酸性飲料的保存的制作方法

專利名稱：：酸性飲料的保存的制作方法酸性飲料的保存本發明涉及保存酸性飲料抗微生物如酵母、真菌和抗細菌生長和存在的方法。酸性飲料是pH值為1-約4.8的飲料。它們可為天然酸或可為通過加酸化劑酸化的飲料。酸性飲料的實例子包括熱包裝型飲品(例如含各種類型的果汁和/或蔬菜汁的飲品)和冷罐裝(cold-fill)包裝型飲品(例如碳酸軟飲品)。基于果汁和/或蔬菜汁的飲品尤其容易產生真菌、酵母和細菌的微生物生長。然而，酸性飲料由于使用防腐試劑的可能性有限而難以保存。只有如下可抗酸性環境的試劑適合1.它們不失去抗微生物活性，和/或2.它們及應用它們的飲品保持化學穩定(例如，無蛋白變性或沉淀物形成)，3.它們不降解，從而不產生對產品口味、顏色、氣味和/或外觀帶來負面影響的副產物。這使得例如多種蛋白、氨基酸和酶不適于用作酸性飲料中的防腐試劑。結果，就在大多數情況下，將食品級酸和/或其鹽用作所述酸性飲料中的防腐試劑。—例是使用苯甲酸和/或其苯甲酸鹽。苯甲酸鈉被優選用作食品和飲料的主要抗微生物防腐劑。但對苯甲酸和/或其鹽的使用有限制，一般不超過0.1%(對于鈉鹽)，因為這些成分具有毒性。如果與抗壞血酸、苯甲酸鈉和苯甲酸鉀組合，可在特定條件下甚至產生可檢測水平的苯。山梨酸和/或山梨酸鹽也被廣泛應用作為酸性食品或飲品的防腐試劑。但這些成分在使用上也有限制當用它們保存食品抗例如青霉屬物種生長的霉菌時，山梨酸被所述青霉屬物種降解而產生具有煤油臭味的1，3_戊二烯。山梨酸鉀的被接受的使用水平可為約200-約3000ppm。一般而言，飲料中所含山梨酸鉀水平遠高于有效最低量，以保證抗微生物活性。但高于此被接受的使用范圍的上限時，山梨酸鉀可使果汁飲料產生異味。山梨酸鹽和苯甲酸鹽是一般用于經歷冷罐裝包裝方法的防腐試劑。它們還常與磷酸鹽組合使用。酸性防腐試劑的第三例是丙酸和/或丙酸鹽，最初知道它們具有抗由真菌形成的霉，但不抗酵母的抗微生物作用。而且，丙酸及大多數丙酸鹽的缺點是由于其非常獨特且令人厭惡的氣味和口味而在其應用上受到限制。本發明提供保存低PH型飲品的改良方法。本發明具有廣泛的抗微生物活性，且可降低或甚至防止真菌和酵母出現，且還具有抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的抗細菌活性。本發明還提供保存酸性飲品且保持人消費的安全性和感官特性(包括口味、顏色和/或氣味)方面可接受質量的方法。本發明還提供飲品用溶液，其中如前所述的常規防腐試劑造成例如由于沉淀或渾濁出現的問題。其次，通過應用本發明，可將所用正常應用的防腐試劑降至可受其益避其短地使用所述防腐試劑的水平。而且，本發明使得用于滅活食物腐敗微生物(如酵母、真菌和特定細菌)的熱處理的使用成為多余并因此是可選的。由此可使用簡單且更便宜的冷灌裝法或冷包裝法。對于仍需要熱處理的飲料，本發明的應用會防止微生物孢子的生長。含常用防腐試劑(例如苯甲酸鹽和山梨酸鹽)的經熱處理的飲料仍面臨此問題，因為雖然可防止一些微生物的孢子形成，但無法防止已存在于飲品中的孢子的生長。至此，本發明涉及保存pH值為1-4.8的酸性飲料抗真菌、酵母和細菌的方法，其中所述保存方法包括應用含多聚賴氨酸和/或其鹽及至少一種下列成分的組合物-羥基羧酸和/或其鹽的脂肪酸酯，或-甘油的脂肪酸酯。本發明的保存方法包括殺滅、防止和/或抑制微生物的生長和/或存在，所述微生物已存在于飲品中，或者在例如制備、操作和/或儲藏飲品的過程中由其他成分或環境來源引入飲品中。已知多聚賴氨酸具有抗真菌、酵母和細菌的抗微生物作用。多數現有技術(如各種文章中所述)提及多聚賴氨酸且尤其是多聚賴氨酸在PH值5-9具有抗微生物活性(Hiraki,J.Antibact.AntifungalAgents,vol.23no.6349-354(1995)禾口Hiraki，Finechemicals,2918-25，2000)。而且，多數現有技術(例如Yamada等人的US2001/033884和Masahiro等人的FR2634627)提及固體食品，而非飲品。如本領域技術人員熟知，飲品對于例如外觀、口味、氣味和風味具有非常不同的標準和要求。通常應用于食品的許多防腐試劑不能應用于飲品，因為它們會造成例如飲品中出現渾濁或沉淀的問題。飲品類型中還有眾多類別，包括例如乳品、基于果汁的飲料、PH中性飲品、酸性和弱酸性飲料、碳酸或非碳酸飲品等。所有這些飲品均有其自身標準和要求。Zheng等人的EP1832182描述了在含酸性果汁的飲料中ε-多聚賴氨酸和熱處理組合的應用。生產可穩定存放的含果汁飲料總是需要此熱處理，更常為超高溫處理(UHT)，以滅活孢子形成細菌的孢子。ΕΡ1832182公開了可在此類飲料中應用ε-多聚賴氨酸，但其抗微生物活性遠不足以提供可接受的存放壽命。ε“多聚賴氨酸的應用不足以滅活細菌孢子，更難說首先防止全部這些孢子的存在，因此在生產這些酸性含果汁的飲料中仍需要例如UHT或巴氏消毒法形式的附加處理。已發現，可意想不到地非常好地將多聚賴氨酸和/或其鹽與第二防腐試劑組合用于PH值為1-4.8，優選為2-4.6的酸性飲料中，所述第二防腐試劑選自羥基羧酸(或其鹽)的脂肪酸酯或甘油的脂肪酸酯或者它們的組合。多聚賴氨酸與羥基羧酸或甘油的脂肪酸酯的組合意想不到地產生了足以降低、抑制或防止酵母、真菌和細菌存在和/或活性的抗微生物活性。以此組合得到了非常有效的抗微生物組合物并非常適合應用于酸性飲料，因其不容易在酸性飲料中沉淀或影響該飲料的外觀和感官特性。所得抗微生物活性并非多聚賴氨酸和脂肪酸酯在抗微生物活性中貢獻的簡單加合，而是顯著大于所述加合，因為發現脂肪酸酯與多聚賴氨酸協同作用。這在意料之外，因為只知道所述羥基羧酸的脂肪酸酯(如乳酸酯(鹽)(Iactylate))及甘油酯具有乳化作用，不知道它們還具有抗微生物活性，因為它們本身也缺乏足夠的抗微生物活性。協同作用的結果，可減少兩種防腐試劑達到抑制和/或防止酵母、真菌和細菌的存在和/或活性的滿意抗微生物活性的最低需要量。而且，例如熱處理的附加處理成為多余或可選的，且即便應用，也可以以顯著更低的溫度應用。此外，本發明的方法中使用的多聚賴氨酸-脂肪酸混合物的協同性提供了產生保存性混合物或混合劑的可能性，其中，作為附加的防腐試劑，可以以各種理由使用非常適合應用于酸性至弱酸性飲料的化合物，但由于上述原因，它們如本文的應用通常受限。例如，現可以以顯著更低的量使用酸性防腐試劑例如山梨酸鹽和苯甲酸鹽，由此，它們不會形成沉淀或副產物，也不會對酸性飲料的口味和氣味產生負面影響。可使用α-多聚賴氨酸形式和ε-多聚賴氨酸形式或者它們的混合物形式的多聚賴氨酸。優選ε-多聚賴氨酸，因其具有更高的抗微生物活性，從而在應用中可使用更少量。ε-多聚賴氨酸是含25-35個L-賴氨酸殘基的同聚物。ε-多聚賴氨酸的系統名是聚(亞氨基(2-氨基-1-氧-1，6-乙二醛))。典型ε-多聚賴氨酸同聚物的經驗式是C180H362N60031，其分子量約為4700(對應于約30個L-賴氨酸殘基)。可用于本發明中的多聚賴氨酸可為多聚賴氨酸的一種或多種鹽形式。本文中的實例是無機酸(例如鹽酸、硫酸、磷酸等)的鹽或有機酸(例如乳酸、乙酸、丙酸、富馬酸、蘋果酸、檸檬酸等)的鹽。盡管抗細菌作用無本質不同，但有時優選使用游離形式的多聚賴氨酸，因為鹽形式的多聚賴氨酸的溶解度有限。根據本發明的方法，待與多聚賴氨酸或其鹽組合使用的脂肪酸酯包括-羥基羧酸和/或這些羥基羧酸的鹽的脂肪酸酯、或-甘油的脂肪酸酯(也稱為甘油酯)所述羥基羧酸可包括羥基羧酸的一個單體或通過聚合鍵彼此連接的羥基羧酸的多個單體；前者的實例是乳酸的脂肪酸酯。含多個聚合單體的后者的實例是熟知的乳酸酯(鹽)類型。熟知這些乳酸酯(鹽)具有乳化特性，且用作生產各種食品和飲品的乳化劑。這些乳酸酯(鹽)中包括單_乳酸和二_乳酸酯(鹽)，所述羥基羧酸含多個乳酸的單體。所述羥基羧酸的單體可一般含1-6個碳原子，例如上述乳酸單體，但所述單體也可含蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖酸或酒石酸。所述羥基羧酸還可以是鹽或酯的形式。所述羥基羧酸的這些鹽和/或酯還非常適合用于根據本發明的方法。非常有效的乳酸鹽衍生物的實例是辛酸(稱為C8)或癸酸(ClO)或十二酸(C12)或十四酸(C14)或棕櫚酸(C16)或油酸(C18:l)的單_乳酸和/或二_乳酸酯的鈉鹽、鉀鹽和鈣鹽。多聚賴氨酸還可與甘油的脂肪酸酯(也稱為甘油酯)組合用于本發明的方法。甘油酯可包括甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯或者它們的混合物。這些酯產生的方法常產生熟知的各種可能的單酯、二酯或三酯的混合物。可用本領域技術人員已知的不同技術從這些混合物中分離出所述酯。因此，當說到單酯時，這些甘油單酯包括純成分，及主要包括單酯，但也包括作為所述混合物的附加成分的二酯和三酯的混合物。通過多聚賴氨酸與甘油單酯和甘油二酯的組合應用得到了非常好的結果。通過組合多聚賴氨酸與甘油的脂肪酸和脂肪酸(包括飽和脂肪酸，例如但不限于丙酸(C3)、己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(ClO)、十二酸(C12)、十四酸(C14)、十六酸(C16)、十八酸(C18)及他們的混合物)的脂肪酸酯觀察到高協同性及由此的高抗細菌活性。當說到應用例如C8-甘油或ClO-甘油時，指的是甘油的脂肪酸酯，且分別為辛酸和癸酸。第三或附加防腐試劑優選為選自下列的一種或多種的試劑苯甲酸和苯甲酸鹽、山梨酸和山梨酸鹽、乳酸和乳酸鹽、葡萄糖酸和葡萄糖酸鹽、檸檬酸和檸檬酸鹽、乙酸和乙酸鹽、蘋果酸和蘋果酸鹽、富馬酸及其鹽、酒石酸及其鹽、抗壞血酸和抗壞血酸鹽、EDTA、磷酸和基于磷酸的鹽、植酸和植酸鹽，丙酸和/或丙酸鹽、己酸和/或己酸鹽、丙酸和/或己酸與甘油、乳酸、精氨酸的酯，辛酸和/或辛酸鹽、及/或辛酸與甘油、乳酸、精氨酸的酯，及癸酸和癸酸鹽、及/或癸酸與甘油、乳酸或精氨酸的酯，桂皮酸和/或其鹽。可非常好地將上述成分與多聚賴氨酸和羥基羧酸和/或甘油的脂肪酸酯的組合應用于酸性至弱酸性飲料中，并表現出顯著高的抗微生物活性。此外，當把尤其是山梨酸、桂皮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸或它們的任意組合(包括這些酸的鹽)加入包括多聚賴氨酸和甘油酯的組合物或包括多聚賴氨酸和乳酸酯(鹽)(任選與甘油酯組合)的組合物時，在保存作用和應用上述的飲品的期望感官特性的保持方面得到了明顯好的結果。上述特定酸給飲料賦予了在特定口味和氣味方面非常特殊的感官特性。可將多聚賴氨酸直接加入飲品，也可將其與其他成分以混合劑的形式加入飲品。適于生產飲品的組合物包括例如-0.OOOlwt%-多至50wt%、更優選0.Iwt%_45wt%、且最優選Iwt%多聚賴氨酸和/或其鹽，及作為第二防腐試劑的-0.OOOlwt%-多至45wt%、且更優選多至40wt%，且最優選多至35wt%的甘油酯，或-0.0001wt%-多至45wt%、且更優選5wt%_35襯％的乳酸酯(鹽)，及-0_45wt%、且更優選0_30wt%的有機酸，或者所述有機酸的混合物的鹽或酯。如果使用桂皮酸和/或山梨酸，則可將這些成分和/或它們的鹽應用于包括0-45wt%、且更優選0-30wt%的這些成分的組合物。組合物可為固體或液體形式。如果組合物是液體形式，則其一般為含水組合物形式，其可為溶液或分散劑，且可包括載體。在各種熟知的載體中，發現聚乙二醇和/或乳酸鹽(lactate)是性能極優的載體。載體的濃度可以是約50_98wt%。此外，還可加入本領域技術人員已知的各種乳化劑。優選以基于100%脂肪酸衍生物(例如甘油酯和/或乳酸酯(鹽))例如0.1-25%、更優選1-10%及最優選2-4%的濃度應用乳化劑，例如聚山梨酸(例如聚山梨酸60或80)和卵磷脂。如果組合物為固體形式，其一般為包括相關成分顆粒的粉末形式。也可應用載體。發現二氧化硅和/或麥芽糊精是非常適合的載體，且以多至50wt%_98wt%的濃度存在。正常情況下，多聚賴氨酸以占產品重量的多至1%、優選0.0001%-1%或0.0001%-0.1%、更優選0.0001%-0.01%、最優選0.0001%-0.001%的量存在于飲品中。正常情況下，乳酸酯(鹽)以占產品重量的多至1%、優選0.0001%-1%或、或甚至0.0001%-0.1%、且最優選0.0001%-0.01%的量存在于所述產品中。正常情況下，甘油酯以占產品重量的多至5%、優選0.0001%-5%、更優選0.0001%_2%、最優選0.0001%-1%的量存在于飲品中。有機酸或其鹽，例如乳酸、富馬酸、琥珀酸、酒石酸、抗壞血酸、羥乙酸、苯甲酸、乙酸、檸檬酸、丙酸、己酸、辛酸、蘋果酸和脂肪酸以占產品重量的多至10%、優選0.0001%-10%、優選0.0001%-5%的量存在于食品或飲品中。終產物中存在的桂皮酸和/或山梨酸也應用相同的濃度范圍。本發明的方法在殺滅、抑制和/或防止食品腐敗酵母的生長或存在中尤其有效，所述食品腐敗酵母優選但不限于例如假絲酵母屬(白色假絲酵母(Candidaalbicans)或發酵假絲酵母(Candidafermentati)或近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)或熱帶假絲酵母(Candidatropicalis))、德巴利酵母屬(例如Debaryomyceshansenii)、德克酵母屬(例如Dekkerabruxellensis)、有抱漢遜酵母屬(例如Hanseniasporauvarum)、伊薩酵母屬(例如東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis))、克魯維酵母屬(例如馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus))、Metschnokowia酵母屬(例如Metschnokowiapulcherrima)、畢赤酵母屬(例如異常畢赤酵母(Pichiaanomala))、紅酵母屬(例如粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)或膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa))、酸酒酵母屬(例如酸酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、裂殖酵母屬(例如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、有抱圓酵母屬(Torulospora)(例如德爾布有孢圓酵母(Torulosporadelbruecki))、子囊菌酵母屬(Yarrowia)(例如解脂子囊菌酵母(Yarrowialipolytics))、及結合酵母屬(例如拜耳結合酵母(Zygosaccharomycesbailii)^Ι氏結母(Zygosaccharomycesrouxii))￥另1|白勺_母。根據本發明使用多聚賴氨酸與甘油或羥基羧酸的脂肪酸酯的組合也可有效降低和/或防止酸性飲料中細菌的存在和/或活性。尤其是細菌例如但不限于環脂酸芽孢桿菌屬、醋桿菌屬、葡萄糖菌屬、葡萄糖酸醋桿菌屬、乳桿菌屬類別及其他據發現在存在本發明的成分的酸性環境中敏感的相關細菌類別的細菌。還發現根據本發明方法的多聚賴氨酸與甘油和/或羥基羧酸的脂肪酸酯有效抗酸性飲品中的下列真菌的存在和/或生長，例如鐮刀菌屬(例如尖孢鐮刀菌屬(Fusariumoxysporum))、毛霄菌屬(例如Mucorplumbeus)、絲衣霄屬(例如Byssochlamysfulva)>新薩托菌屬(Neosartorya)(例如Neosartoryaspinosa)、裸節菌屬(例如Talaromycestrachyspermus或Talaromycesmacrosporus)、地絲菌屬(例如白地絲霉(Geotrichumcandidum))、擬青霉屬(例如多變擬青霉(Paecilomycesvariotii))、青霉屬(例如婁地青霉(Penicilliumroqueforti)或產黃青霉(Penicilliumchrysogenum))、曲霉菌屬(例如黃曲霉(Aspergillusflavus))、葡萄孢屬(例如灰葡萄孢(Botrytiscinerea))、根霉菌屬(例如匍莖根霉(Rhizopusstolonifer))、分枝孢子菌屬(例如草本分枝孢子(Cladosporiumherbarum))禾口散囊菌屬(Eurotium)(例如Eurotiumherbariorum)類另Ij的真菌。發現本發明非常適于在熱罐包裝或冷罐裝包裝型飲品中應用。熱罐包裝和冷罐裝包裝是熟知的技術。本領域技術人員知道在這些技術中使用何種特殊條件。冷罐裝包裝最常在低于50°C的溫度下應用，且優選在環境溫度下應用。如上所述，本發明使得熱處理變得多余或可選，且如果需要進行熱處理，也可以在甚更適宜的低溫下應用。本發明非常適于冷灌型飲料，表示通過應用冷罐裝包裝法包裝的飲料。用本發明的方法可非常好地保存飲品，例如包括水果或蔬菜的果汁。果汁可加碳酸或不加。而且，所述果汁可為濃縮型或可為即飲果汁，且包括天然的和經加工的/經重配的果汁。本發明的方法在保存碳酸軟飲料中也表現出非常有效。以下非限制性實施例會進一步說明本發明。鐘實驗1在pH3.5的GPY-肉湯(葡萄糖蛋白胨酵母粉)中測試了山梨酸或桂皮酸和ε-多聚賴氨酸與一些脂肪酸衍生物的混合物的抗食品腐敗酵母的效力。組合這些兩種化合物(如果存在山梨酸或桂皮酸)可大大降低ε-多聚賴氨酸和特定中鏈脂肪酸衍生物的濃度。培養物和培養條件所研究的培養物列于表1。將培養物在GPY-肉湯中培養，所述GPY-肉湯為每升去礦質水中包括40g葡萄糖、5g蛋白胨和5g酵母提取物，用2N的HCl將培養基的pH調至3.5。將培養物在螺旋蓋試管中于25°C下培養至少48小時。在搖瓶中培養膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)MUCL27794、CBS8427和CBS5567，粘紅酵母CBS2367、膠紅酵母CBS8054和CBS2401和拜耳結合酵母MUCL27812。表1所測試的CBS和MUCL培養物所測試微生物培養物來源溫育發酵假絲酵母CBS6319葡萄汁螺旋蓋瓶近平滑假絲酵母CBS1954橄欖螺旋蓋瓶近平滑假絲酵母CBS2215酸洗螺旋蓋瓶近平滑假絲酵母C-S飲料螺旋蓋瓶熱帶假絲酵母MUCL29893螺旋蓋瓶熱帶假絲酵母MUCL28180螺旋蓋瓶DebaryomyceshanseniiCBS791牛肉螺旋蓋瓶DebaryomyceshanseniiCBS5230米醪螺旋蓋瓶DebaryomyceshanseniiMUCL30003乳酪螺旋蓋瓶DekkerabruxellensisMUCL27706螺旋蓋瓶DekkerabruxellensisMUCL27707螺旋蓋瓶HanseniasporauvarumMUCL31705螺旋蓋瓶HanseniasporauvarumMUCL30628螺旋蓋瓶HanseniasporauvarumMUCL30626螺旋蓋瓶東方伊薩酵母CBS2050姜螺旋蓋瓶東方伊薩酵母CBS5147果汁螺旋蓋瓶馬克思克魯維酵母MUCL30063螺旋蓋瓶馬克思克魯維酵母MUCL30092螺旋蓋瓶MetschnokowiapulcherrimaMUCL29874螺旋蓋瓶MetschnokowiapulcherrimaMUCL31701螺旋蓋瓶異常畢赤酵母螺旋蓋瓶CBS1683橙汁螺旋蓋瓶螺旋蓋瓶異常畢赤酵母CBS1979泡菜螺旋蓋瓶異常畢赤酵母MUCL27777螺旋蓋瓶膜醭畢赤酵母MUCL27794榆樹搖瓶膜醭畢赤酵母CBS8427西紅柿搖瓶膜醭畢赤酵母CBS5567檸檬水搖瓶膜醭畢赤酵母MUCL30004榆樹螺旋蓋瓶粘紅酵母CBS2367果汁搖瓶膠紅酵母CBS8054紅胡椒搖瓶膠紅酵母CBS2401麥芽糖漿搖瓶釀酒酵母MUCL30115酒廠螺旋蓋瓶釀酒酵母CBS6710橙螺旋蓋瓶釀酒酵母CBS2190果汁螺旋蓋瓶釀酒酵母MUCL30006啤酒螺旋蓋瓶釀酒酵母C-S飲料螺旋蓋瓶栗酒裂殖酵母C-S飲料螺旋蓋瓶德爾布有孢圓酵母CBS7443檸檬水螺旋蓋瓶德爾布有孢圓酵母CBS705酸化螺旋蓋瓶解脂子囊菌酵母CBS7033土壤螺旋蓋瓶解脂子囊菌酵母MUCL29439乳酪螺旋蓋瓶解脂子囊菌酵母MUCL29853濕磨螺旋蓋瓶拜耳結合酵母CBS6708橙螺旋蓋瓶拜耳結合酵母MUCL38486腌食用小黃瓜螺旋蓋瓶拜耳結合酵母MUCL28823蘋果汁螺旋蓋瓶拜耳結合酵母MUCL27812果汁搖瓶拜耳結合酵母MUCL38950螺旋蓋瓶魯氏結合酵母MUCL43236螺旋蓋瓶魯氏結合酵母MUCL30008螺旋蓋瓶魯氏結合酵母C-S飲料螺旋蓋瓶抑制測定測定最小抑制濃度(一維篩選)在無菌的96-孔微量滴定板中進行抑制測試。將遞增量(經10步(每步IOyL)從O到100μL)的各化合物的無菌濃儲液轉移到無菌微量滴定板中。接著加入IOOyL經過濾除菌的雙倍強度的GPY-肉湯，且將各孔中的體積用無菌去礦質水調至200μL。將板用2μL培養2天的培養物接種，并于25°C溫育96小時。通過用微板讀取儀測量595nm處的光密度來對生長進行定量。所有實驗都重復進行兩次。將吸光度增加不超過閾值(定義為空白的平均吸光度值加三次的標準偏差)的最小濃度作為最小抑制濃度(MIC)。兩種抑制劑的組合的篩選在無菌的96-孔微量滴定板中進行這些組合測試。用遞增量的兩種不同抑制劑制備GPY-肉湯。用8個等濃縮步驟(特定抑制劑對特定酵母的MIC值的O至1-2倍，產生64種不同培養基)提供了各抑制劑的濃度。將200ml各培養基轉移到一組無菌的96-孔微量滴定板中。將完成的孔板于4°C保存待用。將板用2μL培養2天的培養物接種，并于25°C溫育96小時。通過用微板讀取儀測量595nm處的光密度來對生長進行定量，并表示為對照(不包括抑制劑)中的生長的百分比。所有實驗都重復進行兩次。三種成分的組合的篩選還在96-孔微量滴定板中進行這些組合測試。制備包括遞增量的抑制劑的無菌GPY-肉湯。首先，在8個等濃縮步驟中提供了第一抑制劑的濃度。第二，選擇固定比例的其他兩種抑制劑。用8個等濃縮步驟提供了此混合物，產生64種不同培養基。將200ml各培養基轉移到一組無菌的96-孔微量滴定板中。將完成的多孔板于4°C保存待用。將板用2μL培養2天的培養物接種，并于25°C溫育96小時。通過用微板讀取儀測量595nm處的光密度來對生長進行定量，并表示為對照(不包括抑制劑)中的生長的百分比。所有實驗都重復進行兩次。所測試的防腐劑/抗微牛物試劑單/二-辛酰甘油、單/二-癸酰甘油、MCE8060(即為單/二-辛酰甘油和但/二-癸酰甘油的混合物)、辛酰乳酸鈉、癸酰乳酸鈉和Pationic122A(辛酰乳酸鈉和癸酰乳酸鈉的混合物)購自CaravanIngredients，Lenexa，Kansas，USA。山梨酸和桂皮酸購自Sigma-Aldrich，StLouis，USA，且ε-多聚賴氨酸購自ChissoCorp(Japan)。MM表2a列出了pH3.5下ε-多聚賴氨酸對許多酵母的MIC值。表2a:pH3.5下ε-多聚賴氨酸對各種酵母的最小抑制濃度所測試微生物培養物MIC(%)[最小值]O[最大值]0.03白色假絲酵母DSM13860.024白色假絲酵母ATCC2091>0.03發酵假絲酵母CBS6319>0.03近平滑假絲酵母CBS19540.030近平滑假絲酵母CBS2215>0.03近平滑假絲酵母C-S>0.021熱帶假絲酵母MUCL298930.003熱帶假絲酵母MUCL281800.003DebaryomyceshanseniiCBS7910.003DebaryomyceshanseniiCBS52300.006DebaryomyceshanseniiMUCL300030.006DekkerabruxellensisMUCL277060.006DekkerabruxellensisMUCL277070.003HanseniasporauvarumMUCL317050.003HanseniasporauvarumMUCL306280.006HanseniasporauvarumMUCL306260.003東方伊薩酵母CBS20500.003東方伊薩酵母CBS51470.003馬克思克魯維酵母MUCL300630.006馬克思克魯維酵母MUCL300920.003MetschnokowiapulcherrimaMUCL298740.015MetschnokowiapulcherrimaMUCL317010.027異常畢赤酵母CBS1683>0.03異常畢赤酵母CBS1979>0.03異常畢赤酵母MUCL27777>0.03膜醭畢赤酵母MUCL27794ND膜醭畢赤酵母CBS8427ND膜醭畢赤酵母CBS5567ND膜醭畢赤酵母MUCL30004ND粘紅酵母CBS2367ND膠紅酵母CBS8054ND膠紅酵母CBS2401ND釀酒酵母MUCL30115ND釀酒酵母CBS67100.003釀酒酵母CBS21900.003釀酒酵母MUCL300060.003釀酒酵母C-S0.002栗酒裂殖酵母C-S0.006德爾布有孢圓酵母CBS74430.003德爾布有孢圓酵母CBS7050.003解脂子囊菌酵母CBS70330.018解脂子囊菌酵母MUCL294390.012解脂子囊菌酵母MUCL298530.006拜耳結合酵母CBS67080.006拜耳結合酵母MUCL384860.006拜耳結合酵母MUCL288230.003拜耳結合酵母MUCL278120.003拜耳結合酵母MUCL389500.003魯氏結合酵母MUCL432360.003魯氏結合酵母MUCL300080.003魯氏結合酵母C-S0.001表2b總結了pH3.5下一些中鏈脂肪酸衍生物、山梨酸、桂皮酸和ε_多聚賴氨酸對許多酵母(例如表1所示的酵母)的MIC值。數據顯示，癸酸衍生物是比辛酸衍生物更強的抑制劑。桂皮酸也比山梨酸更有效。表2b:C8甘油酯(單/二-辛酰甘油)、ClO甘油酯(單/二-癸酰甘油)、MCE8060、C8乳酸酯(鹽)(辛酰乳酸鈉)、ClO乳酸酯(鹽)(癸酰乳酸鈉)、Pationic122A、多聚賴氨酸、山梨酸和桂皮酸對酵母集合的平均最小抑制濃度(MIC〒iS)、最大MIC(MIC最大)(在pH3.5下)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>組合2種防腐試劑和3種防腐試劑以下表顯示了多聚賴氨酸與各種其他防腐試劑組合對不同酵母的作用。表3在pH3.5下的GPY-肉湯中，在不同濃度的多聚賴氨酸和山梨酸鉀下栗酒裂殖酵母的生長暈(outgrowth)。所述生長暈表示為0濃度抑制劑時生長暈(其被設定為100%)的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>30.04970031410表4在pH3.5下的GPY-肉湯中，在不同濃度的￡-多聚賴氨酸和MCE8060(單/二-辛酰甘油和單/二-癸酰甘油的混合物)下釀酒酵母生長暈。所述生長暈表示為0濃度抑制劑時生長暈(其被設定為100%)的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表5在pH3.5下的GPY-肉湯中，在不同濃度的多聚賴氨酸和癸酰乳酸鈉下德爾布有孢圓酵母的生長暈。所述生長暈表示為0濃度抑制劑時生長暈(其被設定為100%)的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表6在pH3.5下的GPY-肉湯中，在不同濃度的ε-多聚賴氨酸、MCE8060(單/二-辛酰甘油和單/二-癸酰甘油的混合物)和山梨酸鉀下釀酒酵母生長暈。所述生長暈表示為O濃度抑制劑時生長暈(其被設定為100%)的百分比。將山梨酸鹽-MCE8060的比例設定為2.33。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表7在ρΗ3.5下的GPY-肉湯中，在不同濃度的ε-多聚賴氨酸、MCE8060(單/二-辛酰甘油和單/二-癸酰甘油的混合物)和桂皮酸下釀酒酵母生長暈。所述生長暈表示為0濃度抑制劑時生長暈(其被設定為100%)的百分比。將MCE8060-ε-多聚賴氨酸的比例設定為18.9。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實驗2碳酸果汁本實驗中，使用各種抗微生物制劑將本發明的保存方法應用于碳酸果汁中。通過對取自不同時刻的果汁樣品的平板計數方法測定了這些制劑的抗微生物活性。所用果汁包括水、約10_15襯％的甜味劑、約的果汁濃縮物、約0.3wt%的香料和一些檸檬酸和檸檬酸鹽。初始PH為約3.15。向果汁中充二氧化碳至CO2濃度為約5.2g/l。用4種不同酵母(近平滑假絲酵母、栗酒裂殖酵母、拜耳結合酵母和釀酒酵母)的混合培養物接種果汁樣品，其中接種水平為約100個細胞/ml或約100個孢子/ml。將酵母預培養于無菌的GPYpH3.5(pH3.5的葡萄糖蛋白胨酵母粉)上。在25°C下溫育所述培養基24小時。接種前，用血細胞計數器(BUrker-TUrk型)對細胞數量進行計數。使用不同的抗微生物制劑。所述制劑包括苯甲酸鈉鹽(99+%，來自Acros)、山梨酸鉀(99%，來自Acros)、桂皮酸鉀、六偏磷酸鈉(下文簡稱為“SHMP”)、ε-多聚賴氨酸(25wt%，來自Chisso)和MCE8060(CaravanIngredients)。這些成分也用于實驗3，其針對下文所述的非碳酸冰茶。MCE8060是CaravanIngredients的商品，其包括單/二-辛酰甘油和單/二-癸酰甘油的混合物，其中總甘油單酯最少為58%。表8提供用于所述果汁樣品的抗微生物制劑的組合物。表8用于碳酸果汁的本發明的保存方法的抗微生物制劑的組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>上表中的結果顯示，本發明的保存酸性飲料的方法非常適于保存酸性碳酸果汁。ε-多聚賴氨酸與C8/C10甘油酯的混合物(樣品3)能夠保存該果汁至少98天(此前未見報導)。其他樣品通過7天后的計數證實，再加入其他防腐試劑時，如本發明的方法中使用的多聚賴氨酸/甘油酯組合的抗微生物效果甚至更佳，及可降低所用全部防腐試劑的濃度的同時得到相同的保存結果。當用辛酰乳酸鈉或癸酰乳酸鈉或者Pationic122Α(可商購的辛酰乳酸鈉和癸酰乳酸鈉的混合物，CaravanIngredients)替換所述甘油酯時，或當使用甘油酯與上述乳酸酯(鹽)之一的混合物時，得到近似結果。實驗3非碳酸冰茶本實驗中，使用各種抗微生物制劑將本發明的保存方法應用于冰茶。通過對取自不同時刻的冰茶樣品的平板計數方法測定了這些制劑的抗微生物活性。制備初始pH為約2.65的冰茶標準制劑。用4種不同酵母(近平滑假絲酵母、栗酒裂殖酵母、拜耳結合酵母和釀酒酵母)的混合培養物或者3種不同變質霉菌(Mucorplumbeus、多變擬青霉和青霉屬物種)的接合孢子或分生孢子的混合物接種非碳酸冰茶樣品。在全部情況下，接種水平為約100個細胞/ml或約100個孢子/ml。將霉菌預培養于麥芽提取物瓊脂上。在25°C下溫育所述培養基7天。通過用5-10ml0.05%(w/v)的吐溫80充分沖刮自身瓊脂板來收集霉菌的分生孢子。后將包括分生孢子的液體轉移到包括10-20個無菌的玻璃珠(5mm直徑)的無菌的50ml試管中。以渦旋短暫震蕩試管的內容物，以松弛孢子。隨后將試管內容物轉移到底部具有玻璃塞的無菌注射器中。通過過濾除去任何殘余的菌絲體。接種前，用血細胞計數器(Btoker-TUrk型)對細胞或分生孢子的數量進行計數。使用不同的抗微生物制劑。所述制劑包括與實驗2中所述相同的成分。表10提供用于非碳酸冰茶樣品的抗微生物制劑的組合物。表10用于非碳酸冰茶的本發明的方法的保存方法的抗微生物制劑的組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>可商購的ε-多聚賴氨酸是包括25襯％的ε-多聚賴氨酸的溶液。上表中的ε-多聚賴氨酸包括量是IOOwt%。表11和12顯示對取自不同時刻的冰茶樣品的平板計數結果。表11不同時刻的冰茶樣品中霉菌的總平板計數(logCFU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>上表中的結果顯示，本發明的保存酸性飲料的方法非常適于保存包括霉菌的酸性非碳酸冰茶飲料。ε“多聚賴氨酸與C8/C10甘油酯的混合物(樣品3)對霉菌的生長具有抑制作用，且在加入第三防腐劑(例如桂皮酸鉀或山梨酸鉀)時顯著更有效。表12不同時刻的冰茶樣品中酵母的總平板計數(logCFU/ml)LogCFU/ml時間(天數)_<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>上表中的結果顯示，本發明的保存酸性飲料的方法非常適于保存酸性非碳酸飲料(如冰茶)。ε_多聚賴氨酸與C8/C10甘油酯的混合物(樣品3)能夠保存該飲料至少62天(此前未見報導)。其他樣品證實，再加入其他防腐劑時，本發明的方法中使用的多聚賴氨酸/甘油酯組合，即便降低所用防腐試劑的濃度，仍保持相同的抗微生物效果。當用辛酰乳酸鈉或癸酰乳酸鈉或者Pationic122Α(可商購的辛酰乳酸鈉和癸酰乳酸鈉的混合物，CaravanIngredients)替換所述甘油酯時，或當使用甘油酯與上述乳酸酯(鹽)之一的混合物時，得到抗非碳酸冰茶中的霉菌和酵母的抗微生物作用的近似結果。權利要求用于保存pH值為1-4.8的酸性飲料的方法，包括應用包括多聚賴氨酸和/或其鹽以及作為第二防腐劑的、羥基羧酸和/或其鹽的脂肪酸酯或甘油的脂肪酸酯中至少一種的組合物。2.權利要求1的方法，其中所述飲料的PH值為2-4.6。3.權利要求1或2的方法，其中所述飲料經冷罐裝包裝方法。4.以上權利要求中任一項的方法，其中所述羥基羧酸的脂肪酸酯包括乳酸酯(鹽)。5.以上權利要求中任一項的方法，其中所述組合物包括其他防腐試劑。6.權利要求5的方法，其中所述其他防腐試劑是選自下列的一種或多種的成分山梨酸及其鹽、桂皮酸及其鹽、乳酸及其鹽、乙酸及其鹽、檸檬酸及其鹽、和丙酸及其鹽。7.以上權利要求中任一項的方法，其中多聚賴氨酸是ε-多聚賴氨酸。8.以上權利要求中任一項的方法，其中所述組合物包括0.0001wt%-多至50wt%的多聚賴氨酸和/或其鹽，和0.OOOlwt%-多至45wt%的甘油酯或0.OOOlwt%-多至45wt%的乳酸酯(鹽)，及另外0-45wt%的有機酸或者其混合物的鹽或酯，0-45wt%的桂皮酸或其鹽，和0-45wt%的山梨酸或其鹽。9.權利要求8的方法，其中所述有機酸包括乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸或它們的任意組合ο10.以上權利要求中任一項的方法，其中所述組合物應用于抗酵母、真菌或細菌。11.以上權利要求中任一項的方法，其中所述真菌包括來自鐮刀菌屬、毛霉菌屬、絲衣霉屬、新薩托菌屬、裸節菌屬、地絲菌屬、擬青霉屬、青霉屬、曲霉菌屬、葡萄孢屬、根霉菌屬、分枝孢子菌屬和散囊菌屬的類別的真菌。12.權利要求10的方法，其中所述酵母包括來自假絲酵母屬、德巴利酵母屬、德克酵母屬、有孢漢遜酵母屬、伊薩酵母屬、克魯維酵母屬Jetschnokowia酵母屬、畢赤酵母屬、紅酵母屬、釀酒酵母屬、裂殖酵母屬、有孢圓酵母屬、子囊菌酵母屬和結合酵母屬的類別的酵母。13.pH值為1-4.8的酸性飲品，其包括多聚賴氨酸和第二防腐試劑和第三防腐試劑，所述第二防腐試劑選自乳酸酯(鹽)或甘油酯，或者二者；所述第三防腐試劑選自山梨酸、桂皮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和/或丙酸，這些酸的任意鹽，及它們的任意組合。14.甘油的脂肪酸酯在包括多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物中用作抗微生物劑以保存PH值為1-4.8的酸性飲品的用途。15.脂肪酸和酸_、鹽-或酯_形式的羥基羧酸的脂肪酸酯在包括多聚賴氨酸和/或其鹽的組合物中用作抗微生物劑以保存PH值為1-4.8的酸性飲品的用途。全文摘要本發明涉及保存的pH4.8以下的酸性飲料抗霉菌、酵母和細菌的方法。所述方法包括應用基于多聚賴氨酸和/或其鹽與第二防腐試劑組合的組合物，所述第二防腐試劑選自甘油酯和/或羥基羧酸的酸、鹽或酯形式的脂肪酸酯。文檔編號A23L2/02GK101801221SQ200880107450公開日2010年8月11日申請日期2008年9月17日優先權日2007年9月17日發明者A·M·拉米雷斯,D·R·克莫爾,E·W·邦滕保爾,R·奧托申請人:普拉克生化公司