產(chǎn)同型琥珀酸細(xì)菌突變體以及使用該微生物突變體制備琥珀酸的方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)同型琥珀酸細(xì)菌突變體以及使用該微生物突變體制備琥珀酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高產(chǎn)量產(chǎn)生同型琥珀酸(homo-succinic acid)的微生物突變體和使 用該微生物突變體生產(chǎn)同型琥珀酸的方法，具體涉及通過(guò)從產(chǎn)琥珀酸微生物中破壞乳酸脫 氫酶編碼基因(IdhA)和乙酸激酶編碼基因(ackA)構(gòu)建的微生物突變體，以及高濃度生產(chǎn) 同型琥珀酸的方法，所述方法包括使用葡萄糖作為碳源在厭氧條件下培養(yǎng)所述突變體。
背景技術(shù)：
琥珀酸(H00CCH2CH2C00H)，一種由4個(gè)碳原子構(gòu)成的二羧酸，是具有高效用的 有機(jī)酸，其被廣泛用作藥物、食物、化妝品和其他工業(yè)的化學(xué)產(chǎn)品(Zeikus等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.，51 :545，1999 ；Song 等人，Enzyme Microbial Technol.，39 :352， 2006)的前體。特別是，隨著最近石油價(jià)格的劇烈上漲和有關(guān)環(huán)境污染的關(guān)注日益增加， 預(yù)期對(duì)于琥珀酸作為可生物降解大分子的主要來(lái)源的需要急劇增加(Willke等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,66 :131,2004)。琥珀酸可通過(guò)化學(xué)合成和發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)，并且僅僅少量用于特別用途，諸如用作藥 物、食品添加劑和保護(hù)劑的琥珀酸通過(guò)傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。相反，目前用于工業(yè) 應(yīng)用的大多數(shù)琥珀酸由美國(guó)、歐洲、日本和中國(guó)的大石化公司使用來(lái)自石油或液化天然氣 (LNG)的η-丁烷和乙炔通過(guò)化學(xué)合成方法生產(chǎn)。一般說(shuō)來(lái)，上面提到的化學(xué)合成方法具有 的問(wèn)題在于排出大量的在生產(chǎn)丁二醇的過(guò)程中產(chǎn)生的有害固體廢物、廢水和廢氣(例如CO 等)。特別是，具有高消耗可能性的化石來(lái)源被用作基本材料，因此迫切需要開(kāi)發(fā)可替代原 料諸如可再生來(lái)源代替化石來(lái)源的琥珀酸制備方法。為了克服由制備琥珀酸的化學(xué)合成工藝帶來(lái)的這些問(wèn)題，有關(guān)通過(guò)使用各種可再 生來(lái)源通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸已經(jīng)由許多研究人員廣泛深入地進(jìn)行。由于這些努力的 結(jié)果，可相對(duì)大量產(chǎn)生琥珀酸的微生物，諸如基因工程hcherichia coli，反芻細(xì)菌(放線(xiàn) 桿菌屬、擬桿菌屬、曼氏桿菌屬、琥珀酸單胞菌屬、琥珀酸弧菌屬等)和厭氧螺菌屬被鑒別 和開(kāi)發(fā)(Song 等人，Enzyme Microbial Technol. ,39 :352,2006) 作為用于使用微生物產(chǎn)生琥珀酸的新菌株開(kāi)發(fā)的研究，使用E. coli的研究很容 易操作并且對(duì)其新陳代謝特性可進(jìn)行較好的研究。E. coli用于生產(chǎn)琥珀酸的操作包括 在生產(chǎn)乳酸和蟻酸中涉及的dh和pfl的破壞，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ptsG的操作，蘋(píng)果酸酶 基因SfcA的擴(kuò)增，來(lái)自菜豆根瘤菌菌株的在丙酮酸羧化過(guò)程中涉及的外源基因pyc的引 入，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因pta的破壞。另外，可在有氧條件下產(chǎn)生琥珀酸的基因工程E. coli 菌株已經(jīng)通過(guò)對(duì)在糖酵解、三羧酸(TCA)循環(huán)和乙醛酸途徑中涉及的基因進(jìn)行操作被 開(kāi)發(fā)(US5770435 ；Hong 等人，Biotechnol. Bioeng. ,74 :89,2001 ；Venuri 等人，J. Ind. Microbiol. Biotechnol. ,28 :325,2001 ；US 6648061 ；Lin 等人，Eng.，7 :116,2005 ；Lin 等 人，Biotechnol. Bioeng.，90 :775，2005)。根據(jù)迄今為止已經(jīng)報(bào)道的研究，已知作為反芻細(xì)菌種類(lèi)的放線(xiàn)桿菌和曼氏桿菌(Mannheimia)菌株和專(zhuān)性厭氧細(xì)菌，厭氧螺菌菌株在厭氧條件下產(chǎn)生大量的琥珀酸，并具 有比基因工程菌E. coli更高的產(chǎn)率。關(guān)于放線(xiàn)桿菌，美國(guó)密西根生物技術(shù)研究所(MBI)-領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)分離了琥 珀酸放線(xiàn)桿菌130Z菌株(ATCC No. 55618)并開(kāi)發(fā)了生產(chǎn)琥珀酸的方法(U.S.專(zhuān)利號(hào) 5504004)，并使用傳統(tǒng)化學(xué)基因突變法構(gòu)建了各種琥珀酸放線(xiàn)桿菌微生物突變體以便在開(kāi) 發(fā)生產(chǎn)和純化琥珀酸的過(guò)程中使用(U. S.專(zhuān)利號(hào)5521075 ；U. S.專(zhuān)利號(hào)5168055 ；U. S.專(zhuān)利 號(hào) 5143834)。但是，到目前為止開(kāi)發(fā)的使用微生物發(fā)酵的琥珀酸生產(chǎn)工藝產(chǎn)率低，并且每克碳 源的琥珀酸產(chǎn)量非常低，因此導(dǎo)致商業(yè)化的困難，尤其是以發(fā)酵為基礎(chǔ)的琥珀酸生產(chǎn)工藝 招致從發(fā)酵液中分離和純化琥珀酸的成本巨大，因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中琥珀酸與作為副產(chǎn)物的 大量各種有機(jī)酸和乙醇一起產(chǎn)生。特別是，琥珀酸放線(xiàn)桿菌和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌要求大量的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)成分諸如發(fā)酵 中提取的酵母菌，因此生產(chǎn)琥珀酸發(fā)生高原材料費(fèi)用；而且還加入大量的MgCO3或CaCO3來(lái) 調(diào)節(jié) pH，導(dǎo)致分離和純化的困難(US 5504004 ；US 5521075 ；US 5168055 ；US 5143834)。為 了克服前述缺陷并使使用微生物發(fā)酵琥珀酸的生產(chǎn)商業(yè)化，存在對(duì)于開(kāi)發(fā)高產(chǎn)量有效產(chǎn)生 同型琥珀酸但避免副產(chǎn)物形成的新琥珀酸產(chǎn)生菌以便高產(chǎn)量生產(chǎn)同型琥珀酸的迫切需要 (Song 等人，Enzyme Microbial Technol.，39 :352，2006)。為了開(kāi)發(fā)新的琥珀酸產(chǎn)生菌以滿(mǎn)足上述需要，首先應(yīng)當(dāng)進(jìn)行具有極好琥珀酸 產(chǎn)生能力的菌株的分離，其新陳代謝特性的理解，其基因組序列的完成以及對(duì)于構(gòu)建 基因工程菌所要求的基因操作技術(shù)的建立。雖然試圖嘗試通過(guò)在E. COli中擴(kuò)增琥珀 酸放線(xiàn)桿菌和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(PckA)生產(chǎn)琥珀 酸已經(jīng)被報(bào)道(Kim 等人，Appl. Environ. Microbiol. ,70 :1238,2004 ；Laivenieks 等 人，Appl. Environ. Microbiol.，63 :2273，1997)，到目前為止，除產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌 (Mannheimiasucciniciproducens)以外，尚沒(méi)有琥珀酸過(guò)量產(chǎn)生菌的全基因組序列的報(bào) 道，并且除由本發(fā)明的發(fā)明人報(bào)道的研究以外，沒(méi)有試圖嘗試基于基因組序列來(lái)開(kāi)發(fā)基因 工程琥珀酸產(chǎn)生菌株。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)報(bào)道他們從韓國(guó)母牛中分離了高效產(chǎn)生琥珀酸的 M. succiniciproducens MBEL55E (于2000年4月10日被保藏在地址為韓國(guó)大田市305-333 儒城區(qū)魚(yú)隱洞#52韓國(guó)生命工學(xué)研究院的韓國(guó)典型菌種保存中心(KCTC)，保藏號(hào)為 KCTC0769BP)，完成了其全基因組序列，并描述了菌株的新陳代謝性質(zhì)(Hong等人，Nature Biotechnol. ,22 =1275,2004)。而且，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)在 Μ. succiniciproducens MBEL55E中破壞編碼乳酸脫氫酶的基因(IdhA)和編碼丙酮酸甲酸裂解酶的基因(pfl) 構(gòu)建了細(xì)菌突變體M. succiniciproducens LPK(于2003年11月沈日被保藏在地址為 韓國(guó)大田市305-333儒城區(qū)魚(yú)隱洞#52韓國(guó)生命工學(xué)研究院的韓國(guó)典型菌種保存中心 (KCTC)，保藏號(hào)為KCTC10558BP)。另外，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)在所述微生物突變體 M. succiniciproducens LPK中破壞磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?pta)和乙酸激酶基因(ackA) 構(gòu)建了微生物突變體M. succiniciproducens LPK7 (于2004年04月22日被保藏在地址 為韓國(guó)大田市305-333儒城區(qū)魚(yú)隱洞#52韓國(guó)生命工學(xué)研究院的韓國(guó)典型菌種保存中心 (KCTC)，保藏號(hào)為KCTC106^BP)，從而增加了琥珀酸的產(chǎn)生(W0 2005/052135 Al)。但是，在這種微生物變種的情況下，雖然副產(chǎn)物乳酸、蟻酸和醋酸的形成可被有效抑制，但在發(fā)酵 過(guò)程中大量丙酮酸作為副產(chǎn)物積累。特別是，與野生型菌株相比M. succiniciproducens LPK7的生長(zhǎng)率變得非常低，以至于不能達(dá)到顯著的琥珀酸的高產(chǎn)。雖然本發(fā)明的發(fā)明人已 經(jīng)通過(guò)在 M. succiniciproducensMBEL55E (PCT/KR2007/003574)中破壞乳酸脫氫酶編碼基 因(IdhA)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶編碼基因(pta)和醋酸激酶編碼基因(ackA)構(gòu)建了微生物突變 體M. succiniciproducens PALK(于2006年07月洸日被保藏在地址為韓國(guó)大田市305-333 儒城區(qū)魚(yú)隱洞#52韓國(guó)生命工學(xué)研究院的韓國(guó)典型菌種保存中心(KCTC)，保藏號(hào)為KCTC 1097!3BP)，結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長(zhǎng)率的增加并提高了琥珀酸產(chǎn)率，仍然存在對(duì)于更好的產(chǎn)琥 珀酸突變微生物的開(kāi)發(fā)的需要。本發(fā)明的發(fā)明人付出了極大的努力通過(guò)在M. succiniciproducensMBEL55E和 M. succiniciproducens ALKt中破壞乳酸脫氫酶編碼基因(IdhA)和醋酸激酶編碼基因 (ackA)構(gòu)建微生物突變體(M. succiniciproducens ALK)，其作為與基于實(shí)際細(xì)胞模型的結(jié) 果的所述突變體相同效果的突變體，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用葡萄糖作為碳源在厭氧條件下對(duì)微生物 突變體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，它們可高產(chǎn)量地生產(chǎn)同型琥珀酸，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供具有高琥珀酸產(chǎn)率的缺少乳酸脫氫酶編碼基因 (IdhA)和醋酸激酶編碼基因(ackA)的反芻微生物突變體，以及制備該微生物突變體的方法。本發(fā)明的另一目的在于通過(guò)使用葡萄糖作為碳源在厭氧條件下培養(yǎng)所述微生物 突變體來(lái)提供高產(chǎn)量產(chǎn)生同型琥珀酸而不積累其他副產(chǎn)物的方法。述微生物突變體來(lái)提 供高產(chǎn)量產(chǎn)生同型琥珀酸而不積累其他副產(chǎn)物的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了缺少乳酸脫氫酶編碼基因(IdhA)和醋酸激酶 編碼基因(ackA)同時(shí)在產(chǎn)琥珀酸微生物中保持了磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?pta)的產(chǎn)琥珀酸 微生物突變體，其可在厭氧條件下高濃度產(chǎn)生琥珀酸。本發(fā)明還提供了產(chǎn)琥珀酸微生物突變體M. succiniciproducens ALKt，其中編碼 磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶的基因(pta)被引入到缺少乳酸脫氫酶編碼基因(IdhA)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶 基因(pta)和醋酸激酶編碼基因(ackA)的M. succiniciproducens PALK中。本發(fā)明還提供了產(chǎn)琥珀酸微生物突變體M. succiniciproducens ALK，其中在 M. succiniciproducens MBEL55E中乳酸脫氫酶基因(IdhA)和醋酸激酶基因(ackA)被破 壞。另外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的方法，其包括下列步驟(a)通 過(guò)同源重組在產(chǎn)琥珀酸微生物的基因組中破壞編碼乳酸脫氫酶基因(IdhA)的基因得到缺 乏乳酸脫氫酶基因(IdhA)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體；和(b)通過(guò)同源重組在缺少乳酸脫氫 酶基因(IdhA)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的基因組中破壞編碼醋酸激酶的基因(ackA)得到 缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)和醋酸激酶基因(ackA)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體。本發(fā)明還提供了制備產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的方法，其中編碼磷酸轉(zhuǎn)乙?；傅?基因(Pta)被引入到缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶基因(pta)和醋酸激酶 基因(ackA)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體中。
此外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)琥珀酸的方法，其包括在厭氧條件下培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸微生 物突變體的步驟和從培養(yǎng)液中回收琥珀酸的步驟。通過(guò)下列詳細(xì)描述和隨附的權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和實(shí)施方式將更加清
林 疋。附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示在曼氏桿菌屬微生物突變體中的同型琥珀酸產(chǎn)生途徑的示意圖，其中 同型琥珀酸高產(chǎn)量產(chǎn)生。圖2顯示了構(gòu)建用于破壞IdhA的載體(pMLKO-sacB)的過(guò)程。圖3顯示了構(gòu)建用于破壞IdhA的載體(pMFldhA)的過(guò)程。圖4顯示了通過(guò)從M. succiniciproducens MBEL55E中破壞IdhA以構(gòu)建微生物突 變體(M. succinicproducens LK)的過(guò)禾呈。圖5顯示了通過(guò)從M. succiniciproducens MBEL55E中破壞IdhA以構(gòu)建微生物突 變體(M. succinicproducens MFLK)的過(guò)程。圖6顯示了構(gòu)建用于破壞pta和ackA的載體(pPTA-sacB)的過(guò)程。圖7顯示了構(gòu)建用于破壞ackA的載體(pAckAKO)的過(guò)程。圖8顯示了通過(guò)從M. succiniciproducens LK中破壞pta-ackA以構(gòu)建微生物突 變體(M. succinicproducens PALK)的過(guò)程。圖9顯示了通過(guò)從M. succiniciproducens MFLK中破壞ackA以構(gòu)建微生物突變 體(M. succinicproducens ALK)的過(guò)禾呈。圖10是顯示用于通過(guò)在M. succinicproducens PALK中表達(dá)pta來(lái)制備微生物突 變體(M. succinicproducens ALKt)的 pta 表達(dá)載體(pME18PTA)的示意圖。圖11顯示在厭氧條件下使用(X)2飽和的本發(fā)明的M. succiniciproducensPALK、 Μ. succiniciproducens ALKt 禾口 Μ· succiniciproducens ALK 的培養(yǎng)特性。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)了實(shí)際細(xì)胞模型以便開(kāi)發(fā)通過(guò)使副產(chǎn)物形成最小化高濃度 有效生產(chǎn)同型琥珀酸的微生物突變體。M. succiniciproducens MBEL55E的基因組包 括 2314078 個(gè)堿基對(duì)(Hong 等人，Nat. Biotechnol. ,22 12275，2005)，并含有 2384 個(gè) 候選基因，其由生物信息學(xué)所揭示(Kim等人，Biotechnol, Bioeng. ,97 :657，2007)。 M. succiniciproducens MBEL55E的基因分布在整個(gè)基因組中，并根據(jù)其全基因組的性質(zhì) 被評(píng)估的細(xì)胞功能分類(lèi)。基因組信息的綜合分析被提供以設(shè)定M. succiniciproducens MBEL55E的實(shí)際細(xì)胞模型。實(shí)際細(xì)胞包括686個(gè)酶反應(yīng)和516個(gè)代謝，其代謝級(jí)聯(lián)的變化被 定量比較。需要大量微生物突變體來(lái)使用每種基因的組合構(gòu)建多基因突變體。在現(xiàn)實(shí)中，由 于在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上構(gòu)建這種數(shù)目巨大的微生物突變體困難到不可能；使用實(shí)際細(xì)胞模型進(jìn)行計(jì) 算機(jī)模擬(in silico simulation)(韓國(guó)專(zhuān)利號(hào)630，836)。特別是，在計(jì)算機(jī)中在兩個(gè)或 三個(gè)基因的每個(gè)被組合和消除之后，對(duì)于每種突變體的產(chǎn)物形成率和特定生長(zhǎng)率被計(jì)算， 通過(guò)上述計(jì)算推導(dǎo)選擇曲線(xiàn)(trade off curve) 0另外，在所述選擇曲線(xiàn)上，待消除的基因 組合被選擇，其可假定消除使細(xì)胞生長(zhǎng)速率的抑制最小化并使琥珀酸的產(chǎn)率最大化的基因組合。在本發(fā)明中，具有ackA和IdhA同時(shí)破壞的組合的AackA Δ IdhA菌株被生產(chǎn)以產(chǎn)生 用于琥珀酸產(chǎn)率對(duì)菌株的特定生長(zhǎng)速率的優(yōu)化曲線(xiàn)。在本發(fā)明中，檢查了含有編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶(pta)的基因并具有破壞的編碼乳 酸脫氫酶的基因(IdhA)和編碼醋酸激酶的基因(ackA)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體是否能夠 在厭氧條件下高濃度產(chǎn)生琥珀酸。為了檢查其能力，在通過(guò)由M. succiniciproducens MBEL55E，一種產(chǎn)琥珀酸細(xì)菌 中破壞乳酸脫氫酶基因(IdhA)、醋酸激酶基因(ackA)和磷酸轉(zhuǎn)乙?；傅幕?pta)構(gòu)建 的M. succiniciproducens PALK中重新表達(dá)編碼磷酸轉(zhuǎn)乙?；傅幕?pta)，由此構(gòu)建 了微生物突變體(M. succiniciproducensALKt)。另外，通過(guò)在M. succiniciproducens MBEL55E，一種產(chǎn)琥珀酸細(xì)菌中破壞乳酸 脫氫酶基因(IdhA)和醋酸激酶基因(ackA)構(gòu)建微生物突變體(M. succiniciproducens ALK)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)和醋酸激酶基因 (ackA)的同時(shí)將磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶基因(pta)保持在產(chǎn)琥珀酸微生物中的產(chǎn)琥珀酸微生物 突變體，其能夠在厭氧條件下高濃度產(chǎn)生同型琥珀酸。在本發(fā)明中，所述產(chǎn)琥珀酸微生物優(yōu)選選自下組，該組包括放線(xiàn)桿菌屬，厭氧螺菌 屬，擬桿菌屬，曼氏桿菌屬，琥珀酸單胞菌屬，琥珀酸弧菌屬和基因工程大腸桿菌，更優(yōu)選曼 氏桿菌屬，但不限于此，并且任何微生物都可被使用而沒(méi)有限制，只要其能夠在厭氧條件下 產(chǎn)生琥珀酸。在本發(fā)明中，如果產(chǎn)琥珀酸微生物含有磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶基因(pta)，所述產(chǎn)琥珀酸 微生物突變體可通過(guò)破壞乳酸脫氫酶基因(IdhA)和醋酸激酶基因(ackA)構(gòu)建。并且如果 產(chǎn)琥珀酸微生物固有或非固有地失去磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶基因(Pta)，則所述琥珀酸微生物突 變體可通過(guò)破壞乳酸脫氫酶編碼基因(IdhA)和醋酸激酶基因(ackA)并引入磷酸轉(zhuǎn)乙酰基 酶基因(pta)構(gòu)建。本發(fā)明還涉及產(chǎn)琥珀酸微生物突變體(M. succiniciproducens ALKt)，其中磷酸 轉(zhuǎn)乙?；富?Pta)被引入到缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)、磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?pta) 和醋酸激酶基因(ackA)產(chǎn)琥珀酸微生物突變體(M. succiniciproducens PALK)中。本發(fā)明還涉及產(chǎn)琥珀酸微生物突變體(M. succiniciproducens ALK)，其中醋酸激 酶基因(ackA)在通過(guò)從M. succiniciproducens MBEL55E中破壞乳酸脫氫酶基因(IdhA) 構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體(M. succiniciproducensMFLK)中被破壞。在本發(fā)明中，所述產(chǎn)琥珀酸微生物突變體優(yōu)選為僅僅能夠高濃度產(chǎn)生琥珀酸同時(shí) 很少或者不產(chǎn)生作為副產(chǎn)物的其他有機(jī)酸和乙醇的同型發(fā)酵微生物(homo-fermentative microorganism)0所述產(chǎn)琥珀酸微生物突變體可高濃度生產(chǎn)同型琥珀酸，因?yàn)樵趨捬鯒l件下當(dāng)葡萄 糖被用作碳源時(shí)在一般發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物諸如乙醇和其他有機(jī)酸的形成可有效地被防止。通過(guò)產(chǎn)琥珀酸微生物諸如琥珀酸放線(xiàn)桿菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌和已知產(chǎn)琥珀 酸的各種產(chǎn)琥珀酸的微生物的部分遺傳信息(16s rRNA)、新陳代謝特征和發(fā)酵結(jié)果，發(fā) 現(xiàn)在所屬產(chǎn)琥珀酸微生物中由碳源產(chǎn)生琥珀酸的主要生物合成途徑與曼氏桿菌屬中琥 珀酸產(chǎn)生的生物合成途徑幾乎相同(Van der Werf等人，Arch Microbiol. ,167 :332,1997 ；Laivenieks 等人’ Appl. Environ. Microbiol. , 63 :2273,1997 ；SamueIov 等人’ App. Environ. Microbiol. ,65 :2260,1999 ；Kim 等人，Appl. Environ. Microbiol. ,70 :1238, 2004)。尤其是，在琥珀酸產(chǎn)生中參與的所有細(xì)菌在琥珀酸生產(chǎn)時(shí)都使用(X)2固定酶將磷酸 烯醇式丙酮酸和丙酮酸、C3化合物轉(zhuǎn)化成草酰乙酸和蘋(píng)果酸、C4化合物，從而產(chǎn)生琥珀酸 (圖1)。另外，在厭氧條件下產(chǎn)琥珀酸微生物產(chǎn)生乙酸、甲酸、乳酸和乙醇作為發(fā)酵副產(chǎn)物。在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的方法，包括下列步驟(a) 通過(guò)同源重組在Μ. succiniciproducens MBEL55E中破壞編碼乳酸脫氫酶基因(IdhA)的 基因得到缺乏乳酸脫氫酶基因(IdhA)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體；和(b)通過(guò)同源重組在 缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的基因中破壞編碼醋酸激酶的基因 (ackA)得到缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)和醋酸激酶基因(ackA)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變 體。在本發(fā)明中，同源重組優(yōu)選通過(guò)使用含有破壞IdhA的遺傳交換載體和含有破壞 ackA的遺傳交換載體進(jìn)行。在本發(fā)明中，所述含有破壞IdhA的遺傳交換載體優(yōu)選為pMLKO-sacB和pMFldhA， 并且所述含有破壞ackA的遺傳交換載體優(yōu)選為pPTA-sacB和pAckAKO。在又一方面，本發(fā)明涉及構(gòu)建產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的方法，其包括將磷酸轉(zhuǎn)乙 ?；富?Pta)引入到缺少編碼乳酸脫氫酶的基因(IdhA)、編碼醋酸激酶的基因(ackA) 和磷酸轉(zhuǎn)乙?；傅幕?pta)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體中。在本發(fā)明中，所述缺少乳酸脫氫酶基因(ldhA)、醋酸激酶基因(ackA)和 磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶基因(pta)的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體優(yōu)選M. succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)。在又一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)琥珀酸的方法，包括下列步驟在厭氧條件下培養(yǎng)所 述產(chǎn)琥珀酸微生物突變體；并從培養(yǎng)液中回收琥珀酸。在本發(fā)明中，優(yōu)選葡萄糖作為用于培養(yǎng)的碳源。在本發(fā)明中，基因工程微生物的培養(yǎng)和琥珀酸的生產(chǎn)工藝可通過(guò)常規(guī)發(fā)酵過(guò)程中 已知的培養(yǎng)方法以及用于分離和純化琥珀酸的方法來(lái)進(jìn)行。
實(shí)施例下面將通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)容易想到的 是，這些實(shí)施例僅僅用于說(shuō)明的目的，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例或者不由這些實(shí)施例限定。特別是，下面的實(shí)施例僅僅示出了特定載體和作為產(chǎn)琥珀酸微生物的曼氏桿菌屬 作為宿主細(xì)胞以便剔除根據(jù)本發(fā)明的基因。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到的是，即便當(dāng)使 用其他種類(lèi)的載體和產(chǎn)琥珀酸微生物時(shí)也可得到產(chǎn)琥珀酸的微生物突變體。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)還顯而易見(jiàn)的是，缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)和醋酸激 酶基因(ackA)的微生物突變體的效果與通過(guò)在缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)、醋酸激酶基 因(ackA)和磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?pta)的微生物突變體中重新表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?(pta)構(gòu)建的微生物突變體的效果相同。實(shí)施例1 IdhA破壞載體(pMLKO-sacB)的構(gòu)建為了通過(guò)同源重組破壞產(chǎn)琥珀酸微生物中的乳酸脫氫酶基因(ldhA)，以下列方式構(gòu)建遺傳交換載體。首先，使用在下面序列號(hào)1和序列號(hào)2中闡明的引物以 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)基因組 DNA 作為模板進(jìn)行 PCR，然后使用 SacI和I3StI切割得到的PCR片段并將其引入到pUC18載體(New England Biolabs,Inc., USA)中，由此構(gòu)建pUC18-Ll。序列號(hào)1:5，-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG-3，序列號(hào)2:5，-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA-3，另外，以M. succiniciproducens MBEL55E的基因組DNA作為模板，使用在下面序 列號(hào)3和序列號(hào)4中闡明的引物進(jìn)行PCR，使用I^stI和HindIII切割得到的PCR片段，并 將其引入到PUC18-L1中，由此構(gòu)建pUC18-Ll-L2。序列號(hào)3:5，-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC-3，序列號(hào)4:5，-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG-3，為了將卡那霉素抗性基因插入到PUC18-L1-L2中作為選擇標(biāo)記物，使用I^stI切割 PUC4K載體(Pharmacia，F(xiàn)reiburg, Germany)，并將卡那霉素抗性基因與使用I3StI切割的 PUC18-L1-L2融合，從而構(gòu)建pUC18-Ll-KmR-L2。將在序列號(hào)5中闡明的連接子插入到使 用Mel切割的pUC 18-Ll-KmR-L2中，從而形成新的)(bal切割位點(diǎn)。序列號(hào)5:5，-TCTAGAAGCT以pKmobsacB (Schafer等人，Gene，145 :69，1994)作為模板，使用在下面序列號(hào)6 和序列號(hào):7中闡明的引物進(jìn)行PCR。然后，將得到的PCR片段使用^CbaI切割，并將其插入 到新的)(bal限制酶位點(diǎn)中，從而構(gòu)建pMLK0-sacB(圖2)。序列號(hào)65' -GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3，序列號(hào)7:5，-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC-3，實(shí)施例2 IdhA破壞載體(pMFldhA)的構(gòu)建為了通過(guò)同源重組破壞M. succiniciproducens MBEL55E基因組中的乳酸脫氫酶 基因(IdhA)，以下列方式構(gòu)建遺傳交換載體。首先，以M. succiniciproducens MBEL55E的 基因組DNA作為模板使用在下面序列號(hào)8和序列號(hào)9中闡明的引物進(jìn)行PCR，然后使用 BamHI和PstI切割得到的PCR片段并將其引入到pSacHR06 (Park等人，PNAS.，104 :7797， 2007)中，從而構(gòu)建pldhAL。序列號(hào)8 5 ‘ -TTGCAACATGGCGAACTTAGC-3 ‘序列號(hào)9 5 ‘ -ATATCTGCAGTTAATAAAATGCGCGACGG-3 ‘接著，以M. succiniciproducens MBEL55E的基因組DNA作為模板，使用在下面序 列號(hào)10和序列號(hào)11中闡明的引物進(jìn)行PCR，然后使用MlI和SphI切割得到的PCR片段 并將其插入到PldhAL中，從而構(gòu)建pldhALR。序列號(hào)10:5，5'-ATATGTCGACCAACTTTCATAGTTAGCTCC-3'序列號(hào)11 5 ‘ -ATCCGCATGCTTGCCGTCGTTTAGTGCTG-3 ‘以 pMSmulox(Kim 等人，F(xiàn)EMS Microbial Lett.，278 :78,2008)作為模板，使用在 下面序列號(hào)12和序列號(hào)13中闡明的引物進(jìn)行PCR。然后使用Sl核酸酶處理得到的PCR 片段以產(chǎn)生平頭末端，并插入到PldhALR中，從而構(gòu)建pMFldhA(圖3)。序列號(hào)12 5 ‘ -ATATAAGCTTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGACGGGCTGG CGGTATTGG-3‘
序列號(hào)13:5‘ -AATTCCCGGGTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAA GTTATTGCCAGTTGATCACCTCGGG-3‘實(shí)施例 3 :M. succiniciproducens LK 菌株的構(gòu)建通過(guò)破壞M. succiniciproducens MBEL55E基因組中的IdhA基因構(gòu)建微生物突變 體(M. succiniciproducens LK)(圖 4)。特別是，將M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)接種于含有 10g/L 葡 萄糖的LB-瓊脂糖培養(yǎng)基上并在37°C下培養(yǎng)36小時(shí)。將形成的菌落接種到10ml LB-葡萄 糖液體培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)12小時(shí)。將已經(jīng)充分生長(zhǎng)的的培養(yǎng)液接種在100ml LB-葡萄 糖液體培養(yǎng)基中，并以200rpm在37 °C下在搖床中培養(yǎng)。4-5小時(shí)之后當(dāng)培養(yǎng)液的OD6tltl達(dá)到大約0. 3-0. 4時(shí)，將其在4°C下4500rpm離心 20分鐘以收集細(xì)胞。然后，在4°C下200ml 10%甘油溶液中細(xì)胞懸浮并在4°C下5500rpm 離心20分鐘以收集細(xì)胞。重新懸浮之后，以上面描述的過(guò)程同樣的方式收集一半上述甘油 溶液兩次，將細(xì)胞以1 1的體積比懸浮在甘油溶液中以得到細(xì)胞濃縮液。將由此得到的細(xì)胞濃縮液與在實(shí)施例1中構(gòu)建的遺傳交換載體pMLKO-sacB 混合，然后通過(guò)在1. 8kV、25 μ F和200ohms條件下電穿孔將pMLK0_sacB引入到培養(yǎng) 的M. succiniciproducens MBEL55E中。將Iml LB-葡萄糖液體培養(yǎng)基加入到引入了 pMLKO-sacB的菌株中，并在37°C下以200rpm在搖床中預(yù)培養(yǎng)一小時(shí)。將培養(yǎng)液接種于含 有抗生素卡那霉素(終濃度25 μ g/ml)的LB-葡萄糖液體培養(yǎng)基上并在37°C下培養(yǎng)48小 時(shí)或者更長(zhǎng)。為了選擇其中僅僅發(fā)生雙交換的菌落，將形成的菌落在含有卡那霉素(25μ g/ ml)和100g/L蔗糖的LB-蔗糖固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)。M小時(shí)以后，再次將形成的菌落在相同 培養(yǎng)基上劃線(xiàn)。將在培養(yǎng)基上形成的菌落(突變體)在含有抗生素的LB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，并從菌株中通過(guò)Rochelle等人描述的方法分離基因組DNA(Rochelle等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett.，100 :59，1992)。使用分離的突變體基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，并將 PCR產(chǎn)物電穿孔以證實(shí)基因組DNA中IdhA的破壞。為了證實(shí)IdhA基因的破壞，以下列方式進(jìn)行兩次PCR。首先，以突變體基因組DNA 作為模板使用在序列號(hào)14和序列號(hào)15中闡明的引物進(jìn)行PCR。序列號(hào)14:5，-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC-3，(KMl)序列號(hào)15:5'-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC-3，(LUl)然后，以突變體基因組DNA作為模板使用在序列號(hào)16和序列號(hào)17中闡明的引 物進(jìn)行PCR。將在兩種PCR中得到的PCR片段進(jìn)行凝膠電泳以根據(jù)它們的大小(1.51Λ)證 實(shí)IdhA的破壞。序列號(hào)16:5，-GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG(KM2)序列號(hào)175' -CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC(LU2)通過(guò)如下事實(shí)確認(rèn)具有破壞IdhA的基因組DNA的PCR片段使用引物序列號(hào) 14(KMl)和序列號(hào)15 (LUl)通過(guò)PCR得到的產(chǎn)物具有1. 5kb的大小，同時(shí)，使用引物序列 號(hào):16(KM2)和序列號(hào):17(LU2)通過(guò)PCR得到的產(chǎn)物具有1. 7kb的大小。每個(gè)引物的位置 在圖4中顯示。實(shí)施例 4 :M. succiniciproducens MFLK 菌株的構(gòu)建
通過(guò)破壞M. succiniciproducens MBEL55E基因組中的IdhA基因構(gòu)建微生物突變 體(M. succiniciproducens MFLK)(圖 5)。特別是，將M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)接種子含有 10g/L 葡萄 糖的TSA-葡萄糖培養(yǎng)基上，并在37°C下培養(yǎng)36小時(shí)。將形成的菌落接種到IOml LB-葡萄 糖液體培養(yǎng)基中并培養(yǎng)12小時(shí)。將已經(jīng)充分生長(zhǎng)的的培養(yǎng)液接種到100ml LB-葡萄糖 培養(yǎng)液中并在搖床中200rpm37°C下培養(yǎng)。在以與實(shí)施例3中描述的相同方式從所述培養(yǎng)液中得到的濃縮液與在實(shí)施例2中 構(gòu)建的遺傳交換載體PMFldhA混合，然后在1. 8kV、25 μ F和200ohms條件下通過(guò)電穿孔將 pMFldhA引入到培養(yǎng)的M. succiniciproducensMBEL55E中。將Iml LB-葡萄糖培養(yǎng)液加入 到引入了 pMFldhA的菌株中，并37°C下以200rpm在搖床中預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)。將培養(yǎng)液接種 于含有抗生素氯霉素(終濃度6. 8 μ g/ml)的TSA-葡萄糖培養(yǎng)基上并在37°C下培養(yǎng)48小 時(shí)或者更長(zhǎng)。為了選擇其中僅僅發(fā)生雙交換的菌落，將形成的菌落在含有氯霉素(6. Syg/ ml)和100g/L蔗糖的TSA-蔗糖平板上劃線(xiàn)。M小時(shí)以后，再次將形成的菌落在相同培養(yǎng) 基上劃線(xiàn)。使用通過(guò)重復(fù)上述過(guò)程得到的菌落進(jìn)行PCR，并將得到的PCR產(chǎn)物電穿孔以證實(shí) 基因組DNA中IdhA基因的破壞。為了證實(shí)IdhA基因的破壞，以下列方式進(jìn)行兩次PCR。首先，以突變體基因組DNA 作為模板使用在序列號(hào)18和序列號(hào)19中闡明的引物進(jìn)行PCR。序列號(hào)18:5'-ACCTTTACTACCGCACTGCTGG-3‘序列號(hào)19:5'-GCGGGAGTCAGTGAACAGGTAC-3‘然后，以突變體基因組DNA作為模板使用在序列號(hào)20和序列號(hào)21中闡明的引 物進(jìn)行PCR。將在兩種PCR中得到的PCR片段進(jìn)行凝膠電泳以證實(shí)基因組DNA中IdhA基因 的破壞。序列號(hào)20:5'-TTACAGCTCACCGAAAGCACGC-3‘序列號(hào)21 5 ‘ -ATAAGCGGCGTTAACCTTCAAC-3 ‘為了從所述IdhA雙交換微生物突變體中破壞抗生素基因，得到IdhA雙交換突變 體的細(xì)胞濃縮物，然后使用TS質(zhì)粒pCRX5 (Kim等人，F(xiàn)EMSMicrobial Lett.，278 :78，2008) 以上面描述的相同方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。PCRX5插入到表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞中以破壞定位在Iox 位點(diǎn)之間的氯霉素基因。將含有pCRX5的IdhA雙交換微生物突變體接種到含有氨芐西林 的TSB液體培養(yǎng)基中并培養(yǎng)M小時(shí)，然后接種于含有氨芐西林的TSB瓊脂培養(yǎng)基上。缺少 抗生素基因的IdhA雙交換微生物突變體使用在序列號(hào)22和序列號(hào)23中闡明的引物通 過(guò)PCR證實(shí)。序列號(hào)22:5'-TTACAGCTCACCGAAAGCACGC-3‘序列號(hào)23:5'-AATTCGTAACGCATCCGCCG-3‘然后，為了破壞pCRX5，將細(xì)胞(IdhA雙交換突變菌株)轉(zhuǎn)移到不含抗生素的TSB 液體培養(yǎng)基中，在42°C下培養(yǎng)M小時(shí)，并再次在不含抗生素的TSB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng) (300C )。將形成的菌落在含有氨芐西林和抗生素的TSB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)并在30°C下培養(yǎng)，由 此得到不能在含有氨芐西林的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的破壞PCRX5的M. succinicproducens MFLK。實(shí)施例5 用于pta和ackA破壞的遺傳交換載體(pPTA-sacB)的構(gòu)建為了通過(guò)同源重組破壞M. succiniciproducens LK菌株基因組中的磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶基因(Pta)和醋酸激酶基因(ackA)，以下列方式構(gòu)建遺傳交換載體。以含有sacB基 因(GenBank 02730)的載體pKmobsacB作為模板使用在序列號(hào) 和序列號(hào)25中闡明的 引物進(jìn)行PCR。將得到的sacB產(chǎn)物使用I3StI和BamHI切割并插入到pUC19 Gtratagene Cloning Systems. USA)中，從而構(gòu)建 pUC19_sacB。序列號(hào)24 5 ‘ -AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3 ‘序列號(hào)25:5'-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC-3'同時(shí)，以 M. succiniciproducensLK (KCTC10558BP)的基因組 DNA 作為模板，使用在 序列號(hào)26和序列號(hào)27中闡明的引物進(jìn)行PCR，將得到的PCR片段使用^CbaI和BamHI進(jìn) 行切割并將其插入到PUC19中，由此構(gòu)建pUC19-PTAl。序列號(hào)26 5 ‘ -GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC-3 ‘序列號(hào)27:5'-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG-3'然后以M. succiniciproducens LK的基因組DNA作為模板，使用在序列號(hào) 和 序列號(hào) 中闡明的引物進(jìn)行PCR，并將得到的PCR片段使用^CbaI和Mcl切割并將其插入 到 pUC19-PTAl 中，由此構(gòu)建 pUC19-PTA12。序列號(hào)28 5 ‘ -GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCATGTTT CC-3 ‘序列號(hào)29 5 ‘ -GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC-3 ‘以含有奇霉素抗性基因(GenBank X02588)的質(zhì)粒pIC156 (Steinmetz等人，Gene， 142 =79,1994)作為模板，使用在序列號(hào)30和序列號(hào)31中闡明的引物進(jìn)行PCR，并將得到 的含有奇霉素抗性基因的PCR片段使用EcoRV切割并將其引入到PUC19-PTA12中，由此構(gòu) 建具有奇霉素抗性基因的PUC19-PTA1S2。將構(gòu)建的PUC19_PTA1S2使用BamHI切割并將其 插入到上面構(gòu)建的pUC19-&icB中，由此構(gòu)建pPTA-sacB(圖6)。序列號(hào)30 5 ‘ -GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC-3 ‘序列號(hào)31 5 ‘ -CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC-3 ‘實(shí)施例6 :ackA破壞載體(pAckAKO)的構(gòu)建為了通過(guò)同源重組破壞M. succiniciproducens MBEL55E基因組中的醋酸激酶基 因(ackA)，以下列方式構(gòu)建遺傳交換載體。以M. succiniciproducensMBEL55E的基因組 DNA作為模板，使用在序列號(hào)32和序列號(hào)33中闡明的引物進(jìn)行PCR。將得到的PCR產(chǎn)物 使用PstI和SalI切割并插入到pSacHR06 (Park等人，PNAS，104 =7797,2007)中，從而構(gòu)建 PAckAL0序列號(hào)32:5'-AACGACTGCAGCCACTAAATCCGACTTTGCGTAAAA-3'序列號(hào)33:5'-AGCATGTCGACTCTTCAGGCATTGTTTGGTGGAA-3'同時(shí)，以M. succiniciproducens MBEL55E的基因組DNA作為模板，使用下述兩組 引物進(jìn)行PCR，序列號(hào)34和序列號(hào)35，及序列號(hào)36和序列號(hào)37，用于擴(kuò)增ackA的啟動(dòng) 子區(qū)和pta ORF的正向部分。使用在序列號(hào)34和序列號(hào)37中闡明的引物對(duì)得到的PCR 片段再次進(jìn)行重疊PCR，將擴(kuò)增的PCR片段使用MlI和SphI進(jìn)行切割并將其插入到pACKAL 中，由此構(gòu)建pACKALR。序列號(hào)34 5 ‘ -TGTGCTGTCGACTAAAGATCGCTTATCGCATGAAACTC-3 ‘序列號(hào)355 ‘ -AGGATAATTGTACGTGACATTGAACGAATAGACGTTTGGGAATGT-3 ‘序列號(hào)36 5 ‘ -CCCAAACGTCTATTCGTTCAATGTCACGTACAATTATCCTTATTCCAATC-3 ‘
序列號(hào)37:5'-GCACATAGCATGCGTTTGCCAAGTGTTACCTTCAATAC G-3‘然后以PACYC184作為模板，使用在序列號(hào)38和序列號(hào)39中闡明的引物進(jìn)行 PCR，然后將得到的PCR片段使用Mel切割并將其插入到pAckALR中，由此構(gòu)建pAckAKO。序列號(hào)38 5 ‘ -ATACATCGTCGACCAGGCATTTGAGAAGCACACGGT-3 ‘序列號(hào)39 5 ‘ -ATACGGTCGACATAAATACCTGTGACGGAAGATC-3 ‘實(shí)施例 7 :M. succiniciproducens PALK 菌株的構(gòu)建通過(guò)破壞在實(shí)施例3中構(gòu)建的M. succiniciproducens LK的基因組中的pta和 ackA 構(gòu)建微生物突變體(M. succiniciproducens PALK)(圖 8)。將M. succiniciproducens LK接種于含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 上，并在37°C下培養(yǎng)36小時(shí)。將形成的菌落接種在10ml LB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中，并培養(yǎng) 12小時(shí)。將已經(jīng)充分生長(zhǎng)的(ν/ν)培養(yǎng)液接種在100ml LB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中，并 以200rpm在37 °C下在搖床中培養(yǎng)。以與實(shí)施例2中描述的相同方式從得到的培養(yǎng)液中收集細(xì)胞濃縮液，并將其與在 實(shí)施例5中構(gòu)建的遺傳交換載體pPTA-sacB混合，然后通過(guò)在2. 5kV、50 μ F和200ohms條 件下電穿孔將pPTA-sacB引入到培養(yǎng)的M. succiniciproducens LK。將0. 8ml LB-葡萄糖 液體培養(yǎng)基加入到引入了 PPTA-sacB的菌株中，并在37°C下以200rpm在搖床中預(yù)培養(yǎng)一個(gè) 半小時(shí)。為了誘導(dǎo)雙交換，將培養(yǎng)液接種于含有100g/L含奇霉素(終濃度50μ g/ml)的蔗 糖(Becton，Dickinson and Company)的TSB蔗糖培養(yǎng)基上并在37°C下培養(yǎng)48小時(shí)或者 更長(zhǎng)。為了選擇其中僅僅發(fā)生雙交換的菌落，將形成的菌落分別在含有50 μ g/ml奇霉素的 TSB蔗糖培養(yǎng)基和含有50 μ g/ml氨芐西林的TSB瓊脂培養(yǎng)基上劃線(xiàn)并在37°C下培養(yǎng)12小 時(shí)。然后選擇在含有50 μ g/ml奇霉素的TSB蔗糖培養(yǎng)基上形成但不在含有50 μ g/ml氨芐 西林的TSB瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落，并再次在含有50 μ g/ml奇霉素的TSB蔗糖培養(yǎng)基上 劃線(xiàn)。這里再次使用含奇霉素的培養(yǎng)基和含氨芐西林的培養(yǎng)基對(duì)形成的菌落進(jìn)行篩選，然 后對(duì)顯示所需結(jié)果的菌落進(jìn)行最終選擇。使用分離的突變體基因組DNA作為模板通過(guò)PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物電穿孔以證實(shí)基因組DNA中pta-ackA的破壞。為了證實(shí)pta-ackA基因的破壞，以下列方式進(jìn)行兩次PCR。首先，以突變體基因 組DNA作為模板使用在序列號(hào)40和序列號(hào)41中闡明的引物進(jìn)行PCR。然后以突變基因 組DNA作為模板，使用在序列號(hào)42和序列號(hào)43中闡明的引物進(jìn)行PCR。序列號(hào)40 5 ‘ -CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC-3 ‘序列號(hào)41 5 ‘ -GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC-3 ‘序列號(hào)42 5 ‘ -GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG-3 ‘序列號(hào)43:5'-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG-3'將在兩種PCR中得到的PCR片段進(jìn)行凝膠電泳以通過(guò)pta-ackA的大小證 實(shí)其破壞。微生物突變體M. succiniciproducens PALK按照上面描述的方法通過(guò)從 M. succiniciproducens LK 的基因組中破壞 pta-ackA 構(gòu)建。實(shí)施例8 用于構(gòu)建M. succiniciproducens ALKt菌株的pta-表達(dá)載體 (PME18PTA)的構(gòu)建為了在缺少乳酸脫氫酶基因(IdhA)、磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?pta)和醋酸激酶基因(ackA)的微生物突變體中表達(dá)pta基因，按照如下方式構(gòu)建基因表達(dá)載體首先，以M. succiniciproducens MBEL55E的基因組DNA為模板，使用在下面序列 號(hào)44和序列號(hào)45中闡明的引物進(jìn)行PCR，由此構(gòu)建PTA-PR0。序列號(hào)44 5 ‘ -CATCAGAGCTCCCTTTGCCAACAAATCCGCTAAAT-3 ‘序列號(hào)45 5 ‘ -AGGATAATTGTACGTGACATTGAACGAATAGACGTTTGGGAATGT-3 ‘接著，以M. succiniciproducens MBEL55E的基因組DNA為模板，使用在下面序列 號(hào)46和序列號(hào)47中闡明的引物進(jìn)行PCR，由此構(gòu)建PTA-GENE。序列號(hào)46 5 ‘ -CCCAAACGTCTATTCGTTCAATGTCACGTACAATTATCCTTATTCCAATC-3 ‘序列號(hào)47 5 ‘ -CTACAGCCCGGGAGATCACAAAATGAAAAACTACTATTTGCAGG-3 ‘然后，以PTA-Pro和PTA-GENE作為模板，使用在序列號(hào)44和序列號(hào)47中闡明的 引物進(jìn)行PCR，使用McI和XmaI切割得到的PCR片段并將其插入到穿梭載體pME18中，由 此構(gòu)建 pME18PTA(圖 10)。實(shí)施例 9 :M. succiniciproducens ALKt 菌株的構(gòu)建將在實(shí)施例7中構(gòu)建的M. succiniciproducens PALK接種于含有10g/L葡萄糖的 LB-葡萄糖培養(yǎng)基上并在37°C下培養(yǎng)36小時(shí)。將形成的菌落接種在10ml LB-葡萄糖培養(yǎng) 基中并培養(yǎng)12小時(shí)。將已經(jīng)充分生長(zhǎng)的(ν/ν)的培養(yǎng)液接種在100ml LB-葡萄糖液體 培養(yǎng)基中，并在搖床中37°C下培養(yǎng)。以與實(shí)施例2中描述的相同方式從所述培養(yǎng)液中收集 細(xì)胞濃縮液并將其與在實(shí)施例8中構(gòu)建的pta基因表達(dá)載體pME18PTA混合，然后在2. 5kV, 50yF 和 200ohms 的條件下通過(guò)電穿孔將 pME18PTA 引入到 Μ. succiniciproducens PALK 中。電穿孔后，將0.8ml LB-葡萄糖液體培養(yǎng)基加入到引入了 pME18PTA的菌株中，然后在 恒溫箱中在37°C下預(yù)培養(yǎng)一個(gè)半小時(shí)。將培養(yǎng)液接種于含有抗生素氨芐西林(終濃度50 μ g/ml)的胰酶大豆肉湯固體培 養(yǎng)基(Becton，Dickinson and Company)上并在37°C下培養(yǎng)48小時(shí)或者更長(zhǎng)時(shí)間。將形 成的菌落接種在TSB液體培養(yǎng)基中并在37°C下培養(yǎng)12小時(shí)以上。為了證實(shí)載體是否成功 地被引入，通過(guò)使用GeneAllK質(zhì)粒SV(GeneAll Biotechnology,Korea)從培養(yǎng)的菌株中分
離載體。使用在下面序列號(hào)48 62中闡明的引物通過(guò)S
序列號(hào)485'-TTAGCCTGCAAATAGTAGTT--3'
序列號(hào)495'-CCCCGCCGATATAGTTTTAA--3'
序列號(hào)505'-GAAGCCGATTTCACAACCTC--3'
序列號(hào)515'-CTAATTTACTTGGTGTGGTT--3'
序列號(hào)525'-GGCGGTTACAAAATAGATTG--3'
序列號(hào)535'-AAGACGTAAAACGTGTTGCC--3'
序列號(hào)545'-ATCTGCGGAATCGGCGAAAT--3'
序列號(hào)555'-GGCAATTCAGGCGACACAAT--3'
序列號(hào)565'-CGCATAAAAATACCGCACTT--3'
序列號(hào)575'-TCACTTTTTCAACATCTGCG--3'
序列號(hào)585'-AACGAGCGACATAGTTTTCA--3'
序列號(hào)595'-TGCCAAGTGTTACCTTCAAT--3'
序列號(hào)605'-GGGCTGTTTTCAAATAGTTTGT-3‘
序列號(hào)61 5 ‘ -ATAACAGGTTCGGTAGTTTC-3 ‘序列號(hào)62:5'-GCGATCTTTAAAACAGGATA-3‘實(shí)施例 10 :M. succiniciproducens ALK 菌株的構(gòu)建通過(guò)破壞在實(shí)施例4中構(gòu)建的M. succiniciproducens MFLK的基因組中的ackA 基因構(gòu)建微生物突變體(M. succiniciproducens ALK)(圖9)。將M. succiniciproducens MFLK接種于含有10g/L葡萄糖的TBS-葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基上并在37°C下培養(yǎng)36小時(shí)。將形成的菌落接種在10ml TSB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中，并 培養(yǎng)12小時(shí)。將已經(jīng)充分生長(zhǎng)的(ν/ν)的培養(yǎng)液接種到100ml TSB-葡萄糖液體培養(yǎng) 基中并37°C下在搖床中培養(yǎng)。以與實(shí)施例2中描述的相同方式從所述培養(yǎng)液中收集細(xì)胞濃縮液并將其與在實(shí) 施例6中構(gòu)建的遺傳交換載體pAckAKO混合，然后在2. 5kV、25 μ F和400ohms的條件下通 過(guò)電穿孔將PAckAKO引入到M. succiniciproducensMFLK中。電穿孔后，將0.8ml LB-葡萄 糖液體培養(yǎng)基加入到引入了 PAckAKO的菌株中，然后在恒溫箱中在37°C下預(yù)培養(yǎng)一小時(shí)。為了誘導(dǎo)雙交換，將培養(yǎng)液接種于含有氯霉素(終濃度6.8 μ g/ml)的TSB蔗糖固 體培養(yǎng)基上并在37°C下培養(yǎng)48小時(shí)或者更長(zhǎng)。為了選擇其中僅僅發(fā)生雙交換的菌落，將 形成的菌落在含有氯霉素(終濃度6. 8 μ g/ml)的TSA蔗糖培養(yǎng)基(含有100g/L蔗糖的 TSA培養(yǎng)基)上劃線(xiàn)。M小時(shí)以后，形成的菌落再次在相同培養(yǎng)基上劃線(xiàn)。使用重復(fù)上述 過(guò)程得到的菌落進(jìn)行PCR，并將得到的PCR產(chǎn)物電穿孔以證實(shí)ackA的破壞。為了證實(shí)ackA的破壞，以下列方式進(jìn)行兩次PCR。首先，以突變體基因組DNA為模 板，使用在序列號(hào)63和序列號(hào)64中闡明的引物作為模板進(jìn)行PCR。然后，以突變體基因 組DNA為模板，使用在序列號(hào)65和序列號(hào)66中闡明的引物作為模板進(jìn)行PCR。序列號(hào)63:5'-CGCTAAATGCTGATAGGTTGGGC-3‘序列號(hào)64:5'-CCCAATGGCATCGTAAAGAACA-3‘序列號(hào)655 ‘ -GGAAGCCAGTGAATGAATGAAAT-3 ‘序列號(hào)66 5 ‘ -ACATGGAAGCCATCACAGACGG-3 ‘將在兩種PCR中得到的PCR片段進(jìn)行凝膠電泳根據(jù)它們的大小證實(shí)ackA 的破壞。微生物突變體M. succiniciproducens ALK按照上面描述的方法通過(guò)從 M. succiniciproducens MFLK 的基因組中破壞 ackA 構(gòu)建。實(shí)施例11 使用M. succiniciproducens ALKt和ALK菌株生產(chǎn)同型琥珀酸將在實(shí)施例9中構(gòu)建的M. succiniciproducens ALKt和在實(shí)施例10中構(gòu)建的 M. succiniciproducens ALK分別接種于含有5g/L葡萄糖的IOml復(fù)合培養(yǎng)基上，并在厭氧 條件下39°C下培養(yǎng)8小時(shí)，然后將它們移到250ml含有5g/L葡萄糖的復(fù)合培養(yǎng)基上并在 39°C下培養(yǎng)。此時(shí)，將50 μ g/ml氨芐西林加入到培養(yǎng)基中用于培養(yǎng)Μ. succiniciproducens ALKt，并將6. 8 μ g/ml氯霉素加入到培養(yǎng)基中用于培養(yǎng)Μ. succiniciproducens ALK。將 M. succiniciproducens ALKt 禾口 M. succiniciproducens ALK 的每禾中培養(yǎng)液 250ml 接 種到含有 2. 25L 復(fù)合培養(yǎng)基(lg/L NaCl，2g/L (MM)2HPO4，0. 02g/LCaCl2 · 2H20，0. 2g/L MgCl2 · 6H20,8. 709g/L K2HPO4,0. 5g/L 半胱氨酸，0. 5g/L 甲硫氨酸，0. 5g/L 丙氨酸，0. 5g/L 天冬酰胺，0. 5g/L天冬氨酸，0. 5g/L果仁糖，0. 5g/L絲氨酸，0. 005g/L煙酸，0. 005g/L泛酸 鈣，0. 005g/L煙酸吡哆醇，0. 005g/L硫胺，0. 005g/L維生素C，和0. 005g/L生物素)的生物反應(yīng)器中，并在初始葡萄糖濃度100mM、39°C條件下進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)使用氨 水將培養(yǎng)物的PH調(diào)節(jié)到6. 5，并且用作抗生素的氨芐西林和氯霉素的濃度與上面提到的相 同。培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度使用分光光度計(jì)測(cè)定，然后使用分光光度計(jì)事先測(cè)定的光密 度和用于細(xì)胞干重的驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。在發(fā)酵過(guò)程中，有規(guī)律地從生物反應(yīng)器中采集樣 品。將采集的樣品以13000rpm離心10分鐘，然后將上清液用于使用高效液相色譜分析葡 萄糖和各種代謝產(chǎn)物的濃度，包括琥珀酸和其他有機(jī)酸以及乙醇的濃度。如圖11 和表 1 所示，基因工程 M. succiniciproducens ALKt 和 M. succiniciproducens ALK顯示了極佳的琥珀酸產(chǎn)率并顯著地抑制了副產(chǎn)物形成。與 其親本菌株 M. succiniciproducens MBEL55E 禾口 M. succiniciproducensPALK 相比， M. succiniciproducens ALKt菌株顯示了每克葡萄糖的琥珀酸產(chǎn)量分別增加了 61. 7%和 7. 0%,并且與其親本菌株 M. succiniciproducensMBEL55E 禾口 M. succiniciproducens PALK 相比，Μ. succiniciproducens ALK菌株顯示了每克葡萄糖的琥珀酸產(chǎn)量分別增加了 63. 8% 禾口 8. 5 %。相反，與 M. succiniciproducens MBEL55E 禾口 M. succiniciproducens PALK 相 比，M. succiniciproducens ALKt 禾口 Μ· succiniciproducens ALK 減少了 54. 1 %禾口 43. 4% 的副產(chǎn)物形成，使其能夠節(jié)約大量的原材料并降低了琥珀酸分離和純化的成本。另外， M. succiniciproducens ALKt 菌株的最終細(xì)胞濃度為 2. 29g/L，M. succiniciproducens ALK 菌株的最終細(xì)胞濃度為2. 22g/L，與M. succiniciproducens PALK相比最終細(xì)胞濃度分別 增加了 29. 3%和28. 4%，表明細(xì)胞生長(zhǎng)的改善。表1 :M. succiniciproducens ALKt 和 ALK 的琥珀酸產(chǎn)量
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)琥珀酸微生物突變體，其缺少乳酸脫氫酶基因和醋酸激酶基因，同時(shí)保持了 磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?，并能夠在厭氧條件下高濃度產(chǎn)生琥珀酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體，其特征在于，所述產(chǎn)琥珀酸微生物 選自下組，該組由放線(xiàn)桿菌屬、厭氧螺菌屬、擬桿菌屬、曼氏桿菌屬、琥珀酸單胞菌屬、琥珀 酸弧菌屬和基因工程大腸桿菌所組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體，其特征在于，所述產(chǎn)琥珀酸微生物 突變體是高產(chǎn)量產(chǎn)生同型琥珀酸而不積累其他有機(jī)酸和乙醇作為副產(chǎn)物的同型發(fā)酵微生 物。
4.一種產(chǎn)琥珀酸微生物突變體M. succiniciproducens ALKt，其中磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?因被引入到缺少乳酸脫氫酶基因、磷酸轉(zhuǎn)乙?；富蚝痛姿峒っ富虻漠a(chǎn)琥珀酸微生物 突變體(M. succiniciproducens PALK)中。
5.一種產(chǎn)琥珀酸微生物突變體M. succiniciproducens ALK，其中乳酸脫氫酶基因和醋 酸激酶基因從M. succiniciproducens MBEL55E中被破壞。
6.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的方法，包括下列步驟(a)通過(guò)同源重組在產(chǎn)琥珀酸微生物基因組中破壞編碼乳酸脫氫酶基因的基因以獲得 缺乏乳酸脫氫酶基因的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體；和(b)通過(guò)同源重組在缺少乳酸脫氫酶基因的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的基因中破壞編碼 醋酸激酶的基因得到缺少編碼乳酸脫氫酶的基因和編碼醋酸激酶的基因的產(chǎn)琥珀酸微生 物突變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的方法，其特征在于，所述同源 重組通過(guò)使用含有破壞的IdhA的遺傳交換載體和含有破壞的ackA的遺傳交換載體來(lái)進(jìn) 行。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的方法，其特征在于，所述含有 破壞IdhA的遺傳交換載體為pMLKO-McB和pMFldbA，并且所述含有破壞的ackA的遺傳交 換載體為 pMLKO-sacB 和 pAckAKO。
9.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體的方法，其包括將編碼磷酸轉(zhuǎn)乙 ?；傅幕蛞氲饺鄙偃樗崦摎涿富?、磷酸轉(zhuǎn)乙?；富蚝痛姿峒っ富虻漠a(chǎn)琥珀 酸微生物突變體中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述缺少乳酸脫氫酶基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰 基酶基因和醋酸激酶基因的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體是Mannheimia succiniciproducens PALK0
11.一種生產(chǎn)琥珀酸的方法，包括下列步驟在厭氧條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1-5中任意一 項(xiàng)所述的產(chǎn)琥珀酸微生物突變體；并從培養(yǎng)液中回收琥珀酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，葡萄糖作為用于培養(yǎng)的碳源。
全文摘要
本發(fā)明涉及高產(chǎn)量產(chǎn)生同型琥珀酸(homo-succinic acid)的微生物突變體和使用該微生物突變體生產(chǎn)同型琥珀酸的方法，具體涉及通過(guò)從產(chǎn)琥珀酸微生物中破壞乳酸脫氫酶編碼基因(ldhA)和乙酸激酶編碼基因(ackA)構(gòu)建的微生物突變體，以及高濃度生產(chǎn)同型琥珀酸的方法，所述方法包括使用葡萄糖作為碳源在厭氧條件下培養(yǎng)所述突變體。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102083977SQ200880106559
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2008年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
發(fā)明者宋孝鶴, 崔松, 李政旭, 李相燁, 金知滿(mǎn) 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院