植物中表達的噬菌體外膜破壞蛋白用于控制革蘭氏陰性細菌的應用的制作方法

專利名稱：植物中表達的噬菌體外膜破壞蛋白用于控制革蘭氏陰性細菌的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及殺死或抑制在植物中感染、侵染或導致疾病的革蘭氏陰性細菌的生長 的方法，所述革蘭氏陰性細菌包括在植物中導致疾病或在人類或動物飼料料中導致食物傳 播疾病的病原性、腐生性和條件性微生物。
背景技術：
將此處所有出版物和專利申請通過述及并入，其范圍如同每一篇獨立出版物或專 利申請被詳細和單獨的通過述及并入一樣。以下描述包括可能有助于理解本發明的信息。其并非承認此處提供的任何信息是 現要求保護的發明的現有技術或與之相關，也并非承認任何明確或隱含引用的出版物是現 有技術。為了商業化農業目種植的植物近乎總是作為一致的單種栽培來種植；也就是說， 一種給定作物的單個變種通過無性繁殖或通過種子進行大規模生產，并以極大規模種植。 當能克服給定變種的天然疾病抗性或抗蟲性的病原體或害蟲到來時，由于單種培養的實施 會產生嚴重的經濟損失，有時牽涉到給定地區全部作物的損失。大量應用農藥控制病蟲害 是昂貴的、不環保的且經常不太可能。例如，柑橘潰瘍病(citrus canker disease)，由受檢 疫的革蘭氏陰性細菌病原體柑橘黃單胞菌(Xanthomonas citri)引起，無法控制的席卷了 整個佛羅里達。作為又一個例子，革蘭氏陰性細菌病原體柑橘黃龍病菌(Ca. Liberibacter asiaticus)是一種 USDA 選擇劑(USDA Select Agent)(潛在的生物恐怖劑；http //www. aphis, usda. qov/programs/ag_selectaqent/ag. —bioterr—toxinslist. html)，其在 2005 年被引入佛羅里達并不可控制的蔓延整個佛羅里達。該病原體威脅了世界柑橘生產。作為 第三個例子，革蘭氏陰性細菌病原體茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)種3生物變 體2(Race 3Biovar 2)曾多次被引入美國，并且其對于美國馬鈴薯生產如此具有嚴重威脅 以致其也被列入USDA選擇劑。該病原體通過感染天竺葵(geranium)植株而進入美國，但 無癥狀，因此延誤了對該病原體的檢出。作為第四個也是最后一個例子，已報道了由于革蘭氏陰性細菌大腸桿菌的嚴重的 人類疾病甚至死亡，該細菌能在內不感染_不僅是污染_特定作物植株，例如菠菜、苜蓿芽和綠豆芽。已報道了幾次與有機培養的芽苗和生菜(mesclim lettuce)相關的沙門氏菌 (Salmonella)和大腸桿菌 0157:H7 的爆發(Doyle,M. P. 2000. Nutrition 16 :647_9)。根據 FDA在其網站上對2006年在受污染菠菜中的大腸桿菌的爆發的報道(http://www. cfsan. fda. gov/ dms/spinacaa. html)“迄今為止，已向CDC報道了 204例由大腸桿菌0157:H7 感染引起的疾病，包括31例涉及一種稱為溶血性尿毒性綜合征(HUS)的腎衰竭，104例入院 治療，和3例死亡。首例死亡是威斯康辛州的一名大齡婦女；第二例死亡，是愛達荷州的一 名2歲兒童，而第三例死亡，是內布拉斯加州的一名大齡婦女”。常規植物育種來控制這些植 物病或食物傳播污染已被證實不可能。因此緊急和迫切的需要基因工程技術提供植物(包 括載體植物如天竺葵)，所述植物對其天然易感的或耐受的疾病或害蟲具有抗病性和抗蟲 性。廣泛多樣的抗細菌和抗真菌蛋白已被鑒定，且其基因已從動物和植物二者中分 離。由于真菌，革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌細胞壁結構的顯著不同，這些蛋白中許多 只攻擊真菌或革蘭氏陽性細菌，這兩者具有直接暴露于環境的細胞壁。革蘭氏陰性細菌不 具有直接暴露于環境的細胞壁。相反，它們的細胞壁被獨特的外膜結構所包被和保護，即脂 多糖(LPS)屏障，其提供非常有效的附加屏障來保護它們的細胞壁免受大多數真核防御， 尤其是植物防御。USDA作為選擇劑列出的病原體中絕大多數是細菌病原體，并且其均為革 蘭氏陰性。LPS為革蘭氏陰性細菌針對外部產生的酶提供有效防御，所述外部產生的酶能夠 有效降解細菌細胞壁(也稱胞壁質層)，包括革蘭氏陽性細菌和真菌的相對厚但暴露的細 胞壁。例如，溶菌酶是抗微生物劑，其發現于哺乳動物細胞、昆蟲、植物、細菌和病毒中，其破 壞細菌和真菌細胞壁，特異性切割再生胞壁肽的氨基糖間的鍵(微生物細胞壁的N-乙酰胞 壁酸的C-I和N-乙酰葡萄糖胺的C-4 (Ibrahim等.2001及其參考文獻))。一些溶菌酶也 是多效裂解蛋白，意味著它們在殺死革蘭氏陰性和陽性細菌方面有活性，但這種活性不是 由于溶菌酶的酶促作用，而是特定的由于一種短線性肽片段，該片段是一些溶菌酶的降解 產物；是所述溶菌酶的線性降解產物穿透LPS屏障和細胞壁(但均無損害)，到達內膜并透 化內膜，導致裂解(During等，1999 ；Ibrahim等.2001)。但是，這種線性肽活性在植物中作 用不佳(見下文)。那些顯示殺死革蘭氏陰性細菌的抗微生物蛋白大多數是小肽(長度小于50個氨 基酸的蛋白質)，其為兩親性的并荷正電，因此他們被吸引到帶負電的革蘭氏陰性外膜，其 足夠小而可以穿過暴露的LPS，并且也可以穿過相對薄的革蘭氏陰性細胞壁。這些肽通常 發揮透化內膜的作用，直接引起細胞死亡。在剛過去的20年內，在病毒、昆蟲、植物和動物 中發現了超過 500 種的抗微生物肽(Jaynes 等，1987 ；Mitra and Zhang, 1994 ；Broekaert 等.1997 ；Nakajima等，1997 ；Vunnam等，1997)。其中描述最好的是在來源生物體和人工 媒介中對病毒、細菌、真菌、寄生蟲和甚至腫瘤細胞有廣譜活性的肽(Hancock and Lehrer, 1998)。迄今在這些抗微生物肽中描述最廣泛的組是線性的(如，殺菌肽(cecropins)、 天蠶抗菌肽(attacins)和爪蟾抗菌肽(magainins))。但是，線性肽并不在植物中天然 存在，并且大多數線性肽被植物蛋白酶迅速降解。例如，當與植物細胞間液一起溫育時， 殺菌肽B迅速降解，其半衰期從在馬鈴薯中的約3分鐘到在稻中的約25小時(Owens &Heutte，1997)。表達殺菌肽的轉基因煙草植株只有輕微增加的抗(革蘭氏陰性)丁香 假單胞菌煙草致病變種(Pseudomanas syringae pv. tabaci)抗性，該菌是煙草野火病 (tobacco wildfire) (Huang等1997)的起因。合成的殺菌肽類似物Shiva-I和SB-37 (表 達自馬鈴薯植株中的轉基因)只輕微降低由(革蘭氏陰性)胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)引起的細菌感染(Arce等1999)。表達SB-37肽的轉基因蘋果在田間試驗中 只顯示了輕微增加的對(革蘭氏陰性)解淀粉歐文氏菌(E. amylovora)的抗性(Norelli 等1998)。類似的，表達天蠶抗菌肽的轉基因馬鈴薯顯示了對胡蘿卜軟腐歐文氏菌引起的細 菌感染的抗性(Arce等1999)，且表達天蠶抗菌肽基因的轉基因梨和蘋果也已顯示了輕微 增強的對解淀粉歐文氏菌的抗性(Norelli等1994 ；Reynoird等1999)。也發現了天蠶抗 菌肽E由植物迅速降解(Ko等2000)。表達合成爪蟾抗菌肽類似物的轉基因煙草植株對細 菌病原體胡蘿卜軟腐歐文氏菌僅有輕微抗性，該類似物經修飾而對胞外植物蛋白酶較不敏 感(Li 等 2001)。二硫鍵連接的肽(如防衛素(defensins)、prophenins和奇甜蛋白(thaumatins)) 當在植物中表達時顯示了更有前景的穩定性，但抗性要么弱，未證明，要么產生細胞毒性問 題。母雞卵白溶菌酶基因(具有裂解活性)已被用于為轉基因煙草植株賦予弱革蘭氏陰性 細菌疾病抗性(Trudel等1995 ；Kato等1998)。也已報道了噬菌體T4溶菌酶輕微增強轉基 因馬鈴薯對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抗性(During等1993 ；AhrenhoIz等.，2000)以及在轉 基因蘋果中對解淀粉歐文氏菌的抗性(Ko 1999)。但是，如先前所述，溶菌酶對革蘭氏陰性 細菌的作用是特定地由于一種據推測對蛋白酶敏感的短裂解肽片段(Ibrahim等.2001)。 奇甜蛋白表現出迄今表征的最廣泛的抗微生物活性，但也表現出對真核細胞的強力細胞毒 性作用(Taguchi等2000)。由植物、哺乳動物和昆蟲產生的防衛素的特征是復雜的β-折 疊結構，帶有幾個結合和破壞微生物質膜的二硫鍵。一種來自苜蓿的植物防衛素針對真菌 病原體提供強力抗性(Guo等2000)，而來自菠菜的防衛素在體外對革蘭氏陽性和陰性細菌 有活性(Segura等.1998)。但是，感染了腸細菌的苜蓿和菠菜二者已導致了人類疾病的產 生；顯然這些防衛素要么不是由這些細菌觸發，要么對這些細菌無效。迫切需要更有效的抗 細菌劑來保護作物植株。非酶的抗微生物肽在自然界中是豐富的，但在轉基因植物中含量有限(of limited value)，主要由于植物蛋白酶的降解。此外，一些革蘭氏陰性細菌即使在培養基中 也對抗微生物肽有抗性，因為LPS的化學結構中的變異(Gutsmarm等.，2005)。這可以幫助 解釋為什么植物病原細菌能克服宿主植物防衛素。迄今，當在植物中表達時沒有證明抗菌 肽有除了針對革蘭氏陰性細菌的邊緣效果之外的效果。迫切需要更有效的控制植物疾病的 方法。與動物的細菌病原體相比，植物的細菌病原體中的絕大多數均為革蘭氏陰性。如 上所述，革蘭氏陰性細菌的區別特征是存在LPS，其形成一種完全圍繞細胞壁的外膜。影響 柑橘的一種(革蘭氏陰性)細菌植物病原體LPS結構的突變引起該病原體在柑橘上迅速消 失，但在大豆(bean)上沒有，表明LPS結構在避免特定植物的植物化學防御中的重要性。此 外，影響革蘭氏陰性細菌中多藥運出的突變導致細菌在植物中迅速消失，凸顯了低分子量 植物防御化合物(植物抗毒素)在植物防御中的作用，并進一步表明革蘭氏陰性菌的完整 LPS在抵抗植物防御化合物中的重要性(Reddy等.，2007)。多藥運出需要完整的LPS行使
8功能。動物針對微生物入侵具有一套獨特的固有防御，不依賴于在先暴露給病原體 (Hoffman等.，1999)。其中有上面討論的裂解肽，也有嗜中性粒細胞，一種作為先天免疫系 統一部分的白細胞。嗜中性粒細胞產生多種殺死微生物的蛋白質和肽抗生素。其中有殺細 菌/滲透性增強(BPI)蛋白，其是一種強力的抗微生物蛋白，主要對革蘭氏陰性細菌有活 性(Levy，2000)。BPI對革蘭氏陽性細菌、真菌或動物細胞無毒，但卻攻擊革蘭氏陰性細胞 的LPS層，破壞其結構并最終攻擊內膜和導致裂解(Marmion等.，1990)。BPI蛋白的一個 標志是他們的強陽離子性、富含賴氨酸的本質，以及其調理能力或免疫系統激活能力(Levy 等.，2003)。BPI蛋白家族成員包括脂多糖結合蛋白(LBP)，肺特異性X蛋白(LUNX)，顎、肺 和鼻上皮克隆(PLUNC)和腮腺分泌性蛋白(PSP)，其中許多是通過生物信息學技術鑒定的， 家族成員之間具有高達43%的同一性(Wheeler等.2003)。涵蓋BPI和特定的較小的肽衍 生物的用途的專利有許多(例如，US 5，830，860和US 5，948，408)。抗微牛物的噬菌體蛋白所有噬菌體必須逃脫細菌宿主細胞，要么通過從宿主細胞擠出，如對于絲狀噬菌 體，要么通過宿主細胞從內裂解。宿主細胞從內裂解需要兩個事件穿過革蘭氏陰性和革蘭 氏陽性兩種細菌的內膜的能力，和解聚在革蘭氏陽性細胞壁中相對厚的胞壁質層的能力。噬菌體穿入并流出通過內膜在許多(但顯然不是所有)噬菌體中是通過使用稱為 “穴蛋白(holin) ”的小膜定位蛋白完成的，顯示該蛋白積累于細菌內膜直到達到特定濃度， 此時它們被認為進行自組裝以透化內膜(Grundling等.，2001 ；Wang等· 2000 ；Young等·， 2000)。術語“穴蛋白”和“類穴蛋白(holin-like)”在生化上或者甚至在功能上都不是準確 的術語，但相反如此處所用，意指任何具有至少一個能透化內膜的跨膜結構域的噬菌體蛋 白，由此允許穴蛋白之外的通常由內膜隔離的胞質內分子(包括諸如內溶素等的蛋白質) 攻破或穿過內膜以達到細胞壁。穴蛋白的生化功能是推測的；大多數(如不是所有的)關 于穴蛋白的現有知識是基于λ噬菌體S蛋白(Haro等.2003)。穴蛋白由至少35個不同家族中的基因編碼，有至少一個跨膜結構域并分為三種 拓撲學類型(類型Ι、ΙΙ和III，分別具有三、二和一個跨膜結構域[TMD])，都沒有檢測到的 直向同源關系(Gmndling等.，2001)。已知至少兩種穴蛋白是溶血的，且該溶血功能被假設 在特定細菌對昆蟲和線蟲的發病機理中起作用(BriIlard等.，2003)。只有少數已在體內 功能方面進行了表征，導向至少兩種關于它們可能如何發揮功能的非常不同的理論。最為 廣泛接受的理論是穴蛋白行使功能形成寡聚膜孔(Graschopf & Blasi，1999 ；Young等.， 2000)。胞壁質層的解聚是通過稱為內溶素的裂解酶完成的。內溶素有至少三種功能不同 的類型1)葡萄糖胺酶(溶菌酶)，其攻擊肽聚糖的氨基糖間的糖苷連接；2)酰胺酶，其攻 擊聚糖鏈和交聯肽之間的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺連接，和3)內肽酶，其攻擊肽間橋 連接(Sheehan等.，1997)。內溶素的合成未使用可允許其接近肽聚糖(胞壁質)層的輸出 信號序列，并且因此其通常在噬菌體感染的細菌的細胞質中積累，直到其通過穴蛋白活性 釋放(Young andBlasi，1995)。溶菌酶已被建議作為能用作對抗革蘭氏陽性和陰性兩種細菌的外部作用劑的有 用抗生素，因為至少它們中的一些是多功能的(During等.，1999)。該雙重功能性是基于發現T4噬菌體和母雞卵白溶菌酶都具有葡萄糖胺酶(glucosaminidase)活性和使其能夠穿 透并破壞細菌、真菌和植物的膜的兩親性螺旋狀伸展(During等.，1999)。溶菌酶的殺微 生物活性能受到C-末端添加的影響；添加疏水性氨基酸降低對革蘭氏陽性細菌的活性，但 增加對革蘭氏陰性的大腸桿菌的活性(Arima等.，1997 ；Ito等.，1997)。向T4溶菌酶添 加組氨酸，一種親水性氨基酸，使其對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的抗微生物活性加倍 (During 等·，1999)。溶菌酶的非酶促殺微生物功能似乎緣于兩親的C-末端結構域，該結構域可由模 仿C-末端溶菌酶結構域構建的小合成肽所模擬(During等.，1999)。如上所述，已建立了 表達溶菌酶并對特定植物病原體有某種抗性的轉基因植物。因為大多數內溶素在細菌細胞 中積累到高效價而不引起裂解，所以預期除特定溶菌酶如T4之外的內溶素如果在外部施 用不會攻擊革蘭氏陰性細菌，因為革蘭氏陰性細菌被由LPS和脂雙層組成的外膜包圍，其 會保護胞壁質層免受酶攻擊，如同其內膜一樣有效。已有嘗試使用完整噬菌體處理動物和植物的細菌病。所有這些嘗試在其用途上都 有嚴重局限。例如，美國專利5，688，501公開了一種使用完整噬菌體處理動物感染性疾病 的方法，該噬菌體對于該疾病的細菌引發劑是特異性的。美國專利4，957，686公開了一種 使用完整噬菌體預防齲齒的方法，該噬菌體對于齲齒的細菌引發劑是特異性的。Flaherty 等(2000)描述了一種使用完整噬菌體治療植物的感染性疾病的方法，該噬菌體對于該疾 病的細菌引發劑是特異性的。在所有這些使用完整噬菌體的例子和類似例子中，噬菌體必 須粘附細菌宿主，且這種粘附具有高度宿主特異性，將噬菌體的應用限制于特定的細菌宿 主種，并且有時是特定的細菌宿主株。此外，為發生粘附，細菌必須在正確的生長期，且噬菌 體必須能接近細菌，細菌經常深埋在動物或植物的組織中或被部分通過分泌細菌胞外多糖 (EPS)而形成的細菌生物膜掩蔽。已嘗試過通過用表達胞外脂多糖(Eps)降解酶(EPS-解聚酶)的轉基因植物治療 梨和蘋果樹的解淀粉歐文氏菌細菌感染，該酶衍生自解淀粉歐文氏菌噬菌體。但是，充其 量，獲得的抗性水平較弱，且噬菌體EPS-解聚酶對來自解淀粉歐文氏菌的EPS特異性很高。 顯然需要更有效的且更通用的對策。已嘗試過通過使用裂解酶制備物治療動物的(而非植物的)革蘭氏陽性細菌疾 病，該酶制備物從感染了噬菌體的細菌或從表達噬菌體基因的細菌中提取。這些也有嚴重 的局限性。例如，美國專利No. 5，985，271公開了一種通過使用粗特異性內溶素制備物治療 一種由特定革蘭氏陽性菌-鏈球菌(Stri5pt0C0CCUS)引起的動物疾病的方法。類似的，美 國專利No. 6，017，528公開了一種通過使用粗特異性內溶素制備物預防和治療動物鏈球菌 感染的方法。類似的，WO 01/90331和US 2002/0058027公開了通過使用由特異性內溶素 組成的純化制備物預防和治療動物鏈球菌感染的方法。在所有這些例子中，酶制備物必須 是純化的、緩沖的，并制備好以便運輸到目的區域并保存在目的地點。此外，該酶必須能接 近感染細菌，并有足夠的量以殺死生長中的細菌。這些方法中沒有可以用于治療革蘭氏陰 性細菌的，因為內溶素不能穿過此種細菌的外膜。已嘗試過通過使用裂解酶制備物治療動物的(而非植物的)革蘭氏陽性細菌和革 蘭氏陰性細菌疾病，該酶制備物從感染了噬菌體的細菌或表達噬菌體基因的細菌中提取。 WO 01/51073,WO 01/82945,WO 01/019385、US2002/0187136 和 US 2002/0127215 公開了通
10過使用裂解酶預防和治療動物的多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌感染的方法，所述裂解 酶任選地包括特異性“穴蛋白裂解酶”或“穴蛋白酶”。由于并未已知穴蛋白顯示酶功能，且由于這些穴蛋白裂解酶的例子在WO 01/51073,WO 01/82945,WO 01/19385,US 2002/0187136 和 US2002/0127215 中未被闡明或 教導，這些酶似乎代表了一種理論上的且未通過定義其期望的特征或性質而被闡明的酶。 正如相同的發明人在他處正確地表述“穴蛋白不具有酶活性”(參考WO 01/90331，9頁12 行)。形成全部這些PCT公開文本中公開的方法之基礎的裂解酶，在其中定義為“本發明基 于發現了對受特定噬菌體感染的細菌為特異性的噬菌體裂解酶能有效力并有效率的降解
所述細菌的細胞壁。同時，酶底物在哺乳動物組織中不存在......”(W0 01/51073的第四
頁第三段)。“細菌噬菌體產生的裂解酶對殺死選擇的細菌是特異性的和有效的”(第7頁 第2段)。在WO 01/51073的權利要求3中使用的術語“穴蛋白酶”意指在權利要求1中
的定義的酶，其定義為“由裂解酶、修飾的裂解酶及其組合組成的組......”。可在WO
01/82945、WO 01/019385、US 2002/0187136 和 US2002/0127215 的權利要求中發現類似的 參考。這些專利申請中無一篇以任何方式公開或要求保護缺少酶活性的穴蛋白或其它噬菌 體衍生蛋白質的用途，包括化合物的分子式或治療動物或植物疾病的方法。WO 02/102405公開了一種通過包埋純化制備物預防動物食物中毒的方法，該制備 物由特定裂解酶和任選的特定裂解性“穴蛋白酶”組成。同樣，由于已知穴蛋白不表現酶活 性，不清楚除了一種理論性的且未通過定義期望的特征或性質來闡明的酶之外，在權利要 求中還教導或詳細描述了什么。已有人提出的是，若來自攻擊革蘭氏陰性細菌性植物病原體的噬菌體的內溶素基 因被克隆并在植物中表達，其可能能有效提供對該病原體的抗性(Ozawa等.，2001)。這 種提議幾乎不太可能，由于不知道除T4溶菌酶外的內溶素可穿過細菌的膜，且革蘭氏陰性 細菌有獨特的外膜，即LPS屏障，其提供強有力的環境屏障，對于大多數分子都是不能通過 的。已證明了來自感染茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的噬菌體的基因編 碼一種裂解肽，該肽能裂解多種茄科雷爾氏菌菌株(Ozawa等.2001)。這些作者提出，這種 未公開序列的裂解肽可能能用于增強轉基因煙草植株中對茄科雷爾氏菌的抗性。但是，沒 有教導或提議這種裂解肽對特定茄科雷爾氏菌菌株以外的任何細菌有殺菌或抑菌能力。實 際上，這種具有明顯種特異性的裂解肽在大腸桿菌中表達而未被報道對生產大腸桿菌菌株 有損害(Ozawa等.2001)。這并非不可預料，因為噬菌體對其細菌宿主菌株具有高度特異 性，且通常局限在給定宿主種中的一小亞組菌株的范圍內。迫切需要增強植物針對比一個 病原種的若干菌株更大范圍的病原體的抗性的方法。在所有在先公開的例子中，已報道或提出噬菌體基因用在轉基因方法中，該噬菌 體基因或者編碼酶，或者在一個例子中，編碼有高度種特異性的裂解肽。在所有在先公開的 摻入、使用或描述噬菌體制備物的例子中，涉及酶和酶制備物。這些酶必須是純化的、緩沖 的、制備好以便運往目的區域并保存在目的地點。因此，現有技術并未教導或描述對革蘭氏陰性細菌具有廣泛抗微生物活性的噬菌 體蛋白的鑒定或用途。現有技術也沒有教導編碼對革蘭氏陰性細菌具有廣泛抗微升物活性的噬菌體蛋白的基因的用途。尤其是，現有技術并未教導為控制植物革蘭氏陰性細菌感染 而使用能使外菌膜(細菌脂多糖或LPS屏障)喪失穩定性或透化的噬菌體蛋白。發明簡述如在本文在別處所述，基于一種先前從未描述的這里稱為噬菌體外膜破壞 (Bacteriophage Outer Membrane Breaching) (BOMB)蛋白的噬菌體蛋白的作用，本發明 提供使外膜(LPS屏障)去穩定性和透化的方法。本發明部分基于我們發現了 BOMBs不僅 破壞且使革蘭氏陰性細菌外膜失去穩定性。該作用不但發生在當BOMB合成于細菌細胞內 時，并且也發生在當BOMB在外部施用時。推測BOMB的外膜失穩活性使植物和/或其它微 生物分泌的天然防御分子也可對靶細胞外膜進行破壞，因此損害(compromise)革蘭氏陰 性細菌外膜的“屏障作用”。Kingsley等.，(1993)提供了有力的證據，表明植物病原菌外 膜在阻止植物防御分子殺死細菌中起屏障作用。本發明也提供了酶促細胞壁解聚的并入 (incorporation)，其是基于稱為內溶素的肽聚糖降解噬菌體蛋白，并提供了以一系列基因 融合和以所述基因融合為模型的全合成基因進行的BOMBs和內溶素功能二者的并入。本發明提供1)廣譜BOMBs的鑒定方法，其具有高水平非酶活性以對微生物外膜 進行破壞并因此增加天然植物防御化合物和人工應用化合物的效力；2)基因融合中維持 和增加BOMBs的抗微生物和抗蟲效力所需的條件；3)通過使用木質部增強性啟動子和將 BOMB蛋白引向植物質外體和木質部的前導肽而使在植物中表達的BOMBs有效靶向的方法； 4)通過基因融合物的表達來控制植物革蘭氏陰性細菌疾病的方法，所述基因融合物包括 BOMBs和BOMB片段、C-末端添加和前導肽，和任選的內溶素和/或脂肪酶；5)增加切花貯 藏期的方法；和6)用于生產基于BOMBs和BOMB片段的新抗微生物蛋白的轉基因植物。本發明人現已發現特定噬菌體攜帶編碼除穴蛋白和內溶素以外的協助噬菌體破 壞宿主細胞(特別是破壞只在革蘭氏陰性細菌中發現的細菌外膜或LPS層)的蛋白質的 基因。進一步發現了至少一種這樣的細菌外膜破壞(BOMB)蛋白從細胞外發揮作用以損害 細菌LPS外膜的完整性。進一步發現了在革蘭氏陰性細菌中表達BOMB蛋白抑制培養中細 菌的生長，并發現當與洗滌劑、裂解蛋白如特定溶菌酶或植物防御化合物例如鹽酸小檗堿 一起使用時，則發生生長抑制和/或裂解。因此發現了 BOMB蛋白不僅能對培養基中的革 蘭氏陰性細菌具有直接抑制作用，而且其效果與導致裂解的酶或毒性的化合物具有協同作 用。進一步發現了 BOMB蛋白損害細菌LPS屏障而非內膜的完整性。進一步的，本發明人已 經1)鑒定、克隆并在大腸桿菌中表達天竺葵黃單胞菌(Xanthomonas pelargonii)噬菌體 Xpl5B0MB蛋白BC ；2)可操作的將bombBC基因單獨與基因表達盒中的植物啟動子融合；3) 在多個不同轉基因植物中表達功能性BombBC，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括番茄、煙 草、天竺葵、柑橘和稻；4)殺死或抑制所述植物的許多不同革蘭氏陰性病原體的生長，為所 述植物賦予增強的疾病抗性或免疫性。因此也發現了 BombBC，和更概括而言BOMBs，在單子 葉植物和雙子葉植物二者中可以功能性表達以增強植物的天然疾病抵御機制。本發明因此提供強有力增強植物中對革蘭氏陰性細菌的疾病抗性的通用方法，無 論該細菌是否是植物病原體，所述方法包括向植物中引入基因表達盒，其可操作的融合了 1)在植物中有功能的啟動子；2)BOMB基因或基因片段，其功能是在植物中表達活性BOMB蛋 白；3)在植物中有功能的轉錄終止子區；和4)獲得在所述植物中生產BOMB的所述基因的 表達。
在一個實施方式中，上述表達盒含有功能為在植物中表達活性BOMB蛋白的BOMB 基因或基因片段，該表達盒具有在植物中有功能的植物分泌信號序列，其可操作地融合到 所述BOMB基因或基因片段的氨基末端。本發明進一步提供核酸分子，其可操作地連接到一種或多種表達控制元件上，包 括含有分離的核酸分子的載體。本發明的核酸序列可天然產生或使用核酸制備領域技術人 員熟知的方法合成產生。本發明進一步包括含有本發明的核酸分子的轉化的宿主細胞，和產生肽、多肽或 蛋白質的方法，該方法包括在表達蛋白質的條件下培養用本發明核酸分子轉化的宿主細胞 的步驟。本發明提供包含本發明核酸構建物的載體，以及包含本發明的載體的宿主細胞、 重組細胞和轉基因組織和生物體。更具體地，本發明提供這樣的細胞或轉基因組織和生物 體，其就所述核酸構建體而言是半合子的、雜合的或純合的，其中如果生物體是植物，其可 是單倍體、二倍體或多倍體。本發明的一個目標是提供這樣的細胞和轉基因組織和生物體， 其中它們表達單拷貝或多拷貝的本發明的一種或多種BOMB蛋白或類BOMB(BOMB-Iike)直 向同源蛋白產物。表達多拷貝的BOMB蛋白、或類BOMB蛋白、突變BOMB或類BOMB蛋白、或 BOMB或類BOMB直向同源蛋白之一的，或表達多于一種BOMB或類BOMB蛋白，突變BOMB或 類BOMB蛋白，或BOMB或類BOMB直向同源蛋白的，或表達攜帶BOMB或類BOMB蛋白的翻譯 或轉錄基因融合體的細胞或轉基因組織和生物體可望，例如，產生對許多不同革蘭氏陰性 細菌的廣譜抗性或耐受性，無論是否為病原體，是條件性的還是腐生性的。革蘭氏陰性細菌是特別的具有LPS的細菌，包括但不限于下述屬土壤桿菌 屬(Agrobacterium)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、徹皮部桿菌屬(Candidatus Liberibacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬 (Shigella)、黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)和木桿菌屬(Xylella)。根據本發明，可以向實事上所有植物中賦予對革蘭氏陰性細菌(包括但不限于， 以上指明的病原菌屬)的抗性或增加的抗性。在作物植物中特別需求這種抗性的產生，無 論所述作物植物是農學的還是園藝學的，無論用于糧食作物還是觀賞植物。也特別需求消 除對人類和動物為病原性的、在一些植物中無癥狀攜帶的革蘭氏陰性細菌，所述植物如新 鮮的苜蓿和豆芽、萵苣和菠菜。也特別需要消除在一些植物(例如觀賞植物，包括天竺葵) 中無癥狀攜帶，但能在其它植物(例如作物植物，包括馬鈴薯)上引發疾病的革蘭氏陰性細 菌。也特別需求消除可由作物植物(例如柑橘或天竺葵)攜帶的USDA選擇劑。也特別需 求延長切花的貯藏期，由于其被腐生的革蘭氏陰性細菌攻擊。本發明因此也涉及制備轉化的植物細胞和植物(包括種子和植物所有部分)的 方法，其對無論是否是植物病原性的革蘭氏陰性細菌的感染或侵染具有增加的抗性或免疫 性。該方法提供一種或多種BOMB基因，BOMB基因融合物，和將這些基因和融合物導入植物 細胞基因組，隨后將所述基因導入植物細胞，從所述細胞再生整株轉化的植株，為轉基因植 物提供針對革蘭氏陰性細菌的疾病、感染或侵染的抗性和免疫性。本發明描述了使用BOMB 基因控制轉基因植物中的疾病、感染或侵染，從而1)控制疾病以其他方式(otherwise)影 響所述轉基因植物，2)使所述轉基因植物避免成為影響其它動植物的疾病(如，醫院感染或在動物飼料中)的載體，和3)若植株和根部分離(如，切花，嫁接)，則延長該轉基因植株 的貯藏期。為將BOMB基因引入單子葉植物或雙子葉植物的植株或植物細胞，本領域技術 人員可使用多種方法，包括但不限于，使用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 和不同的Ti-質粒變體，使用根瘤菌屬菌種(Rhizobium spp)、中華根瘤菌屬菌種 (Sinorhizobium spp)或中生根瘤菌屬菌禾中(Mesorhizobium spp. ) (Broothaerts 等·， 2005)和不同的Ti-質粒變體，使用電穿孔、粒子轟擊、纖維性碳化硅晶須或非纖維性碳化 硅粉末。為再生整全轉基因植物(包括單子葉植物和雙子葉植物二者)，本領域技術人員可 采取多種方法。此處所用術語“植物/植株”是指完整植物/植株和植物/植株的部分，包 括種子、塊莖、插條等。本發明進一步提供用于在例如植物中檢測本發明的BOMB或類BOMB蛋白、或突變 體、或同源物(homolog)、或直向同源物的表達的核酸探針，所述植物或是已經被遺傳改變 以表達至少一種所述蛋白的植物，或是可天然表達BOMB或類BOMB蛋白、或其突變體、同源 物或直向源物。本發明也提供噬菌體P150RF “BC”(bombBC:SEQ ID No. 1)的分離的核酸序列及 其補體，及其相應的編碼BombBC肽的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)。本發明進一步提供SEQ ID No. 1的所有可能的變異和重復，包括但不限于其相應的DNA序列，編碼序列，基因組序 列,RNA序列，干擾RNA (RNAi)序列，雙鏈RNAi (dsRNA)序列，微小RNA (miRNA)序列，小干擾 RNA(siRNA)序列，表達RNAi (eRNAi或eiRNA)序列，反義序列，互補DNA(cDNA)序列，反向 cDNA序列等。本發明也提供自SEQ ID No. 1制備的引物，其可用于定位和鑒定任何原核或真核 生物體中的同源物或直向同源物。本發明也提供使用這些引物獲得和分離SEQ ID No. 1的 這些同源物或直向同源物的方法。本發明也提供使用全部或部分SEQ ID No. 1的序列通過檢索核酸序列數據庫 鑒定同源物或直向同源物的方法。這樣的數據庫的例子包括但不限于玉米、稻和擬南芥 (Arabidopsis)的基因組數據庫。這些序列檢索方法是本領域技術人員熟知的。本發明也提供在嚴緊條件下與SEQ ID No. 1雜交的任何核酸序列。該條件為本領 域技術人員所熟知，使用由例如Sambrook等(1989)教導的方法，但通常是低于目標分子經 計算的解鏈溫度(Tm)大約20攝氏度的溫度和鹽濃度的組合。解鏈溫度通常使用Bolton和 McCarthy (1962)的公式計算。本發明進一步提供分離的核酸分子及其補體，其編碼的序列與SEQ IDNo. 1具有 至少約65%序列同一性，或至少約70%序列同一性，或至少約75%序列同一性，或至少約 80 %序列同一性，或至少約85 %序列同一性，或至少約86 %序列同一性，或至少約87 %序 列同一性，或至少約88%序列同一性，或至少約89%序列同一性，或至少約90%序列同一 性，或至少約91%序列同一性，或至少約92%序列同一性，或至少約93%序列同一性，或 至少約94%序列同一性，或至少約95%序列同一性，或至少約96%序列同一性，或至少約 97%序列同一性，或至少約98%序列同一性，或至少約99%序列同一性，或至少約99. 5% 序列同一性，或至少約99. 9%與SEQ ID No. 1的序列同一性。本發明也提供編碼具有BOMB 活性的肽或蛋白質的任何此類核酸。
本發明進一步提供分離的氨基酸，其編碼的序列與SEQ ID No. 2具有至少約65% 序列同一性，或至少約70%序列同一性，或至少約75%序列同一性，或至少約80%序列同 一性，或至少約85%序列同一性，或至少約86%序列同一性，或至少約87%序列同一性，或 至少約88%序列同一性，或至少約89%序列同一性，或至少約90%序列同一性，或至少約 91 %序列同一性，或至少約92 %序列同一性，或至少約93 %序列同一性，或至少約94 %序 列同一性，或至少約95%序列同一性，或至少約96%序列同一性，或至少約97%序列同一 性，或至少約98%序列同一性，或至少約99%序列同一性，或至少約99. 5%序列同一性，或 至少約99. 9%與SEQ ID No. 2的序列同一性。本發明也提供這些氨基酸序列編碼的肽和蛋 白質，包括具有BOMB活性的。本發明也提供一種權利要求2的DNA編碼區，其由bombBC(SEQ ID No. 1)或任何 由在50個堿基對的序列段(stretch)上具有70% DNA序列同一性的序列段組成的DNA序 列組成。這是一個實踐性的標準，被Food Allergy ResearchResource Program用于根據 蛋白質或DNA編碼序列確定一種蛋白質是否可能與任何已知變應原相似。本發明也提供肽片段，其由BombBC (SEQ ID No. 2)中至少8個連續氨基酸組成，或 任何肽片段或蛋白質，其在80個氨基酸上與BombBC(SEQ IDNo. 2)具有35%或更高相似性。 這是一個實踐性的標準，被Food AllergyResearch Resource Program用于根據蛋白質或 DNA編碼序列確定一種蛋白質是否可能與任何已知變應原相似。本發明提供分離的核酸序列，其包含、其基本上的組成為或其組成為SEQ ID No. 1 的核酸序列及其保守取代物；核酸序列，其與SEQ ID No. 1具有至少70%核酸序列同一性； 連續核酸序列，其與SEQ ID No. 1至少50個堿基對的連續核酸序列具有至少70%核酸序 列同一性；核酸序列，其在嚴緊雜交條件下與SEQ ID No. 1的核酸序列雜交；或編碼SEQ ID No. 2的氨基酸序列。本發明也提供含有這些核酸序列的核酸構建體、載體、植物細胞、植物 部分、植物組織和完整植株。植物可以是任何植物，例如任何單子葉植物或任何雙子葉植 物。在本發明中有用的此類植物的例子包括但不限于天竺葵、煙草、柑橘和稻。本發明也提 供轉化植物細胞的方法，包括將本發明分離的核酸序列導入植物細胞。本發明也可在轉化或處理藻類的細菌感染中發現用途，包括用本發明提供的序列 轉化藻類。本發明也提供增強植物對革蘭氏陰性細菌感染或侵染的抗性的方法，無論所述細 菌是否為病原性的，所述方法包括將本發明的核酸序列導入所述植物的基因組中。本發明也提供分離的肽、多肽或蛋白質，其包含、其基本上的組成為或其組成為 SEQ ID No. 2的氨基酸序列；具有SEQ ID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；在嚴 緊條件下與SEQ ID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或與SEQ ID No. 2的氨基酸序 列在至少80個氨基酸上具有35%或更高氨基酸序列相似性的氨基酸序列。本發明也提供衍生自噬菌體的分離的肽、多肽或蛋白質；缺少細菌分泌信號氨基 酸序列；缺少跨膜結構域；當其在細菌中表達時不引起裂解，而是引起“擬裂解”，就此誘導 后不久培養物的光密度增加且此后下降到約初始光密度；且當于在植物抗毒素存在下生長 的細菌中表達時，其導致“擬裂解”和額外的細胞死亡，就此誘導后不久培養物光密度增加 且此后下降到明顯低于初始光密度的水平。本發明的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株也能導致昆蟲和線蟲不能茁壯成長(thrive)或避免其以所述植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株為食，這是由 于抑制或殺死了對昆蟲或線蟲的消化或生存重要的共生革蘭氏陰性細菌。本發明也提供了阻止、處理或降低革蘭氏陰性細菌感染或侵染植物細胞、植物部 分、植物組織或完整植株的方法，所述方法包括將植物細胞、植物部分、植物組織或完整植 株與本發明分離的肽、多肽或蛋白質相接觸。本發明也提供組合物，其包含本發明的分離的肽、多肽或蛋白質。這樣的組合物的 例子包括但不限于種子處理，例如種子包被，和這樣的組合物的其它形式包括但不限于噴 霧劑(spray)、粉末、漿(slurry)、粉塵(dusting)等。本發明提供阻止、治療或降低動物細胞、動物組織或完整動物的微生物感染的方 法，所述方法包括將動物細胞、動物組織或完整動物與本發明的分離的肽、多肽或蛋白質接 觸。所述肽、多肽或蛋白質可包括在用于治療這些動物的組合物中。這些組合物的例子包 括但不限于噴霧劑、粉末、漿、補片(patch)、植入物等。本發明提供阻止、處理或降低表面或設備(例如用于制備食物的工作臺或醫療設 備)的微生物感染的方法，所述方法包括將該表面或設備與本發明的分離的肽、多肽或蛋 白質相接觸。所述肽、多肽或蛋白質可包括在用于處理這樣的表面和設備的組合物中。這 樣的組合物的例子包括但不限于涂料、洗滌劑、噴霧劑、粉末、漿、補片、植入物等。本發明提供增強植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株對革蘭氏陰性細菌感 染或侵染的抗性的方法，包括向所述植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株中引入表達 盒，該表達盒包括作為可操作連接元件的a)在植物中有功能的啟動子區；b)權利要求1、 權利要求2或權利要求3的核酸序列；和c)在植物中有功能的終止子區；隨后使該表達盒 表達；由此獲得植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株體對革蘭氏陰性細菌感染或侵染 的增強的抗性。這些方法可進一步包括使引入了表達盒的完整植株進行自花傳粉或將引入 了表達盒的完整植株同與其同種的植株進行異花傳粉。此外，這些方法甚至可進一步包括 在對完整植株進行自花或異花傳粉前，檢測通過引入表達盒獲得的完整植株中表達盒的存 在，或檢測其對革蘭氏陰性細菌的感染或侵染的增強的抗性。該方法可進一步包括收獲任 何自花或異花傳粉產生的種子。該方法甚至可進一步包括使收獲的種子萌發以產生幼苗， 并檢測萌發的幼苗的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株中表達盒或對革蘭氏陰性 細菌感染或侵染的增強的抗性的存在。本發明也提供通過本發明的方法獲得的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植 株的組織培養物，其中如此獲得的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株含有所引入的
表達盒。可使依照本發明的方法獲得的含有引入的核酸序列的完整植株進一步進行自花 傳粉或與另一屬于同一種的植物進行異花傳粉。任何得到的種子可被收獲并用于進一步產 生用于自花和異花傳粉的植物。本發明的方法既可用于病原性的也可用于非病原性的革蘭氏陰性細菌。本發明的方法可進一步包括向植物基因組引入第二核酸序列，其編碼增強植物對 植物病原體感染或侵染的抗性的第二肽、多肽或蛋白質。所述第二肽、多肽或蛋白質可包括 但不限于非酶促裂解肽、酶促裂解肽或酶促肽聚糖降解肽。例如，第二肽、多肽或蛋白質可 以是溶菌酶、內溶素、蛋白酶、胞壁質裂解酶(mureinolytic enzyme)、具有糖基轉移酶活性的酶、脂肪酶和酯酶。附圖簡述

圖1顯示考馬斯藍染色的聚丙烯酰胺凝膠的第1泳道中的純化BombBC蛋白 (ISkDa)和第2泳道中的具有表明的大小的分子量標記。圖2顯示用bombBC轉化四種植物物種的PCR確認，包括花店天竺葵(Florist，s geranium)(天竺葵(Pelargonium X hortorum)) Avenida栽培種(泳道 3、4、5)、柑橘(甜橙 χ積(Citrus sinensis χ Poncirus trifoliate))Carizzo栽培禾中、煙草(煙草(Nicotiana tobacum))Xanthi栽培種、和稻(Oryza sativa japonica) TP309栽培種每種三個植株。泳 M 1, Ikb DNA 梯形標記(ladder) ；2，非轉基因 Avenida 對照；3，Av250 ；4，Av386 ；5,Av387 ； 6，非轉基因 Carizzo 對照；7，C12 ；8，C17 ；9，C18 ；10，非轉基因 Xanthi 對照；11，X473 ；12， X480 ； 13，X901 ； 14，非轉基因 TP309 對照，15，TP147 ； 16，TP170 ； 17，TP192 ； 18，Ikb DNA 梯 形標記。使用的 PCR 引物是 IPG872(5' -tea gccact cga tgc cgt c)和 IPG911(5' -gca cga ttc aag agt agg)。所有情況下預期的PCR產物是974bp。圖3顯示非轉基因花店天竺葵(Pelargonium X hortorum)栽培種〃 Avenida" 葉片上的細菌枯萎病的典型癥狀，所述葉片通過在葉片上以IO7集落形成單位每毫升(cfu/ ml)的濃度噴霧而接種有天竺葵黃單胞菌細胞，且也使用浸入109CfU/ml天竺葵黃單胞菌細 胞的剪刀在多處夾(clip)葉片來接種。接種之后，將植株保持在32°C下。剪去圈出的區 域，其包含約105cfU/cm2活的天竺葵黃單胞菌細胞(細節參考下文實施例11)。接種后4周 后拍照。圖4顯示表達BombBC的轉基因花店天竺葵(Pelargonium X hortorum)栽培 種"Avenida"葉片，其接種時間和方式都與圖1圖例描述的相同。接種后，將植株保持在 32°C下。圈出的剪掉的區域不含可檢測到的天竺葵黃單胞菌細胞。接種后4周后拍照。圖5顯示接種在非轉基因天竺葵(Pelargonium X hortorum)栽培種〃 Avenida" 上的天竺葵黃單胞菌菌株CHSC的生長，以及接種于表達BombBC的轉基因變種"Avenida" 上的菌株CHSC的快速死亡。每天從三片接種的樹葉上最可能包含病原體細胞的區域，通 過使用木塞鉆孔器(cork borer)取下共計1平方厘米(cm2)的圓形切片，進行細胞計數， 為期9天(參考圖1和2)。用研缽和研棒，將這些葉片的切片浸漬在1毫升緩沖液中，用 1 10的稀釋梯度系列進行稀釋，將10微升的液滴置于固體生長培養基上計數。接下來， 5天后，在非轉基因天竺葵變種"Avenida"植株中獲得的最大細胞密度為106cfu/ml的天 竺葵黃單胞菌，癥狀平穩并系統性(systemically)發展直到整個植物死亡，通常于接種后 12周內。但是，接種后5天，從轉基因天竺葵變種"Avenida"植株中并未回收到活的天竺 葵黃單胞菌細胞(圖3)，而且沒有天竺葵黃單胞菌引起的天竺葵枯萎病癥狀的跡象。這些 植物既對天竺葵黃單胞菌感染免疫，也快速使人工接種病原體種群消失。圖6顯示接種有茄科雷爾氏菌細胞的非轉基因花店天竺葵(PelargoniumX hortorum)栽培種"Avenida"葉片的比較，其中接種通過使用結核菌素注射器的鈍頭 用注射器將106CfU/ml直接浸入葉片的海綿狀葉肉中。此外，這些同樣通過注射器接種 的植株也通過向盆栽天竺葵植株的土壤中直接添加5mll07cfU/ml的液體培養物而接 種。接種后，將植株維持在32°C以促進病原體生長和癥狀發生。接種后四周，對非轉基 因天竺葵變種"Avenida"(左)和表達BombBC的相同變種〃 Avenida"的轉基因天竺
17葵(右)都進行拍照。非轉基因植株上發生了細菌性枯萎的典型癥狀，該植株12周后死 亡。除了在接種區域中最初發生并保持局限在該區域的癥狀外，在表達BombBC的轉基因變 種〃 Avenida"(右)上未觀察到癥狀發生。發明詳述除非另有定義，本文所用所有技術與科學術語與本發明所屬領域普通技術人員通 常理解的含義相同。盡管任何與此處描述相似或等同的方法和材料可被用于本發明的實施 或試驗，還是描述了實例性的方法和材料。本發明使用的DNA克隆技術是常規的并且可由 任何本領域技術人員完成，使用由例如Sambrook等(1989)教導的方法。本發明基于發現了至少一些噬菌體編碼先前未知的稱為BOMB (細菌外膜破壞)蛋 白的蛋白質，其明顯地通過降解或影響細菌LPS屏障的結構而強烈抑制培養中至少一些細 菌的生長。進一步的，我們發現1)表面活性劑，2)攻擊肽聚糖或細胞壁的酶，和3)植物防 御化合物增加表達的BOMBs對培養基中生長的革蘭氏陰性菌的效力。進一步的，我們發現 當在各種不同轉基因植物中表達時，無論植物是單子葉植物還是雙子葉植物，來自天竺葵 黃單胞菌的噬菌體Xpl5的BombBC都對多種革蘭氏陰性細菌具有致死或抑制作用。最后，我 們發現不僅至少一些BOMBs，例如BombBC，可由植物細胞穩定生產而對植物沒有毒性作用， 而且所述BOMB基因在植物中的表達提供了一種針對革蘭氏陰性細菌保護植物的新方法。本發明也基于我們發現了至少一些植物分泌信號肽可用作將BOMBs的抗微生物 作用靶向植物質外體和木質部的手段，它們在那里積累，提供保護植物免受許多不同革蘭 氏陰性細菌的新方法。進一步的，我們發現了表達BOMBs的轉基因植物可用于產生粗制或 純化的抗微生物化合物的提取物。下列示例性的實施方式意在對本發明進行更詳細的闡述。1.為鑒定BOMB和/或類BOMB基因，首先有必要分離和純化對多種目標生物體具 有非常強的抗微生物活性的DNA噬菌體。這是通過首先獲得攻擊目標革蘭氏陰性細菌的噬 菌體而實現的。攻擊特定細菌的噬菌體可使用為本領域技術人員熟知的已完全公開的方法 容易的從未處理的污水(rawsewage)、池塘水或來自溫室復合物的排水中分離。第二，通過 使用本領域技術人員已知的方法將噬菌體與革蘭氏陰性宿主細菌一起涂布后形成的噬菌 斑大小對多種噬菌斑進行評估。第三，噬菌體通過它們裂解或抑制它們不能感染的其它革 蘭氏陰性細菌的能力進行選擇。這是通過一系列感染測定和覆蓋測定實現的。最終，用本 領域技術人員熟知的方法，將噬菌體核酸分離并用DNAse處理，再單獨用RNAse處理。僅選 擇基于DNA的噬菌體。2.噬菌體純化后，將噬菌體DNA片段化并全長測序，如GenBank中以登錄號 NC_007024保藏的噬菌體15序列所示例的。本領域技術人員已知，有不同的策略可用于此 目的；測序可通過鳥槍文庫測序或通過亞克隆、限制性圖譜作圖和使用引物步移技術測序 來實現。表達來自革蘭氏陰性細菌的BOMBs的噬菌體基因組區域也許不能輕易在大腸桿菌 中克隆，并且是通過以下實事被認識的它們只能要么在不含其天然啟動子情況下克隆，要 么克隆在完全被抑制的啟動子下游。這些區域可直接從噬菌體DNA測序。3.對噬菌體基因組進行DNA測序后，轉錄方向通過使用本領域技術人員熟悉的程 序鑒定啟動子和轉錄終止子而決定。噬菌體基因組通常被轉錄為大段的多順反子信息。隨 后使用本領域技術人員熟知的程序鑒定所有開放閱讀框(ORFs)，并且也鑒定了可能的功能基因(LFGs)，鑒定是基于ORF的長度、密碼子選擇、第三位密碼子偏愛性、Shine-Delgamo序 列的存在與否以及轉錄背景，包括可能的啟動子、轉錄終止子和轉錄方向。隨后通過與其它 基因(通常是編錄在諸如GenBank 的大型數據庫中經表征的基因)進行比較，測定一些 LFGs的生化功能。由于BOMBs以前并未被描述過，不太可能通過與公共或私人數據庫中的 任何已知基因進行比較而發現BOMB基因。4.編碼BOMBs的基因和/或類BOMB基因是通過檢查噬菌體的每種LFG而鑒定 的，從任何不可亞克隆的DNA片段中存在的LFG開始。BOMB的特征性地是1)小(20kD或 更小)LFGs，具有2)多重螺旋-環-螺旋-環結構域，3)無跨膜結構域其4)無前導序列。 具有這些特征的LFGs隨后被選作進一步試驗，該試驗使用功能性基因表達測定法。推定的 BOMB基因的預測的肽編碼區由噬菌體DNA通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，并在不帶啟動 子的情況下克隆到合適的載體中。隨后將這些編碼區與強力調節的阻抑性啟動子可操作的 融合于合適的細菌表達載體中。隨后釋放可操作的融合有推定BOMB基因的啟動子的阻抑 作用，其會導致攜帶該克隆的大腸桿菌菌株生長明顯降低或終止。隨后進一步測試任何這 種克隆對其它細菌的作用。5.進一步評估了任何在誘導后引起攜帶該克隆的大腸桿菌菌株生長明顯降低或 終止的DNA克隆，所述評估通過從誘導時較低但可測量到的OD開始，在24小時的時間段內 測量培養物在600納米(nm)下的光密度OD進行。這些測量是在存在或不存在諸如小檗堿 的植物抗毒素或諸如Silwet L77的洗滌劑的條件下進行。對細胞裂解或缺乏裂解的證據進 行觀察。任何在誘導后引起細胞密度隨時間變化(長達24hrs)連續下降的DNA克隆有可 能是BOMB候選基因。如果加入的諸如鹽酸小檗堿的植物抗毒素或諸如Silwet L77的濕潤 劑的作用與DNA克隆在隨著時間連續降低細胞培養物密度方面的作用相協同(長達24小 時)，則這些克隆可被進一步確認為BOMB基因。在一個實施方式中是一種克隆的bombBC。6.所述BOMB克隆可操作地融合到可用于植物中瞬時基因表達的植物表達載體 中的植物基因表達盒內，所述表達盒最低限度含有在植物中有功能的啟動子，隨后是BOMB 克隆，再接著是植物終止子。幾種植物啟動子和來自植物病毒的在植物中有功能的啟動子 是可廣泛地獲得的，其可用于在瞬時表達測定法中在植物中功能性表達外源基因，例如， pCAMBIA系列植物表達載體(Cambia，Canberra, Australia)中存在的CaMV啟動子。幾 種植物終止子也是可得的，包括可廣泛獲得的NOS終止子，其也存在于pCAMBIA植物表達 載體系列。為轉移入植物細胞，植物表達載體可選的也可含有T-DNA邊界，并具有在根癌 土壤桿菌，根瘤菌(Rhizobium spp.)，中華根瘤菌(Sinorhizobium spp.)或中生根瘤菌 (Mesorhizobium spp.)中復制的能力，隨后將這些菌用于將T-DNA邊界之間的DNA區域轉 移到植物中。7.在另一個實施方式中，可選的可使用內含子以增加基因表達。已知內含子是植 物(包括雙子葉植物和觀賞植物和尤其是單子葉植物)中許多基因大量表達所需的，其可 能是通過增強轉錄物穩定性或促進mRNA成熟(CaIMs等·，1987 ；Mun, J. H.等· 2002 ；Rose & Beliakoff, 2000 ；Rose,2002,Simpson &Filipowicz，1996)。8.在一個實施方式中，將植物分泌信號加入BOMB編碼區。已發現一些植物脅迫 相關和/或疾病相關蛋白在植物木質部中優先并最大量的積累，推測其需要特異性分泌信 號序列。只在木質部中發現了非常少數的幾種蛋白；它們如何穿過植物細胞壁分泌到達木
19質部還不清楚。這些蛋白質具有可用于將抗微生物化合物靶向植物質外體和木質部的分 泌信號肽；我們將這些稱作“木質部分泌信號肽”。將所述木質部分泌信號肽序列從合適的 植物來源通過PCR擴增并克隆到BOMB序列的上游。一個實施方式是源自一種此類蛋白即 P12 (GenBank登錄號AF015782 ；Ceccardi等.，1998)的24個氨基酸的植物信號肽。9.使用瞬時基因表達，在幾種植物物種的任一種中證實了有活性的正確折疊的 BOMB的植物表達(Wroblewski等.2005)。攜帶克隆于基因表達盒中的BOMB基因的植物表 達載體被轉化入根癌土壤桿菌，并且通過用稀釋的細胞培養物浸沒(flood)葉片組織的某 個面積可測的區域而將所得的轉化細胞接種到植物中。也接種了由植物表達載體組成但不 含克隆于表達盒中的BOMB基因的空載體對照，優選接種在同一葉片上。3-4天后，從經接種 的植物組織提取蛋白質并用于Western印跡分析。將接種了 BOMB克隆的組織中的BOMB蛋 白水平與接種了空載體對照的組織中的BOMB水平進行比較。10.然后使用合適的革蘭氏陰性細菌病原性種，在宿主植物瞬時表達攻擊 (challenge)測定法中測試最具活性的DNA構建體；例如，將天竺葵黃單胞菌接種入天竺葵 或將茄科雷爾氏菌接種入煙草、天竺葵、番茄或椒(P印per)。倘若非宿主植物對攻擊病原 體產生可見的過敏反應(HR)，也可使用非宿主植物瞬時表達攻擊測定法。在上述兩種情況 中，都通過用攜帶BOMB基因表達載體的根癌土壤桿菌的稀釋培養物浸沒來接種植物葉片 組織，如上述實施方式5所闡述的完全一樣，并標記接種面積的范圍。3-4天后，已被接種的 植物組織在相同組織區域被再次超-接種(super-inocluate)，這次使用具有與所用根癌 土壤桿菌菌株的標記不同的抗生素抗性標記的植物病原體或目標革蘭氏陰性細菌。如果是 一種病原體，在空載體對照組織上觀察到可見的病原性癥狀或HR反應與在BOMB克隆組織 上觀察到的比較。無論病原體或非病原體，從超-接種區域中取Icm葉盤，置于培養基中， 并進行細胞計數分析，將接種空載體對照組織的區域的細胞計數與接種BOMB克隆的區域 的細胞計數進行比較。11.接下來進行植物細胞的永久轉化，既有單子葉植物也有雙子葉植物，其后對感 興趣的期望的雙子葉植物或單子葉植物物種的轉化植株進行再生和繁殖。本發明的又一目的是通過殺死任何感染植物或以植物為食并引起植物疾病的革 蘭氏陰性細菌來預防性地阻止單子葉植物或雙子葉植物疾病。在本發明的一個實施方式 中，實現了對多種疾病的預防性和治療性處理，這些疾病由黃單胞菌屬、假單胞菌屬、歐文 氏菌屬、土壤桿菌屬、韌皮部桿菌屬、木桿菌屬、雷爾氏菌屬和伯克霍爾德氏菌屬的多種菌 種或致病變型引起。轉基因植物使用是指明的病原體屬的宿主的植物來創建，所述宿主植 物攜帶一個或多個BOMB、或類BOMB肽，其融合有木質部分泌信號肽，可操作地連接有植物 啟動子以使所述類BOMB肽由所述植物產生。本發明的目的還有阻止雙子葉植物和單子葉植物中人類和動物經食物傳播的疾 病，其通過預防性地殺死任何感染植物或以植物為食并引起人類和/或動物經食物傳播的 疾病的革蘭氏陰性細菌而實現。在本發明的一個實施方式中，實現了預防性和治療性消除 糞便細菌，所述細菌可感染新鮮蔬菜例如菠菜和豆芽，并引起多種腸道疾病，包括埃希氏菌 屬、志賀氏菌屬和沙門氏菌屬。轉基因植物的創建使用是指明的病原體屬的宿主的植物，所 述宿主植物攜帶一個或多個BOMB或類BOMB肽，其融合有木質部分泌信號肽，其可操作地連 接有植物啟動子以使所述類BOMB肽由植物產生。
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在本發明的另一個實施方式中，創建了作為所指明屬的宿主的轉基因植物，所述 宿主植物攜帶一個或更多BOMB或類BOMB肽，其融合有木質部分泌信號肽以及酯酶、裂解肽 或裂解酶，全部與植物啟動子可操作地連接以使所述BOMB和/或類BOMB肽和裂解酶由所 述植物宿主產生。裂解肽或酶可以是線性的或緊湊球狀的，并且包括但不限于溶菌酶、殺菌 肽、天蠶抗菌肽、爪蟾抗菌肽、穴蛋白、滲透性增強蛋白等。本發明的一個進一步的目的是通過將這些轉基因植物作為“誘捕”植物種植在環 境中，從而通過以該轉基因植物為食來減小感染性細菌、真菌、線蟲或昆蟲的種群，由此阻 止或抑制(dampen)流行病或瘟疫。這種環境可包括商品化農作物(包括與轉基因誘捕植 物為相同或不同植物種的非轉基因作物)、園林和內部建筑物。本發明的目的還有通過殺死任何可能污染飼料或食物的革蘭氏陰性細菌來預防 性地阻止家畜飼料和人類食品的污染。在本發明的另一個實施方式中，家畜飼料可摻入或 其組成為表達BOMB和/或類BOMB酶或肽片段的轉基因完整植株、轉基因植物部分或轉基 因植物的粗制、半純化或純化提取物。在本發明的另一個實施方式中，諸如蛋或芽/苗的人 類食物可用由轉基因植物制成的BOMB和/或類BOMB酶或肽片段的噴霧制劑處理。定義如此處所用，術語"BOMB"意思包含任何噬菌體衍生蛋白1)不具有細菌分泌信 號序列；2)不具有跨膜結構域，并且3)能夠負面影響、破壞、透化或降解革蘭氏陰性細菌外 LPS屏障。在大腸桿菌中表達BOMB蛋白導致"擬裂解"一在誘導時，細胞培養物的光密度 以一種與未誘導的培養物相似的方式持續增加1到2小時，但隨后光密度降回誘導時的起 始水平。BOMBs缺乏導致裂解的能力-在誘導時，細胞培養物的光密度突然下降。BOMBs也 缺乏以與穴蛋白在細菌細胞內產生或過量產生時相似的方式破壞細菌內膜的能力。細菌內 膜的破壞通過在細菌細胞內同時表達BOMB基因和內溶素基因而測定；同時過表達BOMB基 因和內溶素基因在數小時或更短時間內不會導致細胞裂解。如此處所用，術語"穴蛋白"意指任何這樣的噬菌體衍生蛋白質，其具有至少一 個跨膜結構域，并且當在細菌細胞內不伴隨前導肽產生時具有破壞細菌內膜的能力。細菌 內膜的破壞通過在細菌細胞內同時表達穴蛋白基因和內溶素基因而測定；同時過表達穴蛋 白基因和內溶素基因在數小時或更短時間內不會導致細胞裂解。如此處所用，術語"內溶素"意指任何能使胞壁質或肽聚糖細胞壁解聚的酶。該 術語包括1)葡萄糖胺酶(溶菌酶)，其攻擊肽聚糖的氨基糖之間的糖苷鍵；2)酰胺酶，其 攻擊聚糖鏈和交聯肽之間的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺鍵；和3)內肽酶，其攻擊肽內 (interpeptide)橋聯(Sheehan等.，1997)。合成的內溶素不帶有可使其進入肽聚糖(胞 壁質)層的輸出信號序列，因此內溶素通常積累在被噬菌體感染的細菌的細胞質中直到其 通過穴蛋白的活性釋放。如此處所用，術語"擬裂解"意指在誘導時，細胞培養物的光密度以一種與未誘 導的培養物相似的方式持續增加1到2小時，但隨后光密度降回誘導時的初始水平。如此處所用，術語"裂解"意指在誘導時，細胞培養物的光密度突然下降。如此處所用，術語"酯酶"意思包含任何歸類為羧酸酯水解酶(EC 3. 1. 1. 1)或 三酰基甘油酰基水解酶(EC 3. 1. 1. 3)的酶。如此處所用，術語"羧酸酯水解酶"(EC 3. 1. 1. 1)意指“羧酸酯酶”，并且其催化羧酸酯+H2O到醇加羧酸的反應。羧酸酯水解酶的其它通用名有脂族酯酶；B-酯酶；單 丁酸酯酶(monobutyrase)；可卡因酯酶；普魯卡因酯酶；甲基丁酯酶(methylbutyrase)； 維生素 A 酉旨 Sl ； 丁酉先酉旨 Sl (butyryl esterase)；幾基酉旨 Bl (carboxyesterase)；幾 酸酉旨 Bl (carboxylate esterase)；幾化酉旨 Bl (carboxylic esterase)；甲基丁 酸酉旨 Sl (methylbutyrate esterase)；醋酸甘油酉旨 Bl (triacetinesterase)；幾基酉旨 7_K 角軍 Sl (carboxyl ester hydrolase) ；丁 酸酉旨 Bl (butyrate esterase)；甲基 丁酉旨 Bl (methylbutyrase)；幾酉旨Sl (carboxylesterase)；丙酉先酉旨Sl (propionyl esterase)；非特 異性羧酯酶；酯酶D ；酯酶B;酯酶A ；絲氨酸酯酶；羧酸酯酶(carboxylic acid esterase)； 可卡因酯酶。如此處所用，術語"脂肪酶"意指任何甘油三酯酰基水解酶(EC 3. 1. 1.3)，通常 稱為“三酰基甘油脂肪酶”，并且催化三酰基甘油加H2O到二酰基甘油加羧酸的反應。脂 肪酶的其它通用名有三丁酸酶(tributyrase) ； 丁脂酶(butyrinase)；甘油酯水解酶 (glycerol ester hydrolase) ；丁酸甘油酯酶(tributyrinase)；吐溫水解酶；胰脂酶; 三乙酸甘油酯酶(triacetinase) ； 丁酸甘油酯酶(tributyrin esterase)；吐溫酶；氨 S N-AP ；Takedo 1969-4-9 ；Meito MY30 ；吐溫酯酶；GA 56 ；Capalase L ；甘油三酯水解酶 (triglyceride hydrolase)；油酸甘油酯水解酶(triolein hydrolase)；吐溫水解酯酶； Amano CE酶；cacordase ；甘油三酯酶；三酰基甘油酯水解酶；Amano P酶；Amano AP酶； PPL ；甘油-酯水解酶(glycerol-ester hydrolase) ；GEH ；meito Sangyo 脂肪酶；肝脂酶； Iipazin ；后肝素血漿抗魚精蛋白脂肪酶；抗鹽后肝素脂肪酶；肝素可釋放肝脂酶；Amano CES酶；Amano B酶；三丁酸酶；甘油三酯脂肪酶；肝脂肪酶；肝單酰甘油酰基轉移酶。如此處所用，術語"革蘭氏陰性細菌"意指任何產生脂多糖(LPS)的細菌。如此處所用，術語"疾病抗性/抗病性"意指與未處理植物或材料的可比試驗中 得知的最易感的表型性癥狀或病原體數量相比，在檢測的植物或材料中任何由處理引起的 疾病癥狀或病原體數量的減少。如此處所用，術語對細菌的"抗性"意指與未處理的植物或材料相比，由處理引 起的所檢測植物或材料中細菌數量的任何減少。如此處所用，術語對細菌的"免疫性"意指與未處理的植物或材料相比，由處理 引起的所檢測植物或材料中可檢測到的細菌細胞計數的消失。如此處所用，術語"等位基因"是指基因的幾種可選形式中的任一種。如此處所用，術語"氨基酸"是指作為蛋白質和肽的組分的氨基羧酸。氨基酸 的縮寫如下A(Ala) ；C(Cys) ；D(Asp) ；E(GIu) ；F(Phe) ；G(Gly) ；H(His) ；I (Iso) ；K(Lys)； L(Leu) ；M(Met) ；N(Asn) ；P (Pro) ；Q(Gln) ；R(Arg) ；S (Ser) ；T (Thr) ；V(Val) ；W(Trp)禾口 Y (Tyr)。如此處所用，“同源的"是指兩個聚合物分子之間的亞單位序列相似性，如兩核 酸分子之間，如兩DNA分子或兩RNA分子之間，或兩多肽分子之間。當兩分子中的某亞單位 位置都由相同單體亞單位所占據，例如，如果某個位置在兩個DNA分子的每一個中都由腺 嘌呤占據，則它們在該位置是同源的。兩序列之間的同源性是匹配或同源位置數量的直接 函數，例如，如果兩化合物序列的一半位置是同源的(如，長度為10個亞單位的多聚體中的 5個位置)，則所述兩序列50%同源，如果90%的位置，例如，10個中的9個是匹配的或同源的，則兩序列享有90 %同源性。例如，DNA序列3 ‘ A TTGCC5 '和3 ‘ TATGGC享有50 %同 源性。如此處所用，“同源性〃與〃同一性〃同義使用。此外，當術語〃同源性〃或〃 同一性"用于此處意指核酸和蛋白質時，其應理解為適用于核酸和氨基酸序列兩種水平上 的同源性或同一性。如果兩條寡核苷酸在只有至少約60%，更優選至少約65%，甚至更優 選至少約70%，還更優選至少約80%，且優選至少約90%或，更優選，至少約95%互補的寡 核苷酸彼此退火的條件下退火，則第一寡核苷酸與第二寡核苷酸以“高嚴緊性”或“在高度 嚴緊條件下”退火。用于退火兩條寡核苷酸的條件的嚴緊性是溫度、退火培養基離子強度、 培養期、寡核苷酸長度、寡核苷酸G-C含量、和兩寡核苷酸間預期的非同源性程度等因素 (如果已知)的函數。調整退火條件嚴緊性的方法是已知的(參見例如Sambrook et al., 1989, In :Molecular Cloning :A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。兩核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性的測定可使用數學算法完成。例如， 一種用于比較兩序列的數學算法是Karlin and Altschul算法(1990，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87 :2264-2268)，其如Karlin and Altschul (1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)中進行了修改。該算法整合入 Altschul 等(1990，J. MoI. Biol. 215 403-410) 的NBLAST和XBLAST程序，其可在例如國立衛生研究院(NIH)的國家藥物圖書館(NLM)的 生物技術信息國家中心(NCBI)萬維網站點的BLAST站點上進入。BLAST核酸檢索可使用 NBLAST程序進行(在NCBI網站上定名為〃 blastn")，使用如下參數gap penalty (缺 口罰分)=5 ；gap extension penalty (缺 口延伸罰分)=2 ；mismatch penalty (錯配 罰分)=3 ；match reward(匹配得分)=1 ；expectation value (期望值)10. O ；和 word size(字長)=11，以獲得與此處描述的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可用 XBLAST程序(NCBI網站上定名為〃 blastn")或NCBI " blastp 〃程序進行，使用下列參 數 expectation value (期望值)10. 0，BL0SUM62 scoring matrix (BL0SUM62 得分矩陣)， 以獲得與此處描述的蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得有缺口的比對用于比較的目的，如Altschul et al. (1997，Nucleic Acids Res. 25 3389-3402)中所描述，可利用 Gapped BLAST。或者，PSI-Blast 或 PHI-Blast 可用 于進行迭代搜索，其檢測分子間的遠緣關系(id.)和享有共同結構(pattern)的分子間的 關系。當利用 BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast 和 PHI-Blast 程序時，各程序(如 XBLAST 和NBLAST)的缺省參數可按照國立衛生研究院的國家藥物圖書館的生物技術信息國家中 心站點上可獲得的參數使用。可使用與上述那些類似的技術測定兩序列之間的百分比同一性，在允許或不允許 缺口的條件下。在計算百分比同一性中，通常對精確匹配進行計數。“分離的核酸”是指核酸區段或片段，其與在天然存在狀態下在其側翼的序列已分 開，例如，DNA片段，其已從通常與該片段相鄰的序列(例如，在該片段天然存在于其中的基 因組中與該片段相鄰的序列)移開。該術語也適用于從其它天然伴隨該核酸的組分(例 如，RNA或DNA或蛋白質)中已經基本上純化的核酸。該術語因此包括，例如，并入載體中、 自主復制質粒或病毒中、或原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或作為獨立分 子(如，作為cDNA或通過PCR或限制性酶消化產生的基因組或cDNA片段)而不依賴其它序列的重組DNA。其也包括作為編碼額外多肽序列的雜合基因的部分的重組DNA。如此處所用，術語"作物/作物植物"是指為任何商業目的種植的任何植物，包 括但不限于下述目的種子生產、干草生產、觀賞用途、水果生產、漿果生產、蔬菜生產、油料 生產、蛋白質生產、飼料生產、動物牧草、高爾夫球場、草坪、花卉生產、園林美化、侵蝕控制 (erosion control)、綠肥、改進土壤耕作/健康、生產藥學產品/藥物、生產食品或食品添 加劑、吸煙產品、紙漿生產和木材生產。如此處所用，術語“異花受粉”或“雜交育種”是指這樣的過程，通過該過程將一種 植物上的一種花的花粉施于(人工地或天然地)另一種植物的花的胚珠(柱頭)上。如此處所用，術語“栽培種”是指通過園藝或農學技術產生且在野生種群中少見的 植物的變種、品系或品種(race)。如此處所用，術語“雙子葉植物” ("dicotyledon"and "dicot")是指具有包含兩 半種子或兩片子葉的胚的開花植物。其實例包括柑橘、天竺葵、煙草、番茄、包括豌豆(pea)、 苜蓿(alfalfa)、三葉草(clover)和大豆(soybean)的豆類(legumes)、櫟樹(oaks)、槭樹 (maples)、薔薇(roses)、薄荷(mints)、南瓜(squashs)、雛菊(daisies)、古月桃(walnuts) > 仙人掌(cacti)、堇菜(violet)和毛茛(buttercup)。如此處所用，術語“ER保留信號”是指這樣的氨基酸序列(ER保留信號肽)，其附 接在于多肽并導致該多肽在內質網中保留并積累。如此處所用，術語“雌株”是指產生胚珠的植物。雌株通常在受精后產生種子。指 定為“雌株”的植物可同時含有雄性和雌性性器官。或者，“雌株”可僅含雌性性器官，要么 是天然的(如，在雌雄異株的種中)，要么由于去雄(如，玉米去雄(detasselling))0如此處所用，術語“子代”是指細胞、組織或生物體在特定親代以后的任何世代。由 親本交配產生的世代是第一子代(指定為“F1，，或“F/’)，而由Fl個體雜交產生的世代是 第二子代(指定為“F2”或“F2”)。如此處所用，術語“配子”是指生殖細胞，其細胞核(通常還有細胞質)與另一相 似來源但相反性別的配子的細胞核融合以形成合子，合子具有發育成新個體的潛力。配子 是單倍體并分化成雄性或雌性。如此處所用，術語“基因”是指任何與生物功能相關的DNA區段。所以，基因包括但 不限于，編碼序列和/或其表達所需的調控序列。基因也可包括不表達的DNA區段，例如， 其形成其它蛋白質的識別序列。基因可從多種來源獲得，包括從感興趣的來源克隆或從已 知或預測的序列信息合成，并且可包括經設計而具有期望參數的序列。如此處所用，術語“基因型”是指個體細胞、細胞培養物、組織、生物體(如植株)或 生物群體的遺傳構成。如此處所用，術語“半合子的”是指這樣的細胞、組織或生物體，其中基因在基因型 中只出現一次，如單倍體細胞或生物體中的基因，異配性別中的性連鎖基因，或已經缺失了 基因的配偶體區段的二倍體細胞或生物體的染色體區段中的基因。如此處所用，術語“異源多核苷酸”或“異源核酸”或“外源DNA區段”是指這樣的 多核苷酸、核酸或DNA區段，其來源于對于特定宿主細胞而言是外源的來源，或者，如果來 自相同來源，其相對于其原始形式是經修飾的。因此，宿主細胞中的異源基因包括對于該特 定宿主細胞來說是內源的但是經過修飾的基因。所以，該術語是指這樣的DNA區段，其對于
24細胞是外源或異源的，或對該細胞是同源的但在宿主細胞核酸中的某個位置上的元件并非 通常所見的。外源DNA區段表達產生外源多肽。如此處所用，術語“異源性狀”是指由外源DNA區段、異源多核苷酸或異源核酸而 賦予經轉化的宿主細胞或轉基因生物體的表型。如此處所用，術語“雜合子”是指二倍體或多倍體個體細胞或植物，其在至少一個 基因座存在不同的等位基因(給定基因的多種形式)。如此處所用，術語“雜合的”是指在特定基因座存在不同等位基因(給定基因的多 種形式)。如此處所用，術語“同源物”或“同源體”是指與來自另一物種的核酸或肽序列具 有共同起源和相似功能的核酸或肽序列。如此處所用，術語“純合子”是指在一個或多個基因座具有相同等位基因的個體細 胞或植物。如此處所用，術語“純合的”是指在同源染色體區段的一個或多個基因座上存在相 同的等位基因。如此處所用，術語“雜合體”是指由一個或多個基因不同的親本之間雜交產生的任 何個體細胞、組織或植株。 如此處所用，術語“近交”或“近交系”是指相對純育的品系。如此處所用，術語“系/株系”用于廣泛的包括但不限于，從單獨親本植株通過組 織培養技術無性繁殖的植物群體，或由于繁衍自共同親本而在遺傳上非常類似的近交植物 群體。稱一種植株“屬于”特定的株系，若其(a)是再生自該株系材料的初代轉化體(TO)植 株；(b)具有含該株系的TO植株的譜系；或(c)由于共同的祖先而在遺傳上非常類似(如， 通過近交或自交)。在本文上下文中，術語“譜系”表示植物的世系，例如根據完成的有性雜 交以使基因或基因的組合在雜合(半合子)或純合的條件下將期望的性狀賦予植物。如此處所用，術語“基因座”是指已在遺傳上定義的任何位點。基因座可以是基因、 或基因的部分、或具有某種調控作用的DNA序列，且可以由不同的序列占據。如此處所用，術語“裂解蛋白”是指任何酶的整體或部分，或裂解肽，其1)降解或 穿入形成革蘭氏陽性或陰性細菌的細菌細胞壁的肽聚糖或胞壁質層，并且2)能透化或破 壞細菌內膜。所述蛋白質可以是線性的、部分降解的或緊密球狀的，且包括但不限于溶菌 酶、殺菌肽、天蠶抗菌肽、爪蟾抗菌肽、滲透性增強蛋白等。如此處所用，術語“雄株”是指產生花粉粒的植株。“雄株”通常是指為授精卵產生 配子的性別。指定為“雄株”的植株可含有雄性和雌性性器官。或者，“雄株”可僅含雄性器 官，要么是天然的(如，雌雄異株的種)，要么是由于去雄(如，通過去除子房)。如此處所用，術語“混合選擇”是指這樣的選擇形式，其中個體植物被選擇，并且其 下一代繁衍自它們種子的聚集物。如此處所用，術語“單子葉植物” ("monocotyledon" or "monocot")是指任何 具有只含一片子葉的胚且通常具有平行脈的葉片、花的部分為三的倍數、且根和莖無次生 生長的開花植物的亞類(單子葉類(Monocotyledoneae))。實例包括百合(lilies)；蘭 (orchids)；稻(rice)；玉米(corn)，草(grasses)，例如高羊茅草(tall fescue)、山羊草 (goat grass)禾口草地早熟禾(Kentucky bluegrass)；谷物(grains),例如小麥(wheat)、燕
25麥(oats)和大麥(barley)；鳶尾根(irises)；洋蔥(onions)和棕櫚(palms)。如此處所用，術語“突變體”或“突變”是指具有可導致變體表型的異常遺傳組成 的基因、細胞或生物體。如此處所用，術語“核酸”或“多核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單 鏈或雙鏈形式的聚合物。除非具體限定，該術語涵蓋含有天然核苷酸已知類似物的核酸，其 具有與參考核酸類似的結合特性且其代謝方式與天然存在的核苷酸類似。除非另有指示， 特定的核酸序列也隱含涵蓋其保守修飾變體(如簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指 明的序列。具體地，實現簡并密碼子取代可通過產生這樣的序列實現，在所述序列中將一 個或多個選擇的(或所有)密碼子的第三位用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer 等· (1991)Nucleic Acid Res. 19 5081 ；Ohtsuka等.(1985) J. Biol. Chem. 260 :2605_2608 ； Cassol 等.(1992) ；Rossolini 等.(1994)Mol. Cell. Probes8 :91_98)。術語核酸可與基因、 cDNA和基因編碼的mRNA替換使用。術語“核酸”也涵蓋實驗室中使用本領域技術人員熟知 的步驟合成的多核苷酸。如此處所用，當DNA區段處于與另一 DNA區段的功能性關系中時，將其稱作“可操 作地連接”。例如，若信號序列的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白(preprotein)，則該信 號序列的DNA與編碼該多肽的DNA是可操作地連接的；若啟動子或增強子刺激編碼序列的 轉錄，則其與該序列是柯傲佐地連接的。總的來說，可操作地連接的DNA序列是連續的，且 在信號序列的情況中，其既是連續的且處于可讀狀態。但是，增強子不必與它們控制轉錄的 編碼序列連續。連接通過在方便的限制性位點連接或通過插入該處的銜接子或接頭實現。如此處所用，術語“自由傳粉”是指自由暴露給一些基因流的植物種群，正與具有 對基因流的有效屏障的閉花授粉相反。如此處所用，術語“自由傳粉種群”或“自由傳粉變種”是指通常能至少有一些異 花受精的植物，按這樣的標準選擇，即其可以顯示變異，但也具有一個或多個基因型或表型 特征使該種群或變種能區別于其它。對異花傳粉沒有屏障的雜合體是自由傳粉種群或自由 傳粉變種。如此處所用，術語“直向同源物”和“直向同源體”是指與來自另一物種的核酸或 肽序列功能相似的核酸或肽序列。例如，來自一種植物物種的一種基因與來自另一植物物 種的另一基因具有高核酸序列相似性并編碼具有相似功能的蛋白質，在這種情況下這些基 因是直向同源物。如此處所用，當討論植物時，術語“胚珠”是指雌性配子體，而術語“花粉”是指雄 性配子體。如此處所用，術語“表型”是指由個體遺傳組成(如基因型)和環境之間的相互作 用而產生的個體細胞、細胞培養物、生物體(如植物)或生物體群體的可觀察到的特征。如此處所用，術語“植物抗毒素”是指由植物產生的任何抗微生物化合物，無論是 預形成還是響應于微生物的存在而產生的。如此處所用，術語“植物株系/植物品系”用于廣泛包括但不限于，從單獨親本植 株通過組織培養技術無性繁殖的植物群體，或由于繁衍自共同的一個或多個親本而在遺傳 上非常類似的近交植物群體。稱一種植株“屬于”特定的株系，若其(a)是再生自該株系的 材料的初代轉化體(TO)植株；(b)具有含該株系的TO植株的譜系；或(c)由于共同的祖先(如，通過近交或自交)而在遺傳上非常類似。在本文上下文中，術語“譜系”表示植物的世 系，例如根據完成的有性雜交以使基因或基因的組合在雜合(半合子)或純合的條件下將 期望的性狀賦予植物。如此處所用，術語“植物組織”是指植物的任何部分。植物器官包括，但不限于 葉、莖、根、塊莖、種子、枝、短柔毛(pubescence)、瘤(nodule)、葉腋(leaf axil)、花、花粉、 雄藍、雌藍、花瓣(petal)、梗(peduncle)、柄(stalk)、柱頭(stigma)、花柱(style)、苞片 (bract)、果實、干(trunk)、心皮(carpel)、萼片(s 印 al)、花藥(anther)、胚珠(ovule)、花 梗(pedicel)、針葉(needle)、球果(cone)、根狀莖(rhizome)、匍匐莖(stolon)、枝條 / 苗 (shoot)、果皮(pericarp)、胚乳(endosperm)、胎座(placenta)、漿果(berry)、雄蕊和葉鞘 (leaf sheath)。如此處所用，術語“啟動子”是指結合RNA聚合酶以起始轉錄中涉及的DNA區域。如此處所用，術語“蛋白質”、“肽”或“多肽”是指氨基酸殘基及其聚合物。除非具 體限定，該術語涵蓋含有天然氨基酸殘基已知類似物的氨基酸，其與參考氨基酸具有類似 的結合特性且以與天然存在的氨基酸殘基類似的方式代謝。除非另有指示，特定的氨基酸 序列也隱含涵蓋其保守修飾變體(如保守取代)以及明確表明的序列。術語“多肽”也涵 蓋實驗室中使用本領域技術人員熟知的步驟合成的多肽。如此處所用，術語“重組體”是指經過用重組DNA的轉化的細胞、組織或生物體。稱 原始重組體為〃 R0"或〃 Rtl. “。RO自交產生的第一個轉化世代稱為〃 Rl"或〃 R1.“。如此處所用，術語“分泌信號”是指附接于多肽的N-末端的氨基酸序列(分泌信 號肽)，其是成熟多肽從細胞分泌所需的。如此處所用，術語“自花傳粉的”或“自花傳粉”是指一種植物的一朵花的花粉被 傳(人工地或天然地)到同一植物的相同或不同花的胚珠(柱頭)。如此處所用，術語“轉錄物”是指轉錄過程的產物。如此處所用，術語“轉化”是指將核酸(即核苷酸聚合物)轉移到細胞中。如此處 所用，術語“遺傳轉化”是指將DNA尤其是重組DNA轉移并整合到細胞中。如此處所用，術語“轉化體”是指經過轉化的細胞、組織或生物體。原始轉化體被 指定為〃 T0"或〃 Ttl"。TO自交產生被指定為〃 Tl"或〃 T1"的第一轉化世代。如此處所用，術語“轉基因”是指以保證其功能的方式插入生物體、宿主細胞或載 體的核酸。如此處所用，術語“轉基因的”是指細胞、細胞培養物、生物體(如植物)和后代通 過不同轉化方法之一接受了外源的或經修飾的基因，其中所述外源的或經修飾的基因來自 與接受該外源的或經修飾的基因的生物體的物種相同或不同的物種。如此處所用，術語“轉座事件”是指轉座子從供體位點移動到目標位點。如此處所用，術語“變種，，是指種的細分，由一組該種中的與其它相似個體組的形 式或功能不同的個體組成。如此處所用，術語“非翻譯區”或“UTR”是指一種mRNA分子中任何不編碼蛋白質 的部分(如真核細胞中的Poly(A)尾)。如此處所用，術語“載體”廣泛地指任何編碼外源核酸的質粒或病毒。該術語也應 理解為包括協助核酸轉入病毒體或細胞的非質粒和非病毒化合物，例如，聚賴氨酸化合物等等。載體可以是適合作為將核酸或其變體遞送到細胞的遞送運載體的病毒載體，或載體 可以是適合于同樣目的的非病毒載體。病毒和非病毒載體用于將DNA遞送到細胞或組織的 例子是本領域所熟知的，并且描述于，例如，Ma等(1997，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 94 12744-12746)中。病毒載體的例子包括，但不限于，重組痘苗病毒、重組腺病毒、重組逆轉錄 病毒、重組腺相關病毒、重組禽痘病毒等等(Cranage等.，1986，EMBO J. 5 =3057-3063 ；專利 國際申請No. W094/17810，公開于1994年8月18日；專利國際申請No. W094/23744，公開于 1994年10月27日)。非病毒載體的例子包括但不限于，脂質體、DNA的聚胺衍生物等等。植物轉化如此處討論，本發明的幾種實施方式使用表達單元(或表達載體或系統)以在植 物中表達外源提供的核酸序列。產生在植物中使用的表達單元/系統/載體的方法是本領 域熟知的，且能容易的為適應目前發明的使用而改變。熟練技術人員根據此處提供的概要 能容易的在本方法中使用任何合適的植物/載體/表達系統。用于調節蛋白質表達的表達控制元件要么可以是通常發現與編碼序列相關的表 達控制元件(同源表達元件)，要么可以是異源表達控制元件。多種同源和異源表達控 制元件為本領域所知曉并可容易地用于制備本發明中使用的表達單元。例如，轉錄起始 區域可包括多種冠癭堿起始區域中的任一，例如在根癌土壤桿菌Ti質粒中發現的章魚堿 (octopine)、甘露堿(marmopine)、胭脂堿(nopaline)等。或者，也可使用植物病毒啟動 子，例如用于控制植物中基因表達的花椰菜花葉病毒19S和35S啟動子(分別為CaMV 19S 和 CaMV35S 啟動子)(例如美國專利 Nos. 5，352，605 ；5，530，196 和 5，858，742)。也可以 利用衍生自CaMV的增強子序列(例如美國專利Nos. 5，164，316 ；5, 196，525 ；5, 322，938 ； 5，530，196 ；5, 352,605 ；5, 359，142 ；和 5，858，742)。最后，也可使用植物啟動子，如 RUBISC0 大小亞基啟動子、增殖啟動子(prolifera promoter)、果實特異性啟動子、Ap3啟動子、熱休 克啟動子、種子特異性啟動子等。使用本領域知曉的標準技術，通常將配子特異性啟動子、組成型啟動子(例如 CaMV或Nos啟動子)、器官特異性啟動子(例如來自番茄的E8啟動子)或誘導型啟動子連 接到蛋白質或反義編碼區。表達單元可以通過使用諸如轉錄終止子和/或增強元件的補充 元件進一步優化。因此，為在植物中表達，除蛋白質序列外，表達單元會通常含有植物啟動子區，轉 錄起始位點和轉錄終止序列。在表達單元的5'和3'末端通常包括獨特的限制酶位點以 允許容易地插入預成載體。在異源啟動子/結構基因或反義組合的構建中，啟動子優選位于距異源轉錄起始 位點與在其天然設置中距轉錄起始位點大約相同的距離之處。但是，如本領域所知曉，在該 距離中可以容納一些變異而不喪失啟動子的功能。除啟動子序列外，表達盒還可含有位于結構基因下游的用以提供有效終止的轉 錄終止區。終止區可以與啟動子序列獲得自相同的基因，或可以獲得自不同的基因。若 要使由結構基因編碼的mRNA得到有效加工，通常向載體構建體加入指導RNA聚腺苷酸 化的DNA序列。聚腺苷酸化序列包括但不限于，土壤桿菌章魚堿合酶信號(Gielen等.， EMBO J 3 835-846(1984))或胭脂堿合酶信號(D印icker 等.，Mol. and Appl. Genet. 1 561-573(1982))。
28其它方式構建從而包括在適于高等植物轉化的載 體中。該載體也可以含有選擇性標記基因，通過該基因能夠鑒別培養物中經轉化的植物細 胞。通常也包含細菌或病毒來源的復制序列，以允許載體克隆到細菌或噬菌體宿主中，優選 包括廣泛宿主范圍的原核復制起點。也應包括用于細菌的選擇性標記，以允許選擇含有期 望構建體的細菌細胞。合適的原核選擇性標記也包括對抗生素(例如氨芐青霉素、卡那霉 素或四環素)的抗性。如本領域所知，其它編碼額外功能的DNA序列也可存在于載體中。例如，在土壤桿 菌、根瘤菌、中生根瘤菌(Mesorhizobium)和中華根瘤菌(Sinorhizobium)轉化的情況中， 也會包含T-DNA序列用以隨后轉移至植物染色體。本發明的序列也可融合至多種其它核酸分子，例如表達序列標簽(ESTs)、表位或 熒光蛋白標記。ESTs是基因片段，長度通常是300到400個核苷酸，從互補-DNA(cDNA)克隆的3' 或5'末端測序。一個法國和美國的合伙團體已生產了將近30，000個擬南芥ESTS(Delseny φ ·， FEBS Lett. 405(2) 129-132(1997) ；Arabidopsisthaliana Database, http:// genome, www. Stanford. edu/Arabidopsis)。關于對衍生自EST大數據庫的基因表達模式的 分析的討論，參見例如 M. R. Fannon, TIBTECH 14 :294_298 (1996)。要通過常規方法引入期望的基因或一組基因，需要在兩個系之間進行有性雜交， 然后在雜合后代和一個親本之間反復回交直到獲得具有期望特征的植株。但是，該過程限 于能進行有性雜交的植物，而且除期望基因之外的基因也會被轉移。重組DNA技術使植物研究者規避了這些限制，這是通過使植物遺傳學家能鑒定并 克隆理想性狀(諸如對蟲害的抗性)的特定基因并將這些基因導入已有用途的植物變種而 實現的。一旦外源基因導入植物，植物隨后即能用于常規植物育種方案(如譜系育種、單顆 種子后代育種方案、相互反復選擇)以生產也含有感興趣基因的后代。基因可使用同源重組以位點定向的方式導入。同源重組允許內源基因中的位點 特異性修飾并由此使遺傳的或獲得的突變可得到修正，和/或可把新的改變設計入基因 組。植物中的同源重組和位點定向整合在例如美國專利Nos. 5，451，513 ；5, 501，967和 5，527,695中有所討論。生產轉基因植物的方法為本領域普通技術人員所熟知。目前轉基因植物可由 各種不同轉化方法生產，包括但不限于，電穿孔；顯微注射；微粒轟擊、也稱為粒子加速或 生物彈射轟擊；病毒介導的轉化；土壤桿菌、根瘤菌、中生根瘤菌和中華根瘤菌介導的轉 化。參見例如，美國專利 Nos. 5，405，765 ；5，472，869 ；5，538，877 ；5，538，880 ；5，550，318 ； 5，641，664 ；5，736，369 ；5，736369 ；US 2005/0289672 ；US 2005/0289667，PCT 公開 WO 2006/004914 ；Watson 等·， Recombinant DNA, Scientific American Books(1992)； Hinchee 等·，Bio/Tech. 6 :915_922(1988) ；McCabe 等·，Bio/Tech. 6 :923_926(1988)； Toriyama 等·，Bio/Tech. 6 1072-1074(1988) ；Fromm 等·，Bio/Tech. 8 :833_839(1990)； Mullins 等·，Bio/Tech. 8 :833_839(1990) ；Hiei 等·，Plant Molecular Biology 35 205-218(1997) ；lshida et al. , Nature Biotechnology 14 745-750 (1996) ；Zhang 等.，Molecular Biotechnology 8 :223_231 (1997) ；Ku 等.，Nature Biotechnologyl7 76-80(1999) ；Raineri 等·，Bio/Tech. 8 33-38(1990)和 Broothaerts 等·，Nature433
29629-633 (2005)，將每篇整體通過述及并入本文。根癌土壤桿菌是一種自然發生的細菌，其可將其DNA(遺傳信息)插入植物，對植 物產生一種稱為冠癭的損傷。其也可將外源DNA插入植物，通過使用其修飾的或“去攻擊 的”天然DNA插入系統，但不形成冠癭病。目前大多數植物物種可用該方法轉化。參見例 如，Wang 等，Australian Journal of Plant Physiology 23(3) :265_270 (1996) ；Hoffman 等·，Molecular Plant-Microbe Interactions 10(3) :307_315 (1997)；禾口 Trieu等，Plant Cell Imports 16:6-11(1996)。根瘤菌、中生根瘤菌和中華根瘤菌是天然存在的細菌，其也能將外源DNA(遺傳信 息)插入植物。目前許多植物物種可用該方法轉化。參見例如，Broothaerts等.，Nature 433 629-633(2005)。微粒轟擊也稱為粒子加速、生物彈射轟擊和基因槍法(Biolistic Gene Gun)。基 因槍用于將涂有基因(例如期望性狀的基因)的彈丸射入植物種子或植物組織中，以獲得 隨后表達該新基因的植物細胞。基因槍使用實際的炸藥(.22 口徑間隙)來推進材料。也 可使用壓縮空氣或蒸汽作為推進劑。Biolistic 基因槍是由John Sanford, Edward Wolf 和Nelson Allen在康奈爾大學于1983-1984發明的。目前基因槍及其商標為Ε. I. du Pont de Nemours and Company所有。已使用此方法轉化過大多數植物物種，包括苜蓿(美國專 利 No. 5，324，646)和三葉草(Voisey 等·，Biocontrol Science and Technology 4(4) 475-481(1994) ；Quesbenberry 等·，Crop Science 36(4) 1045-1048(1996) ；Khan 等.， Plant Physiology 105(1) :81_88(1994)；和 Voisey 等· ， Plant Cell R印ortsl3(6) 309-314(1994))。WHISKERS 是其它將DNA插入植物細胞的方法(如Biolistic Gene Gun、根癌土 壤桿菌、〃鳥槍〃法等)的替代方案，其由ICI Seeds Inc. (Garst Seed Company)于1993 年開發；其由碳化硅針狀結晶("晶須")組成。將纖維和植物細胞一起放入容器中，隨后 高速混合，導致結晶以極微小的(microscopic) “孔”(通道)刺入植物細胞壁。隨后加入 新DNA (基因)，導致DNA流入植物細胞。隨后植物細胞整合該新基因；從而使其被遺傳工 程操作。WHISKERS 技術的精髓是將小針狀碳化硅〃晶須〃(直徑0. 6微米而長度5_80 微米)以下述方式使用。將一個裝有由DNA(例如農作物基因加選擇性標記基因)、胚發生 性玉米組織和碳化硅"晶須"組成的“轉化混合物(cocktail)”的容器在銀汞合金混合器 (dental amalgam mixer)或涂料振蕩器(paint shaker)中以強力方式混合或振蕩。隨 后的胚發生性玉米細胞和鋒利碳化硅"晶須"的碰撞導致在植物細胞壁上產生小孔，認為 DNA(農作物基因)通過該小孔進入細胞。接受并納入了新基因的那些細胞隨后被誘導而生 長并最終發育成可繁殖的轉基因植物。不奇怪的，碳化硅的纖維狀、針狀〃晶須〃形式是一種肺部健康危險，因此必須用 與處理不含晶須的非纖維狀碳化硅粉末非常不同的方式來處理。兩種碳化硅形式，粉末和 纖維狀晶須，受到非常不同的管制，British Columbian(加拿大Occupational Health and Safety(OHS)管制纖維形式與石棉相同，暴露極限是0. 1纖維每cc (f/cc)；而普通的非 纖維形式的暴露極限是3-10mg/立方米。顯示碳化硅晶須以與石棉相似的方式產生致突變 的活性羥基并導致DNA鏈斷裂；碳化硅粉末不導致這樣的作用(Svensson等.，1997)。
用碳化硅粉末對植物細胞壁進行破壞并不引導任何與該粉末相關的DNA進入植 物細胞核，盡管這也會以低頻率發生。如果DNA被引導至細胞核，正如根癌土壤桿菌或通過 特定病毒的天然感染那樣，則該問題就可克服。核定位信號序列(NLSs)指導蛋白質和任何 相關核酸進入植物細胞核。使用重組DNA方法成功導入植物的基因包括但不限于，編碼下述性狀的基因 種子貯藏蛋白，包括修飾的7S豆類種子貯藏蛋白(參見例如美國專利Nos. 5，508，468、 5，559，223 和 5，576，203)；除草劑耐受或抗性(參見例如，De Greef 等·，Bio/Technology 7 61(1989)；美國專利 No. 4，940，835 ；美國專利 No. 4，769，061 ；美國專利 No. 4，975，374 ； Marshall 等· (1992) Theor. Appl. Genet. 83，435 ；美國專利 No. 5，489，520 ；美國專利 No. 5，498，544 ；美國專利 No. 5，554，798 ；Powell 等·，Science 232 :738_743(1986)； Kaniewski etal, . Bio/Tech.8 750-754 (1990)) ；Day 等.，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88:6721-6725(1991))；肌醇六磷酸酶(參見例如，美國專利No. 5，593，963)；抗 細菌、真菌、線蟲和蟲害的抗性，包括Bt基因帶來的對鱗翅目昆蟲的抗性(參見例如， 美國專利 Nos. 5，597，945 和 5，597，946 Johnson 等·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 9871-9875(1989) ；Perlak 等·，Bio/Tech. 8 939-943 (1990))；凝集素，(美國專利 No. 5，276，269)；花的顏色(Meyer et al.，Nature 330 :677_678 (1987) ；Napoli 等.， Plant Cell 2:279-289(1990) ；van der Krol 等·，Plant Cell 2:291-299(1990))； Bt基因(Voisey等·，同上文)；新霉素磷酸轉移酶II (Quesbenberry等·，同上文)；豌 豆凝集素基因(Diaz 等·，Plant Physiology 109(4) :1167_1177 (1995) ；Ei jsden 等·， Plant Molecular Biology 29(3) :431_439 (1995))；生長素應答啟動子 GH3 (Larkin 等·， Transgenic Research 5 (5) 325-335 (1996))；來自向日葵的種子白蛋白基因(Khan 等.，Transgenic Research 5(3) 179-185 (1996))；和編碼膦絲菌素乙酰轉移酶、編碼對 Basta 除草劑的抗性的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、新霉素磷酸轉移酶幾種酶和α-淀粉 酶抑制劑(Khan等.，同上文)的基因，將以上每種都整體通過述及并入本文。為了特定目的，可優選不同抗生素或抗除草劑選擇標記。轉化中常規使用的選 擇標記包括nptll基因，其賦予對卡那霉素和相關抗生素的抗性(參見例如，Messing & Vierra, Gene 19 :259_268 (1982) ；Bevan 等·，Nature 304 184-187 (1983)) ；bar 基因，其 賦予對抗除草劑膦絲菌素的抗性(White等.，Nucl Acids Res 18 1062 (1990)，Spencer 等，Theor Appl Genet 79 :625_631 (1990))；和dhfr基因，其賦予對氨甲喋呤的抗性 (Bourouis 等，EMBO J. 2 (7) :1099_1104(1983))。使用土壤桿菌、根瘤菌、中生根瘤菌或中華根瘤菌轉化方法形成的轉基因植物通 常在一個染色體上含有一個單獨基因，盡管多拷貝也有可能。這樣的轉基因植物可被稱為 對于加入的基因來說是半合子的。這樣植物的更準確的名字是獨立分離子，因為每個轉化 植物代表一個獨特的T-DNA整合事件(美國專利No. 6，156，953)。轉基因基因座通常通過 轉基因的存在與否進行表征。將其中一個等位基因與轉基因的缺失相對應的雜合基因型也 指定為半合子的(美國專利No. 6，008, 437)。假設處于正常半合子狀態，那么自交會導致第一代自交重組世代(也稱為Rl或R1 代)的最大基因型分離。Rl代通過原始重組系(也稱為RO或Rtl代)的自交產生。由于 在不存在連鎖且假設耐受性表達僅需一個半合子插入物時，每個插入物都充當顯性等位基因，所以一個插入物會分離為3 1，兩個插入物為15 1，三個插入物為63 1，等等。因 此，為了發現至少一種抗性表型所需要培養的Rl植物相對較少(美國專利Nos. 5，436，175 和 5，776，760)。如上所述，半合子轉基因再生植株的自花傳粉會產生等同于F2的子代，其中約 25%會是純合轉基因植物。F2子代自花傳粉和測交到非轉化的對照植物可用于鑒定純合轉 基因植物并保持該系。如果為得到再生植株而最初獲得的子代來自異花傳粉，則鑒定純合 轉基因植物會需要增加一個自花傳粉世代(美國專利5，545，545)。育種方法自由傳粉種群。作物例如黑麥、多種玉米和甜菜、草本草(herbage grass)、豆類 例如苜蓿和三葉草、和熱帶喬木作物例如可可、椰子、油棕櫚樹和一些橡膠樹，上述作物的 自由傳粉種群的改良本質上依靠向固定有利等位基因的方向改變基因頻率，同時保持高度 (但遠不是最高)雜合性。這些種群中的一致性是不可能的，且在自由傳粉變種中的類型真 實性(trueness-to-type)是整個種群的統計學特征，并不是個體植株的特征。因此，自由 授粉種群的異質性與近交系、克隆和雜合體的同質性(或實事上這樣)形成對比。種群改良方法自然分成兩組，基于通常稱為混合選擇的純粹基因型選擇的方法以 及基于子代測定選擇的方法。種群間改良利用自由育種種群的概念；使基因從一個種群向 另一種群流動。一個種群(栽培種、株、生態型或任何種質資源)的植株與來自其它種群的 植株天然地(如通過風)、或通過人工或通過蜜蜂(通常為蜜蜂(Apis mellifera L.)或苜 蓿切葉蜂(Megachile rotundataF.))雜交。使用選擇，通過從兩種來源分離具有理想性狀 的植株來改良一個(或有時是兩個)種群。基本上有兩種主要方法進行自由傳粉種群改良。第一種，有種情況是種群通過選 定的選擇程序一同改變。結果是產生改良的種群，其可通過孤立條件下自體隨機雜交進行 不確定的傳播。第二種，合成變種與種群改良獲得了同樣的最終結果，但不能同樣地自體傳 播；其必需從親本系或克隆進行重建。這些用于改良自由傳粉種群的植物育種程序為本領 域技術人員所熟知，很多文章和論文提供了用來改良異花傳粉植株的常規育種程序的廣泛 綜述，包括:Allard, Principles of Plant BreedinR, John Wiley & Sons, Inc. (1960)； Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman Group Limited(1979) ；Hallauer and Miranda, Quantitative Genetics in Maize Breeding, Iowa StateUniversity Press(1981)；禾口 Jensen, Plant BreedinR MethodoloRy, John Wiley &Sons, Inc. (1988)。混合選擇。在混合選擇中，選擇并收獲理想的個體植株，種子不進行子代檢驗而復 合以產生后代。由于選擇僅基于母本，且沒有控制傳粉，混合選擇總體上是隨機雜交并選擇 的形式。如上文所述，混合選擇的目的是增加種群中優良基因型的比例。合成物。合成變種是通過將多種在所有可能的雜交組合中選擇的具有良好配合力 的基因型相互(inter se)雜交并隨后通過自由傳粉保持該變種而產生的。無論親本是(或 多或少是近交的)種子繁殖系，如在某些甜菜和豆類(蠶豆(Vicia))中，還是克隆，如在草 本草、三葉草和苜蓿中，原理上并無不同。親本根據總體配合力選擇，有時通過測交或頂交， 更通常的是通過多系雜交。親本種子系可以是有意近交的(如通過自交或近交)。但是，即 使親本不是有意近交的，株系維持過程中在系內進行選擇會保證一些近交的發生。當然，無 性系親本會保持不變并高度雜合。
合成物是否能從親本種子生產試驗田(plot)直接到農民處或必須首先經歷一或 兩個循環的增殖取決于種子生產和對種子的需求規模。在實踐上，草和三葉草通常增殖一 次或兩次從而可觀地從原初合成物中移出。雖然有時使用混合選擇，通常優選進行子代檢驗來實現多系雜交，這是由于它們 操作簡便且與目標具有明顯相關性，即合成物中總體配合力的開發。親本系或克隆進入合成物的數量差異顯著。實際中，親本系的數量范圍從10到幾 百，平均100-200。在種子增殖過程中，由100或更多克隆形成的廣基的合成物可望比窄基 合成物更加穩定。雜合體。雜合體是不同基因型親本之間雜交產生的個體植株。商業化雜合體目前 在許多作物上廣泛使用，包括玉米(玉蜀黍)、高梁、甜菜、向日葵和綠花椰菜(broccoli)。 雜合體可通過許多不同的方式形成，包括通過兩親本的直接雜交(單交雜合體)，通過使單 交雜合體與另一親本雜交(三方或三交雜合體)，或通過兩個不同雜合體的雜交(四方或雙 交雜合體)。嚴格的說，遠交(out breeding)(即自由傳粉)種群中大多數個體是雜合體，但該 術語通常也適用于以下情況親本是基因組有足夠的不同而被認為是不同的種或亞種的個 體。雜合體可以是可育的或不育的，這取決于兩親本基因組中的的定性和/或定量差異。雜 種優勢或雜種活力(hybrid vigor)，通常與雜合性增加相關，雜合性增加導致雜合體生長 活力、存活和生育力與用于形成該雜合體的親本系相比有所增加。最大雜種優勢通常通過 兩個遺傳上不同的、高度近交系的雜交來實現。 雜合體生產是發展成熟的產業，涉及親本系和由那些親本系雜交而產生的雜合體 二者的單獨生產。對雜合體生產過程的詳細討論，參見例如Wright，Commercial Hybrid Seed Production 8 :161—176,In Hybridization of Crop Plants。應該理解的是，本發明描述實施例和實施方式的目的只是用作說明，而其各種修 改或變化會暗示給本領域技術人員，將這些修改和變化包括在本申請的主旨和范圍內。
實施例實施例1 使用植物病原體來分離能夠感染革蘭氏陰性植物病原體天竺葵黃單胞 菌(Xanthomonas pelaraonii)的噬菌體。在PYGM培養基中(蛋白胨，酵母提取物，甘油和嗎啉代丙磺酸；DeFeyter 等。1990)在30°C適度搖動下培養野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種(X. campestris pv. Pelargonii)(同物異名天竺葵黃單胞菌)CHSC菌株的過夜培養物。將5ml這種過夜培 養物加上50ml從農業環境中大池塘的邊緣取得的未經消毒的水一起加入到50ml的PYGM 加2. 5g CaCO3,并允許在30°C下不搖動溫育48小時。溫育后，將Iml這種富集培養物以 5000g離心1分鐘以去除大多數細菌和碎片，將500μ 1上清液移出并用一滴氯仿消毒。將 上清液的小滴置于在上層瓊脂中含有菌株CHSC的覆蓋平板頂部。覆蓋平板是這樣的PYGM 瓊脂平板，其用加有200 μ 1過夜CHSC培養液的在50°C保持的3ml 0. 7%水瓊脂覆蓋并允 許其冷卻和固化。溫育24小時后觀察噬菌斑；其通過從平板上刮去噬菌斑來收集，根據標 準程序(Sambrook等.，1989)滴定和保存。然后將這些噬菌體混合物從單一的噬菌斑中純 化出來，并對個體噬菌體針對柑橘黃單胞菌菌株B21. 2、野油菜黃單胞菌(X. campesths)菌株528和茄科雷爾氏菌菌株G2的細菌宿主范圍進行檢測。所有噬菌體都只能特異性地攻 擊天竺葵黃單胞菌菌株CHSC而不感染其他菌株。 棚列2 :側_評禾反■細雜艘漏謝本帛械酣ffl硫詔丨、壞舗將PYGM平板用天竺葵黃單胞菌CHSC覆蓋，并將從實施例1獲得的多種純化的噬 菌體樣品小滴加到所述平板，在30°C下溫育48小時。所有噬菌體都能感染CHSC并產生裂 解的亮區。將柑橘黃單胞菌B21. 2、野油菜黃單胞菌528和茄科雷爾氏菌G2的過夜培養液 的細胞懸液加入如實施例1中所述的0. 7%水瓊脂，并單獨地覆蓋在噬菌體感染的CHSC平 板上。將平板在30°C下再溫育48小時，并評估噬菌體殺死它們從外面不能感染的革蘭 氏陰性細菌的能力。一些噬菌體顯示了存在對于所有被檢測細菌的強力的、明顯為可擴散 的殺傷因子。選擇噬菌體分離物15 (P15)進行測序和進一步的評估。實施例3目測丨序禾π灃釋M^從卩策菌體pi5 m^mm^m^Mm 的蛋白質的基因候詵物。將P15基因組完全測序以鑒定表達可擴散的殺傷因子的基因。P15DNA是使用天 竺葵黃單胞菌菌株CHSC作為宿主細菌根據標準步驟來制備的。將P15DNA用EcoRV消化， 產生了 11個片段，大小范圍為從12.4kb到357bp。大多數片段得到了克隆，雖然進行了反 復嘗試，但有些片段未被克隆，最有可能是由于限制性內切核酸酶和穴蛋白的存在。將克隆 的DNA片段直接用于測序，最初使用基于載體的引物，隨后進行引物步移直到每個片段都 完成。使用P15基因組DNA對未克隆的片段測序。片段組裝用P15基因組DNA和每個片段 在二個方向上向外延伸的引物來完成。P15有長度為55，770bp的雙鏈DNA基因組(GenBank NC_007024)。經測序噬菌體的ORF分析用幾個程序的組合完成，包括PromScan，Terminator (終 止子)(GCG)、GeSTer (Unniraman 等.2001, 2002)、Glimmer> Genie、Codon preference (密 碼子偏好)(GCG)、ORF finder (0RF搜索器)(NCBI)以及Blast (NCBI)分析。潛在的 Shine-Delgarno序列通過檢查序列手動鑒定。使用缺省的Glimmer設定，只鑒定了 32個 0RF;這些ORF中沒有和之后通過功能分析鑒定為穴蛋白或BOMB的功能基因對應的，雖然 鑒定了預測為編碼內溶素的lysY。在基因組中鑒定了啟動子和終止子之后，使用Codon preference (GCG)對所有ORF的手動分析允許鑒別出額外的52個0RF，包括那些預測為編 碼穴蛋白的。所述基因組編碼84個推定的ORF(GenBank NC_007024)。還有幾個不知功能 的推測ORF。噬菌體P15 0RF“BC”(bombBC ；SEQ ID No. 1)被預測為編碼在中性pH帶-0. 5 電量的17.9kD蛋白質(BombBC ;SEQ ID No. 2)。這個ORF屬于幾個經克隆、表達并對于其 對大腸桿菌外膜作用的證據進行了功能性評估的噬菌體P150RF。實施例4 使用植物抗毒素和誘導型基因表達系統來鑒別編碼能夠從外部進行殺 傷的蛋白質的候詵基因。如上文所沭,已知噬菌體編碼能夠降解細菌細胞壁的蛋白質(內 溶素)和能夠降解或破壞細菌內膜的蛋白質(穴蛋白)。直到現在仍不知道具有降解或破 壞細菌外膜的能力的噬菌體蛋白(即，“BOMB"蛋白)，也不知道描述過任何鑒定這樣的 蛋白質的測定法。將P15推定穴蛋白的預測肽編碼區holZ(美國申請流水號10/556,563 和PCT/US2004/015099中的SEQ ID No. 27)，其內溶素的預測肽編碼區IysY(美國申請流水號 10/556，563 和 PCT/US2004/015099 中的 SEQ ID No. 26)，及其 BOMB 的預測肽編碼區 bombBC(美國申請流水號 10/556，563*PCT/US2004/015099 *&SEQ ID No. 82)通過聚合 酶鏈反應(PCR)從P15噬菌體DNA擴增并克隆至不含啟動子的pGemT內。將這些編碼區在 一種使用大腸桿菌菌株BL21DE3 (Novagen)的改良型pET27b表達載體系統中與阻抑型啟動 子可操作地融合。在bombBC的情況中，產生了兩個版本，它們之中一個有pelB前導序列， 而另一個沒有PelB前導序列。這個前導序列保證了 bombBC跨過內膜輸出到細菌周質。進 行實驗通過與空載體比較而比較了液體培養中這三個基因在pET27b中表達的效果。此外， 進行實驗比較了 BL21 DE3細胞中穴蛋白holZ的表達效果與BOMB bombBC的表達效果，所 述BL21 DE3細胞也組成型表達一種內溶素基因，lysS。將細胞在葡萄糖抑制下在瓊脂平板 上培養，接著在沒有抑制的液體培養基中培養。然后通過添加ImM IPTG來誘導細胞，并比 較在誘導后的不同時間培養物在600nm的光密度(OD)。結果顯示在下面的表格1.穴蛋白HolZ(沒有內溶素LysS)的誘導表達引起了擬裂解；培養物的光密度有所 增加，接著降低到初始密度。沒有在這些培養物中有細胞碎片的證據。相反地，有LysS的 HolZ誘導表達引起了立即裂解，在清亮的裂解物中有明顯的細胞碎片。這些效果是穴蛋白 的特性，其通過破壞內膜殺死細胞，但是不能降解細菌細胞壁，使得細胞內容物保持在內且 培養物中沒有出現裂解物。內溶素LysY的誘導表達引起了細胞密度緩慢降低(沒有顯示)，且與單獨表達 HolZ的效果相比，細胞裂解碎片在這些培養物中是明顯的。由于LysY是在沒有前導序列的 情況下克隆的，這種內溶素似乎表現得和溶菌酶類似，顯示了一些穿透或透化細菌內膜的 能力，使其到達并降解細菌細胞壁，引起裂解。BOMB蛋白BombBC的誘導表達引起了擬裂解，其看起來和由HolZ引起的類似；培 養物的光密度有一些增加，接著降低到初始密度。也沒有發現在這些培養物中有細胞碎片 的證據。然而，與HolZ和LysS的組合相比，BombBC和LysS的組合不引起裂解，而是BombBC 和LysS的組合看上去沒有裂解效果，提示內細菌膜是完整的且LysS不能到達周質并攻擊 細胞壁。這強烈表明BombBC的活性和穴蛋白在性質上不同，穴蛋白對內膜進行破壞，其也 與內溶素在性質上不同，內溶素降解胞壁質或者肽聚糖細胞壁。此外，鹽酸小檗堿，一種商業制備的、植物來源的抗菌化合物(一種“植物抗毒 素”)，和BombBC協同作用降低培養物密度。在穴蛋白或內溶素上都沒看到這種協同作用。 小檗堿可用于檢測LPS屏障的缺損和/或植物病原細菌外流泵送能力(Reddy等.，2007)。 細菌對小檗堿的敏感性是濃度依賴性的。為了細菌存活，任何從LPS泄漏的小檗堿一定要 主動泵出(外流)；如果是LPS被破壞或者外流泵能力喪失，細菌都無法在小檗堿存在下生 存。當在這些實驗中將小檗堿(5，6_ 二氫-9，10-二甲氧基苯并-1，3-苯并二氧雜環戊烯 喹嗪(5,6-dihydro-9, lO-dimethoxybenzo-l, 3-benzodioxolo quinolizimium), 一禾中生物 堿DNA插入劑；Schmeller等.，1997)加至(5微克/ml)攜帶bombBC的細胞并在液體培養 中培養時，當BombBC表達時細胞死亡快很多。向只攜帶pET載體的BL21DE3細胞加入相同 濃度的小檗堿幾乎沒有效果。小檗堿和表達的BombBC的協同效果證明了 BombBC作用在細 菌細胞的外膜或LPS保護層上，指示了小檗堿等必需要從細菌細胞中主動地流出的試劑可 作為附加基因表達測定法的一部分，所述測定法將Bomb基因區別于其它在表達時殺死細 菌細胞的噬菌體基因(如內溶素和穴蛋白基因)。
權利要求
一種分離的核酸序列，包含a.SEQ ID No.1的核酸序列及其保守取代物；b.與SEQ ID No.1具有至少70％核酸序列同一性的核酸序列；c.連續核酸序列，其與SEQ ID No.1的至少50個堿基對的連續核酸序列具有至少70％核酸序列同一性；d.在嚴緊雜交條件下與SEQ ID No.1的核酸序列雜交的核酸序列；或e.編碼SEQ ID No.2的氨基酸序列。
2.一種分離的核酸序列，其基本上由以下組成a.SEQ ID No. 1的核酸序列及其保守取代物；b.與SEQID No. 1具有至少70%核酸序列同一性的核酸序列；c.連續核酸序列，其與SEQID No. 1的至少50個堿基對的連續核酸序列具有至少70% 核酸序列同一性；d.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 1的核酸序列雜交的核酸序列；或e.編碼SEQID No. 2的氨基酸序列。
3.一種分離的核酸序列，其由以下組成a.SEQ ID No. 1的核酸序列及其保守取代物；b.與SEQID No. 1具有至少70%核酸序列同一性的核酸序列；c.連續核酸序列，其與SEQID No. 1的至少50個堿基對的連續核酸序列具有至少70% 核酸序列同一性；d.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 1的核酸序列雜交的核酸序列；或e.編碼SEQID No. 2的氨基酸序列。
4.包含權利要求1、2或3的核酸序列的核酸構建體。
5.包含權利要求1、2或3的核酸序列的載體。
6.植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其包含權利要求1、2或3的核酸序列。
7.權利要求6的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其中所述植物是單子葉植物。
8.權利要求6的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其中所述植物是雙子葉植物。
9.權利要求6的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其中所述植物選自由天竺 葵、煙草、柑橘和稻組成的組。
10.一種轉化植物細胞的方法，包括將權利要求1、2或3的分離的核酸序列導入植物細胞。
11.一種增強植物對病原性的或非病原性的革蘭氏陰性細菌感染或侵染的抗性的方 法，包括將權利要求1、2或3的核酸序列導入所述植物的基因組。
12.—種權利要求1、2或3的分離的核酸序列，其可操作的連接至包含SEQ ID No. 3的 核酸序列。
13.—種編碼肽、多肽或蛋白質的分離的核酸序列，其包含a.SEQ ID No. 2的氨基酸序列；b.具有SEQID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；c.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或d.與SEQID No. 2的氨基酸序列在至少80個氨基酸上具有35%或更高氨基酸序列相 似性的氨基酸序列。
14.一種編碼肽、多肽或蛋白質的分離的核酸序列，其基本上由以下組成a.SEQ ID No. 2的氨基酸序列；b.具有SEQID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；c.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或d.與SEQID No. 2的氨基酸序列在至少80個氨基酸上具有35%或更高氨基酸序列相 似性的氨基酸序列。
15.一種編碼肽、多肽或蛋白質的分離的核酸序列，其由以下組成a.SEQ ID No. 2的氨基酸序列；b.具有SEQID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；c.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或d.與SEQID No. 2的氨基酸序列在至少80個氨基酸上具有35%或更高氨基酸序列相 似性的氨基酸序列。
16.一種編碼肽、多肽或蛋白質的分離的核酸序列，所述肽、多肽或蛋白質具有以下特征a)其衍生自噬菌體；b)其缺乏細菌分泌信號氨基酸序列；c)其缺乏跨膜結構域；d)當在細菌中表達時，其不導致裂解，而是導致“擬裂解”，從而使培養物的光密度在誘 導后立刻增加并隨后降低到約初始光密度；和e)當在于植物抗毒素存在下生長的細菌中表達時，其導致“擬裂解”和額外的細胞死 亡，從而使培養物光密度在誘導后立刻增加并隨后降低到顯著低于初始光密度的水平。
17.權利要求13、14、15或16的分離的核酸序列，其進一步包含SEQIDNo 3的核酸。
18.包含權利要求13、14、15、16或17的核酸序列的核酸構建體。
19.包含權利要求13、14、15、16或17的核酸序列的載體。
20.植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其包含權利要求13、14、15、16或17的 核酸序列。
21.權利要求20的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其中所述植物細胞、植 物部分、植物組織或完整植株由于抑制或殺死了對昆蟲或線蟲的消化或生存重要的共生革 蘭氏陰性細菌而導致所述昆蟲和線蟲不能茁壯成長或避免以所述植物細胞、植物部分、植 物組織或完整植株為食。
22.權利要求20或21的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其中所述植物是單 子葉植物。
23.權利要求20或21的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其中所述植物是雙 子葉植物。
24.權利要求20的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株，其中所述植物選自由天 竺葵、煙草、柑橘和稻組成的組。
25.一種阻止、處理或降低植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株的革蘭氏陰性細 菌感染或侵染的方法，所述方法包括將植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株與具有以 下序列的分離的肽、多肽或蛋白質接觸a.SEQ ID No. 2的氨基酸序列；b.具有SEQID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；c.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或d.與SEQID No. 2的氨基酸序列在至少80個氨基酸上具有35%或更高的氨基酸序列 相似性的氨基酸序列。
26.一種組合物，其包含具有以下序列的分離的肽、多肽或蛋白質a.SEQ ID No. 2的氨基酸序列；b.具有SEQID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；c.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或d.與SEQID No. 2的氨基酸序列在至少80個氨基酸上具有35%或更高的氨基酸序列 相似性的氨基酸序列。
27.一種組合物，其基本上由具有以下序列的分離的肽、多肽或蛋白質組成a.SEQ ID No. 2的氨基酸序列；b.具有SEQID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；c.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或d.與SEQID No. 2的氨基酸序列在至少80個氨基酸上具有35%或更高的氨基酸序列 相似性的氨基酸序列。
28.一種組合物，其由具有以下序列的分離的肽、多肽或蛋白質組成a.SEQ ID No. 2的氨基酸序列；b.具有SEQID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；c.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或d.與SEQID No. 2的氨基酸序列在至少80個氨基酸上具有35%或更高的氨基酸序列 相似性的氨基酸序列。
29.一種阻止、處理或降低動物細胞、動物組織或完整動物的微生物感染的方法，所述 方法包括將所述動物細胞、動物組織或完整動物與具有以下序列的分離的肽、多肽或蛋白 質接觸a.SEQ ID No. 2的氨基酸序列；b.具有SEQID No. 2的至少8個連續氨基酸的氨基酸序列；c.在嚴緊雜交條件下與SEQID No. 2的氨基酸序列雜交的氨基酸序列；或d.與SEQID No. 2的氨基酸序列在至少80個氨基酸上具有35%或更高的氨基酸序列 相似性的氨基酸序列。
30.一種增強植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株對革蘭氏陰性細菌感染或侵染 的抗性的方法，包括向所述植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株引入表達盒，該表達 盒包含可操作連接的下述元件a)在植物中有功能的啟動子區；b)權利要求1、2或3的核酸序列；和c)在植物中有功能的終止子區；其使所述表達盒能夠表達；并由此獲得所述植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株 對革蘭氏陰性細菌感染或侵染的增強抗性。
31.權利要求30的方法，其進一步包括使具有所述引入的表達盒的完整植株進行自花 傳粉或使具有所述引入的表達盒的完整植株與其同種的植株進行異花傳粉。
32.權利要求31的方法，其進一步包括在完整植株進行自花或異花傳粉前，檢測通過 引入表達盒獲得的完整植株中表達盒的存在或對革蘭氏陰性細菌感染或侵染的增強抗性。
33.權利要求31的方法，其進一步包括收獲任何作為自花或異花傳粉的結果產生的種子。
34.權利要求32的方法，其進一步包括使收獲的種子萌發以生成幼苗，并檢測萌發幼 苗的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株中表達盒的存在或對革蘭氏陰性細菌感染 或侵染的增強抗性。
35.由權利要求30的方法獲得的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株的組織培 養物，其中獲得的植物細胞、植物部分、植物組織或完整植株含有所述引入的表達盒。
36.根據權利要求30產生的完整植株，其中所述完整植株包含所述表達盒。
37.一種植物育種方法，包括將權利要求36的完整植株進行自交，允許從所述自交形 成種子并收獲所得的自交種子。
38.一種植物育種方法，包括將權利要求36的完整植株與同種的另一植株雜交，允許 種子形成并收獲所得的雜交種子。
39.權利要求30的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌對所述植株不是病原性的。
40.權利要求30的方法，其中權利要求1、2或3的核酸序列位于所述啟動子區的下游。
41.權利要求30的方法，其中所述終止子區位于權利要求1、2或3的核酸序列的下游。
42.權利要求30的方法，其中在植物中有功能的分泌信號與權利要求1、2或3的核酸 序列可操作地連接。
43.權利要求30的方法，其中在植物中有功能的內質網(ER)保留信號與權利要求1、2 或3的核酸序列可操作地連接。
44.權利要求30的方法，其進一步包括向植物基因組引入第二核酸序列，該第二核酸 序列編碼增強所述植物對植物病原體感染或侵染的抗性的第二肽、多肽或蛋白質。
45.權利要求44的方法，其中將所述第二核酸序列包含在權利要求30的方法中使用的 表達盒中。
46.權利要求44的方法，其中所述植物病原體是革蘭氏陰性細菌。
47.權利要求44的方法，其中所述第二肽、多肽或蛋白質是非酶促裂解肽、酶促裂解肽 或酶促肽聚糖降解肽。
48.權利要求44的方法，其中所述第二肽、多肽或蛋白質選自下組溶菌酶、內溶素、蛋 白酶、胞壁質裂解酶、具有糖基轉移酶活性的酶、脂肪酶和酯酶。
49.權利要求30的方法，其中所述植物是單子葉植物。
50.權利要求30的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
51.權利要求30的方法，其中所述植物選自由天竺葵、煙草、柑橘和稻組成的組。
全文摘要
本發明提供殺死或抑制感染、侵染植物或導致植物疾病的革蘭氏陰性細菌生長的組合物和方法，所述革蘭氏陰性細菌包括導致植物疾病或人類或動物飼料中的食物傳播疾病的病原性、腐生性和條件性微生物。
文檔編號C12N15/31GK101952300SQ200880107780
公開日2011年1月19日 申請日期2008年7月21日 優先權日2007年7月19日
發明者約瑟夫·D·雷迪, 迪安·W·加布里埃爾 申請人:綜合植物遺傳股份有限公司;佛羅里達大學研究基金會