與膜脂質的活性基團直接結合)附著至膜時，與脂質體 膜“結合”。此類抑制調理作用的親水聚合物形成了顯著減少脂質體被MMS和RES吸收的保 護性表面層；例如，如美國專利4，920，016中所描述的，其全部公開內容通過引用合并入本 文。適合于修飾脂質體的調理作用抑制部分優選是具有大約500至大約40，000道爾 頓，更優選大約2，000至大約20，000道爾頓的數量平均分子量的水溶性聚合物。此類聚合 物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG 硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；線性的、分支的或樹枝 狀聚酰胺-胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇，例如與羧基或氨基化學連接的聚木糖 醇和聚乙烯醇，以及神經節苷脂，例如神經節苷脂GMl。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其 衍生物的共聚物也是合適的。此外，抑制調理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多 糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制調理作用的聚合物還可以是包含 氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質酸、果膠酸、神 經氨酸、褐藻酸、角叉菜膠(carrageenan)；胺化的多糖或低聚糖(線性或分支的)；或羧基 化的多糖或低聚糖，例如與碳酸的衍生物反應從而與羧基連接的多糖或低聚糖。優選，調理 作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修飾的脂質體有時稱為“PEG 化的脂質體”。可通過許多熟知的技術中的任一種將調理作用抑制部分結合至脂質體膜。例如， 可將PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯與磷脂酰乙醇胺脂質可溶性錨結合，然后再與膜結合。類 似地，可使用Na(CN)BH3和溶劑混合物(例如以30 12比例的四氫呋喃和水)在60°C下 通過還原胺化作用，用硬脂酰胺脂質可溶性錨衍生葡聚糖(dextran)聚合物。
用調理作用-抑制部分修飾的脂質體在循環中比未修飾的脂質體保持更長時間。因此，此類脂質體有時稱為“隱形(stealth)”脂質體。已知隱形脂質體在通過多孔或“滲 漏”微脈管系統供養的組織中積累。因此，由此類微脈管系統缺陷表征的組織例如肺腫瘤 將有效地積累這些脂質體；參見 Gabizon 等(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. Α. , 18 6949-53。此外，減少的通過RES的吸收通過阻止脂質體在肝和脾中的大量積累來降低隱形 脂質體的毒性。因此，用調理作用-抑制部分修飾的脂質體特別適合用于將miR基因產物 或miR基因表達抑制化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤細胞。可在對受試者施用前，按照本領域已知的技術將miR基因產物或miR基因表達抑 制化合物配制為藥物組合物，有時稱為“藥劑”。因此，本發明包括用于治療肺癌的藥物組合 物。在一個實施方案中，藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產物或其分離的變 體或生物活性片段，和藥學上可接受的載體。在特定的實施方案中，至少一種miR基因產物 相應于在肺癌細胞中，相對于適當的對照細胞具有減少的表達水平的miR基因產物。在某 些實施方案中，分離的miR基因產物選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合。在其他實施方案中，本發明的藥物組合物包含至少一種miR表達抑制化合物。在 特定的實施方案中，至少一種miR基因表達抑制化合物對于miR基因(所述miR基因的表 達在肺癌細胞中比在對照細胞中高)是特異性的。在某些實施方案中，miR基因表達抑制 化合物對于一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因產物是特異性 的。本發明的藥物組合物的特征在于至少是無菌的且無熱原的。如本文中所用的， “藥物組合物”包括用于人和獸醫用途的制劑。制備本發明的藥物組合物的方法在本領域 技術人員的能力范圍內，例如如Remington' s Pharmaceutical Science，第17版，Mack PublishingCompany, Easton, Pa. (1985)中所描述的，其全部公開內容通過引用合并入本文。本藥物組合物包含至少一種與藥學上可接受的載體混合的miR基因產物或miR基 因表達抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)(例如，按重量計算0. 1至 90% )，或其生理學上可接受的鹽。在某些實施方案中，本發明的藥物組合物額外包含一種 或多種抗癌劑(例如，化學治療劑)。本發明的藥物制劑還可包含至少一種被脂質體封裝的 miR基因產物或miR基因表達抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)和藥 學上可接受的載體。在一個實施方案中，藥物組合物包含為miR29a、miR-29b和miR-29c的 一種或多種的miR基因或基因產物。特別適合的藥學上可接受的載體是水、緩沖的水、生理鹽水、0.4%的鹽水、0.3%
的甘氨酸、透明質酸等。在特定的實施方案中，本發明的藥物組合物包含至少一種抗核酸酶降解的miR基 因產物或miR基因表達抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)。本領域技術人員可通過將一個或多個在2'-位置上進行修飾的核糖核苷酸摻 入miR基因產物來容易地合成抗核酸酶的核酸。適當的2'-修飾的核糖核苷酸包括在 2'-位置上用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的核糖核苷酸。本發明的藥物組合物還可包含常規藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩定劑、抗氧化劑、滲透壓調節劑(osmolalityadjusting agent)、緩沖劑和pH調節 齊U。合適的添加劑包括例如生理上生物相容性緩沖劑(例如，氨丁三醇鹽酸鹽)、螯合劑(例 如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合絡合物(例如，DTPA鈣、CaNaDTPA-雙酰胺)的添加， 或任選地，鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的添加。本發明的 藥物組合物可以以液體形式包裝使用或可以進行凍干。對于本發明的固體藥物組合物，可使用常規無毒性的固體的藥學上可接受的載 體例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸 鎂等。例如，用于口服施用的固體藥物組合物可包含上文所列的任何載體和賦形劑以及 10-95%，優選25% -75%的至少一種miR基因產物或miR基因表達抑制化合物(或至少 一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可包含封裝在 上文所述的脂質體中的按重量計算0.01-20%，優選-10%的至少一種miR基因產物或 miR基因表達抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)和噴射劑。需要時還 可包含載體例如卵磷脂以用于鼻內遞送。本發明的藥物組合物還可包含一種或多種抗癌劑。在特定的實施方案中，組合物 包含至少一種HliR基因產物或HliR基因表達抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列 的核酸)和至少一種化學治療劑。適合于本發明的方法的化學治療劑包括但不限于DNA-烷 化劑、抗腫瘤抗生素劑、抗代謝劑(anti-metabolic agent)、微管蛋白穩定劑、微管蛋白去 穩定劑、激素拮抗劑、拓撲異構酶抑制劑、蛋白激酶抑制劑、HMG-CoA抑制劑、CDK抑制劑、細 胞周期蛋白抑制劑、胱天蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、反義核酸、三鏈螺旋DNA、核酸 適體和分子修飾的病毒、細菌和外毒素劑(exotoxic agent) 0用于本發明的組合物的適當 的試劑的實例包括但不限于阿糖胞苷(cytidinearabinoside)、甲氨蝶呤、長春新堿、依托 泊苷(VP-16)、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、順鉬(CDDP)、地塞米松、arglabin、環磷 酰胺、溶肉瘤素(sarcolysin)、甲基亞硝脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、長春堿、喜樹堿、 放線菌素D、絲裂霉素C、過氧化氫、奧沙利鉬、伊立替康、托泊替康、亞葉酸、卡莫司汀、鏈佐 星、CPT-11、紫杉醇、它莫西芬、達卡巴嗪、利妥昔單抗、柔紅霉素、l-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶 (arabinofuranosylcytosine)、伊馬替尼、氟達拉濱、多西他賽、F0LF0X4。本文中還提供了鑒定腫瘤發生抑制劑的方法，所述方法包括給細胞提供測試試劑 和測量細胞中至少一種miR基因產物的水平。在一個實施方案中，方法包括給細胞提供測 試試劑和測量至少一種在癌細胞中具有減少的表達水平的miR基因產物的水平。在提供試 劑后，相對于適當的對照細胞(例如，未提供試劑)，細胞中miR基因產物的水平的增加表示 測試試劑是腫瘤發生的抑制劑。在特定的實施方案中，至少一種在癌細胞中具有減少的表 達水平的miR基因產物選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合。在其他實施方案中，方法包括給細胞提供測試試劑和測量至少一種在癌細胞中具 有增加的表達水平的miR基因產物的水平。在提供試劑后，與適當的對照細胞(例如，未提 供試劑)相比較，細胞中miR基因產物水平的減少表示測試試劑是腫瘤發生的抑制劑。在特 定的實施方案中，至少一種在癌細胞中具有增加的表達水平的miR基因產物選自miR29a、 miR-29b、miR-29c 和其組合。適當的試劑包括但不限于藥物(例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白質、核酸)。試劑可重組產生、合成產生，或其可從天然來源分離(即，純化)。用于給細胞提供此類試劑的各種方法(例如，轉染)在本領域內是熟知的，且下文中描述了幾種這樣的方法。 用于檢測至少一種miR基因產物的表達的方法(例如，Northern印跡、原位雜交、RT-PCR、 表達特征譜分析)在本領域內也是熟知的。在下文中也描述了幾種此類方法。現通過下列非限定性實施例舉例說明本發明。實施例1在肺癌患者中，MiR-29的表達與MMT3A和3B呈負相關。此外，miR-29直接靶向 DNMT3A和3B。肺癌細胞系中增強的miR-29的表達恢復DNA甲基化的正常模式，誘導甲基 化沉默的腫瘤抑制基因(TSG)例如ΠΠΤ和WffOX14的再表達，并在體外和體內抑制致瘤性。
這些發現支持miR-29在NSCLC的表觀遺傳調控中的作用，從而為開發用于治療肺 癌的基于miR的策略提供了理論依據。利用組織微陣列(TMA)的免疫組織化學分析來分析172個配對的非腫瘤性/原發 性NSCLC組織對。如圖5所示，更高的DNMT3A蛋白的表達與更低的總存活顯著相關(P = 0. 029)。在該患者群體中未觀察到DNMTl和DNTM3B與存活的統計學上顯著的相關性。為了在體內驗證這些miRNA-靶相互作用，將DNMT3A和DNTM3B的互補位點克 隆入螢火蟲螢光素酶基因的3 ‘ UTR并且與miR-29a、mi-R29b或miR-29c —起共轉染入 A459 (NSCLC)細胞。如圖2a中所示，相對于混雜寡核苷酸，所有3種miRNA(miR_29a、mi_R29b或 miR-29c)顯著減少螢光素酶的活性。為了估計單個miR-29序列的異位表達是否誘導內源 DNMT3A和DNTM3B mRNA水平的下調，我們還在用混雜RNA或用miR-29轉染的A549和H1299 肺癌來源的細胞中進行了定量RT-PCR(qRT-PCR)。單個miR-29的過表達誘導了 DNMT3A和DNMT3B mRNA水平的顯著降低(圖2b，上 圖)，然而用反義分子沉默miR-29誘導了 DNMT3A和DNMT3B mRNA水平的上調(圖2b，下 圖)(只顯示A549細胞的結果)。為了證明miR-29的過表達可下調Dnmt3A和3B蛋白的表達，我們使用GFP-報告 載體 QBI-GFP25。簡而言之，我們將DNMT3A和DNMT3B的3 ‘ UTR克隆到QBI-GFP25載體的GFP 編碼序列的下游，從而允許含有DNMT3A或DNMT3B的3' UTR的融合GFP蛋白表達。用 GFP-3A/3B-3 ‘ UTR-載體和miR_29a、29b、29c或混雜寡核苷酸共轉染A549細胞。在用 miR-29轉染的細胞中觀察到GFP蛋白，特別地GFP-3B-3' UTR蛋白的表達顯著降低(圖 2c)；蛋白質表達結果與通過qRT-PCR獲得的結果一致，其中內源DNMT3BmRNA因miR-29的 表達而更顯著降低(圖2b)。然而不希望受理論束縛，現認為與DNMT3A相比，DNMT3B的優先下調可能歸因于 miR-29與3B 3' -UTR的預測的配對“種子”的數目(對于29a，3個；對于29b，1個；對于 29c，l個)總體上比與3A 3' -UTR的(對于各miR-29，1個)更多。此外，DNMT3B 3' UTR為miR_29a和為29b/c配對提供了相異不超過1個核苷酸 的配對位點。因此，根據miRNA可通過一個基因上的多個靶位點協同作用的“協同原理”，使 用miR-29家族的任何成員的轉染可導致對DNMT3B比對DNMT3A更強的沉默1(1'23。為了顯示DNMT3B 3' UTR與miR_29b的直接的功能性相互作用，通過使用miRNA作為內源細胞質引物在mRNA模板上合成cDNA，將最近描述的檢測方法用于檢測真核細胞 中的miRNA-mRNA復合物24。內源miR_29b，在Pictar-預測的與3 ‘ UTR相互作用的位點 上8，能夠用作起始DNMT3B mRNA的逆轉錄的“天然”引物(圖2d)。然后確定DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達在原發性NSCLC組織中與miR-29的水平 是否呈負相關。通過qRT-PCR25就DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達水平以及就miR_29a、29b 和 29c 的表達分析 14 (14)個 NSCLC。在 DNMT3A mRNA 與 miR_29a (P = 0. 02)和 miR_29c (P =0. 02)之間觀察到統計學上顯著的負相關(圖6)。觀察到DNMT3B mRNA 水平與 miR_29a(P = 0. 02)和 miR_29c (P = 0. 04)的相似的 負相關性。雖然DNMT3A和DNMT3B mRNA水平與miR_29b水平存在朝向負相關的趨勢，但相 關性在統計學上不顯著(DNMT3A P = 0. 14,DNMT3B P = 0. 09)，這可能歸因于分析的癌癥數 量較少或歸因于這樣的事實，即雖然miR-29a和29c分別只從第7和第1號染色體上的一 個染色體位置轉錄，但成熟miR_29b可從不同染色體上的兩個不同原始轉錄本(7q32. 3上 的 miR-29b-l/miR-29a 簇和 lq32. 2 上的 miR-29b_2/miR-29c 簇)轉錄。用于 qRT-PCR 以 測定miR-29b的成熟產物的探針不能區別29b-l或29b_2基因產物。miR-29靶向DWT3A和DWT3B的發現顯示此類miRNA的表達促成了癌癥中的DNA 表觀遺傳修飾。為了闡明該問題，用miR-29a、miR-29b、miR-29C或混雜寡核苷酸轉染A549 細胞，然后使用LC-MS/MS方法26在48和72小時后分析總DNA甲基化。如圖3a中所示，相對于對照，所有三種miR-29減少總DNA甲基化。miR_29b的作 用顯示更強，在48小時后產生30%的減少，在72小時后產生40%的減少。在用miR_29b 處理的細胞中觀察到的總甲基化減少的百分數與利用DNMT1抑制劑例如地西他濱26觀察到 的相當，并且對于任一方法來說都是不完全的。然而不希望受理論束縛，本發明者在本文中 現認為可通過將地西他濱(或其他核苷類似物)與miR-29組合來獲得更強的總DNA低甲 基化，從而阻斷從頭和維持DNMT途徑。為了表征甲基化變化對基因表達的作用，分析在肺癌中通常被啟動子甲基化沉默 的兩種TSG，FHIT和WW0X14的mRNA表達水平。如圖3b上圖中所示，轉染A549細胞后48小時，H1IT表達分別被miR_29a、29b和 29c的表達增加大約65%、89%和74%，并且WWOX mRNA水平分別被miR_29a和29b增加大 約40%和60% ；在H1299細胞中觀察到相似的趨勢(圖3b，下圖)。在兩個細胞系中也都觀察到raiT和WW0X蛋白的增加的表達(圖3c)。為確定miR-29是否通過改變這些基因的啟動子甲基化來調控H1IT和WW0X的表 達，使用MassARRAY系統27(定量高通量DNA甲基化分析)在用miR_29b轉染的A549和 H1299細胞中檢查HUT和WW0X的調控區域的甲基化狀態。設計兩個亞硫酸氫鹽反應(每 個基因CpG島一個)，對于HUT和WW0X，其分別覆蓋7個CpG和11個CpG。在miR_29b轉 染的H1299和A549細胞中，FHIT的MassARRAY分析分別顯示平均19. 和54. 3%的甲基 化減少，然而在H1299中對于WW0X，與混雜寡核苷酸相比較，顯示平均32. 的減少(圖 3d)。還估量了 miR-29的再表達對A549細胞的致瘤性的作用。miR-29在A549中的異 位表達在體外抑制細胞生長(圖4a)，并且相對于混雜對照轉染誘導了細胞凋亡(圖4b)。還在體內觀察到miR-29對A549的致瘤性的抑制作用。相對于模擬對照和混雜寡
28核苷酸轉染的細胞，利用miR-29的轉染抑制了 A549移植腫瘤的生長(圖4c，4d，4e)，從而 說明了此類miRNA的可能的抗瘤作用。因此，本實施例顯示miR-29家族成員的表達在肺癌中與DNMT3A和DNMT3B的表達 呈負相關并且此類miRNA下調兩種酶的表達水平。此外，肺癌細胞中此類miRNA的增強的表達導致減少的總DNA甲基化，恢復TSG的 表達，且在體外和體內抑制致瘤性。這些結果可用于開發單獨地或與其他療法組合使用合 成的miR-29的新型表觀遺傳療法，以在肺癌中重新激活腫瘤抑制基因，并且使異常的甲基 化模式恢復正常。由于在其他常見人惡性腫瘤中觀察到miR-29家族成員的表達的喪失，因 此可將該方法擴展至其他人惡性腫瘤的治療。方法。樣品我們從The Ohio State University 的 Pathology Core Facility 獲得 172 個 肺癌樣品，包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌和神經內分泌大細胞癌(統稱為非小細胞肺癌 (NSCLC))，以進行關于DNMT表達的組織微陣列(TMA)。這些患者的臨床特征(組織學診斷、 性別、年齡、 M狀態和存活時間)是可獲得的。從 Cooperative Human Tissue Network-Midwestern Division，Columbus，OH 購 得原發性肺癌組織(8個鱗狀細胞癌和6個腺癌)以進行qRT-PCR分析。按照廠商說明書， 利用 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取法來分離總 RNA。組織微陣列組織微陣列(TMA)各陣列包含每一個肺癌的4個樣品以及多個適當的肺和其他 正常組織的點。用抗DNMT1、DNTM3A和DNMT3B蛋白的抗血清對TMA染色(通常對于每一種抗 血清使用2個TMA)，將肺癌中每一個此類酶的表達與臨床特征相比較以尋找顯著相關性。 使用 1 150 的稀釋度的 GeneTex 的 DNMT1 抗血清(GTX13537，San Antonio，TX)、1 25 的 稀釋度的 Novus Biologicals 的 DNMT3A 抗血清(ab-4897，Littleton，CO)和 1 32 的稀釋 度的 Abgent 的 DNTM3B 抗血清(AP1035a，San Diego, CA)在肺癌 TMA 上估量 DWT1、DWT3A 和DNMT3B蛋白的表達。將來自TMA塊的4微米切片置于帶正電荷的載玻片上，置于60°C烘 箱中1小時，然后冷卻，然后通過二甲苯和梯度乙醇溶液(進行至水)而脫蠟和再水化。將 載玻片在3%過氧化氫中淬滅5分鐘以封閉內源過氧化物酶。在TRS(Dako，Carpinteria, CA)溶液中于95°C下收回(retrieve)抗原，進行25分鐘。將載玻片于室溫下暴露于第一 抗血清進行1小時，然后于室溫下暴露于第二抗血清(1 200)進行20分鐘；第二抗血清 是山羊抗小鼠(對于DNMT1)和山羊抗兔(對于DNMT3A和DMT3B)。在應用生物素化的第 二抗血清之前，針對內源生物素封閉所有載玻片。使用Vectastain Elite (Vector, cat# PK-6100)進行生色團檢測，進行30分鐘。底物生色團是DAB+(Dako，cat# K3468)。使用蘇 木精對載玻片進行復染，通過梯度乙醇溶液脫水，然后蓋上蓋玻片。由對臨床特征不知情的病理學家閱讀TMA并且對其打分；通過將個體樣品中的陽 性細胞的百分數乘以染色強度來測定表達評分；以1至3的等級評估染色強度，其中1是最 低強度的染色，3是最高強度。例如，具有10%的強度為3的陽性細胞的樣品被賦予30的 評分，與具有30%的強度為1的陽性細胞的樣品評分相同。定量RT-PCR。按照廠商說明書，使用TaqMan MicroRNA測定試劑盒(AppliedBiosystems, Foster City, CA)以一式三份進行 miRNA 的定量 RT-PCR(qRT-PCR)分析。將 18S RNA用于標準化；如之前所述1進行其他目的基因的qRT-PCR分析。利用基因特異 性引物和 IQ SYBRGreen Supermix (Biorad, Hercules, CA)將 RNA 逆轉錄成 cDNA。GAPDH 用作標準化對照。關于miR-29的沉默，按照廠商的方案通過使用Lipofectamine 2000 試劑(Invitrogen)，用 100nM(終)反義 miR-29a、29b_l、29c 或混雜反義 miR(Fidelity Systems, Gaithersburg, MD)在 6 孔板中轉染 A549 和 H1299 細胞。細胞培養。將來自美國典型培養物保藏中心(Manassas，VA)的A549和H1299肺 癌細胞維持在具有10% FBS和抗生素(100U/ml青霉素和100 u g/ml鏈霉素)的RPMI培養 基1640中。靶向DNMT 3' UTR的螢光素酶報告基因測定法。為了進行螢光素酶報告基因實 驗,通過PCR從人基因組DNA擴增979bp的DNMT3A 3' UTR區段和978bp的DNMT3B 3 ‘ UTR 區段，然后利用緊在螢光素酶的終止密碼子上游的Xbal位點，將其插入具有SV40啟動子的 PGL3-對照載體(Promega)。使用下列引物組產生特定片段DWT3A-UTR Fw :5，-GCTCTAGAGCCGAAAAGGGTTGGACATCAT-3’, [SEQ ID NO 15]DWT3A-UTR Rv :5，-GCTCTAGAGCGCCGAGGGAGTCTCCTTTTA-3’ ； [SEQ ID NO 16]DWT3B-UTR Fw :5，-GCTCTAGAGCTAGGTAGCAACGTGGCTTTT-3’, [SEQ ID NO 17]DWT3B-UTR Rv :5，-GCTCTAGAGCGCCCCACAAAACTTGTCAAC-3' . [SEQ ID NO 18]DNMT 3A的擴增的3' UTR在位點583上含有Xbal限制性位點，因此我們將上游 3' UTR(DWT 3A 3' -UTRup = 583bp)和下游片段(DNMT3A3‘ -UTRdown = 396bp)分開 地克隆入PGL3載體。預測的miR-29的配對種子位于DNMT3A 3' -UTR下游片段，將其用于 進行螢光素酶測定。按照廠商的方案，通過使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)，用0. 4 ii g螢 火蟲螢光素酶報告載體和0. 08 y g含有海腎螢光素酶的對照載體pRL-TK載體(Promega) 在12孔板中共轉染A549細胞。對于每一個孔，使用100nM(終)的前體miR-29a、29b_l、 29c或混雜miR(Ambi0n)。在轉染后24小時，通過使用雙重-螢光素酶測定法(Promega) 連續測量螢火蟲和海腎螢光素酶活性。以一式三份進行實驗。評估DNMT 3' UTR對蛋白質表達的作用的GFP-抑制構建體。對于GFP-抑制，通 過 PCR 從人基因組 DNA 擴增 1472bp 的 DNMT3A 3 ‘ UTR 區段和 1566bp 的 DNMT3B 3 ‘ UTR 區段(相應于3' UTR的全長)，然后利用位于載體(其在GFP編碼序列的末端沒有終 止密碼子)的GFP編碼序列的3’的BamHI-EcoRI克隆位點，將其插入QBI-GFP25載體 (Autofluorescent Proteins，Canada)。使用下列引物組產生特定片段DWT3A-GFP Fw 5' -CGGGATCCGCAGGATAGCCAAGTTCAGC-3’，[SEQID N0 19]DWT3A-GFP Rv :5，-CCCAAGCTTAAGTGAGAAACTGGGCCTGA-3‘ ； [SEQ ID NO 20]DWT3B-GFP Fw 5' -CGGGATCCCTCGATCAAACAGGGGAAAA-3’，[SEQID N0 21]DWT3B-GFP Rv 5' -CCCAAGCTTGTTACGTCGTGGCTCCAGTT-3’ [SEQID NO 22].按照廠商的方案使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)，用2 ii g含有 DNMT3A 的 3 ‘ UTR (QBI-GFP25-DWT3A)或 DNMT3B 的 3 ‘ UTR (QBI-GFP25-DWT3B)的 GFP 抑 制載體和lOOnM(終)的前體miR29a、29b-l、29c或混雜寡核苷酸(Ambion)在12孔板中共 轉染A549細胞。作為另外的對照，還用GFP載體(無miR)轉染一組細胞。在24小時后收獲細胞。如之前所述2進行蛋白質提取和免疫印跡分析。使用下列第一抗血清兔多克隆 抗-GFP，1 1000 (Novus Biologicals，Littleton，CO)。miR 29b_DNMT3B RNA復合物的檢測。為了檢測miR-29b_DNMT3BRNA復合物，我們 使用由Vatolin S.等描述的方法3來確定內源miR-29b在A549細胞中是否能夠用作逆轉 錄DNMT3B mRNA的引物。將cDNA克隆入pCR2. 1-T0P0載體(Invitrogen)。使用下列引物 組和接頭(adapter)序列(GSP意指基因特異性引物)GSP-DWT3B :5，-GAGATGACAGGGAAAACTGC-3，； [SEQ ID NO 23]GSP-DNMT3B 5N :5，-ACAGGGAAAACTGCAAAGCT-3，； [SEQ ID NO 24]接頭5，-CGACTGGAGCACGAGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAA-3，； [SEQ IDN0 25]接頭:5N:5，-CTGAAGGAGTAGAAA-3，[SEQ ID NO 26].引物5N代表來自用于使PCR條帶的檢測更靈敏的GSP序列和接頭的嵌套引物 (nested primer)0總甲基化研究。如之前所述4測定在用混雜miRNA和用miR_29轉染后A549細胞 的總甲基化狀態。對于該測定，如上對于螢光素酶測定所描述的，轉染2 X 106個A549細胞， 48和72小時后收集細胞。定量DNA甲基化。使用EpiTYPER甲基化分析測定法(Sequenom，San Diego, CA) 進行HUT和WWOX的調控區域的定量DNA甲基化分析。設計兩個亞硫酸氫鹽反應(每個基 因CpG島一個反應)，對于raiT和WW0X其分別覆蓋7個CpG和11個CpG。在轉染后48小 時提取混雜_或miR-29b-轉染的A549/H1299的DNA，對1 y g DNA進行亞硫酸氫鹽處理，體 外轉錄，用RNA酶A進行切割，然后經歷基質輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-T0F)質譜 分析以確定甲基化模式，如所描述的5。使用下列引物擴增raiT和WW0X基因的調控區FHIT Fw 5' -GGGGAGGTAAGTTTAAGTGGAATATTGTT-3，[SEQ ID NO 27]FHIT Rv 5' -CACCCCCAAAACCAAAAACTATAAC—3，[SEQ ID NO 28]WWOX Fw 5' -TTGAAAGAAAGTTTTTTAAAATTAGGAAAT-3，[SEQ IDN0 29]WWOX Rv 5' -TCAAAAAAACAAAACCTAAAAAAAA—3，[SEQ ID NO :30].j^ffi fi Stanford UniversityHeatmap builder versionl. 03d c^ 的熱圖(heatmap)。FHIT和WWOX蛋白的Western印跡分析。如之前所述2進行蛋白質提取和免疫印 跡分析。使用下列第一抗血清兔多克隆抗_FHIT，1 1000 (Zymed, San Francisco, CA)； 小鼠單克隆抗-WffOX，1 500 (如參考文獻2中)。使用Molecular Dynamics Personal Densitometer SI 禾口 IMAGEQUANT 5. 2 (Image Products International, Chantilly, VA)進行FHIT、WWOX和Gapdh的信號的定量。細胞生長曲線。將A549細胞(5X104)涂板在6x多孔板中，24小時后，按照廠商 的方案，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，用終濃度100nM的來自Ambion的混雜寡 核苷酸或miR-29寡核苷酸進行轉染。作為對照，還包括未轉染的(模擬)細胞。收獲細胞， 以24小時的間隔使用ViCell計數器(Beckman Coulter, Fullerton，CA)計數細胞。各樣
品以一式三份進行實驗。細胞凋亡和流式細胞術研究。按照廠商的方案，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，用100nM終濃度的來自Ambion的混雜寡核苷酸或miR-29寡核苷酸轉 染A549細胞(2X105)。24小時后，按照提供商的說明書，將細胞重懸浮于含有膜聯蛋白 V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶的結合緩沖液(BD Biosciences, San Diego, CA)中， 然后使用 Beckman-Coulter model EPICS XL 細胞計數器(Beckman-Coulter)通過流式細 胞術進行估量。各樣品以一式三份進行實驗。體內研究。按照制度化的指導方針(institutional guideline)進行動物研究。 按照廠商的方案通過使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)，A549細胞用100nM(終 濃度)的混雜(Scr)寡核苷酸或miR-29a、-29b或-29c體外轉染，或進行模擬轉染。在轉 染后48小時時，將3X 106個活細胞皮下注射入6周齡雌性裸小鼠(Charles RiverBreeding Laboratories,ffilmington,MA)的左脅腹，每組5只小鼠。在注射后7天測量腫瘤直徑，然 后每5天測量一次。在注射后第21天，殺死小鼠，在尸體剖檢后測量腫瘤的重量。通過使 用公式V(以mm3表示)=AXB2/2測定腫瘤體積，其中A是最大直徑，B是垂直直徑。統計分析。P值是雙向的(two-sided)，并使用SPSS軟件包(SPSS10. 0)來獲得。 從診斷的時間直至最后一次跟蹤觀察的日期計算總存活。檢查最后一次跟蹤觀察時活著 的患者的數據。為了進行存活分析和產生Kaplan-Meier (KM)曲線，通過將樣品分成兩組 (高和低表達，按照DNMT評分< 10(低)或> 10(高))來將利用免疫組織化學染色測量 的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B水平轉變成離散變量。可獲得各組的存活曲線，并且通過使用 時序檢驗(log-ranktest)進行比較。為了評估miRNA表達和DNMT表達之間的相關性，我 們使用皮爾森相關性(Pearson correlation)和線性回歸分析(SPSS軟件包)。這些函數 檢查每一對測量值(一個來自miRNA，另一個來自DNMT)以確定兩個變量是趨向于一起還是 反向移動，即miRNA的更大的值(高表達)是否與MMT表達的更低的值相關。實施例2用于診斷、分期、預后、監控和治療肺癌相關疾病的方法、試劑和試劑盒。應理解，本文所中有實施例在它們的范圍內將被認為是非限定性的。在下面部分 更詳細地描述各個方面。診斷方法在一個實施方案中，提供了評估患者是否患有肺癌相關疾病或具有高于正常的發 生肺癌相關疾病的風險的診斷方法，所述方法包括將患者樣品中標志物的表達水平與對照 例如來自無肺癌相關疾病的患者的樣品中的標志物的正常表達水平相比較的步驟。與正常水平相比，患者樣品中顯著更高的標志物表達水平表示患者患有肺癌相關 疾病或具有高于正常的發生肺癌相關疾病的風險。選擇標志物以使該方法的陽性預測值為至少大約10%，在某些非限定性實施方案 中，大約25%、大約50%或大約90%。也優選用于本方法的是與正常細胞相比較在至少大 約20%，在某些非限定性實施方案中，大約50%或大約75%的細胞中差異表達至少2倍的 標志物。在一個評估患者是否患肺癌相關疾病的診斷方法(例如，新檢測(“篩查”)、復 發的檢測、反射測試(reflex testing))中，方法包括比較a)患者樣品中標志物的表達水 平，和b)對照非肺癌相關疾病樣品中標志物的正常表達水平。與正常水平相比較患者樣品 中顯著更高的標志物表達水平表示患者患有肺癌相關疾病。
還提供了用于評估抑制患者的肺癌相關疾病的療法的效果的診斷方法。此類方法 包括比較a)在對患者提供至少一部分治療之前從患者獲得的第一樣品中標志物的表達， 和b)在提供部分治療后從患者獲得的第二樣品中標志物的表達。相對于第一樣品中標志 物的表達水平，第二樣品中顯著更低的標志物的表達水平表示療法對于抑制患者的肺癌相 關疾病是有效的。應理解，在此類方法中，“療法”可以是治療肺癌相關疾病的任何療法，包括但不限 于藥物組合物、基因療法和生物療法例如抗體和趨化因子的施用。因此，本文中描述的方法可用于評估治療前、治療期間和治療后的患者，例如用于評估疾病狀態的減輕。在某些方面，診斷方法關注于使用化學或生物試劑的療法。此類方法包括比較a) 從患者獲得的并且在化學或生物試劑存在的情況下維持的第一樣品中標志物的表達，和b) 從患者獲得的并且在所述試劑不存在的情況下維持的第二樣品中標志物的表達。相對于第 一樣品中標志物的表達水平，第二樣品中顯著更低的標志物的表達水平表示試劑對于抑制 患者的肺癌相關疾病是有效的。在一個實施方案中，第一和第二樣品可以是從患者獲得的 單個樣品的部分或從患者獲得的混合樣品的部分。評估預后的方法還提供了用于評估患者的肺癌相關疾病的進展的監控方法，所述方法包括a)在 第一時間點檢測患者樣品中標志物的表達；b)在隨后的時間點及時重復步驟a)；和c)比 較步驟a)和b)中檢測的表達水平，從而監控患者的肺癌相關疾病的進展。與第一時間點 上的樣品的標志物的表達水平相比，在隨后的時間點上的樣品中顯著更高的標志物的表達 水平表示肺癌相關疾病已向前發展，而顯著更低的表達水平表示肺癌相關疾病已消退。還提供了用于確定肺癌相關疾病是否已惡化或可能在將來惡化的診斷方法，所述 方法包括比較a)患者樣品中標志物的表達水平，和b)對照樣品中標志物的正常表達水 平。與正常水平相比較，患者樣品中顯著更高的表達水平表示肺癌相關疾病已惡化或可能 在將來惡化。評估抑制性、治療性和/或有害組合物的方法還提供了用于選擇抑制患者的肺癌相關疾病的組合物的檢測方法。該方法包括步 驟a)從患者獲得含有細胞的樣品；b)在多種受試組合物存在的情況下分別維持樣品的等 分；C)比較各等分中標志物的表達；和d)選擇其中的一種受試組合物，所述組合物，相對于 在其他受試組合物存在的情況下標志物的表達水平，顯著減少含有該受試組合物的等分中 標志物的表達水平。另外提供了評估化合物在引起肺癌相關疾病中的有害潛能的檢測方法。該方法包 括步驟a)在化合物存在和不存在的情況下維持分開的細胞等分；和b)比較各等分中標志 物的表達。相對于在化合物不存在的情況下維持的等分中標志物的表達水平，在化合物存 在的情況下維持的等分中顯著更高的標志物的表達水平表示化合物具有這樣的有害潛能。此外，還提供了抑制患者的肺癌相關疾病的方法。該方法包括步驟a)從患者獲 得含有細胞的樣品；b)在多種組合物存在的情況下分別維持樣品的等分；c)比較各等分中 標志物的表達；和d)對患者施用至少一種組合物，所述組合物，相對于在其他組合物存在 的情況下標志物的表達水平，在含有該組合物的等分中顯著降低標志物的表達水平。樣品中標志物的表達水平可以例如通過檢測下列物質在樣品中的存在來估量相應的標志物蛋白或所述蛋白的片段(例如，通過使用特異性結合所述蛋白或蛋白片段的試 劑，例如抗體、抗體衍生物、抗體片段或單鏈抗體)、相應的標志物核酸(例如，核苷酸轉錄 物或其互補序列)或所述核酸的片段(例如，通過將從樣品獲得的轉錄的多核苷酸與在其 上附著有一個或多個具有完整的所述核酸的序列或其區段或其互補序列的核酸的基質接 觸)、由相應的標志物蛋白直接(即，催化)或間接產生的代謝產物。可使用至少一個或多個(例如，2、3、5或10或更多個)肺癌相關疾病標志物進行 任何上述方法。在此類方法中，將多個標志物(其中至少一個是標志物)中的每一個在樣 品中的表達水平與多個標志物中的每一個在從未患有肺癌相關疾病的對照人獲得的相同 類型的樣品中的正常表達水平相比較。相對于該標志物的相應的正常或對照水平，一個或 多個標志物或其一些組合在樣品中顯著改變的(即，如在上述使用單個標志物的方法中所 詳細說明的增加或減少)表達水平表示患者患有肺癌相關疾病。對于所有上述方法，選擇 標志物以使方法的陽性預測值是至少大約10%。候選試劑的實例候選試劑可以是本領域已知的藥理學試劑(pharmacologicagent)或可以是之前 未知的具有任何藥理活性的試劑。試劑可以是天然產生的或實驗室中設計的。它們可從微 生物、動物或植物分離，或可重組產生或通過任何適當的化學方法合成。它們可以是小分 子、核酸、蛋白質、肽或模擬肽(p印tidomimetics)。在某些實施方案中，候選試劑是具有大 于50且小于大約2，500道爾頓的分子量的小有機化合物。候選試劑包含與蛋白質結構性 相互作用所必需的官能團。還在生物分子中發現候選試劑，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、 類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結構類似物或組合。可從多種來源(包括合成的或天然化合物的文庫)獲得候選試劑。存在例如許 多可獲得用于隨機和定向合成多種有機化合物和生物分子的方法，包括隨機化寡核苷酸和 寡肽的表達。備選地，以細菌、真菌、植物和動物提取物的形式存在的天然化合物的文庫是 可獲得的或可容易地產生。此外，天然或合成產生的文庫和化合物可容易地通過常規化學、 物理和生物學方法進行修飾，并且可用于產生組合文庫。在某些實施方案中，候選試劑可 使用組合文庫方法領域中的許多方法中的任一方法來獲得，所述方法包括非限定性實例 生物文庫法；空間可定位平行固相或溶液相文庫法(spatially addressable parallel solidphase or solution phase libraries)；需要角軍卷禾只(deconvolution)白勺合成文庫 法；“一珠一化合物(one-bead one-compound) ”文庫法；和使用親和層析選擇的合成文庫 法。在某些其他實施方案中，可將某些藥理學藥劑經歷定向或隨機化學修飾，例如酰 化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以產生結構類似物。用于鑒定治療肺癌相關疾病的治療劑的相同方法還可用于驗證體外研究產生的 前導化合物(lead compound)/試劑。候選試劑可以是上調或下調一個或多個肺癌相關疾病應答途徑的試劑。在某些實 施方案中，候選試劑可以是影響這樣的途徑的拮抗劑。用于治療肺癌相關疾病的方法本文提供了用于治療、抑制、減輕或逆轉肺癌相關疾病應答的方法。在本文所述的 方法中，對有此需要的個體施用干擾信號級聯的試劑，所述個體例如但不限于其中這樣的并發癥還不明顯的肺癌相關疾病患者和已具有至少一種肺癌相關疾病應答的患者。在前一種情況下，這樣的治療用于預防此類肺癌相關疾病應答的發生和/或減輕 它們發生的程度。在后一種情況下，這樣的治療用于減輕此類肺癌相關疾病應答發生的程 度，阻止它們進一步發展或逆轉肺癌相關疾病應答。在某些實施方案中，干擾肺癌相關疾病應答級聯的試劑可以是對此類應答特異的 抗體。標志物的表達可以以許多方式抑制標志物的表達，所述方式包括非限定性實例可對肺癌相關 疾病細胞提供反義寡核苷酸以抑制標志物的轉錄、翻譯或兩者。備選地，可對細胞提供編碼 特異性結合標志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段并且與適當的啟動子/調節子區域 有效連接的多核苷酸，以產生抑制所述蛋白的功能或活性的細胞內抗體。標志物的表達和/ 或功能還可通過用特異性結合標志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段處理肺癌相關疾 病細胞來抑制。通過使用本文中描述的方法，可篩選多種分子，特別地包括足夠小以使它們 能夠穿過細胞膜的分子，以鑒定抑制標志物的表達或抑制標志物蛋白的功能的分子。可對 患者提供如此鑒定的化合物以抑制患者的肺癌相關疾病細胞。任何標志物或標志物的組合，以及與所述標志物組合的任何特定標志物可用于本 文中描述的組合物、試劑盒和方法中。一般地，期望使用這樣的標志物，對于所述標志物，肺 癌相關疾病細胞中該標志物的表達水平與正常肺細胞中相同標志物的表達水平之間的差 異盡可能大。雖然該差異可以小至用于估量標志物的表達的方法的檢測極限，但期望差異 至少大于估量方法的標準誤，在一些實施方案中，與正常組織中相同標志物的表達水平相 比，至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000 倍或更大的差異。已公認，某些標志物蛋白被分泌至圍繞細胞的細胞外空間。由于此類標志物蛋白 可在肺癌相關體液樣品中檢測，因此將這些標志物用于組合物、試劑盒和方法的某些實施 方案，所述體液樣品可以比組織活檢樣品更容易地從人患者收集。此外，用于檢測標志物蛋 白的體內技術包括將抗所述蛋白的標記抗體引入受試者。例如，抗體可用其在受試者中的 存在和定位可利用標準成像技術來檢測的放射性標記物進行標記。為了確定任何特定的標志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳動物細胞例如人肺 細胞系中表達標志物蛋白，收集細胞外液體，估量蛋白質在細胞外液體中的存在或不存在 (例如，使用特異性結合所述蛋白的標記抗體)。應理解，含有肺細胞的患者樣品可用于本文中所述的方法。在這些實施方案中，標 志物的表達水平可通過估量樣品中標志物的量(例如，絕對量或濃度)來估量。當然，可在 估量樣品中標志物的量之前將細胞樣品經歷多種收集后制備和貯藏技術(例如，核酸和/ 或蛋白質提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發、離心等)。還應理解，可使標志物流出細胞進入消化系統、血流和/或間質間隙。可以例如通 過檢查血清或血漿來檢測流出的標志物。組合物、試劑盒和方法可用于檢測標志物蛋白的表達，所述標志物蛋白具有至少 一個展示于表達其的細胞的表面上的部分。例如，可將免疫學方法用于檢測完整細胞上的 此類蛋白，或可將基于計算機的序列分析法用于預測至少一個細胞外結構域(即，包括分 泌蛋白和具有至少一個細胞表面結構域的蛋白質)的存在。可檢測標志物蛋白的表達而無需裂解細胞(例如，使用特異性結合蛋白的細胞表面結構域的標記抗體)，所述標志物蛋白 具有至少一個展示于表達其的細胞的表面上的部分。標志物的表達可通過用多種用于檢測轉錄的核酸或蛋白質的表達的方法中的任 一種來估量。此類方法的非限定性實例包括用于檢測分泌蛋白、細胞表面蛋白、細胞質蛋白 或核蛋白的免疫學方法、蛋白質純化法、蛋白質功能或活性測定法、核酸雜交法、核酸逆轉 錄法以及核酸擴增法。在特定的實施方案中，標志物的表達可使用特異性結合標志物蛋白或其片段(包 括已經歷所有或部分其正常翻譯后修飾的標志物蛋白)的抗體(例如，放射性標記的、發色 團標記的、熒光團標記的或酶標記的抗體)、抗體衍生物(例如，綴合有底物或蛋白質或蛋 白質-配體對的配體的抗體)或抗體片段(例如，單鏈抗體、分離的抗體高變結構域等)來估量。在另一個特定的實施方案中，標志物的表達通過下述來估量從患者樣品的細胞 制備mRNA/cDNA(S卩，轉錄的多核苷酸)，然后將mRNA/cDNA與為標志物核酸的互補序列的參 照多核苷酸或其片段雜交。任選地，可在與參照多核苷酸雜交前使用多種聚合酶鏈式反應 方法中的任一種來擴增cDNA ；優選，其不進行擴增。同樣可使用定量PCR檢測一個或多個 標志物的表達以估量標志物的表達水平。備選地，可使用檢測標志物的突變或變體(例如， 單核苷酸多態性、缺失等)的許多方法中的任一種來檢測患者中標志物的存在。在相關實施方案中，將獲自樣品的轉錄的多核苷酸的混合物與在其上固定有多核 苷酸(其與標志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更 多個核苷酸殘基)互補或同源)的基質接觸。如果可在基質上差異地檢測到互補或同源的 多核苷酸(例如，可使用不同的發色團或熒光團檢測或固定至不同的選擇的位置)，那么可 使用單個基質(例如，固定在所選擇的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微陣列)同時估量 多個標志物的表達水平。當使用包括將一個核酸與另一個核酸雜交的估量標志物表達的方 法時，期望在嚴格雜交條件下進行雜交。在某些實施方案中，可使用質譜法或表面等離子共振術進行生物標志物測定 (biomarker assay)。在不同的實施方案中，鑒定活性抗肺癌相關疾病的試劑的方法可包括 a)提供含有一個或多個標志物或其衍生物的細胞的樣品；b)從所述細胞制備提取物；c)將 所述提取物與含有標志物結合位點的標記核酸探針混合；和，d)在測試試劑存在或不存在 的情況下測定標志物與核酸探針之間的復合物的形成。測定步驟可包括將所述提取物/核 酸探針混合物經歷電泳遷移率試驗(electrophoretic mobility shift assay)。在某些實施方案中，測定步驟包括選自酶聯免疫吸附測定(ELISA)、基于熒光的測 定和超高通量測定，例如，表面等離子共振術(SPR)或熒光相關光譜(FCS)測定的測定。在 此類實施方案中，sra傳感器用于指導生物分子相互作用的實時觀察，因為sra對金屬-電 介質表面上的微小折射率改變非常敏感。sra是對大約200nm的STO傳感器/樣品介面內 的105至10_6折射率(RI)單位的改變敏感的表面技術。因此，sra光譜法用于監控沉積在 傳感層上的薄有機薄膜的生長。因為組合物、試劑盒和方法依賴于一種或多種標志物的表達水平的差異的檢測， 因此期望標志物的表達水平顯著大于用于估量至少一種正常細胞和受肺癌影響的細胞中 的表達的方法的最小檢測極限。
應理解，通過使用一種或多種標志物對另外的患者樣品進行常規篩選，將了解某 些標志物在不同類型的細胞，包括特定的肺癌相關疾病細胞中過表達。此外，通過就標志物的表達評估更大數量的患者樣品，并且使從其獲得樣品的個 體患者的結果相互關聯，還將確認某些標志物的改變的表達與肺癌相關疾病強相關以及其 他標志物的改變的表達與其他疾病強相關。從而組合物、試劑盒和方法可用于表征患者的 肺癌相關疾病的分期、分級、組織學類型和性質中的一種或多種。當組合物、試劑盒和方法用于表征患者的肺癌相關疾病的分期、分級、組織學類型 和性質中的一種或多種時，期望選擇標志物或標志物組以使在至少大約20%，在某些實施 方案中，至少大約40%、60%或80%和基本上所有患者(其患有相應分期、分級、組織學類 型或性質的肺癌相關疾病)中獲得陽性結果。可選擇本發明的標志物或標志物組以使對于 一般群體可獲得大于大約10%的陽性預測值(在非限定性的實例中，外加大于80%的測定 特異性)。當多個標志物用于組合物、試劑盒和方法時，可在單個反應混合物(即，使用針對 各個標記物的試劑，例如不同的熒光探針)或在相應于一個或多個標志物的單獨的反應混 合物中，將患者樣品中各標志物的表達水平與相同類型的非肺癌樣品中多個標志物中的每 一個的正常表達水平相比較。在一個實施方案中，相對于相應的正常水平，樣品中一個以上 的標志物的顯著增加的表達水平表示患者患有肺癌相關疾病。當使用多個標志物時，可使 用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多個單獨的標志物；在某些實施方案中，可能期望 使用更少的標志物。為了使組合物、試劑盒和方法的靈敏性最大化(即在干擾可歸因于患者樣品中非 肺來源的細胞的情況下)，期望本文中所使用的標志物是具有受限制的組織分布(例如通 常不在非肺組織中表達)的標志物。應認識到，組合物、試劑盒和方法對于具有增加的發生肺癌相關疾病的風險的患 者和他們的醫學顧問將是特別有用的。被認為具有增加的發生肺癌相關疾病的風險的患者 包括例如具有肺癌相關疾病家族史的患者。可以以多種方法估量正常人肺組織中標志物的表達水平。在一個實施方案中，該 正常表達水平通過下述來估量估量一部分表現正常的肺細胞中標志物的表達水平且將該 正常表達水平與一部分懷疑為異常的肺細胞中的表達水平相比較。備選地，特別是當由于 常規進行本文中所述的方法而可獲得進一步的信息時，可使用標志物的正常表達的群體平 均值。在其他實施方案中，標志物的“正常”表達水平可通過估量標志物在從未患有肺癌的 患者獲得的患者樣品、在懷疑肺癌相關疾病在患者中發作之前從患者獲得的患者樣品、編 檔保存的患者樣品等中的表達來進行測定。本文中還提供了用于估量肺癌相關疾病細胞在樣品(例如編檔保存的組織樣品 或從患者獲得的樣品)中的存在的組合物、試劑盒和方法。這些組合物、試劑盒和方法基本 上與上述的相同，除了必要時，使組合物、試劑盒和方法適用于除了患者樣品外的樣品。例 如，當待使用的樣品是石蠟包埋的(parafinized)編檔保存的人組織樣品時，可能必需在 用于估量樣品中標志物表達水平的組合物、試劑盒或方法中調整化合物的比例。產生抗體的方法本文中還提供了制備產生用于估量患者是否患有肺癌相關疾病的抗體的分離的雜交瘤的方法。在該方法中，合成或分離(例如通過從其中表達其的細胞純化或通過體內 或體外轉錄和翻譯編碼蛋白質或肽的核酸)含有完整標志物蛋白或其區段的蛋白質或肽。 使用蛋白質或肽免疫脊椎動物例如哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔或綿羊。任選地(和優選 地)可用蛋白質或肽免疫脊椎動物至少另外一次，從而使脊椎動物呈現強烈的針對蛋白質 或肽的免疫應答。從免疫的脊椎動物分離脾細胞，使用多種方法中的任一種將其與永生化 的細胞系融合從而形成雜交瘤。然后使用標準方法篩選以該方式形成的雜交瘤，從而鑒定 一個或多個產生特異性結合標志物蛋白或其片段的抗體的雜交瘤。本文還提供了通過該方 法制備的雜交瘤和使用這樣的雜交瘤制備的抗體。估量功效的方法本文還提供了估量測試化合物抑制肺癌相關疾病細胞的功效的方法。如上所述， 標志物的表達水平的差異與肺細胞的異常狀態相關。雖然公認，某些標志物的表達水平的 變化可能由肺細胞的異常狀態引起，但同樣公認，其他標志物的表達水平的變化誘導、維持 和促進此類細胞的異常狀態。因此，抑制患者的肺癌相關疾病的化合物將使一個或多個標 志物的表達水平改變至更接近該標志物的正常表達水平(即，所述標志物在正常肺細胞中 的表達水平)的水平。因此本方法包括將在測試化合物存在的情況下維持的第一肺細胞樣品中的標志 物的表達與在測試化合物不存在的情況下維持的第二肺細胞樣品中的標志物的表達相比 較。在測試化合物存在的情況下標志物的顯著減少的表達表示該測試化合物抑制肺癌相關 疾病。肺細胞樣品可以例如是獲自患者的正常肺細胞的單個樣品的等分、獲自患者的正常 肺細胞的混合樣品、正常肺細胞系的細胞、獲自患者的肺癌相關疾病細胞的單個樣品的等 分、獲自患者的肺癌相關疾病細胞的混合樣品、肺癌相關疾病細胞系的細胞等。在一個實施方案中，樣品是獲自患者的肺癌相關疾病細胞，并且檢測多種據認為 對于抑制各種肺癌相關疾病是有效的化合物，以鑒定可能最佳地抑制患者的肺癌相關疾病 的化合物。同樣可將該方法用于估量療法抑制患者的肺癌相關疾病的功效。在該方法中，估 量一個或多個標志物在樣品對(一個樣品經歷療法，另一個不經歷療法)中的表達水平。與 估量測試化合物的功效的方法一樣，如果療法誘導顯著更低的標志物表達水平，則療法對 于抑制肺癌相關疾病是有效的。如上，如果來自選擇的患者的樣品用于本方法，那么可在體 外估量備選療法以選擇對于抑制患者的肺癌相關疾病最可能有效的療法。如本文中所描述的，人肺細胞的異常狀態與標志物的表達水平的變化相關。還提 供了用于評估測試化合物的有害潛能的方法。該方法包括在測試化合物存在和不存的情況 下維持分開的人肺細胞等分。比較各等分中標志物的表達。在測試化合物存在的情況下維 持的等分中標志物的顯著更高的表達水平(相對于在測試化合物不存在的情況下維持的 等分)表示測試化合物具有有害的潛能。各種測試化合物的相對有害潛能可通過比較相關 標志物的表達水平的增強或抑制的程度，通過比較其表達水平被增強或抑制的的標志物的 數目，或通過比較兩者來估量。分離的蛋白質和抗體一個方面涉及分離的標志物蛋白和其生物活性部分，以及適合用作免疫原以引發 抗標志物蛋白或其片段的抗體的多肽片段。在一個實施方案中，天然標志物蛋白可使用標準蛋白質純化技術通過適當的純化方案從細胞或組織來源分離。在另一個實施方案中，含 有完整的標志物蛋白或其區段的蛋白質或肽通過重組DNA技術產生。除重組表達外，可使 用標準肽合成技術化學合成此類蛋白質或肽。“分離的，，或“純化的，，蛋白質或其生物活性部分基本上不含細胞材料或來自細胞 或組織來源(所述蛋白質源自于其)的其他污染性蛋白，或當化學合成時基本上不含化學 前體或其他化學藥品。術語“基本上不含細胞材料”包括其中將蛋白質與從其分離或重組 產生所述蛋白質的細胞的細胞組分分離的蛋白質制劑。因此，基本上不含細胞材料的蛋白 質包括具有低于大約30%、20%、10%或5% (按干重計算)的異種蛋白質(在本文中也稱 為“污染性蛋白”)的蛋白質制劑。當重組產生蛋白質或其生物活性部分時，其也優選基本上不含培養基，S卩，培養基 占據低于大約20%、10%或5%的蛋白質制劑的體積。當通過化學合成產生蛋白質時，其優 選基本上不含化學前體或其他化學藥品，即，其與參與蛋白質合成的化學前體或其他化學 藥品分離。因此，此類蛋白質制劑具有低于大約30%、20%、10%、5% (按干重計算)的化 學前體或除了目的多肽外的化合物。標志物蛋白的生物活性部分包括含有與標志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源 自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全長蛋白質更少的氨基酸，并且展示相應的全長蛋 白質的至少一種活性。通常，生物活性部分包含具有相應的全長蛋白質的至少一種活性的 結構域或基序。標志物蛋白的生物活性部分可以是其長度為例如10、25、50、100或更多個 氨基酸的多肽。此外，其中標志物蛋白的其他區域被缺失的其他生物活性部分可通過重組 技術來制備，并且可就標志物蛋白的天然形式的一種或多種功能活性對其進行評估。在某 些實施方案中，有用的蛋白質與此類序列之一基本上同一(例如，至少大約40%，在某些實 施方案中，50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一)并且保持相應的天然發生的標 志物蛋白的功能活性但因天然等位基因變異或誘變而在氨基酸序列上不同。此外，標志物蛋白的區段文庫可用于產生用于篩選和隨后選擇變異標志物蛋白或 其區段的多肽的多樣化(variegated)群體。預測醫學本文中還提供了動物模型和標志物在預測醫學領域中的用途，其中診斷測定、預 后測定、藥物基因組學和監控臨床試驗用于預后(預測)目的，從而預防性治療個體。因 此，本文中還提供了用于測定一個或多個標志物蛋白或核酸的表達水平以確定個體是否處 于發生肺癌相關疾病的風險中的診斷測定。此類測定可用于預后或預測目的，從而在肺癌 相關疾病發作之前預防性治療個體。在另一個方面，方法可用于相同個體的至少周期性篩查以觀察該個體是否已暴露 于改變他/她的表達模式的化學藥品或毒素。另一方面涉及監控試劑(例如，被施用以抑制肺癌相關疾病或治療或預防任何其 他障礙的藥物或其他化合物(例如，以了解這樣的治療可能具有的任何系統性作用))在臨 床試驗中對標志物的表達或活性的影響。藥物基因組學標志物還可用作藥物基因組學標志物。如本文中所用的，“藥物基因組學標志物” 是其表達水平與患者中特定臨床藥物應答或易感性相關的目的生物化學標志物。藥物基因
39組學標志物表達的存在或量與預測的患者應答和更特別地患者的腫瘤對用特定藥物或藥 物種類的療法的應答相關。通過估量患者中一個或多個藥物基因組學標志物的表達的存在 或量，可選擇最適合于患者的或預測具有更大的成功程度的藥物療法。監控臨床試驗監控試劑(例如，藥物化合物)對標志物的表達水平的影響不僅可用于基礎藥物 篩選，而且還可用于臨床試驗。例如，可在接受肺癌相關疾病治療的受試者的臨床試驗中監 控試劑影響標志物表達的有效性。在一個非限定性實施方案中，本發明提供了用于監控利用試劑(例如，激動劑、拮 抗劑、模擬肽、蛋白質、肽、核酸、小分子或其他藥物候選物)治療受試者的有效性的方法， 該方法包括步驟(i)在施用試劑之前從受試者獲得施用前的樣品；(ii)檢測一個或多個選 擇的標志物在施用前的樣品中的表達水平；(iii)從受試者獲得一個或多個施用后樣品； (iv)檢測標志物在施用后樣品中的表達水平；(v)將施用前樣品中標志物的表達水平與施 用后樣品中標志物的表達水平相比較；以及(vi)相應地改變試劑至受試者的施用。例如，在治療過程中增加的標志物基因的表達可表明無效劑量，從而需要增加劑 量。相反地，減少的標志基因的表達可表明有效治療，從而不需要改變劑量。電子設備可讀介質、系統、陣列和使用其的方法如本文中所使用的，“電子設備可讀介質”是指用于存儲、保存或包含可用電子設 備直接閱讀和存取的數據或信息的任何適當介質。此類介質可包括但不限于磁性存儲 介質，例如軟盤、硬盤存儲介質以及磁帶；光學存儲介質例如光盤；電子存儲介質例如RAM、 R0M、EPR0M、EEPR0M等；以及普通硬盤和這些類別的混合體例如磁性/光學存儲介質。可對 介質進行改造或設定以用于在其上記錄本文中所述的標志物。如本文中所用的，術語“電子設備”旨在包括任何適當的計算或處理設備或其他經 改造或設定用于存儲數據或信息的裝置。適合用于本發明的電子設備的實例包括獨立的計 算設備；網絡，包括局域網(LAN)、廣域網絡(WAN)因特網、內聯網和外聯網；電子器具例如 個人數字助理(PDA)、手機、尋呼機(pager)等；以及局域和分布式處理系統。如本文中所使用的，“記錄”是指在電子設備可讀介質上存儲或編碼信息的過程。 本領域技術人員可容易地采用任何用于在介質上記錄信息的方法來產生包含本文中所述 的標志物的材料。許多軟件程序和格式可用于在電子設備可讀介質上存儲本發明的標志物信息。 為了獲得或產生在其上記錄了標志物的介質，可使用許多數據處理程序構建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或數據庫)。通過以可讀形式提供標志 物，可常規存取用于多種目的的標志物序列信息。例如，本領域技術人員可使用可讀形式的 核苷酸或氨基酸序列來將靶序列或靶結構基序與存儲在數據存儲工具中的序列相比較。搜 索工具用于鑒定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或區域。因此，本文中還提供了用于保存進行確定受試者是否具有肺癌相關疾病或對 肺癌相關疾病的易感性的方法的說明書的介質，其中所述方法包括步驟確定標志物 的存在或不存在并且基于標志物的存在或不存在來確定受試者是否具有肺癌相關疾 病或對肺癌相關疾病的易感性和/或推薦用于肺癌相關疾病或肺癌相關疾病前狀況 (pre-lungcancer-related disease condition)白勺特定治療。
本文中還提供了電子系統和/或在網絡中提供了用于確定受試者是否患有肺癌 相關疾病或具有對與標志物相關的肺癌相關疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步 驟確定標志物的存在或不存在，并且基于標志物的存在或不存在來確定受試者是否患有 肺癌相關疾病或具有對肺癌相關疾病的易感性和/或推薦用于肺癌相關疾病或肺癌相關 疾病前狀況的特定治療。方法還可包括接收與受試者相關的表型信息和/或從網絡獲取與 受試者相關的表型信息的步驟。本文中還提供了網絡，用于確定受試者是否患有肺癌相關疾病或具有對與標志物 相關的肺癌相關疾病的易感性的方法，所述方法包括步驟接收與標志物相關的信息，接收 與受試者相關的表型信息，從網絡獲取相應于標志物和/或肺癌相關疾病的信息，并且基 于表型信息、標志物和獲取的信息中的一個或多個，確定受試者是否患有肺癌相關疾病或 具有對肺癌相關疾病的易感性。方法還包括推薦用于肺癌相關疾病或肺癌相關疾病前狀況 的特定治療的步驟。本文中還提供了用于確定受試者是否患有肺癌相關疾病或具有對肺癌相關疾病 的易感性的商業方法，所述方法包括步驟接收與標志物相關的信息，接收與受試者相關的 表型信息，從網絡獲取相應于標志物和/或肺癌相關疾病的信息，并且基于表型信息、標志 物和獲得的信息中的一個或多個，確定受試者是否患有肺癌相關疾病或具有對肺癌相關疾 病的易感性。方法還包括推薦用于肺癌相關疾病或肺癌相關疾病前狀況的特定治療的步 馬聚o本文中還提供了可用于測定陣列中一個或多個基因的表達的陣列。在一個實施方 案中，陣列可用于測定組織中基因的表達，從而確定陣列中基因的組織特異性。這樣，可就 表達同時測定直至大約7000或更多個基因。這使得能夠產生顯示在一個或多個組織中特 異性表達的一組基因的特征譜。除了此類定性測定外，本文中還提供了基因表達的定量。因此，不僅組織特異性而 且一組基因在組織中的表達水平也是可確定的。因此，可基于基因本身的組織表達和在該 組織中的表達水平來對基因進行分類。這可用于例如確定組織間基因表達的關系。因此， 可干擾一個組織，然后可測定對第二組織中的基因表達的影響。在本說明書中，可測定一種 細胞類型對另一種細胞類型(響應生物刺激)的影響。此類測定可用于例如在基因表達的水平上了解細胞間相互作用的效果。如果試 劑被治療性施用以治療一種細胞類型但其對另一種細胞類型具有不期望的作用，則所述方 法提供了確定不期望的作用的分子基礎的測定，從而提供共施用中和劑(counteracting agent)或另外治療不期望的作用的機會。類似地，即使在單個細胞類型中，可在分子水平上 測定不期望的生物學效應。因此，可確定和中和試劑對非靶基因的表達的作用。在另一個實施方案中，陣列可用于監控陣列中一個或多個基因的表達的時程。如 本文中所公開的，這可發生在各種生物學背景(例如肺癌相關疾病的發生，肺癌相關疾病 的進展)和過程(例如與肺癌相關疾病相關的細胞轉化)中。陣列還可用于確定基因的表達或其他基因的表達在相同細胞或不同細胞中的作 用。如果不能調控最終或下游靶，那么這提供了例如用于治療性干預的備選分子靶的選擇。陣列還可用于確定一個或多個基因在正常和異常細胞中的差異表達模式。這提供 了可用作診斷或治療性干預的分子靶的一組基因。
替代 + 示志物(Surrogate Marker)標志物可用作一種或多種障礙或疾病狀態或導致肺癌相關疾病狀態的狀況的替代標志物。如本文中所使用的，“替代標志物”是與疾病或障礙的不存在或存在，或與疾病或 障礙的進展相關的目的生物化學標志物。此類標志物的存在或量不依賴于疾病。因此，此 類標志物可用于指示特定的療程在減輕疾病狀態或障礙中是否有效。當疾病狀態或障礙的 存在或程度難以通過標準方法來評估，或當在達到潛在危險的臨床終點之前期望評估疾病 進展時，替代標志物是特別有用的。標志物還可用作藥效標志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，“藥 效標志物”是與藥物作用特異性相關的目的生物化學標志物。藥效標志物的存在或量與將 對其施用藥物的疾病狀態或障礙無關；因此，標志物的存在或量表示藥物在受試者中的存 在或活性。例如，藥效標志物可表示藥物在生物組織中的濃度，因為標志物在該組織中表達 或轉錄，或者不表達或轉錄與藥物的水平相關。這樣，藥物的分布或吸收可通過藥效標志物 來監控。類似地，藥效標志物的存在或量可與藥物的代謝產物的存在或量相關，這樣標志物 的存在或量表示藥物在體內的相對分解速率。藥效標志物在增加藥物作用的檢測的靈敏性中特別有用，特別是當以低劑量施用 藥物時。由于即使少量的藥物也可足以激活多輪的標志物轉錄或表達，因此擴增的標志物 可以以比藥物本身更容易檢測的量存在。同樣，標志物由于其本身的性質而可以更容易地 進行檢測；例如，通過使用本文中描述的方法，可將抗體用于針對蛋白標志物的基于免疫的 檢測系統，或可使用標志物特異性放射性標記探針來檢測mRNA標志物。此外，藥效標志物 的使用可提供由于藥物治療而產生的超出可直接觀察的范圍的風險的基于機制的預測。用于檢測的方案檢測肺癌相關疾病的方法包括例如在一段時間內測量各標志物基因在來自受試 者的生物樣品中的表達水平和將該水平與對照生物樣品中標志物基因的水平相比較。當標志物基因是本文中描述的基因之一并且表達水平差異表達(例如，比對照中 的表達水平更高或更低)時，受試者被判斷為患有肺癌相關疾病。當標志物基因的表達水 平落在容許的范圍內時，受試者不可能患有肺癌相關疾病。可通過測量對照中標志物基因的表達水平來預先測定對照的標準值，以比較表達 水平。例如，可基于上述標志物基因在對照中的表達水平來測定標準值。例如，在某些實施 方案中，容許的范圍基于標準值采用士2S.D.。在測定標準值后，可通過只測量來自受試者 的生物樣品中的表達水平并將該值與測定的對照的標準值相比較來進行檢測方法。標志物基因的表達水平包括標志物基因至mRNA的轉錄和至蛋白質的翻譯。因此， 基于相應于標志物基因的mRNA的表達強度或由標志物基因編碼的蛋白質的表達水平的比 較，進行檢測肺癌相關疾病的一個方法。可根據各種基因分析方法在肺癌相關疾病的檢測中測量標志物基因的表達水平。 具體地，可使用例如利用與此類基因雜交的核酸作為探針的雜交技術，或利用與標志物基 因雜交的DNA作為引物的基因擴增技術。可基于標志物基因的核苷酸序列設計用于檢測的探針或引物。本文中描述了各標 志物基因的核苷酸序列的標識號。此外，應理解，高等動物的基因通常伴有高頻率的多態性。也存在許多在剪接過程中產生含有相互不同的氨基酸序列的同種型的分子。與肺癌相關疾病相關的具有與標志物 基因的活性相似的活性的任何基因包括在標志物基因中，即使其由于多態性或為同種型而 具有核苷酸序列差異。也應理解，標志物基因可包括除了人外的其他物種的同源物。因此，除非明確指出，否則表述“標志物基因”是指對于物種獨特的標志物基因的同源物或已被導入個體的外 源標志物基因同樣，應理解，“標志物基因的同源物”是指來源于除了人以外的物種的基因，其在 嚴格條件下可作為探針與人標志物基因雜交。這樣的嚴格條件對于本領域技術人員(其可 通過實驗或憑經驗選擇適當的條件來產生相同嚴格性)來說是已知的。含有標志物基因的核苷酸序列或與標志物基因的核苷酸序列的互補鏈互補并且 具有至少15個核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探針。因此，“互補鏈”是指由 A:T (對于RNA為U)和G:C堿基對組成的雙鏈DNA中相對于另一條鏈的一條鏈。此外，“互補”不僅意指與至少15個連續核苷酸的區域完全互補的序列，而且還指 具有在某些情況下至少40 %，在某些情況下50 %，在某些情況下60 %，在某些情況下70 %， 至少80%、90%和95%或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之間的同源性的程 度可利用算法BLAST等來測定。此類多核苷酸可用作檢測標志物基因的探針，或用作擴增標志物基因的引物。當 用作引物時，多核苷酸通常包含15bp至lOObp，在某些實施方案中15bp至35bp的核苷酸。 當用作探針時，DNA包含標志物基因的整個核苷酸序列(或其互補鏈)，或具有至少15bp核 苷酸的其部分序列。當用作引物時，3'區域必須與標志物基因互補，而5'區域可連接至限 制性內切酶識別序列或標簽(tag)。“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此類多核苷酸可以是合成的或天然發生的。同樣， 通常也標記用作雜交探針的DNA。本領域技術人員易于理解此類標記方法。在本文中，術語 “寡核苷酸”意指具有相對低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸內。可使用例如Northern雜交、斑點印跡雜交或DNA微陣列技術進行利用雜交技術的 肺癌相關疾病的檢測。此外，可使用基因擴增技術例如RT-PCR法。通過在RT-PCR的基因 擴增步驟中使用PCR擴增監控法，可更加定量地分析標志物基因的表達。在PCR基因擴增監控法中，將檢測靶(DNA或RNA的反轉錄物)與用熒光染料和吸 收熒光的猝滅劑標記的探針雜交。當PCR進行并且Taq聚合酶以其5' -3'外切核酸酶活 性降解探針時，熒光染料與猝滅劑彼此分離，從而檢測到熒光。實時檢測熒光。通過同時測 量其中靶的拷貝數是已知的標準樣品，可利用循環數(其中PCR擴增是線性的)測定受試 者樣品中靶的拷貝數。同樣，本領域技術人員公認PCR擴增監控法可使用任何適當的方法 來進行。還可通過檢測標志物基因編碼的蛋白質來進行檢測肺癌相關疾病的方法。在下文 中，標志物基因編碼的蛋白質被描述為“標志物蛋白”。對于此類檢測方法，可通過使用結合 各標志物蛋白的抗體來應用例如，Western印跡法、免疫沉淀法和ELISA法。用于檢測的結合標志物蛋白的抗體可通過任何適當的技術來產生。同樣，為了檢 測標志物蛋白，可適當地標記這樣的抗體。備選地，可不標記抗體，而是標記特異性結合抗 體的物質例如蛋白A或蛋白G以間接檢測標志物蛋白。更特別地，此類檢測方法可包括ELISA 法。 可以例如通過將標志物基因或其部分插入表達載體，將構建體導入適當的宿主細 胞來產生轉化株，培養所述轉化株以表達重組蛋白，然后從培養物或培養上清液純化表達 的重組蛋白來獲得用作抗原的蛋白質或其部分肽。備選地，可化學合成由基因編碼的氨基 酸序列或含有由全長cDNA編碼的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。此外，可通過使用指數(不僅生物樣品中標志物基因的表達水平而且標志物蛋白 的活性)來進行肺癌相關疾病的檢測。標志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物活性。 可使用各種方法測量每一種蛋白的活性。即使在常規檢測中患者未被診斷為患有肺癌相關疾病(盡管癥狀暗示此類疾 病)，這樣的患者是否患有肺癌相關疾病也可通過按照本文中所述的方法進行檢測來容易 地確定。更特別地，在某些實施方案中，當標志物基因是本文描述的基因之一時，其癥狀至 少暗示對肺癌相關疾病的易感性的患者中標志物基因的表達水平的增加或減少表明癥狀 主要由肺癌相關疾病引起。此外，檢測可用于確定肺癌相關疾病是否在患者中得到改善。換句話說，本文中描 述的方法可用于判斷肺癌相關疾病治療的治療效果。此外，當標志物基因是本文描述的基 因之一時，已被診斷為患有肺癌相關疾病的患者中標志物基因的表達水平的增加或減少意 味著疾病已向前發展。還可基于表達水平的差異測定肺癌相關疾病的嚴重性和/或易感性。例如，當標 志物基因是本文描述的基因之一時，標志物基因的表達水平的增加程度與肺癌相關疾病的 存在和/或嚴重性相關。此外，標志物基因本身的表達可通過向基因的轉錄調控區導入突變來控制。本領 域技術人員理解此類氨基酸置換。同樣，被突變的氨基酸的數目不受特別限制，只要活性得 到保持即可。通常，其在50個氨基酸以內，在某些非限定性實施方案中，在30個氨基酸以 內，在10個氨基酸以內，或在3個氨基酸以內。突變的位點可以是任何位點，只要活性得到 保持即可。在另一個方面，本文中提供了治療肺癌相關疾病的治療劑的候選化合物的篩選方 法。一個或多個標志物基因選自本文中描述的基因。可通過選擇能夠增加或減少標志物基 因的表達水平的化合物來獲得肺癌相關疾病的治療劑。應理解，表述“增加基因的表達水平的化合物”是指促進基因轉錄、基因翻譯或蛋 白質活性的表達的步驟中的任一步驟的化合物。另一方面，表述“減少基因的表達水平的化 合物”，如本文中所用的，是指抑制這些步驟中的任一步驟的化合物。在特定的方面，可在體內或體外進行篩選肺癌相關疾病的治療劑的方法。該篩選 方法可以例如通過下列步驟來進行(1)對動物受試者施用候選化合物；(2)測量動物受試 者的生物樣品中標志物基因的表達水平；或(3)選擇與對照(其未與候選化合物接觸)中 標志物基因的表達水平相比較增加或減少標志物基因的表達水平的化合物。在另一個方面，本文中提供了這樣的方法，其通過將動物受試者與候選化合物接 觸，然后監控化合物對來源于動物受試者的生物樣品中標志物基因的表達水平的作用來評 估藥劑的候選化合物對標志物基因的表達水平的功效。來源于動物受試者的生物樣品中標志物基因的表達水平的變化可使用與上述檢測方法中所用的相同的技術來監控。此外，基 于評估，可通過篩選來選擇藥劑的候選化合物。試劑盒在另一個方面，提供了各種診斷和檢測試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒可用于 估量患者是否患有肺癌相關疾病。試劑盒包含用于估量標志物的表達的試劑。在另一個實 施方案中，試劑盒可用于估量化學或生物試劑用于抑制患者的肺癌相關疾病的適合性。此 類試劑盒包含用于估量標志物的表達的試劑，并且可包含一種或多種此類試劑。在另外的實施方案中，試劑盒可用于估量肺癌相關疾病細胞的存在或治療肺癌相 關疾病。此類試劑盒包含特異性結合標志物蛋白或所述蛋白的片段的抗體、抗體衍生物或 抗體片段。此類試劑盒還可包含多種抗體、抗體衍生物或抗體片段，其中多種此類抗體試劑 特異性結合標志物蛋白或所述蛋白的片段。在另外的實施方案中，試劑盒可用于估量肺癌相關疾病細胞的存在，其中試劑盒 包含特異性結合標志物核酸或所述核酸的片段的核酸探針。試劑盒還可包含多種探針，其 中每一種探針特異性結合標志物核酸或所述核酸的片段。本文中所述的組合物、試劑盒和方法尤其可具有下列用途1)估量患者是否患有 肺癌相關疾病；2)估量人患者中肺癌相關疾病的分期；3)估量患者中肺癌相關疾病的分 級；4)估量患者中肺癌相關疾病的性質；5)估量患者中發生肺癌相關疾病的可能性；6)估 量患者中與肺癌相關疾病相關的細胞的組織學類型；7)制備用于治療肺癌相關疾病和/或 評估患者是否患有肺癌相關疾病的抗體、抗體片段或抗體衍生物；8)估量肺癌相關疾病細 胞的存在；9)估量一種或多種測試化合物抑制患者的肺癌相關疾病的功效；10)估量療法 抑制患者的肺癌相關疾病的功效；11)監控患者的肺癌相關疾病的進展；12)選擇抑制患者 的肺癌相關疾病的組合物或療法；13)治療患有肺癌相關疾病的患者；14)抑制患者的肺癌 相關疾病；15)評估測試化合物的有害潛能；和16)在處于發生肺癌相關疾病的風險中的患 者中預防肺癌相關疾病的發生。試劑盒可用于評估肺癌相關疾病細胞(例如在樣品例如患者樣品中)的存在。試 劑盒包含多種試劑，每一種所述試劑能夠特異性結合標志物核酸或蛋白。適合于結合標志 物蛋白的試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段等。適合于結合標志物核酸(例如基因組 DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)的試劑包括互補核酸。例如，核酸試劑可包括固定至基質 的寡核苷酸(標記或未標記的)、未與基質結合的標記的寡核苷酸、PCR引物對、分子信標探 針等。試劑盒可任選地包含用于進行本文中所述的方法的另外的成分。例如，試劑盒可 包含適合于使互補核酸退火或適合于使抗體與其特異性結合的蛋白質結合的液體(例如 SSC緩沖液)、一個或多個樣品隔室、描述方法的進行的說明書、正常肺細胞樣品、肺癌相關 疾病細胞樣品等。動物模型在廣泛的方面，提供了用于產生用于評估至少一種肺癌相關疾病的非人動物模型 的方法。該方法包括將動物暴露于重復劑量的至少一種據認為引起肺癌的化學藥品。在某 些方面，該方法還包括收集一種或多種選擇的動物樣品；和將收集的樣品與一種或多種潛 在的肺癌起始或發生的指示物(indicia)相比較。
在廣泛的方面，提供了產生動物模型的方法，該方法包括在無特定化學藥品的 環境中維持動物并且用至少一種據認為引起肺癌的化學藥品敏化動物。在某些實施方案 中，通過多次連續暴露敏化動物的肺的至少一部分。在另一個廣泛的方面，提供了篩選有 效地抗至少一種肺癌相關疾病的試劑的方法。該方法通常包括對受試動物施用至少一種 試劑，確定試劑是否減輕或加重肺癌相關疾病的一個或多個癥狀；使一個或多個癥狀的減 輕與試劑抗肺癌相關疾病的有效性相互關聯；或使一個或多個癥狀的減輕的不存在與試劑 的無效性相互關聯。動物模型用于評估一個或多個代謝途徑，所述代謝途徑促成了至少一 種肺癌相關疾病的起始、進展、嚴重性、病狀、攻擊性、分級、活性、失能(disability)、死亡 率、發病率、疾病亞分類或其他潛在的致病或病理特征中的至少一種。可利用層次聚類 (hierarchicalclustering)、特征網絡構建(signature network construction)、質譜蛋 白組學分析、表面等離子共振術、線性統計建模、偏最小二乘法判別分析(partial leasts quares discriminant analysis)和多次線性回歸分析中的一種或多種來進行分析。
在特定的方面，通過檢查一個或多個標志物或其功能等同物的表達水平來就至少 一種肺癌相關疾病評估動物模型。由本文中描述的方法產生的動物模型將使得能夠篩選可用于治療或預防肺癌相 關疾病的治療劑。因此，方法可用于鑒定用于治療或預防肺癌相關疾病的治療劑。方法包 括對由本文中所述方法產生的動物模型施用候選試劑，評估與未施用候選試劑的對照動物 模型相比動物模型中至少一種肺癌相關疾病應答。如果至少一種肺癌相關疾病應答在癥狀 上減輕或在發生上延遲，則候選試劑是用于治療或預防肺癌相關疾病的試劑。在另一個方面，本文中提供了肺癌相關疾病的動物模型，其中一個或多個標志物 基因或功能上與標志物基因等同的基因的表達水平在所述動物模型中已被提高。如本文中 所用的，“功能上等同的基因”通常是編碼具有與由標志物基因編碼的蛋白質的已知活性相 似的活性的蛋白質的基因。功能上等同的基因的代表性實例包括受試動物的標志物基因對 應物，其是動物本身固有的。肺癌相關疾病動物模型可用于檢測由于肺癌相關疾病而引起的生理學變化。在某 些實施方案中，動物模型可用于揭示標志物基因的另外的功能和評估其靶為標志物基因的 藥物。在一個實施方案中，肺癌相關疾病動物模型可通過控制對應物基因的表達水平或 施用對應物基因來產生。方法可包括通過控制選自本文中所述的基因的基因的表達水平來 產生肺癌相關疾病動物模型。在另一個實施方案中，方法可包括通過施用由本文中所描述 的基因編碼的蛋白質或施用抗所述蛋白的抗體來產生肺癌相關疾病動物模型。還應理解， 在某些其他實施方案中，可過表達標志物，以便可使用適當的方法測量標志物。在另一個實施方案中，肺癌相關疾病動物模型可通過導入選自此類基因的基因， 或通過施用由這樣的基因編碼的蛋白質來產生。在另一個實施方案中，肺癌相關疾病可通過抑制選自此類基因的基因的表達或由 這樣的基因編碼的蛋白質的活性來誘導。反義核酸、核酶或RNAi可用于抑制表達。蛋白質 的活性可通過施用抑制所述活性的物質例如抗體來有效地控制。動物模型可用于闡明肺癌相關疾病背后的機制，還可用于檢測通過篩選獲得的化 合物的安全性。例如，當動物模型產生肺癌相關疾病的癥狀時，或當牽涉某種肺癌相關疾病的測量值在動物中改變時，可構建篩選系統以探測具有減輕疾病的活性的化合物。如本文中所使用的，表述“表達水平的增加”是指下列情況的任一種在人工表達作為外源基因導入的標志物基因的情況下；在受試動物本身固有的標志物基因的轉錄和其 至蛋白質的翻譯得到增強的情況下；或在作為翻譯產物的蛋白質的水解被抑制的情況下。 如本文中所用的，表述“表達水平的減少”是指其中受試動物的標志物基因的轉錄和其至蛋 白質的翻譯被抑制的狀態，或其中作為翻譯產物的蛋白質的水解被增強的狀態。基因的表 達水平可以例如通過DNA芯片上信號強度的差異來測定。此外，翻譯產物(蛋白質)的活 性可通過與正常狀態中的活性相比較來測定。也在預期的范圍內的是動物模型可包括轉基因動物，包括例如其中已人工導入 并且表達標志物基因的動物；標志物基因敲除動物；和其中已用另一個基因置換標志物基 因的基因敲入動物。已向其中導入了標志物基因的反義核酸、核酶、具有RNAi作用的多核 苷酸或用作誘餌核酸的DNA等的轉基因動物可用作轉基因動物。此類轉基因動物還包括例 如這樣的動物，在所述動物中標志物蛋白的活性已通過將突變導入基因的編碼區而被增強 或被抑制，或氨基酸序列已被修飾而變得抗水解或對水解敏感。氨基酸序列中的突變包括 置換、缺失、插入和添加。本文中所引用的所有專利、專利申請和參考文獻以其全文通過引用合并入本文。 雖然對于制備和使用其的本領域技術人員來說已十分詳盡地描述和例示了本發明，但各種 改變、修飾和改進是顯然的，且不背離本發明的精神和范圍。本領域技術人員易于理解，本 發明可進行適當地改變以適合實現目的和獲得提及的目標和有利方面以及其中固有的那些。本文中所描述的方法和試劑代表優選實施方案，是示例性的，并且不意欲限制本 發明的范圍。其中的改進和其他用途對于本領域技術人員來說顯然的。這些改進包括在本 發明的精神內并且由權利要求的范圍界定。對于本領域技術人員來說，同樣極顯然的是可 對本文中公開的發明進行各種替代和改進而不背離本發明的范圍和精神。應理解，雖然本發明已通過優選實施方案和任選特征明確地公開，但本領域技術 人員可采用本文中公開的概念的改進和變化，并且此類改進和變化被認為在由所附權利要 求界定的本發明的范圍內。雖然通過參考各種和優選實施方案描述了本發明，但本領域技術人員應當理解， 可進行各種變化并且可用等同物替代其元素而不背離本發明的基本范圍。此外，可進行許 多改進以使特定的情況或材料適合于本發明的教導而不背離本發明的基本范圍。因此，本發明不意欲限定于本文中公開的預期用于進行本發明的特定實施方案， 而是意欲包括落在權利要求的范圍內的所有實施方案。本文中用于舉例說明本發明或提供關于本發明的實施的另外的詳細內容的公開 案和其他材料通過引用合并入本文，并且為方便起見提供于下列參考書目中。本文中引用的任何文獻的引用不意欲作為任何前述內容是相關現有技術的承認。 關于日期的所有聲明和關于這些文獻的內容的所有陳述基于申請人可獲得的信息，并且不 構成關于這些文獻的日期或內容的正確性的任何承認。參考文獻1.Bartel, D. P. MicroRNAs :genomics, biogenesis, mechanism, and function.Cell 116，281-297(2004).2. Pasquinelli, A. E.，Hunter，S.，Bracht, J. MicroRNAs :a developing story. Curr. Opin. Genet. Dev. 15，200-205 (2005).3. Calin, G. A, & Croce, C. Μ. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer 6，857-866(2006)4. EsqueIa-Kerscher, A. & Slack，F. J. Oncomirs-microRNAs with a role in cancer. Nat. Rev. Cancer 6，259-269(2006).5. Garzon，R.，Fabbri，M. et al. MicroRNA expression and function in cancer. TrendsMo1. Med. 12，580-587(2006).6. Volinia,S. et al. A micoRNA expression signature of human solid tumors definescancer gene targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103，2257-2261 (2006) ·7. Yanaihara, N. et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosisand prognosis. Cancer Cell 9,189-198 (2006).8. Lal 1, S. et al. A Genome-wide map of conserved microRNA targets in C. Elegans. Curr. Biol. 16，460-471 (2006).9. Lewis, B. P. ， Shih， I. H. ， Jones-Rhoades, M. W. ， Bartel, D. P. ， Burge, C. B. Predictionof mammalian microRNA targets. Cell 115，787-798 (2003)·10. John，B. et al. Human microRNA targets. PLoS Biol. 2，e363 (2004) ·11. Megraw, M.，Sethupathy, P.，Corda，B.，Hatzigeorgiou，A. G. miRGen :A databasefor the study of animal microRNA genomic organization and function. Nucleic Acids Res. 35，D149-D155(2006).12.Lin, R-K. et al. Alteration of DNA methyltransferases contributes to CpGmethylation and poor prognosis in lung cancer. Lung Cancer 55， 205-213(2007).13. Kim, H. et al. Elevated mRNA levels of DNA methyltransferase-1 as anindependent prognostic factor in primary nonsmall cell lung cancer. Cancer 107，1042-1049 (2006).14.Iliopoulos, D. et al. Fragile genes as biomarkers :epigenetic control of WWOX andFHIT in lung，breast and bladder cancer. Oncogene 24，1625-1633(2005) ·15. Jemal，A. et al. Cancer Statistics, 2007. CA Cancer J Clin. 57,43-66(2007).16. Yoo, C. B.，and Jones，P. A. Epigenetic therapy of cancer :past，present and future. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 37-50 (2006).17. Schrump, D. S. & Nguyen, D. M. Targeting the epigenome for the treatment andprevention of lung cancer. Semin. Oncol. 32,488-502(2005).18. Ulivi, P. et al. P16 (INK4A) and CDH13 hypermethylation in tumor and serum ofnon-small cell lung cancer patients. J. Cell Physiol· 206，611-615 (2006)·19. Fabbri，M. et al. WWOX gene restoration prevents lung cancer growth in vitro andin vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102，15611-15616 (2005) ·
20. Suzuki，Μ. et al. RNA interference-mediated knockdown of DNA methyltransferase1 leads to promoter demethylation and gene re-expression in human lung and breast cancercells. Cancer Res. 64, 3137-3143(2004).21. Shen, H. et al. A novel polymorphism in human cytosine DNA-methyltransferase-3B promoter is associated with an increased risk of lung cancer. Cancer Res. 62，4992-4995(2002).22.Belinsky, S.A.et al. Inhibition of DNA methylation and histone deacetylationprevents murine lung cancer. Cancer Res. 63,7089-7093(2003).23. Krek，A. et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat. Genet. 37，495-500 (2005)·24. Vatolin, S.，Navaratne，K.，Weil, R. J. A novel method to detect functionalmicroRNA targets. J. Mol. Biol. 358，983-996 (2006).25. Chen，C. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33，el79 (2005).26. Liu,Z. et al. Characterization of in vitro and in vivo hypomethylating effects ofdecitabine in acute myeloid leukemia by a rapid， specific and sensitive LC-MS/MS method. Nucleic Acids Res. 35，e31 (2007) ·27.Ehrich，M. et al. Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patternsby base-specific cleavage and mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 102，15785-15790 (2005) ·另外的參考文獻(如方法部分所列的)1. Chen，C. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Rees. 33，el79 (2005) ·2. Fabbri, M. et al. WWOX gene restoration prevents lung cancer growth in vitro andin vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102，15611-15616 (2005)·3. Vatolin, S.，Navaratne, K.，Weil，R. J. A novel method to detect functionalmicroRNA targets. J. Mol. Biol. 358，983-996 (2006).4. Liu,Z. et al. Characterization of in vitro and in vivo hypomethylating effects ofdecitabine in acute myeloid leukemia by a rapid， specific and sensitive LC-MS/MS method. Nucleic Acids Res. doi :10.1093/nar/gkl1156 (2007).5.Ehrich, M. et al.Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patternsby base-specific cleavage and mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102，15785-15790 (2005) .
權利要求
用于在有此需要的受試者中恢復期望的DNA甲基化模式的方法，其包括施用有效量的一種或多種足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一種或多種的miR-29。
2.用于在有此需要的受試者中誘導甲基化沉默的腫瘤抑制基因(TSG)的再表達的方 法，其包括施用有效量的一種或多種足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一種或多種的miR-29。
3.權利要求2的方法，其中所述TSG包括ΠΠΤ和WffOX中的一種或多種。
4.用于在有此需要的受試者中體外和體內抑制致瘤性的方法，其包括施用有效量的一 種或多種足以靶向WMT3A和DNMT3B中的一種或多種的miR-29。
5.權利要求1的方法，其中所述受試者是肺癌患者。
6.權利要求4的方法，其中所述抑制方法包括非小細胞肺癌(NSCLC)的表觀遺傳調控。
7.內源miR-29b用作起始DNMT3BmRNA的逆轉錄的引物的用途。
8.用于減少總DNA甲基化的方法，其包括施用有效量的一種或多種靶向DNMT3A和 DNMT3B的miR-29，其中所述miR-29的表達促成癌細胞中的DNA表觀遺傳修飾。
9.用于通過將至少一種核苷類似物與一種或多種足以阻斷從頭和維持DNMT途徑的 miR-29組合來獲得DNA低甲基化的方法。
10.權利要求9的方法，其中所述核苷類似物包括地西他濱。
11.用于增加腫瘤抑制基因(TSG)的表達的方法，其包括用一種或多種mi-R29轉染細胞。
12.權利要求10的方法，其中所述TSG包括ΠΠΤ和WffOX蛋白中的一種或多種。
13.相對于混雜對照，在細胞中體外抑制細胞生長和/或誘導細胞凋亡的方法，其包括 用一種或多種miR-29轉染一種或多種細胞。
14.用于下調ΠΠΤ和/或WffOX酶的表達水平的方法，其包括通過用一個或多個miR-29 家族成員轉染細胞來調控DNMT3A和/或DNMT3B。
15.權利要求14的方法，其中所述細胞是肺癌細胞。
16.用于減少總DNA甲基化的方法，其包括在肺癌細胞中誘導mi-R29的表達。
17.用于恢復TSG的表達的方法，其包括在肺癌細胞中誘導mi-R29的表達。
18.用于體外和體內抑制致瘤性的方法，其包括在肺癌細胞中誘導mi-R29的表達。
19.用于開發表觀遺傳療法的方法，其單獨地或與其他治療組合使用合成的miR-29以 在癌細胞中再激活腫瘤抑制基因并且使異常的甲基化模式恢復正常。
20.權利要求19的方法，其中所述癌細胞是肺癌細胞。
21.診斷受試者是否患有肺癌相關疾病、是否處在發生所述疾病的風險中，或對于所述 疾病是否具有減少的存活預后的方法，該方法包括測量來自受試者的測試樣品中至少一種 miR基因產物的水平，其中相對于對照樣品中相應的miR基因產物的水平，測試樣品中所述miR基因產物的 水平的改變表示受試者患有肺癌相關疾病或處于發生所述疾病的風險中，其中至少一種miR基因產物選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合。
22.檢測至少肺癌相關疾病應答的起始、對其的易感性、或對于其的減少的存活預后的 方法，該方法包括(1)測定來自測試受試者的樣品中至少一種標志物的表達水平；所述至少一種標志物 包括至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產物；(2)將步驟(1)中測定的表達水平與來自健康受試者的樣品中標志物的對照表達水平 相比較；和(3)當步驟(2)中的比較的結果顯示i)測試受試者中所述至少一種標志物的表達水平高于對照中的表達水平，或 )測試受試者中所述至少一種標志物的表達水平低于對照中的表達水平時，判斷受試者患有肺癌相關疾病。
23.權利要求22的方法，其中所述樣品包括組織、血液、血漿、血清、尿和糞便中的一種 或多種。
24.權利要求22的方法，其中體外進行所有方法步驟。
25.診斷受試者是否患有肺癌相關疾病、是否處在發生所述疾病的風險中，或對于所述 疾病是否具有減少的存活預后的方法，其包括(1)從獲自受試者的測試樣品逆轉錄RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)將所述靶寡脫氧核苷酸與含有miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供 測試樣品的雜交特征譜；和(3)將測試樣品雜交特征譜與從對照樣品產生的雜交特征譜相比較；其中至少一種miRNA的信號的改變表示所述受試者患有肺癌相關疾病、處在發生所述 疾病的風險中，或對于所述疾病具有減少的存活預后；其中至少一種miRNA的信號，相對于從對照樣品產生的信號，被上調或下調，并且，其中所述微陣列包含針對一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的 miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。
26.在受試者中抑制腫瘤發生的方法，所述受試者患有或懷疑患有肺癌相關疾病，其中 至少一種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因產物相對于對照細胞在所述 受試者的癌細胞中被下調或上調，所述方法包括(1)當所述至少一種miR基因產物在癌細胞中被下調時，對所述受試者施用有效量的 至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29C和其組合的分離的miR基因產物，從而在所述受試 者中抑制腫瘤發生；或(2)當所述至少一種miR基因產物在癌細胞中被上調時，對所述受試者施用有效量的 至少一種用于抑制至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產物的表 達的化合物，從而在所述受試者中抑制腫瘤發生。
27.權利要求26的方法，其中步驟(1)和/或步驟(2)中所述至少一種分離的miR基 因產物是miR29a、miR_29b、miR-29c或其分離的變體或生物活性片段或功能等同物，或與 其結合的抗體。
28.在患有肺癌的受試者中抑制腫瘤發生的方法，其包括(1)測定相對于對照細胞，受試者的癌細胞中至少一種miR基因產物的量；和(2)通過下列方法改變癌細胞中表達的miR基因產物的量(i)如果癌細胞中表達的miR基因產物的量低于對照細胞中表達的miR基因產物的量， 則對所述受試者施用有效量的至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29C和其組合的分離的 miR基因產物；或( )如果癌細胞中表達的miR基因產物的量高于對照細胞中表達的miR基因產物的量，則對所述受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產物的表達的 化合物，從而在所述受試者中抑制腫瘤發生。
29.權利要求28的方法，其中步驟(i)中所述至少一種分離的miR基因產物是miR29a、 miR-29b、miR-29c或其分離的變體或生物活性片段。
30.權利要求29的方法，其中步驟(ii)中所述至少一種miR基因產物選自iR29a、 miR-29b、miR-29c和其組合，或其分離的變體或生物活性片段。
31.鑒定腫瘤發生的抑制劑的方法，其包括 給細胞提供測試試劑，和測量至少一種與肺癌相關疾病中改變的表達水平相關的miR基因產物的水平， 其中相對于適當的對照細胞，細胞中所述miR基因產物的水平的增加或減少表示所述 測試試劑是腫瘤發生的抑制劑；其中所述miR基因產物選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合。
32.鑒定腫瘤發生的抑制劑的方法，其包括 給細胞提供測試試劑，和測量至少一種與肺癌相關疾病中改變的表達水平相關的miR基因產物的水平， 其中相對于適當的對照細胞，細胞中所述miR基因產物的水平的減少表示所述測試試 劑是腫瘤發生的抑制劑；其中所述miR基因產物選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合。
33.權利要求32的方法，其中所述癌癥是肺癌。
34.用于評估一個或多個代謝途徑的標志物，所述代謝途徑促成至少一種肺癌相關疾 病的起始、進展、嚴重性、病狀、攻擊性、分級、活性、失能、死亡率、發病率、疾病亞分類或其 他潛在的致病或病理特征中的至少一個，其中所述標志物包括一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因產物。
35.包含一種或多種前述權利要求的標志物的組合物。
36.鑒定受試者中至少一種肺癌相關疾病的起始或發生的可能性的方法，所述方法測 量一種或多種前述權利要求的任一項的標志物。
37.權利要求36的方法，其中一種或多種標志物存在于分離的樣品中并且在體外進行 所有方法步驟。
38.用于檢測肺癌相關疾病的試劑，其中所述試劑包含含有至少一種前述權利要求的 任一項的標志物的核苷酸序列或與所述標志物的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸。
39.用于檢測肺癌相關疾病的試劑，其中所述試劑包含識別由至少一種前述權利要求 的任一項的標志物編碼的蛋白質的抗體。
40.用于檢測肺癌相關疾病的DNA芯片，在所述芯片上已固定探針以測定至少一種前 述權利要求的任一項的標志物。
41.評估療法預防、診斷和/或治療至少一種肺癌相關疾病的有效性的方法，其包括 (1)將動物經歷其有效性有待評估的療法，和(2)通過評估至少一種前述權利要求的任一項的標志物來測定被測試的療法在治療或 預防肺癌相關疾病中的有效性水平。
42.權利要求41的方法，其中所述候選治療劑包含藥物組合物、營養食品組合物和順 勢療法組合物中的一種或多種。
43.權利要求42的方法，其中所述待評估的療法用于人受試者。
44.權利要求43的方法，其中所述方法不是通過手術或療法治療人或動物體的方法。
45.在動物模型中就起始肺癌相關疾病應答的能力估量至少一種材料的潛能的方法， 所述方法提供(1)在將所述動物暴露于一種或多種在量上足以在所述動物中起始肺癌相關疾病應答 的材料后，測量一種或多種被上調或下調的前述權利要求的任一項的標志物；和(2)確定至少一種被上調或下調的標志物是否具有起始肺癌相關疾病應答的能力。
46.用于治療肺癌相關疾病的藥物組合物，其包含至少一種選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合的miR基因產物；和 藥學上可接受的載體。
47.權利要求46的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產物相應于與適當的對照 細胞相比，在癌細胞中被上調或下調的miR基因產物。
48.權利要求46的藥物組合物，其中所述肺癌相關疾病是腺癌。
49.用于治療肺癌的藥物組合物，其包含 至少一種miR表達抑制化合物，和藥學上可接受的載體，其中所述至少一種miR表達抑制化合物對于選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合 的miR基因產物是特異性的。
50.權利要求49的藥物組合物，其中所述至少一種miR表達抑制化合物對于與適當的 對照細胞相比，在癌細胞中被上調或下調的miR基因產物是特異性的。
51.一種制品，其包含至少一種結合肺癌相關疾病的標志物的捕獲試劑，所述標志物 選自至少一種前述權利要求的任一項的標志物。
52.用于篩選治療肺癌相關疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包含至少一種前述權利要求的任一項的標志物的一種或多種試劑，和 表達至少一種標志物的細胞。
53.權利要求52的試劑盒，其中使用含有特異性結合至少一種標志物的抗體或抗體片 段的試劑檢測所述標志物的存在。
54.權利要求53的試劑盒，其中所述試劑是標記的、放射性標記的或生物素標記的，和 /或其中所述抗體或抗體片段是放射性標記的、發色團標記的、熒光團標記的或酶標記的。
55.權利要求54的試劑盒，其還包括裝有至少一種所述標志物的容器。
56.權利要求55的試劑盒，其中所述試劑包含抗體、所述試劑連接或可連接至其的探 針和固定化的金屬螯合物中的一種或多種。
57.肺癌相關疾病的篩選試驗，其包括將一種或多種前述權利要求的任一項的標志物與此類標志物的底物以及與測試試劑接觸，和確定所述測試試劑是否調節所述標志物的活性。
58.權利要求57的篩選試驗，其中在體外進行所有方法步驟。
59.用于預測受試者中肺癌相關疾病的存在的微陣列，其包含抗至少一種前述權利要 求的任一項的標志物的抗體。
60.權利要求59的微陣列，其中通過檢測轉錄的多核苷酸或其部分的存在來估量所述 標志物的表達水平，其中所述轉錄的多核苷酸包含所述標志物的編碼區。
61.權利要求60的微陣列，其中所述樣品是肺癌相關體液或組織。
62.權利要求61的微陣列，其中所述樣品包含獲自所述患者的細胞。
63.用于在有此需要的個體中治療、預防、逆轉或限制肺癌相關疾病并發癥的嚴重性的 方法，包括對所述個體施用干擾至少一種肺癌相關疾病應答的信號轉導途徑的試劑，以足以干擾 此類信號轉導的量，其中所述試劑包含至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產物。
64.干擾至少一種肺癌相關疾病應答的信號轉導途徑的試劑用于制造藥物的用途，所 述藥物用于在個體中治療、預防、逆轉或限制肺癌相關疾病并發癥的嚴重性，其中所述試劑包含至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產物。
65.用于在有此需要的個體中治療、預防、逆轉或限制肺癌相關疾病并發癥的嚴重性的 方法，包括對所述個體施用干擾至少一種肺癌相關疾病應答的級聯的試劑，其中所述試劑包含至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產物。
66.干擾至少一種肺癌相關疾病應答的級聯的試劑用于制造藥物的用途，所述藥物用 于在個體中治療、預防、逆轉或限制肺癌相關疾病并發癥的嚴重性，其中所述試劑包含至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產物。
67.包含具有多個數字編碼的參照特征譜的數據庫的計算機可讀介質，其中至少第一 參照特征譜代表了來自一個或多個展示肺癌相關疾病應答的指標的受試者的一個或多個 樣品中至少第一標志物的水平，其中所述標志物包括一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因 產物。
68.權利要求67的計算機可讀介質，其包含至少第二參照特征譜，所述第二參照特征 譜代表了來自一個或多個展示肺癌相關疾病應答的指標的受試者或患有肺癌相關疾病的 受試者的一個或多個樣品中至少第二標志物的水平。
69.用于確定受試者是否患有肺癌相關疾病、是否易于患有所述疾病或是否具有對于 所述疾病的不良存活預后的計算機系統，其包括前述權利要求的任一項的數據庫，和包含計算機可執行編碼的服務器，所述編碼使計算機接收受試者的特征譜，從數據庫 鑒定在診斷上與受試者特征譜相關的匹配的參照特征譜，并且產生受試者是否患有或易于 患有肺癌相關疾病的指示。
70.用于評估受試者中肺癌相關疾病的存在、不存在、性質或程度的計算機輔助方法，包括(1)提供包含用于對來自從所述受試者獲得的樣品的數據進行分類的模型或算法的計 算機，其中所述分類包括分析關于至少一種標志物的存在、不存在或量的數據，和 其中所述標志物包括一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因 產物；(2)輸入來自從所述受試者獲得的生物樣品的數據；和(3)對所述生物樣品進行分類以表明肺癌相關疾病的存在、不存在、性質或程度。
71.權利要求70的方法，其中所述至少一種miR基因產物和其組合包括其分離的變體 或生物活性片段或功能等同物，或與其結合的抗體。
72.權利要求71的方法，其中所述肺癌相關疾病是腺癌。
73.肺癌的動物模型，其中存在一種或多種選自miR29a、miR-29b、miR-29C和其組合的 miR基因產物的至少一種改變的表達。
74.權利要求73的動物模型，其中所述動物模型是非人脊椎動物。
75.權利要求74的動物模型，其中所述動物模型是小鼠、大鼠、兔或靈長類動物。
全文摘要
公開了通過施用有效量的一個或多個足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一個或多個的miR-29來恢復期望的DNA甲基化模式，誘導甲基化沉默的腫瘤抑制基因(TSG)的再表達，和/或在有此需要的受試者中體外和體內抑制致瘤性的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101809169SQ200880108625
公開日2010年8月18日 申請日期2008年7月30日 優先權日2007年7月31日
發明者C·M·克羅斯, M·法布里 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會