專利名稱：：由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差的減小方法
技術領域：
：本發明涉及由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差的減小方法。
背景技術：
：在臨床檢查領域，廣泛使用由測定對象成分生成過氧化氫，再通過對該過氧化氫進行定量來測定對象成分的樣品中濃度的方法。在這種方法中，由測定對象成分以外的物質所生成的過氧化氫成為測定值誤差的主要原因，因此一般采用的方法是通過以下方法來消除由測定對象成分以外的物質所生成的過氧化氫，即、使過氧化氫酶作用而分解成水和氧的方法、或使用過氧化物酶而與酚系或者苯胺系氫供體化合物反應轉化成無色醌的方法。例如，在中性脂肪測定用試劑中被用于內源性游離甘油的消除體系、在肌酸酐測定試劑中被用于肌酸和肌氨酸(YA二〉>)的消除體系、在HDL-膽甾醇或LDL-膽甾醇測定用試劑中被用于目標成分以外的脂蛋白中膽甾醇的消除體系。應予說明，迄今為止，作為利用過氧化氫酶的測定體系中所用的過氧化氫酶，一般使用來源于牛的過氧化氫酶。其中，雖常使用基于過氧化氫酶的消除體系，但有時會由于混入抑制過氧化氫酶的成分而受妨礙。特別是疊氮化物的混入即使極微量也會強有力地抑制過氧化氫酶，因此妨礙消除體系、無法充分消除產生自測定對象成分以外的過氧化氫，因而使測定值產生誤差。疊氮化鈉之類的疊氮化物在臨床檢查領域被廣泛用作防腐劑，混入測定體系的可能性非常高。測定體系中疊氮化物的混入已知以下幾種情形測定樣品本身所含有的情形、疊氮化物從存在于附近的含疊氮化物試劑中作為疊氮化氫氣化而溶入測定試劑中的情形、經由自動分析裝置的取樣探針從其它含疊氮化物試劑中將疊氮化物帶入測定試劑中的情形。專利文獻1日本特開平10-14596號公報專利文獻2日本特許第3164829號登載公報專利文獻3日本特許第3058602號登載公報
發明內容發明要解決的問題因此，本發明的目的在于提供減小由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差的方法，其是測定對象成分的定量方法，包含用過氧化氫酶分解來源于測定對象成分以外的成分的過氧化氫。本發明人進行了深入研究，結果發現與以往使用的來源于牛的過氧化氫酶相比，來源于具有75kDa以上亞基的微生物的過氧化氫酶極難受到疊氮化物的抑制，因而想到通過使用來源于具有75kDa以上亞基的微生物的過氧化氫酶作為測定體系所用的過氧化氫酶，可以減小由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差，從而完成了本發明。即，本發明提供由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差的減小方法，其特征在于，用過氧化氫酶分解來源于測定對象成分以外的成分的過氧化氫，然后，通過將來源于測定對象成分的過氧化氫定量從而對上述測定對象成分進行定量，此時使用來源于具有75kDa以上亞基的微生物的過氧化氫酶作為上述過氧化氫酶。根據本發明，首次提供了減小由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差的方法。根據本發明可以比以往更準確地對例如中性脂肪、LDL膽留醇、HDL膽留醇、肌酸酐等測定對象成分進行定量。具體實施例方式如上所述，本發明人得到了以下驚人發現與以往所用的來源于牛的過氧化氫酶相比，來源于具有75kDa以上亞基的微生物的過氧化氫酶極難受到疊氮化物的抑制。本發明基于該新發現。含血紅素的過氧化氫酶即單功能過氧化氫酶可以分類為具有小亞基(5569kDa)的過氧化氫酶、和具有大亞基(75kDa以上)的過氧化氫酶。本發明的方法中所用的過氧化氫酶為具有上述大亞基(75kDa以上)的過氧化氫酶。作為本發明的方法中所用的上述過氧化氫酶的來源微生物，是來源于真菌、細菌和一部分古細菌的微生物，更具體而言，可以列舉鵝柄孢殼菌(Podosporaanserina)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrossa)、暗黃枝抱(Cladosporiumfulvum)、構巢裸胞殼(Emericellanidulans)、糙皮側耳(Pleurotusostreatus)、耐輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、惡臭假單胞菌(Psuedomonasputida)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、富氏葡萄孢盤菌(Botryotiniafuckeliana)、紫瘢麥角菌(Clavic^pspurpurea)、煙曲菌(Aspergillusfumigatus)、莢膜組織胞菜菌(Ajellomycescapsulatus)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑色曲霉(Aspergillusniger)、根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、百脈根中間根瘤菌(MesorhizobiumIoti)、幢蟲微孢子蟲(Nosemalocustae)、水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)等。已知細菌等生產多種過氧化氫酶，而具有大亞基(75kDa以上)的過氧化氫酶是本發明的方法中所用的過氧化氫酶。但是，上述具有大亞基的過氧化氫酶中即使混入了上述具有小亞基的過氧化氫酶也不會影響本發明的實施。上述微生物生產的過氧化氫酶中，作為具有大亞基(75kDa以上)的過氧化氫酶中公知的過氧化氫酶，可以列舉鵝柄孢殼菌CatA(PodosporaanserinaCatA)、煙曲菌CatA(AspergillusfumigatusCatA)、構巢裸胞殼CatA(EmericellanidulansCatA)、莢膜^ΜΜΜCatA(AjellomycescapsulatusCatA)、；胃KatE(EscherichiaColiKatE)、大腸埃希氏菌K12(EscherichiacoliK12)、惡臭假單胞菌CatC(PseudomonasputidaCatC)、枯草芽孢桿菌過氧化氫酶2(Bacillussubtiliscatalase2)、枯草芽孢桿菌KatE(BacillussubtillisKatE)、堅強芽孢桿菌KatA(BacillusfirmusKatA)、鳥分枝桿菌KatE(MycobacteriumaviumKatE)、煙曲菌CatB(AspergillusfumigatusCatB)、莢膜CatB(AjellomycescapsulatusCatB)、豐勾CatA(Aspergi1lusnidulansCatA)、！IfeffiCatR(AspergiIlusnigerCatR)>IH±ff^CatC(AgrobacteriumtumefaciensCatC)、苜蓿中華根瘤菌CatC(SinorhizobiummelilotiCatC)、幢蟲微孢子蟲(Nosemalocustae)、7_K稻黃單胞菌KatX(XanthomonasoryzaeKatX)、野油菜黃單胞菌KatE(XanthomonascampestrisKatE)。在‘‘BacterialCatalaseintheMicrosporidianNosemalocustaeImplicationsforMicrosporidianMetabolismandGenomeEvolution”NaomiM.Fast等，EUKARYOTICCELL，Oct.2003，p.1069-1075中記載了這些過氧化氫酶在基因上近緣，此外，已知這些過氧化氫酶具有血紅素d。眾所周知，在基因上近緣的酶具有類似的特征。因此，本發明的方法中使用的過氧化氫酶不僅限于上述列舉的過氧化氫酶，只要是在基因上近緣、具有血紅素d、并具有75kDa以上亞基的過氧化氫酶即均可用于本發明的方法中。關于大亞基的分子量的上限，有取84kDa的報道或取90kDa的報道，但在基因上近緣的過氧化氫酶均可用于本發明的方法中。應予說明，“在基因上近緣”是指，通過基于氨基酸序列的常法進行系統分析，近緣者被分類至同一組中，例如將根據上述Fast等的文獻中記載的方法而分類至組II中的過氧化氫酶彼此稱為在基因上近緣。過氧化氫酶可以僅使用一種過氧化氫酶，也可以將兩種以上的過氧化氫酶混合使用。另外，使用兩種以上的過氧化氫酶時，可以是來源于同一種類微生物的過氧化氫酶，也可以是來源于不同種類的微生物的過氧化氫酶。這些來源于微生物的各種過氧化氫酶已有市售，可優選使用市售品。另外還可以通過用本領域技術人員公知的方法培養微生物，再從該培養物中純化而得到。在混入測定體系抑制過氧化氫酶的疊氮化物中，成為各種成分的定量測定中的問題的主要是多用作防腐劑的疊氮化鈉之類的疊氮化金屬、或來源于它們的疊氮化氫等，但不僅限于此。本發明的方法可適用于以下所有定量方法，所述定量方法用過氧化氫酶分解來源于測定對象成分以外的成分的過氧化氫，然后通過對來源于測定對象成分的過氧化氫進行定量從而測定上述測定對象成分。在本領域中這類定量方法本身各個方面廣為人知。作為測定對象成分，可列舉中性脂肪(甘油三酯)、HDL(高密度脂蛋白)膽留醇、LDL(低密度脂蛋白)膽留醇和肌酸酐等，但不僅限于此。應予說明，本發明的方法除了使用來源于具有75kDa以上亞基的微生物的過氧化氫酶作為過氧化氫酶之外，還可以通過直接實施現有的各測定對象成分的定量方法來實施。本發明的方法包括用來源于微生物的過氧化氫酶分解來源于測定對象成分以外的成分的過氧化氫后，再添加疊氮化物。本發明的方法中使用的過氧化氫酶不易受到疊氮化物的抑制，但可以通過使足夠量的疊氮化物發揮作用來停止過氧化氫酶的過氧化氫分解反應。根據該方法，可以使定量反應中生成的過氧化氫不被過氧化氫酶分解。以上列舉的各種測定對象成分的、使用過氧化氫酶的測定方法本身是眾所周知的，不需要在此說明，但為了明確起見，在以下進行簡單記載。中性脂肪(甘油三酯)例如可通過以下方法進行定量使甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶和過氧化氫酶作用于體液中所含的甘油，將由甘油生成的過氧化氫除去后，接著使脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、過氧化物酶和色原作用于體液中的甘油三酯，由甘油三酯生成甘油、由甘油生成甘油-3-磷酸、由甘油-3-磷酸生成過氧化氫、再使該過氧化氫發色，然后通過測定其發色強度來進行定量(專利文獻1)。HDL膽留醇例如可通過以下方法進行定量在維持pH58的緩沖液中、以及在2價金屬離子的存在下，使膽留醇酯酶和膽留醇氧化酶作用于被測樣品，用過氧化氫酶將生成的過氧化氫除去，由此消除被測樣品中除高密度脂蛋白以外的脂蛋白中的膽留醇，然后向上述第1工序的產物中加入特異性作用于高密度脂蛋白的、HLB為1314的表面活性齊U，將由膽留醇酯酶和膽留醇氧化酶的作用而生成的過氧化氫定量從而對高密度脂蛋白中的膽留醇進行定量(專利文獻2)。LDL膽留醇例如可通過以下方法進行定量在含有胺的緩沖液、以及作用于低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性劑的存在下，使膽留醇酯酶和膽留醇氧化酶發揮作用，用過氧化氫酶除去生成的過氧化氫，由此消除被測樣品中的高密度脂蛋白、超低密度脂蛋白和乳糜微粒中的膽留醇，然后，將被測樣品中的殘留膽留醇定量從而對LDL膽留醇進行定量(專利文獻3)。肌酸酐例如可通過以下方法進行定量使肌酸脒基水解酶(creatineamidinohydrolase)、肌氨酸氧化酶和過氧化氫酶作用于體液中所含的肌酸，將由肌酸生成的過氧化氫除去后，接著使肌酸酐酰胺水解酶(creatinineamidehydrolase)、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、過氧化物酶和色原作用于體液中的肌酸酐，由肌酸酐生成肌酸、由肌酸生成肌氨酸、由肌氨酸生成過氧化氫、再使該過氧化氫發色后，通過測定其發色強度來進行定量(專利文獻1)。以下、基于實施例對本發明更具體地進行說明。但是，本發明不受下述實施例的限定。實施例比較例1、實施例1作為內源性游離甘油消除中性脂肪測定用試劑，配制具有下列組成的第1試劑和第2試劑。(比較例1)第1試劑PIPES緩沖液、pH6.550mmol/L甘油激酶1000U/L甘油-3-磷酸氧化酶5000U/L過氧化氫酶(來源于牛肝臟)300000U/LN-(2-羥基磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺0.3mmol/L腺苷5'-三磷酸1.6mmol/L氯化鎂7.5mmol/L聚乙二醇單對異辛基苯基醚0.3%第2試劑PIPES緩沖液、pH6.550mmol/L脂蛋白脂肪酶3000U/L過氧化物酶3000U/L4-氨基安替比林4.2mmol/L疊氮化鈉0.1%氯化鎂7.5mmol/L聚乙二醇單對異辛基苯基醚0.3%另一方面，將上述比較例1中第1試劑的過氧化氫酶改為來源于黑色曲霉(黑色曲霉CatR，RocheDiagnosticsGmbH社制)，配制第1試劑(實施例1)。在4iiL添加了00.1%疊氮化鈉的樣品(人血清)中，混合300uL預先在37°C下加熱的第1試劑，在37°C下反應5分鐘后，再加入100yL第2試劑反應5分鐘，測定600nm處的吸光度。由測得的吸光度算出中性脂肪量，求出樣品中的中性脂肪量。比較例1和實施例1的結果如表1所示。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>比較例1中，由于樣品中疊氮化鈉的添加量增加，因此妨礙了內源性游離甘油的消除，測定值上升。另一方面，實施例1中，即使疊氮化鈉的添加量增加，測定值也幾乎不上升，表明幾乎不妨礙消除體系。因此，根據本發明，即使混入疊氮化物，也不會妨礙基于過氧化氫酶的消除體系，可以進行準確的測定。權利要求由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差的減小方法，其特征在于用過氧化氫酶分解來源于測定對象成分以外的成分的過氧化氫，然后，通過將來源于測定對象成分的過氧化氫定量從而對所述測定對象成分進行定量，此時使用來源于具有75kDa以上亞基的微生物的過氧化氫酶作為所述過氧化氫酶。2.權利要求1所述的方法，其中所述過氧化氫酶為具有血紅素d的過氧化氫酶。3.權利要求1或2所述的方法，其中所述微生物為選自柄孢殼菌(Podospora)屬、脈孢菌(Neurospora)屬、枝抱(Cladosporium)屬、裸胞殼(Emericella)屬、側耳(Pleurotus)屬、異常球菌(Deinococcus)屬、±矣希氏菌(Escherichia)屬、沙門氏菌(Salmonella)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、分枝桿菌(Mycobacterium)屬、葡萄孢盤菌(Botryotinia)屬、麥角菌(Clavic印s)屬、曲霉(Aspergillus)屬、組織胞漿菌(Ajellomyces)屬、土壤桿菌(Agrobacterium)屬、中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬、中間根瘤菌(Mesorhizobium)屬、小孢子蟲(Nosema)屬和黃單胞菌(Xanthomonas)屬的微生物中的至少一種微生物。4.權利要求3所述的方法，其中所述微生物為曲霉屬菌。5.權利要求1至4中任一項所述的測定方法，其中所述測定對象成分為中性脂肪、HDL膽甾醇、LDL膽留醇或者肌酸酐。全文摘要本發明公開了減小由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差的方法，其是測定對象成分的定量方法，包含用過氧化氫酶分解來源于測定對象成分以外的成分的過氧化氫。由過氧化氫酶受疊氮化物的抑制引起的測定誤差的減小方法，是用過氧化氫酶分解來源于測定對象成分以外的成分的過氧化氫，然后，通過將來源于測定對象成分的過氧化氫定量從而對上述測定對象成分進行定量，此時使用來源于具有75kDa以上亞基的微生物的過氧化氫酶作為過氧化氫酶。文檔編號C12Q1/60GK101809163SQ20088010688公開日2010年8月18日申請日期2008年9月11日優先權日2007年9月12日發明者平尾裕子申請人:電化生研株式會社