通過微小rna裝置進行細菌介導的基因調節的制作方法

專利名稱：通過微小rna裝置進行細菌介導的基因調節的制作方法
通過微小RNA裝置進行細菌介導的基因調節相關申請的交叉參考該申請要求2007年6月四日提交的美國臨時專利申請系列號60/947，311的優 先權和權益，所述臨時專利申請的內容完整引入作為參考。
背景技術：
盡管首先在秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發現，但已經在植物和 包括人的動物中發現了微小RNA(miRNA)。miRNA由從DNA轉錄但不翻譯成蛋白質的基因 (非蛋白質編碼RNA)編碼，已經發現其調節高于30%的哺乳動物基因。成熟的miRNA分子 與一個或多個信使RNA(mRNA)分子部分互補，并且相信其主要功能是調節基因表達。miRNA具有許多潛在的應用用于治療目的，然而關鍵的障礙在于向靶細胞中遞送 miRNA或其前體。需要新的方法向動物靶標施用安全并可預測的miRNA。發明概述本發明提供細菌介導的系統，用于通過細菌感染向靶細胞內引入miRNA。在一個實 施方案中，所述細菌含有編碼miRNA的DNA，并在所述細菌中通過原核啟動子，或在靶細胞 中使用真核啟動子表達所述miRNA。在可選的實施方案中，所述細菌含有編碼miRNA前體的 DNA，并在所述細菌中通過原核啟動子，或在靶細胞中使用真核啟動子表達所述前體。如果 前體在細菌中進行表達，其可在細菌中或在靶細胞中加工為成熟的miRNA。一方面，本發明提供至少編碼微小RNA(miRNA)或miRNA前體的DNA載體。所述 miRNA能夠調節，即上調或下調真核、原核或病毒靶基因中至少一個表達。所述miRNA前體 可以是初級-miRNA(pri-miRNA)、miRNA前體(pre_miRNA)或miRNA雙鏈體。在一個實施方 案中，所述載體編碼具有基本互補區的兩個miRNA，當表達時，所述兩個miRNA形成雙鏈體。 在一個實施方案中，所述miRNA是成熟miRNA或弓|導miRNA。所述載體還包括原核或真核啟 動子，并還可編碼Hly基因。在一個實施方案中，由miRNA靶向的至少一個基因是與癌相關 的。一方面，本發明提供含有微小RNA(miRNA)、miRNA前體或編碼所述miRNA或所述前 體的DNA分子的細菌，所述miRNA能夠調節真核、原核或病毒靶基因中至少一個表達。所述 細菌可以是活的侵入性細菌或其衍生物。在一個實施方案中，所述細菌還包含能夠將所述 miRNA前體加工成近于成熟miRNA的酶或核酶，如內切核酸酶。在一個實施方案中，所述細 菌還含有細菌核糖核酸酶III、切酶、切酶樣酶、Drosha和I^sha中的至少一種。所述細菌 還包括在遺傳物質釋放到靶真核細胞的細胞質中后幫組轉運其遺傳物質的酶。在一個實施 方案中，所述酶是由Hly A基因編碼的利斯特氏菌溶素0。所述真核靶基因可以是動物，例 如哺乳動物或鳥類基因。在一個實施方案中，由miRNA靶向的至少一個基因是與癌相關的。一方面，本發明提供通過用本發明的細菌感染動物，向動物細胞遞送miRNA或 miRNA前體的方法。在一個實施方案中，所述動物細胞是人細胞。所述方法還包括在細菌感 染動物細胞后，裂解細菌的步驟。一方面，本發明提供制備miRNA的方法。在一個實施方案中，所述方法包括用具有 至少編碼miRNA的原核載體的細菌感染的步驟。或者，所述方法包括具有用至少編碼miRNA前體的第一個原核載體和編碼用于將所述miRNA前體加工成miRNA的至少一種酶的第二個 原核載體的細菌感染的步驟。所述方法還包括在細菌中分別表達miRNA或miRNA前體和所 述酶，并從所述細菌中收集miRNA的步驟。一方面，本發明提供在動物細胞中調節至少一個靶基因表達的方法。所述方法包 括步驟用本發明的細菌感染動物細胞；并裂解所述細菌以釋放其內容物，由此允許來自 所述內容物的或從所述內容物產生的miRNA與靶基因的mRNA相互作用，并由此調節所述基 因的表達。在一個特征中，調節的機制是翻譯阻抑、mRNA降解，或翻譯阻抑和mRNA降解。一方面，本發明提供在動物中治療或預防病征的方法。所述方法包括包括通過用 包含微小RNA(miRNA)、miRNA前體或至少編碼所述miRNA或所述前體的DNA分子的細菌感 染動物細胞，來調節已知參與病征的至少一個靶基因的表達，所述miRNA能夠調節至少所 述基因的表達。所述動物可以是哺乳動物或鳥類。一方面，本發明提供在動物中治療或預防癌或細胞增殖病征的方法。所述方法包 括用包含微小RNA(miRNA)、miRNA前體或至少編碼所述miRNA或所述前體的DNA分子的細 菌感染動物細胞，來調節已知參與細胞增殖或癌的至少一個靶基因的表達，所述miRNA能 夠調節至少所述基因的表達。一方面，本發明提供在動物中治療或預防由動物中至少一個缺陷型miRNA引起的 病征的方法。所述方法包括用包含所述miRNA的功能版本(version)、所述功能性miRNA的 RNA前體或至少編碼所述功能性miRNA或所述前體的DNA分子的細菌感染動物細胞。一方面，本發明提供在動物中治療或預防由動物中至少一個上調miRNA引起的病 征的方法。所述方法包括用包含所述miRNA的反義版本、miRNA所述反義版本的RNA前體， 或至少編碼所述反義版本或所述前體的DNA分子的細菌感染動物細胞。另一方面，本發明提供發現或確認治療靶標的方法。所述方法包括下述步驟用本 發明的細菌感染哺乳動物細胞；裂解所述細菌以釋放其內容物；并研究底物與來自所述內 容物的或從所述內容物產生的miRNA之間的相互作用。所述底物可調節miRNA的活性或所 述miRNA可調節所述底物的活性。本發明的其他特征和優勢可顯而易見于本文提供的，包括于不同實施例中的額外 描述。提供的實施例闡明了用于實踐本發明的不同成分和方法。所述實施例不限于要求本 發明。基于本公開內容，技術人員可鑒定并使用用于實踐本發明的其他成分和方法。附圖簡述

圖1是顯示miRNA如何從其多種前體加工得到的示意圖。圖2是顯示質粒pTiOR構建的載體圖。圖3是顯示質粒pTPIV構建的載體圖。圖4顯示溴化乙錠染色的RT-PCR反應(左)和化學發光western印跡(右)。發明詳述如本文所用，“調節”指升高或降低(例如沉默)，換言之，上調或下調。如本文所 用，向靶細胞“引入”或“遞送”微生物指用所述微生物(例如細菌)感染所述靶細胞的過 程，并且在某些情況下可能通過裂解所述微生物向靶細胞期望位置(例如細胞質)釋放該 微生物內的遺傳物質。微小RNA(miRNA)是一類內源的、單鏈或雙鏈的約22個核苷酸長的RNA分子，其調節約 30 % 的哺乳動物基因(Czech，NEJM 354 :1194-1195(2006) ；Mack, Nature Biotech. 25 :631-638(2007) ；Eulalio，等，Cell 132 :9-14 Q008))。miRNA通過阻斷翻譯或 引起轉錄物降解來抑制蛋白質產生。miRNA可靶向250-500個不同的mRNA。miRNA是miRNA 前體進行切酶消化的產物，而所述miRNA前體是初級miRNA (primary miRNA)的產物。切酶是核糖核酸酶III核糖核酸酶家族的成員。切酶將長的雙鏈RNA(dsRNA)和短 發夾RNA (shRNA)切割成約20-25個核苷酸長的稱為小干擾RNA (siRNA)的短雙鏈RNA片段， 其通常在3'末端具有兩個堿基的突出端。切酶也將pre-微小RNA(miRNA)切割成miRNA 雙鏈體。切酶催化RNA干擾途徑中的第一步并起始RNA誘導沉默復合體(RISC)的形成，所 述RNA誘導沉默復合體的催化組分argonaute是能夠降解信使RNA(mRNA)的內切核酸酶， 所述信使RNA的序列與siRNA引導鏈的序列互補。參考圖1，編碼miRNA的基因比加工過的成熟miRNA分子長的多；miRNA首先轉錄 成具有帽子和poly-Α尾的初級轉錄物或初級-miRNA，并在細胞核中加工成更短的70個核 苷酸的莖環結構，稱為miRNA前體。在動物中通過稱為微處理機復合體的蛋白質復合體進 行該加工，所述微處理機復合體由核酸酶Drosha和雙鏈RNA結合蛋白質Pasha組成。然后 通過與內切核酸酶切酶相互作用將這些miRNA前體在細胞質中加工成成熟的miRNA，所述 內切核酸酶切酶也起始RNA誘導沉默復合體(RISC)的形成。該復合體負責因miRNA表達 和RNA干擾而觀察到的基因沉默。該途徑也不同于來自基因內莖環的miRNA;這些是通過 切酶加工而非Drosha。DNA的正義鏈或反義鏈可作為模板起功能，產生miRNA。如圖1顯示，成熟miRNA具有至少三種形式的中間RNA前體(a)初級-miRNA，(b) miRNA前體和(c)由miRNA前體莖環結構進行切酶切割產生的miRNA雙鏈體。因此，一方面，本發明提供使用細菌向靶細胞遞送miRNA，或miRNA前體，或編碼 miRNA或miRNA前體的DNA，或任何上述的混合物的系統，以通過翻譯阻抑、mRNA降解或兩 者引起基因調控。所述細菌優選為非致病性或治療性菌株，其具有進入細胞的能力。所述 靶細胞可以是真核細胞。本發明的miRNA調節，例如下調靶細胞中的目的基因。所述真核 細胞可以是哺乳動物細胞或鳥類細胞。所述目的基因可以是哺乳動物、鳥類、真核、細菌或 病毒基因。如果遞送的分子是miRNA前體，其可在細菌內或在靶細胞中使用細胞的現有加 工裝置加工成成熟的miRNA。在動物細胞中，酶或核酶，如Drosha、Pasha和切酶是該裝置 的一部分，其將miRNA前體加工成可引導多酶復合體RNA誘導沉默復合體(RISC)靶向mRNA 的成熟形式。在一個實施方案中，本發明提供至少編碼miRNA或miRNA前體的原核載體。所 述miRNA可調節真核、原核或病毒靶基因中至少一個表達。所述miRNA前體可以是(a)初 級-miRNA，(b)miRNA前體和(c)miRNA雙鏈體。對于miRNA雙鏈體，可以是雙鏈環形質粒的 載體編碼具有互補區以形成雙鏈體的兩個miRNA。所述質粒可具有一個或兩個啟動子。根 據載體是否表達，所述啟動子可以是原核啟動子或真核啟動子。在一個實施方案中，因為載 體旨在載體細菌內表達，所以在所述載體上提供至少一個原核啟動子，如T7。在另一實施方 案中，因為載體旨在靶真核細胞內表達，所以在所述載體上提供至少一個真核啟動子。在一個實施方案中，向真核細胞中遞送細菌攜帶的編碼miRNA前體的一個或多個 DNA分子，其在所述真核細胞中轉錄，然后在所述真核細胞中加工以產生成熟的miRNA。所 述DNA分子可處于通常指導小核RNA(snRNA)轉錄的RNA聚合酶II相容啟動子或RNA聚合酶 III 相容啟動子(例如 U6、Hl)的控制下(P. J. Paddison, A. A. Caudiy, G. J. Hannon, PNAS 99，1443(2002)，T. R. Brummelkamp, R. Bernards,R. Agami，Science 296，550 (2002))。 雙"Trojan horse"技術可與攜帶真核轉錄質粒的侵入性和營養缺陷型細菌一起使用。該 質粒依次通過靶細胞轉錄，形成進一步加工成成熟miRNA的miRNA前體，所述成熟miRNA引 發RNAi的細胞內過程。在一個有利方面，本發明提供通過用細菌，優選細菌的非病原性或治療性菌株感 染真核細胞，向該真核細胞中遞送miRNA、miRNA前體或編碼所述miRNA或前體的DNA的方 法，以在真核細胞中引起基因調節。所述細菌包含(a)miRNA，(b)miRNA前體，或(c)編碼所 述miRNA或所述前體的DNA。在一個實施方案中，細菌本身能夠合成并將miRNA前體加工為成熟的miRNA。在一 個實施方案中，所述細菌具有加工或消化所述前體的酶或核酶。所述酶可以是內切核酸酶。 所述內切核酸酶可以是核糖核酸酶III家族的成員，如細菌核糖核酸酶III、切酶或切酶樣 酶。所述酶可以是Drosha或I^asha。在一個實施方案中，所述酶對載體細菌是內源的。在 另一實施方案中，所述酶對載體細菌是外源的并通過表達此類酶(例如切酶樣酶或Drosha 樣酶)的載體引入。所得miRNA可以調節(例如敲減或沉默)一個或多個靶基因的表達，所述方法能 夠降低基因表達的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或高于90%。細菌遞送比病毒遞送更具吸引力，因為可通過抗生素和不能復制的減毒細菌菌株 控制所述細菌遞送。同樣，細菌更易于進行遺傳操作，其允許產生特異用于某些應用的載體 菌株。在本發明的一個實施方案中，本發明的方法用于產生細菌，其以組織特異性方式引起 基因調節。本發明的無毒菌可通過多種機制進入哺乳動物宿主細胞。專門的吞噬細胞活性 吞入菌、侵入性細菌菌株具有侵入非吞噬宿主細胞的能力。此類細菌的天然實例是細胞 內病原體如利斯特氏菌(Listeria)、志賀氏菌(Shigella)和沙門氏菌(Salmonella), 但該性質也可通過轉移侵入相關基因轉移到其他細菌如大腸桿菌(E. coli)和雙歧桿 菌(Bifidobacteriae),包括益生菌(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C. R. Acad. Sci. Paris 318,1207(1995))。在本發明的其他實施方案中，用于向宿主細胞遞 送小 RNA 的細菌包括弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri) (D. R. Sizemore,A. A. Branstrom, J. C. Sadoff，Science 270，299 (1995))、侵入性大腸桿菌(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C. R. Acad. Sci.Paris 318,1207 (1995), C. Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. Μ. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16,862(1998))、 小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)(A. Al-Mariri A, A. Tibor, P. Lestrate, P. Mertens, X. De Bolle, J. J. Letesson Infect Immim 70,1915(2002))禾口
tl Ifi±1 ^^1J T# K S‘ (Listeria monocytogenes) (M. Hense, E. Domann, S. Krusch, P. Wachholz, K. E. Dittmar, M. Rohde, J. ffehland, T. Chakraborty, S. Weiss, Cell Microbiol 3, 599 (2001), S. Pilgrim, J. Stritzker, C. Schoen, A. KoIb-Maurer, G. Geginat, M. J. Loessner, I. Gentschev, W. Goebel, Gene Therapy 10，2036 (2003))。任何侵入性細 菌用于 DNA 向真核細胞中轉移(S.Weiss，Τ. Chakraborty, Curr Opinion Biotechnol 12， 467(2001))。
在一個實施方案中，構建至少編碼微小RNA (miRNA)或miRNA前體的原核載體。所 述miRNA可調節真核、原核或病毒靶基因中至少一個表達。然后用載體轉化侵入性細菌。所 述細菌可以是活的細菌，或其衍生物，例如來自細菌的半失活細菌或功能顆粒。在一個實施 方案中，所述細菌能夠表達和/或加工所述miRNA或其前體。在可選實施方案中，所述細菌 不能夠表達和/或加工所述miRNA或其前體，而僅作為載體在靶真核細胞中用于進一步的 表達和加工。所述miRNA前體可以是(a)初級-miRNA，(b)miRNA前體，(c)miRNA雙鏈體或 其混合物。此時，轉化的細菌包含以下一個或多個微小RNA(miRNA)、miRNA前體、編碼所述 miRNA或所述前體的DNA分子，或任何上述的混合物。細菌的內容物經過細菌侵入(“細菌感染(bactofection) ”)向靶細胞中遞送，并 在通過營養缺陷型、內含體或通過定時添加抗生素引發細菌裂解后在哺乳動物靶細胞內釋 放，導致對所述靶基因的調節。細菌DNA和RNA從細胞內細菌中的釋放通過活性機制發生。所述細菌DNA和RNA 可包含miRNA、miRNA前體和/或其編碼質粒的混合物。一種機制涉及鼠傷寒沙門氏菌 (S. typhimurium)中的III類輸出系統，其為橫跨細菌細胞膜的專門化多蛋白復合體，其功 能包括向細胞外分泌毒力因子，以允許向靶細胞發放信號，但其也可用于向靶細胞中遞送 抗原(Russmann H. Int J Med Microbiol, 293 :107-12(2003))或通過細菌裂解并向細胞 質中釋放細菌內容物。通過加入細胞內活性抗生素(四環素)引發細胞內細菌的裂解，或 通過細菌代謝減毒(營養缺陷型)或通過細胞內體或溶酶體自然發生。釋放真核轉錄質粒 后，在靶細胞內產生miRNA、miRNA前體，依次引發靶基因的基于miRNA的調節。可使用天然侵入性病原體鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)進行 本發明。在該實施方案的一方面，鼠傷寒沙門氏菌的菌株包括SL 7207和VNP20009 (S. K. Hoiseth, B.A.D.Stacker, Nature 291,238(1981) ；Pawelek JM，Low KB, Bermudes D. Cancer Res. 57(20) :4537-44(1997 年 10 月 15 日))。在本發明的另一實施方案中，使用減毒大腸桿菌進行本發明。在該實施方案的 一個實例中，大腸桿菌的菌株是 BM 2710 (C. Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. M. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16,862(1998))。在該實施方案的一個特征 中，通過侵入性質粒例如編碼Inv基因的一個質粒來改造所述BM 2710菌株，以具有細胞侵 入性質。根據本發明的另一特征，本發明的細菌含有具有Hly (利斯特氏菌溶素(listeria lysine)0)基因的載體，因為認為Hly蛋白質對遺傳物質從輸入小泡中逃逸是重要的。顯 然，所述載體可以是相同的侵入質粒。因此，在一個實施方案中，所述細菌具有編碼Inv和 Hly基因的質粒。在一個實例中，用于本發明的大腸桿菌菌株是BL21 (DE3) pLysE。在一個實施方案中，miRNA前體，例如miRNA前體在細菌中表達并加工成miRNA前 體，然后遞送至真核細胞中。在另一實施方案中，miRNA前體，例如miRNA前體在細菌中表 達，然后遞送至真核細胞中并在所述真核細胞中加工成miRNA。在可選實施方案中，編碼 miRNA前體，例如初級-miRNA的DNA分子遞送至真核細胞中，并且所述miRNA前體在所述真 核細胞中表達，然后加工成miRNA。在一個實施方案中，miRNA在細菌中表達，然后遞送至真核細胞中。在另一實施方 案中，編碼miRNA的DNA分子遞送至真核細胞中，并且所述miRNA在所述真核細胞中表達。
在一個實施方案中，至少一個基因是一個基因，或多于2、4、8、16、32、64、100、200 或400個基因。本發明也提供通過用在適當啟動子控制下表達miRNA或前體的載體轉化細菌或 其他宿主細胞制備微小RNA的方法。在細菌的情況下，在載體中提供原核啟動子，例如T7。 如果所述載體編碼miRNA前體，例如miRNA前體，表達上文討論的所需加工酶的載體也轉化 到細菌中。1.應用1. 1研究和藥物開發工具野生型miRNA在細胞中行使基因調節功能；一些已經與多種類型的人類疾病， 包括癌相關。因此，miRNA可用于研究其調節的靶基因和它們本身怎樣被其他分子，例如 miRNA抑制劑靶向。本發明的方法可用于在體外和體內研究基因功能。本發明的載體可用于轉染培養 的動物細胞，作為藥物靶向/途徑鑒定和確認中的研究工具。例如，在用本發明的細菌感染 宿主細胞并釋放細菌內容物提供某些miRNA或可加工成miRNA的前體后，可觀察細胞的表 型或形態改變，其揭示了一些目的途徑已經受到影響。此類表型改變可包括多種細胞核、細 胞核形態、細胞死亡、細胞增殖、DNA片段化、細胞表面標記和有絲分裂指數等。在另一實例 中，可分離或鑒定宿主細胞中分子/底物與轉染到細胞中的miRNA之間的相互作用，以發現 潛在的治療靶標。該靶標可以處于上游并調節所述miRNA的活性，或者所述靶標可以處于 下游，并且其活性受所述miRNA調節。在體內應用方面，因為miRNA可通過本發明的方法引入宿主體內，在研究某些 miRNA對不同細胞類型和不同組織的影響中可采用系統生物學手段。這些體內和體外方法使用具有期望性質(侵入力、減毒、steerability)的細菌。 例如雙歧桿菌和利斯特氏菌用于進行本發明細菌介導的RNAi方法。使用質粒賦予細菌侵 入力以及一個或幾個miRNA或miRNA前體的真核或原核轉錄。1. 2治療用途本發明細菌介導的miRNA組合物可用于治療和或預防多種疾病，包括總結 T Dykxhoorn, Novina&Sharp· Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 :457-467(2003) ；Kim&Rossi， Nature Rev. Genet. 8 :173-184(2007) ；de Fougerolles,等 Nature Rev. Drug Discov. 6 443-453(2007)中的疾病。在一個實施方案中，本發明可通過靶向一個或多個癌相關基因作為癌治療 方法或用于預防癌。該方法受參與細胞增殖或其他癌表型的基因的沉默或敲減影 響。用于癌治療的本發明的細菌優選為改造以安全搜出并殺死腫瘤的細菌(Forbes， Nature Biotechnology 24:1484-1485(2006)。所述細菌可以是專性厭氧菌，如梭菌 (Clostridium) novyi-NT，或兼性厭氧菌，如鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌(如上)。這些基因的實例是多種癌基因，例如k-Ras。例如，k_Ras已經顯示受miRNA Let_7 的調節。這些癌基因是活化的并涉及大多數臨床病例。例如，k-Ras在大多數人結腸癌、胰 腺癌和非小細胞非癌中中異常活化。k-Ras突變賦予對化學治療和目前靶向治療的抗性。 本發明細菌介導的和基于miRNA的基因尋靶方法可應用于達到腸道用于結腸癌治療和預 防。這些方法也用于治療攜帶異種移植腫瘤的動物，以在腸的腫瘤發生的k-RasV12模型中治療并預防癌，并在腺瘤性結腸息肉病(APC-min模型)中預防和治療腫瘤。本發明的方法也可用于產生用于待使用的癌預防性“益生菌”，其尤其具有GI道 或肝的靶標。本發明的方法用作針對炎癥疾病，例如炎性腸病(IBD)，包括局限性腸炎、潰瘍 性結腸炎的治療。這些方法用于沉默或敲減非癌基因靶標(病毒基因，用于治療和預防乙 肝、丙肝；炎性基因，用于治療和預防炎性腸病)和其他基因靶標。本發明的方法可用于向消化道和結腸中遞送基因沉默(稱為結腸癌治療和預 防)，并在多種疾病的治療中用于經口應用。在該實施方案的另一方面，基因沉默的遞送是 經腸外的，如局部的、靜脈內的。細菌產生和/或遞送的dsRNA也可用于沉默或敲減非癌基因靶標。本發明的RNA 分子也可用于治療或預防眼疾(例如年齡相關性黃斑變性(AMD)和糖尿病性視網膜病變 (DR))；感染性疾病(例如HIV/AIDS、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤 病毒(HPV)、單純皰疹病毒(HSV)、RCV、巨細胞病毒(CMV)、登革熱、西尼羅病毒)；呼吸道疾 病(例如呼吸道合胞病毒、哮喘、囊性纖維化)；神經疾病(例如亨廷頓舞蹈病(HD)、肌萎縮 性脊髓側索硬化(ALS)、脊索損傷、帕金森疾病、阿爾茨海默氏疾病、疼痛)；心血管疾病；代 謝疾病(例如糖尿病)；遺傳病；和炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)、關節炎、風濕病、自身免 疫性疾病)，皮膚病。因為miRNA是動物細胞許多細胞途徑調節裝置的一部分，缺陷型miRNA本身可在 動物中引起病征或疾病。因此，本發明的一個治療用途是簡單地產生并向動物中遞送miRNA 的功能拷貝或遺傳改造拷貝，以治療或預防此類病征或疾病。2.細菌遞送根據本發明，能夠如通過穿過細胞膜并進入細胞的細胞質，而向靶細胞的細胞質 中遞送分子，例如miRNA分子的任何微生物可用于向此類細胞中遞送miRNA和其前體。在 優選的實施方案中，所述微生物是原核生物。在甚至更優選的實施方案中，所述原核生物 是細菌。也處于本發明范圍內的是除可用于向細胞遞送RNA的細菌以外的微生物。例 如，所訴微生物可以是真菌，例如Cryptococciis neoformans,原生動物，例如克魯茲錐 蟲(Trypanosoma cruzi)、鼠弓菜蟲(Toxoplasma gondii)、多氏禾丨」什曼蟲(Leishmania donovani)禾口皰蟲(Plasmodia)。如本文所用，當指微生物，例如細菌時，術語“侵入性的”指能夠向靶細胞遞送至少 一種分子，例如RNA或編碼RNA的DNA分子的微生物。侵入性微生物可以是能夠穿過細胞 膜，由此進入所述細胞的細胞質，并向靶細胞遞送至少一些其內容物，例如RNA或編碼RNA 的DNA的微生物。向靶細胞遞送至少一種分子的過程優選不顯著修飾侵入裝置。在優選的 實施方案中，所述微生物是細菌。優選的侵入性細菌是能夠如通過進入真核細胞的細胞質 向靶細胞遞送至少一種分子，例如RNA或編碼RNA的DNA分子的細菌。優選的侵入性細菌 是或的細菌，例如活的侵入性細菌。侵入性微生物包括天然能夠如通過穿過細胞膜，例如真 核細胞膜并進入細胞質，而向靶細胞遞送至少一種分子的微生物，以及非天然侵入性的但 已經被修飾，例如遺傳修飾而變得具侵入性的微生物。在另一優選實施方案中，可通過將細 菌連接到“侵入因子”，也稱為“進入因子”或“細胞質靶向因子”上來修飾非天然侵入性的 微生物，使其變得有侵入性。如本文所用，“侵入因子”是當非侵入性細胞表達時致使細菌 具有侵入性的因子，例如蛋白質或一組蛋白質。如本文所用，“侵入因子”由“細胞質靶向基因”編碼。天然侵入性微生物，例如細菌可具有某些向性，即趨向優選的靶細胞。或者，可修 飾，例如遺傳修飾微生物，例如細菌，以模擬第二種微生物的向性。可根據本領域已知的方法測定至少一種分子向靶細胞的遞送。例如，可通過雜交 或PCR方法，或通過包括使用抗體的免疫方法檢測分子的存在，由此沉默的RNA或蛋白質的 表達降低。測定微生物是否具有用于本發明的足夠的侵入性可包括測定相對于與宿主細胞 接觸的微生物數量，是否有足夠的RNAOniRNA或miRNA前體)或其編碼DNA向宿主細胞遞 送。如果RNA的量相對于所用微生物的數量較低，可期望進一步修飾微生物以提高其侵入 性潛力。可通過多種方法測定細菌進入細胞。細胞內細菌在氨基糖苷類抗生素處理下 存活，而細胞外細菌被快速殺死。可通過用抗生素慶大霉素處理單層細胞來滅活細胞 外細菌，然后在用溫和去污劑釋放存活的細胞內生物并在標準細菌學培養基上測定有 活力的數量前除去該抗生素，來完成對細菌吸收的定量評估。此外，例如通過細胞層的 thin-section-transmission電子顯微鏡或通過免疫熒光技術直接觀察細菌進入細胞 O^alkow等(1992)Annual Rev. Cell Biol. 8 :333)。因此，多種技術可用于測定特定細菌是 夠能夠侵入特定類型的細胞，或用于如修飾細菌的向性以模擬第二種細菌的向性的細菌修 飾后，驗證細菌的侵入。根據本發明方法遞送RNA的細菌優選為非致病性的。然而，只要它 們的致病性已經減毒，由此致使所述細菌對向其施用的受試者無害，也可使用病原菌。如本 文所用，術語“減毒的細菌”指已經被修飾來顯著減少或消除其對受試者的損害的細菌。可 通過下文所述的多種方法減毒病原菌。不想受限于作用的特定機理，根據細菌類型，向真核細胞中遞送RNA或DNA的細菌 可進入細胞的多個區室。例如，所述細菌可以在小泡中，例如吞噬小泡中。一旦進入細胞， 細菌可被破壞或裂解，并且其內容物可遞送到真核細胞中。也可改造細菌表達吞噬體降解 酶，以允許RNA從所述吞噬體中泄漏。在一些實施方案中，所述細菌在真核細胞中可保持活 力不同時間，并可繼續產生RNAOniRNA或miRNA前體)。RNA或編碼RNA的DNA然后可從細 菌中例如通過泄漏釋放到細胞中。在本發明的某些實施方案中，所述細菌也可以在真核細 胞中復制。在優選的實施方案中，細菌復制不殺死宿主細胞沒有明顯的毒性。本發明不限 于通過特定裝置遞送RNA或編碼RNA的DNA并且旨在包括允許通過不依賴的細菌遞送裝置 遞送RNA或編碼RNA的DNA的方法和組合物。下文所述的是在文獻中已經描述為天然侵入性的細菌(部分2. 1)，以及在文獻中 已經描述為天然非侵入性的細菌(部分2. 2)，以及天然非致病性的或減毒的細菌的實例。 盡管已經將一些細菌描述為非侵入性的(部分2.幻，這些根據本發明仍然是侵入性足夠使 用的。無論是否常規描述為天然侵入性的或非侵入性的，可修飾任何的細菌菌株以進行調 節，尤其是增加其侵入性特征(例如在部分2. 3中所述)。2. 1天然侵入性細菌本發明使用的特定天然侵入性細菌并不是至關重要的。此類天然發生的侵入性細 菌的實例包括，但不限于志賀氏菌屬物種，沙門氏菌屬物種，利斯特氏菌屬物種，立克次氏 體屬物種(Rickettsia spp.)，和腸侵染性大腸桿菌。所用的特定志賀氏菌菌株對本發明并 非是至關重要的。可用于本發明的志賀氏菌株的實例包括弗氏志賀氏菌^(ATCC No. 29903),Shigella sonnet (ATCC No. 29930)，和 Shigella disenteriae (ATCCNo. 13313)。減毒志賀 氏菌株,如弗氏志賀氏菌2a 2457T aroA virG突變體CVD 1203 (Noriega等，上文)、弗氏志 賀氏菌 M90T icsA 突變體(Goldberg 等 Infect Immun.，62 :5664-5668 (1994))、弗氏志賀 氏菌 Y SFLl 14 aroD 突變體(Karnell 等 Vacc，10 167-174 (1992))和弗氏志賀氏菌 aroA aroD突變體(Verma等Vacc，9 :6-9(1991))優選用于本發明。或者，可通過單獨引入減毒 突變或與其他一種或更多種額外減毒突變結合構建新的減毒志賀氏菌屬物種菌株。志賀氏菌RNA疫苗載體的至少一個優勢是其對結腸黏膜表面中淋巴組織的向 性。此外，認為志賀氏菌復制的初始位點位于樹狀突細胞和巨噬細胞內，其通常見于黏膜
E^liRΦ M 白勺—/^ (McGhee, J. R.等 Reproduction, Fertility, &Development 6 :369(1994) ；Pascual, D. W.等 Immunomethods 5:56(1994)綜述)。像這樣，志賀氏菌 載體可提供手段以在這些專門抗原呈遞細胞中表達抗原的工具。志賀氏菌載體的另一優 勢是減毒的志賀氏菌菌株在體外和體內遞送核酸報告基因(Sizemore，D. R.等kience 270:299(1995) ；Courvalin, P.等 Comptes Rendus de 1 Academiedes Sciences Serie Ill-Sciences de Ia Vie-Life Sciences 318 :1207(1995) ；Powell,R. J.等在Molecular approaches to the control of infectiousdiseases(1996) ψ . , F. Brown, E. Norrby, D. Burton 禾口 J. Mekalanos,編著 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 183 ； Anderson,R. J.等Abstracts for the 97th General Meeting of the American Society forMicrobiology :E. (1997))。在實踐方面，志賀氏菌的嚴格限制的宿主特異性支持通 過中間宿主防止志賀氏菌載體擴散到食物鏈中。此外，已經在嚙齒類、靈長類和自生自長 型(植物)中開發了高度減毒的減毒菌株(Anderson等(1997)上文；Li，A.等Vaccine 10 :395(1992) ；Li，Α.等 Vaccine 11:180(1993) ；Karnel 1, A.等 Vaccine 13:88(1995)； Sansonetti, P. J.禾口 J. ArondelVaccine 7:443(1989) ；Fontaine, Α.等 Research in Microbiology 141 :907(1990) ；Sansonetti, P.J.等(1991)Vaccine 9 416 ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 62:5168(1994) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64 :3055(1996) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64:23(1996) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64:3055(1996) ；Kotloff, K. L.等 Infection&Immunity 64: 4542(1996))。該近來的認識將允許開發用于人的良好耐受的志賀氏菌載體。可使用化學性非特異性誘變，如使用試劑如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍；或 使用重組DNA技術、經典的遺傳技術(如TnlO誘變、P22-介導的轉導、λ噬菌體介導的交 換和接合轉移)的非特異性誘變；或使用定點誘變的重組DNA技術，將減毒突變引入細菌 性病原菌中。因為對重組DNA技術構建的菌株進行了更明確的定義，所以優選重組DNA技 術。此類減毒突變的實例包括，但不限于(i)營養缺陷性突變，如aroOtoiseth等Nature， 291 :238-239 (1981))、gua (McFarland 等 Microbiol. Path.，3 :129-141 (1987))、nad (Park 等 J. Bact, 170 :3725-3730(1988)、thy (Nnalue 等 Infect. Immun. ,55 :955-962(1987))和 asd(Curtiss，上文)突變；(ii)滅活球形調節功能的突變，如cya(Curtiss等Infect. Immun. ,55 3035-3043 (1987))、crp (Curtiss 等(1987)，上文)、phoP/phoQ (Groisman 等 Proc. Natl. Acad. Sci.，USA,86 :7077-7081 (1989)；禾口 Miller 等 Proc.Natl. Acad. Sci.，USA,86 5054-5058(1989))、phop (Miller 等 J. Bact, 172 :2485-2490 (1990))或 ompR(Dorman 等Infect. Immun. ,57 :2136-2140(1989))突變；(iii)修飾應激應答的突變，如 recA(Buchmeier 等 MoI. Micro.，7 933-936(1993))、htrA (Johnson 等 Mol. Micro.，5 :401-407 (1991) )、htpR(Neidhardt 等 Biochem.Biophys. Res. Com. ，100 :894-900(1981))、hsp (Neidhardt 等 Ann. Rev. Genet, 18 295-329(1984))和 groEL (Buchmeier 等 ki.，248 :730-732(1990))突變；(iv)特定毒力因子中的突變，如 IsyA (Libby 等 Proc. Natl. Acad. ki.，USA, 91 :489-493(1994))、pag 或 prg(Miller 等(1990)，上文；和 Miller 等(1989)，上文)、 iscA 或 virG(d ‘ Hauteville 等 Mol. Micro.，6 :833-841 (1992))、plcA(Mengaud 等 Mol Microbiol.，5 :367-72(1991) ；Camilli 等 J. Exp. MecU 173 :751-754 (1991))，和 act (Brundage 等 Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 90 11890-11894 (1993))突變；(ν)影響 DNA 拓撲結構的突變，如 top A(Galan 等 hfect. Immun.，58 1879-1885 (1990))；(vi)阻斷或修飾細胞周期的突變，如 min(de Boer 等 Cell，56 :641-649 (1989))。(vii)引入編碼自殺系統的基因，如 sacB(Recorbet 等 App. Environ. Micro. ,59 1361-1366(1993) ；Quandt 等 Gene，127 :15-21 (1993) )、nuc (Ahrenholtz 等 App. Environ. Micro. ,60 :3746-3751(1994))、hok、gef、kil 或 phlA (Molin 等 Ann. Rev. Microbiol. ,47 139-166(1993))；(viii)改變脂多糖和/或脂類A的生物起源的突變，如rfMRaetz inEsherishia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt 等編著，ASMPress, Washington D. C.第 1035-1063 頁(1996))、galE(Hone 等 J. Infect. Dis.，156 :164-167(1987))和 htrB(Raetz， 上文)、msbB (Reatz，上文)(ix)引入噬菌體裂解系統，如P22編碼的溶源體(Rermell等Virol，143 280-289(1985))、λ 胞壁質轉糖基酶(Bienkowskalzewczyk 等 Mol. Gen. Genet.，184 111-114(1981))或 S 基因(Reader 等 Virol，43 :623-6 (1971))；禾口減毒突變可組成型表達或處于誘導性啟動子控制下，如啟動子的溫度敏感型 熱激家族(Neidhardt等上文)，或厭氧誘導的nirB啟動子(Harbome等Mol Micro.， 6 :2805-2813(1992))或抑制型啟動子，如 uapA (Gorfinkiel 等 J. Biol. Chem.，268 23376-23381 (1993))或 gcv(Stauffer 等 J. Bact, 176 :6159-6164 (1994))。所用的特定利斯特氏菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的利斯特 氏菌菌株的實例包括單核細胞增生利斯特氏菌(ATCC No. 15313)。減毒的利斯特氏菌株， 如單核細胞增生利斯特氏菌actA突變體(Brundage等上文)或單核細胞增生利斯特氏菌 ρ IcA (Camilli等J.Exp. Med.，173 :751-754(1991))優選用于本發明。或者，可通過引入上 文描述志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建新的減毒利斯特氏 菌株。所用的特定沙門氏菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的沙門氏菌菌株的實例包括傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi) (ATCC No. 7251)和鼠傷寒沙門氏菌(ATCC No. 13311)。減毒的沙門氏菌株優選用于本發明 并包括傷寒沙門氏菌(S. typhi) -aroC-aroD (Hone等Vacc. 9 :810 (1991)和鼠傷寒沙門氏 菌-axoA突變體(Mastroeni等Micro. Pathol. 13 :477 (1992))。或者，可通過引入上文描 述志賀氏菌屬物種的一個或多個減毒突變構建新的減毒沙門氏菌菌株。
所用的特定立克次氏體菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的立 克次氏體菌株的實例包括立氏立克次氏體(Rickettsia Rickettsiae) (ATCC No. VR149 和 VR891)、普氏立克次氏體(Ricketsia prowaseckii) (ATCC No. VR233)、恙蟲熱立克次 氏體(Rickettsia tsutsugamuchi) (ATCCNo. VR312, VRl 50 和 VR609)、摩氏立克次氏體 (Rickettsia mooseri) (ATCCNo. VR144)、西伯利亞立克次氏體(Rickettsia s'ibirica ) (ATCC No. VR151)和五日熱立克次氏體(Rochalimaea qui tana) (ATCC No. VR358)。減毒的 立克次體菌株優選用于本發明，并可通過引入上文描述志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組 中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定腸侵染性大腸桿菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明 的腸侵染性大腸桿菌的實例包括大腸桿菌菌株4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80和 6-81 (Sansonetti 等 Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur)，132A :351-355 (1982))。減毒的腸侵染性大腸桿菌菌株優選用于本發明并可通過引入上文描述志賀氏菌 屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建。此外，因為除細菌之外的某些微生物也可與整聯蛋白分子(其為某些侵入因子 的受體)相互作用用于細胞吸收，此類微生物也可用于向靶細胞中引入RNA。例如，病毒， 例如口蹄病病毒、艾柯病毒和腺病毒，和真菌病原體，例如莢膜組織孢漿菌(Histoplasma capsulatum)和碩大利什曼原蟲(Leishmania major)與整聯蛋白分子相互作用。2. 2較低侵入性的細菌可用于本發明并已經在文獻中描述為非侵入性的或至少比前文部分(2. 1)中列 出的細菌侵入性弱的細菌的實例包括，但不限于耶爾森菌屬物種(Yersinia spp.)、大腸桿 菌屬物種(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌屬物種(Klebsiella spp.)、博德特氏菌屬物種 (Bordetella spp.)、奈瑟氏球菌屬物種(Neisseria spp.)、氣單胞菌屬物種(Aeromonas spp.)、ft禾中(Franciesella spp.)、_ 木干胃 M 禾中(Corynebacterium spp.)、檸檬酸細菌屬物種(CitrcAacter spp.)、衣原體屬物種(Chlamydia spp.)、嗜 血菌屬物種(Hemophilus spp.)、布魯氏菌屬物種(Brucella spp.)、分枝桿菌屬物種 (Mycobacterium spp.)、軍團桿菌屬物種(Legionella spp.)、紅球菌屬物種(Rhodococcus spp.)、假單胞菌屬物種(Pseudomonas spp.)、纏繞桿菌屬物種(Helicobacter spp·)、 弧菌屬物種(Vibrio spp.)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)和丹毒絲菌屬物種 (Erysipelothrix spp.)。修飾這些細菌以增加它們的侵入潛力是必需的。所用的特定耶 爾森菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的耶爾森菌菌株的實例包括小腸結腸炎耶爾森氏菌 (Y. enterocolitica) (ATCC No. 9610)或鼠疫耶爾森氏菌(Y. pestis) (ATCC No. 19428)。 減毒的耶爾森菌菌株如小腸結腸炎耶爾森氏菌k03-R2(al-Hendy等hfect. Immun.， 60 :870-875 (1992))或小腸結腸炎耶爾森氏菌 aroA (0 ‘ Gaora 等 Micro. Path.，9 105-116(1990))優選用于本發明。或者，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i) 到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建新的減毒耶爾森菌菌株。所用的特定大腸桿菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的大腸桿 菌菌株的實例包括大腸桿菌 H10407 (Elinghorst 等 hfect. Immun. ,60 :2409-2417(1992)) 和大腸桿菌 EFC4、CFT325 和 CPZ005 (Donnenberg 等 J. Infect. Dis.，169 :831-838 (1994))。減毒的大腸桿菌菌株，如減毒的火雞病原體大腸桿菌02 carAB突變體(Kwaga等Infect. Immun. ,62 :3766-3772(1994))優選用于本發明。或者，可通過引入上文所述用于志賀氏菌 屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建新的減毒大腸桿菌菌株。所用的特定克雷伯氏菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的克雷伯氏菌菌株的實例包括肺炎雷伯氏菌(K. pneumoniae) (ATCC No. 13884)。減毒的克雷伯氏菌菌株優選用于本發明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌 屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定博德特氏菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的博德特氏菌菌株的實例包括氣管炎博德特氏菌 (B. bronchiseptica) (ATCC No. 19395)。減毒的博德特氏菌菌株優選用于本發明，并可通過 引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定奈瑟氏球菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的奈瑟氏 球菌菌菌株的實例包括腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis) (ATCC No. 13077)和淋病奈 瑟氏球菌(N. gonorrhoeae) (ATCC No. 19424)。減毒的奈瑟氏球菌菌株，如淋病奈瑟氏球菌 MSll aro 突變體(Chamberlain 等Micro. Path. , 15 :51-63(1993))優選用于本發明。或者， 可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建 新的減毒奈瑟氏球菌菌株。所用的特定氣單胞菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于 本發明的氣單胞菌菌株的實例包括A. euCren0phila(ATCC No. 23309)。或者可通過引入上 文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建新的減毒氣單 胞菌菌株。所用的特定弗朗西絲氏菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的弗朗 西絲氏菌菌株的實例包括土拉熱弗朗西絲氏菌(F. tularensis) (ATCC No. 15482)。減毒的 弗朗西絲氏菌菌株優選用于本發明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到 (vii)組中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定棒桿菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的棒桿菌菌株 的實例包括假結核病棒桿菌(C. pseudotuberculosis) (ATCC No. 19410)。減毒的棒桿菌菌 株優選用于本發明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一 個或多個減毒突變構建。所用的特定檸檬酸細菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的檸檬酸 細菌菌株的實例包括弗氏檸檬酸細菌(C. freundii) (ATCC No. 8090)。減毒的檸檬酸細菌菌 株優選用于本發明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一 個或多個減毒突變構建。所用的特定衣原體菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的衣原體菌株 的實例包括C. pneumoniae (ATCC No. VRl 310)。減毒的衣原體菌株優選用于本發明，并可通 過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定嗜血桿菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的嗜血桿菌 菌株的實例包括H. sornmis (ATCC No. 43625)。減毒的嗜血桿菌菌株優選用于本發明，并可 通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定布魯氏菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的布魯氏菌菌株的實例包括流產布魯氏菌(B. abortus) (ATCC No. 23448)。減毒的布魯氏菌菌株優選用 于本發明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個
減毒突變構建。所用的特定分枝桿菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的分枝桿 菌菌株的實例包括胞內分枝桿菌(M. intracelhilare) (ATCC No. 13950)和結核分枝桿菌 (M. tuberculosis) (ATCC No. 27294)。減毒的分枝桿菌菌株優選用于本發明，并可通過引入 上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定軍團桿菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的軍團桿菌 菌株的實例包括L. pneumophila (ATCC No. 33156)。減毒的軍團桿菌菌株，如L. pneumophila mip突變體(0tt，FEMS Micro. Rev. ,14 :161-176(1994))優選用于本發明。或者，可通過引 入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建新的減毒 軍團桿菌菌株。所用的特定紅球菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的紅球菌菌株 的實例包括R.equi(ATCC No. 6939)。減毒的紅球菌菌株優選用于本發明，并可通過引入上 文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定假單胞菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的假單胞菌 菌株的實例包括銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) (ATCC No. 23267)。減毒的假單胞菌菌株優 選用于本發明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或 多個減毒突變構建。所用的特定纏繞桿菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的纏繞桿菌 菌株的實例包括H. mustelae (ATCC No. 43772)。減毒的纏繞桿菌菌株優選用于本發明，并可 通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建。所用的特定沙門氏菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的沙門氏 菌菌株的實例包括傷寒沙門氏菌(ATCC No. 7251)和鼠傷寒沙門氏菌(ATCC No. 13311)。 減毒的沙門氏菌菌株優選用于本發明并包括傷寒沙門氏菌aroC aroD (Hone等Vacc， 9 :810-816(1991))和鼠傷寒沙門氏菌 aroA 突變體(Mastroeni 等 Micro. Pathol，13 477-491(1992)))。或者，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的 一個或多個減毒突變構建新的減毒沙門氏菌菌株。所用的特定弧菌菌株對本發明并非是至 關重要的。可用于本發明的弧菌菌株的實例包括霍亂弧菌(Vibrio cholerae) (ATCC No. 14035)和辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis) (ATCC No. 35912)。減毒的弧菌 菌株優選用于本發明并包括霍亂弧菌RSI毒力突變體(Taylor等J. hfect. Dis.，170 1518-1523(1994))和霍亂弧菌 ctxA、ace、zot、c印突變體(Waldor 等 J. Infect. Dis.，170 278483(1994))。或者，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的 一個或多個減毒突變構建新的減毒弧菌菌株。所用的特定桿菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的桿菌菌株的實 例包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) (ATCC No. 6051)。減毒的桿菌菌株優選用于本 發明并包括 B. anthracis 突變體 pXOl (WeIkos 等 Micro. Pathol, 14 :381-388 (1993))和減 毒的BCG菌株(Mover等Nat，351 :456-460 (1991))。或者，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(Vii)組中的一個或多個減毒突變構建新的減毒桿菌菌株。所用的特定丹毒絲菌菌株對本發明并非是至關重要的。可用于本發明的丹毒絲 菌菌株的實例包括豬丹毒丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae) (ATCC No. 19414) 和扁桃體丹毒絲菌(Erysipelothrix tonsillarum) (ATCCNo. 43339) 減毒的沙門氏菌菌 株優選用于本發明并包括豬丹毒丹毒絲菌Kg-Ia和Kg-2 (ffatarai等J. Vet. Med. Sci.， 55 :595-600(1993))和豬丹毒丹毒絲菌 ORVAC 突變體(Markowska-Daniel 等 ht. J.Med. Microb. Virol. Parisit. Infect. Dis.，277 :547-553 (1992))。或者，可通過引入上文所述 用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構建新的減毒丹毒絲菌菌 株。2. 3用于增加菌株侵入性性質的方法無論已經將生物常規描述為侵入性的還是非侵入性的，可改造這些生物以增加它 們的侵入性性質，例如通過模擬志賀氏菌屬物種、利斯特氏菌屬物種、立克次體屬物種、傷 寒沙門氏菌屬物種或腸侵染性大腸桿菌屬物種的侵入性質。例如，可向微生物中引入使微 生物能夠進入細胞(例如所述非侵入性細菌的天然宿主中的細胞)的細胞質中的一個或多 個基因。本文稱為“細胞質靶向基因”的此類基因的實例包括編碼能夠通過志賀氏菌，或腸 侵染性大腸桿菌的類似侵入基因，或利斯特氏菌的利斯特氏菌溶素0侵入的蛋白質的基因， 像已知此類技術產生廣泛的能夠侵襲并進入動物細胞的細胞質中的侵入細菌一樣(Formal 等 Infect. Immun. ,46 :465(1984) ；Bielecke 等 Nature，345 175-176 (1990) ；Small 等 Microbiology-1986,第 121-124頁，Levine等編著，American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1986) ；Zychlinsky 等 Molec. Micro.，11 :619-627(1994) ；Gentschev 等 (1995) Infection&Immunity 63 4202 ；Isberg, R. R.禾口 S. Falkow (1985) Nature 317:262; 和Isberg，R.R.等(1987)Cell 50:769)。用于向細菌菌株中轉移上述細胞質靶向基因的 方法為本領域所熟知。可向細菌引入另一優選基因以增加其侵入特征，該基因編碼來自假 結核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的侵染素蛋白質，(Leong等EMBO J. ,9 1979(1990))。侵染素也可與listeriolysin組合引入，由此，相對于引入任一這些基因，進 一步增加細菌的侵入特征。為說明性目的，已經對上述基因做了描述；然而，對于本領域技 術人員顯而易見的是來自一種或更多種來源的任何基因或基因組合將足夠，所述基因或基 因組合參與將分子，尤其是RNA或編碼RNA的DNA分子從微生物遞送到細胞，例如動物細胞 的細胞質中。因此，此類基因不限于細菌基因，并包括病毒基因，如流感病毒血凝素HA-2，其 促進胞內體裂解作用(endosmolysis) (Plank 等 J. Biol. Chem.，269 12918-12924 (1994))。 也可通過例如PCR擴增從DNA獲得上述靶向細胞質的基因，從攜帶期望的靶向細胞質的基 因的侵入性細菌中分離所述DNA。可從本領域，例如上文列出的參考文獻和/或在因特網 (www. ncbi. nlm. nih. gov/)上可公開獲得的GenBank中獲得的核苷酸序列設計PCR的引物。 可設計PCR引物以擴增細胞質靶向基因、細胞質靶向操縱子、細胞質靶向基因簇或細胞質 靶向基因調節子。所用的PCR策略將依賴于細胞質靶向基因或靶侵入性細菌中基因的遺傳 結構。設計PCR引物，使其含有與靶DNA序列開始和末端的DNA序列同源的序列。然后可以 例如通過使用 Hfr 轉移或質粒活動(Miller，A Short Course in BacterialGenetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1992) ；Bothwell 等上文；和Ausubel等上文)、噬菌體介導轉導(de Boer，上文；Miller，上文；和Ausubel等上文)、 化學轉化(Bottiwell等上文；Ausubel等上文)、電穿孔(Bottiwel等上文；Ausubel等上文； 禾口Sambrook,MolecularCloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)和物理轉化技術(Johnston 等上文；和 Bothwell，上 文)將細胞質靶向基因引入靶細菌菌株中。細胞質靶向基因可整合到可溶性噬菌體中(de Boer等Cell，56 :641-649 (1989))，質粒載體s (Curtiss等上文)或剪接到靶菌株的染色體 中(Hone等上文)。如上所述，除了遺傳改造細菌提高其侵入性性質外，也可通過將侵入因子與細胞 連接，以修飾細菌。因此，在一個實施方案中，通過用侵入因子，例如具有足夠侵入力的蛋白 質侵染素、侵染素衍生物或其片段共價或非共價包被細菌致使細菌更具侵入性。事實上，已 經顯示用來自假結核耶爾森氏菌的純化侵染素包被非侵入性細菌細胞或侵染素的羧基末 端192個氨基酸能夠進入哺乳動物細胞(Leong等EMBO J. 9 :1979(1990))。此外，侵染素 的羧基末端區包被的乳膠球被哺乳動物細胞有效內化，如用抗體固定的侵染素包被的金黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株(綜述見于 Isberg 禾口 Trail van Nhieu Ann. Rev. Genet. 27 :395(1994))。或者，也可用特異性結合細菌進入因子識別的表面分子的抗 體、其變體或其片段包被細菌。例如，已經顯示如果用針對整聯蛋白分子，例如α5β1(稱 作與細菌侵染素蛋白質相互作用的表面分子)的單克隆抗體包被細菌，那么它們則被內化 (Isberg和Tran van Nhieu，上文)。可根據本領域已知的方法制備此類抗體。通過例如用 抗體包被細菌，使細菌與具有抗體識別的表面受體的真核細胞接觸，并根據上述方法監測 細胞內細菌的存在來檢測抗體在調節細菌侵入力中的功效。用于連接侵入因子與細菌表面 的方法為本領域所知，包括交聯。3.靶細胞本發明提供用于向任何類型的靶細胞遞送RNA(或RNA編碼DNA)的方法，其中所 述RNA是miRNA或miRNA前體。如本文所用，術語“靶細胞”指細菌侵入的細胞，即具有用 于細菌識別必需的表面受體的細胞。優選地，靶細胞是真核細胞。甚至更優選地，靶細胞是動物細胞。將“動物細胞” 定義為來自或存在于多細胞生物中的有核的，不含葉綠體細胞，所述多細胞生物的分類 (taxanomic)位置位于動物國界。該細胞可以存在于完整動物、原代細胞培養物、外植體培 養物或轉化的細胞系中。該細胞的特定組織來源并非對本發明至關重要。用于本發明的受 體動物細胞對其并非至關重要，并包括出現在動物國界內的所有生物中的或來自動物國界 內的所有生物，如哺乳類、魚類、鳥類、爬行類的那些生物。優選的動物細胞是哺乳動物細胞，如人、牛、綿羊、豬、貓、犬、山羊、馬和靈長類細 胞。最優選的動物細胞是人細胞。在優選的實施方案中，靶細胞是黏膜表面。某些腸病原體，例如大腸桿菌、志賀氏 菌、利斯特氏菌和沙門氏菌自然適合用于該應用，因為這些生物具有粘著并侵入宿主黏膜 表面的能力(Kreig等上文)。因此，在本發明中，此類細菌可向宿主黏膜區室中的細胞遞送 RNA分子(miRNA或前體)或編碼RNA的DNA。盡管某些類型的細菌具有某一向性，即趨向優選的靶細胞，可通過選擇對期望的 細胞類型具有向性的細菌或被修飾以能夠侵入期望細胞類型的細菌完成RNA或編碼RNA的DNA向某一類型細胞的遞送。因此，如上討論，例如可遺傳改造細菌以模擬黏膜組織向性和 侵入性性質，由此允許所述細胞侵入黏膜組織，并向這些位點中的細胞遞送RNA或編碼RNA 的 DNA。細菌也可靶向其他類型的細胞。例如，可通過修飾細菌以在其表面上表達間 日瘧蟲(Plasmodium vivax)網織紅細胞結合蛋白質_1或_2，或-1和-2 (其特異性 結合人和靈長類中的紅細胞)，而使細菌靶向人和靈長類的紅細胞(felinski等Cell， 69 :1213-1226(1992)).在另一實施方案中，修飾細菌以在其表面上具有脫唾液酸血 清類黏蛋白，其為肝細胞上脫唾液酸糖蛋白受體的配體OVu等J. Biol. Chem.，263 14621-14624(1988))。在另一實施方案中，用已經顯示靶向質粒吸收到具有胰島素 受體的細胞的胰島素多聚L賴氨酸包被細菌(Rosenkranz等Expt. Cell Res.，199 323-329 (1992))。還在本發明范圍內的是被修飾以在其表面上具有允許肝細胞具有向 性的單核細胞增生利斯特氏菌的p60 (Hess等Infect. Immun. ,63 :2047-2053(1995))或 來自通過結合肝素、硫酸肝素和膠原引起特異性結合哺乳動物細胞外基質的克魯茲錐蟲 (Trypanosoma cruzi)的 60kD 表面蛋白(Ortega-Barria 等 Cell,67 :411-421 (1991))的 細菌。在另一實施方案中，細胞可被修飾以變成遞送RNA的細菌的靶細胞。因此，可修飾 細胞以表達細菌識別的表面抗原(即侵入因子的受體)，用于其靶向進入細胞。可通過向細 胞中引入編碼侵入因子的受體的核酸修飾細胞，使得表面抗原在期望條件下表達。或者，可 用侵入因子的受體包被細胞。侵入因子的受體包括屬于整聯蛋白受體超家族的蛋白質。多 種細菌和其他微生物識別的整聯蛋白受體類型的列表可見于例如Isberg和TranVan Nhieu Ann. Rev. Genet. 27 :395 (1994)。用于整聯蛋白亞基的核苷酸序列可見于例如在因特網上可 公共獲得的GenBank。如上所述，其他靶細胞包括魚類、鳥類和爬行類動物細胞。下文中描述了對魚類、 鳥類和爬行類動物細胞具有天然侵入性的細菌的實例。可天然進入魚類細胞細胞質的細菌的實例包括，但不限于氣單胞菌(Aeromonas salminocida) (ATCC No. 33658)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonasschuberii) (ATCC No. 43700)。 減毒的細菌優選用于本發明，并包括A. salmonicidia vapA (Gustafson等J. MoI. Biol.， 237 :452-463(1994))或 A. salmonicidia 芳香族依賴性突變體(Vaughan 等 hfect. Immun. ,61 :2172-2181 (1993))。可天然進入鳥類細胞細胞質的細菌的實例包括，但不限于雞沙門氏菌 (Salmonella galinarum) (ATCC No. 9184)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteriditis) (ATCC No. 4931)和鼠傷寒沙門氏菌(ATCC No. 6994)。減毒的細菌優選于本發明并包括減毒的沙 門氏菌菌株如雞沙門氏菌(S. galinarum) cya crp突變體(Curtiss等(1987)上文)或腸 炎沙門氏菌(S. enteritidis)aroA芳香族依賴性突變體CVL30 (Cooper等hfect. Immun.， 62 :4739-4746(1994))。可天然進入爬行類動物細胞細胞質的細菌的實例包括，但不限于鼠傷寒沙門氏菌 (ATCC No. 6994)。減毒的細菌優選用于本發明并包括減毒的菌株如鼠傷寒沙門氏菌芳香族 依賴性突變體(Hormaeche等上文)。本發明還提供向其他真核細胞例如植物細胞遞送RNAOniRNA或其前體)，只要具有天然或已被修飾變得具有侵入性后能夠侵入此類細胞的微生物。可侵入植物細胞的微生 物的實例包括根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumerfacium)，其使用通過特異受體結合植物細 胞的菌毛樣結構，然后通過與細菌結合類似的過程向植物細胞中遞送至少一些其內容物。下文說明的是根據本發明方法可向其中遞送RNA的細胞系。人類細胞系的實例包括但不限于ATCC No. CCL 62, CCL 159、HTB151、HTB 22, CCL 2、CRL 1634、CRL 8155、HTB 61 和 HTBl04 牛細胞系的實例包括 ATCC No. CRL 6021、CRL 1733,CRL 6033,CRL 6023,CCL 44 和 CRL 1390。綿羊細胞系的實例包括 ATCC No. CRL6540、 CRL 6538、CRL 6548 和 CRL 6546。豬細胞系的實例包括ATCC No. CL 184、CRL 6492 和 CRL 1746。貓細胞系的實例包括CRL 6077,CRL 6113,CRL 6140,CRL 6164,CCL 94,CCL 150、 CRL 6075 和 CRL 6123。水牛細胞系的實例包括CCL 40和CRL 6072。犬細胞系的實例包括ATCC No. CRL 6213, CCL 34, CRL 6202、CRL6225、CRL 6215、 CRL 6203 和 CRL 6575。山羊來源細胞系的實例包括ATCC No. CCL 73和ATCC No. CRL6270。馬來源細胞系的實例包括ATCC No. CCL 57和CRL 6583。鹿細胞系的實例包括ATCC No. CRL 6193-6196。靈長類來源細胞系的實例包括來自黑猩猩的那些細胞系，如ATCC No. CRL 6312、CRL 6304 和 CRL 1868 ；猴細胞系如 ATCC No. CRL 1576、CCL 26 禾口 CCL 161 ；猩猩 (orangautan)細胞系 ATCC No. CRL 1850 ；和大猩猩細胞系 ATCC No. CRL 1854。4.藥物組合物在本發明優選的實施方案中，含有miRNA或其前體分子，和/或編碼此類分子的 DNA的侵入性細菌通過靜脈、肌內、皮內、腹膜內、經口、鼻內、眼內、直腸內、陰道內、骨內、口 腔、浸入和尿道內灌輸途徑弓I入動物內。本發明的細菌可凍干或加工成其孢子形式。待向受試者施用的本發明的活的侵入性細菌的量根據受試者的類別，以及待治療 的疾病或病征不同而不同。通常，所用的劑量將是每個受試者約IO3到IO15活菌，優選約IO4 到IO12活菌。本發明的侵入性細菌通常與可藥用載體和/或稀釋劑一起施用。所用的特定可 藥用載體和/或稀釋劑對本發明并非至關重要。稀釋劑的實例包括磷酸緩沖鹽水、緩沖 胃中胃酸的緩沖液，如含有蔗糖的檸檬酸鹽緩沖液(PH7. 0)、單獨的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7.0) (Levine 等 J. Clin. Invest, 79 :888-902(1987)；和 Black 等 J. Infect. Dis.，155 1260-1^5(1987))，或含抗壞血酸、乳糖和任選地天冬苯丙二肽酯的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7. 0) (Levine等Lancet，11 :467-470 (1988))。載體的實例包括例如在脫脂牛奶中發現的蛋 白質、糖(例如蔗糖)或聚乙烯吡咯烷酮。通常將以約0. 1-30% (w/v)，但優選1-10% (w/ ν)范圍內的濃度內使用這些載體。下文所示是可用于遞送特異途徑的其他可藥用載體或稀釋劑。任何此類載體或 稀釋劑可用于施用本發明的細菌，只要所述細菌仍然能夠侵入靶細胞。可進行體外或體內 測試侵入力來確定適當的稀釋劑和載體。可配制本發明的組合物用于多種類型的施用，包括全身和局部施用或定域施用。也可包括凍干形式，只要細菌在接觸靶細胞或向受試者施 用后具有侵入性。技術禾口配制通常可見于Remmington' s Pharmaceutical Sciences, MeadePublishing Co.，Easton, Pa。對于全身施用，優選注射，包括肌內、靜脈、腹膜內和 皮下施用。對于注射，可在液體溶液中，優選在生理學相容的緩沖液如Hank' s溶液或 Ringer' s溶液中配制本發明的組合物，例如細菌。對于口服給藥，藥物組合物可以采取例如通過利用可藥用賦形劑，如結合劑(例 如預膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素 或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉 羥乙酸鈉)；或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)的常規手段制備的片劑或膠囊劑形式。可通 過本領域所熟知的方法包被所述片劑。用于口服給藥的液體制劑可采取例如溶液、糖漿劑 或懸浮液的形式，或者它們可呈現為干產品，在使用前用水或其他合適的載體構建。可通過 利用可藥用添加劑如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例 如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如杏仁油、油酯類(oily esters)、乙醇或分餾的植 物油)；和防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)，用常規方法制 備此類液體制劑。所述制劑也含有緩沖鹽、增味劑、著色劑，適當時還含有甜味劑。可適當地配制用于口服施用的制劑，以給出活性化合物的可控釋放。對于口腔施 用，所述組合物可采取常規方式配制的片劑或錠劑形式。對于吸入施用，使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙 烷、二氧化碳或其他合適氣體，以呈現自加壓包裝或噴霧器的噴霧劑形式常規遞送根據本 發明使用的藥物組合物。在加壓氣霧劑的情況下，可通過提供閥門遞送測定量來確定劑量 單元。可配制用于吸入器或吹出器中例如明膠的膠囊和藥筒，所述吸入器或吹出器含有組 合物的粉劑混合物，例如細菌和合適的粉劑基質，如乳糖或淀粉。可配制藥物組合物用于通過注射，例如通過快速濃注或連續輸注來進行腸胃外施 用。可以單位劑量形式，例如在安瓿或含有添加防腐劑的多劑量容器中提供用于注射的制 劑。所述組合物可采取這樣的形式，如油載體或水載體中的懸浮液、溶液或乳劑，并可含有 配制劑(formulatory agent)，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，活性成分可以是在使 用前用合適載體，例如滅菌注射用水構建的粉劑形式。也可在直腸、陰道內或尿道內組合物中配制藥物組合物，例如含有常規栓劑基質 如可可脂或其他甘油酯類的栓劑或保留灌腸劑。全身施用也可通過經黏膜或經皮途徑。對 于經黏膜或經皮施用，在制劑中使用適合于待滲透屏障的滲透劑。此類滲透劑通常為本領 域所知，并包括例如用于經黏膜施用膽汁鹽和夫西地酸衍生物。此外，去污劑也用于促進滲 透。經黏膜施用可通過鼻腔噴霧或使用栓劑。對于局部施用，本發明細菌可配制成本領域 通常已知的軟膏劑、藥膏、凝膠或膏狀物，只要所述細菌在接觸靶細胞后仍然具有侵入性。如果需要，可在含有一個或多個單位劑量形式的包裝或分配裝置和/或藥盒中提 供組合物，所述單位劑量形式含有活性成分。所述包裝例如包含金屬或塑料薄片，如泡罩包 裝。所述包裝或分配裝置可具有用于施用的說明書。含有待引入的miRNA/前體或編碼RNA的DNA的侵入性細菌可用于感染在體外培 養的動物細胞，如從受試者獲得的細胞。然后可將這些體外感染的細胞經過靜脈內、肌內、 皮內或腹膜內，或通過允許細胞進入宿主組織的任何灌輸途徑引入動物，例如所述細胞最初來源的受試者。當向個體細胞中遞送RNA時，所施用的活生物的劑量是每個細胞約0. 1 到106，優選約IO1到IO4細菌的多重性感染。在本發明的另一實施方案中，細菌也可向細胞，例如然后可從中收集或純化蛋白 質的動物細胞中遞送編碼蛋白質的RNA分子。例如，可在組織培養細胞中產生蛋白質。通過以下不應以任何形式解釋為限制的實施例來進一步說明本發明。包括該 申請全文中引用的文獻、授權的專利、公開的專利申請的所有引用參考文獻的內容因此 明確地引入作為參考，但不認為它們是本發明之前的現有技術。除非另行說明，本發明 的實踐將使用本領域技術中的細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生 物學、重組DNA和免疫學的常規技術。在參考文獻中詳細解釋了此類技術。參閱，例如 由 Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis 編著的 Molecular Cloning A LaboratoryManual, 第 2 版(Cold Spring Harbor Laboratory Press :1989) ；DNACloning,第 I 卷和第 II 卷(D. N. Glover 編著，1985) ；OligonucleotideSynthesis (Μ· J. Gait 編著，1984) ；Mullis 等美國專利號4，683，195 ；NucleicAcid Hybridization (B. D. Hames&S. J. Higgins 編著 1984) ；TranscriptionAnd Translation(B. D. Hames&S. J. Higgins 編 著 1984) ；Culture OfAnimal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. ,1987) ；Immobilized CellsAnd Enzymes(IRL Press,1986) ；B. Perbal, A Practical Guide To MolecularCloning(1984)； the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N. Y. ) ；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos 編著，1987，Cold Spring Harbor Laboratory) ；Methods InEnzymology,第 154 卷禾口第 155 卷(Wu 等編著)， ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology (Mayer 禾口 Walker,編 著， Academic Press, London,1987) ；Handbook Of Experimental Immunology,第 I-IV 卷 (D.M.Weir禾口C.C.Blackwell，編著，1986) ；Manipulating theMouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y. ,1986)。
實施例材料和方法質粒對于單個啟動子質粒，如下(圖2)構建transkingdom miRNA(TMIR)質粒。簡 言之，含有多克隆位點(MCQ的退火寡核苷酸、T7啟動子和增強子(Qiagen合成)連接到 KSIK+)的平端BssHII位點中。編碼人Let-7miRNA(Let-7a)或其一個前體的DNA序列插 入MCS的BamHI和Mil位點中，以產生質粒pT7miRNA。已經發現Let_7miRNA家族調節fcis 基因(Johnson, S.等，Cell，第 120 卷，635-64792005))。利用以下引物通過PCR (Pfx DNA 聚合酶，Invitrogen Inc.)從 pGB2Winv_hly (C. Grillot-Courvalin提供)擴增Hly A基因并將其克隆到KSII (+)的EcoRV位點中hly-Ι :5，-CCCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTA-3' (SEQ IDNO :1)，和hly-2 :5，-AAGCTTTTAAATCAGCAGGGGTCTTTTTGG-3，(SEQID NO :2)。含有pGB2 Ω inv-hly 的 inv 基因座的 PstI 片段插入 KSII (+)/Hly ^ PstI 位點。 用BamHI和Mil切割Hly-Inv片段。補平后，將其連接到pT7miRNA的T7終止子中整合的 EcoRV位點中。所得編碼Let-7a miRNA或一個其前體的TiOR轉化到大腸桿菌(BL21(DE3)PLysE)細胞中。過夜培養細胞以允許表達和miRNA加工。對于兩個啟動子的質粒，構建 T7-Therapeutic Pathway Identificationand ValidationCTPIV )質粒，以包括具有兩個T7啟動子的RNAi，盒(圖3)。使用標準的分 子克隆技術通過兩個)(bal位點將所獲DNA分子克隆至質粒中。所述質粒還包括與TiOR質 粒類似的Inv基因座和Hly基因座。對于載體構建，按照標準分子生物學技術將T7終止子復性，并用BamHIAbaI或 Xbal/Sall消化。隨后使用以下引物將終止子克隆至TPIV 載體的BamHlAbaI或)(baI/ Sail位點BamHI 正向5 ‘ ACGGATCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGTCTAGAGGATCCAC 3，(SEQ ID NO 3)BamHI 反向5’ GTGGATCCTCTAGACCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGATCCGT 3，(SEQ ID NO 4)SalI 正向5 ’ GCGTCGACTCTAGACCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGTCGACCG 3，(SEQ ID NO 5)SalI 反向:5 ’ CGGTCGACTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGTCTAGAGTCGACGC 3，(SEQ ID NO 6)miRNA 測定在37°C，MOI為1000時用大腸桿菌(BL21 (DE3)pLysE)細胞感染Hela細胞2小 時。感染M小時后，用TRIZOL(Invitrogen)收獲細胞RNA并在裂解緩沖液中提取蛋白質。 使用OneSt印RT-PCR kit (Invitrogen)并用以下引物通過RT-PCR進行k_Ras mRNA的擴 增，以擴增k-Ras mRNA的278堿基對片段5，-AGTACAGTGCAATGAGGGACCAGT(SEQ ID NO 7)禾口5' -AGCATCCTCCACTCTCTGTCTTGT(SEQ ID NO :8)。對所得PCR產物進行染色并在瓊脂糖凝膠上電泳，根據標準的分子生物學方法 (包括RT-PCR、western印記和/或northern印記分析)觀察(圖4，左)。具體地，使用在12% SDS-PAGE凝膠上分離的50ug細胞提取物進行western印記 分析以測定k-Ras蛋白質水平。通過與單克隆k-Ras抗體(SantaCruz)孵育測定k-Ras蛋 白質水平并通過增強的化學發光(GEBiosciences)進行觀察(圖4，右)。針對k-Ras的細菌介導的基于miRNA的基因調節實施例1 :miRNA前體的細菌表達如上述，將購自 Integrated DNA Technologies, Inc.的人 Let_7miRNA (Let_7a) 的片段克隆至TiOR質粒中。側接限制性酶切位點(BamHI/Sall)的Let_7a DNA具有以下序列(SEQID NO 9)5’ -GCGGATCCTGGGATGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTTAGGGTCACACCC
ACCACTGGGAGATAACTATACAATCTACTGTCTTTCCTAGTCGACCG-3，mRNA測定的結果示于圖4中。當與對照(左)相比，k_Ras mRNA水平在用Let_7a miRNA處理的細胞中顯示僅稍微降低時，k-Ras蛋白質水平中的降低不相稱地增加(右)，提 示了當可能已經發生了一些mRNA降解時，Let-7a miRNA引起的大多數基因調節很可能通 過翻譯阻抑(其為miRNA裝置的標志)。這些數據清楚地顯示細菌可通過合成和加工miRNA 前體的miRNA裝置介導基因調節。實施例2 初級-miRNA的細菌表達將編碼人miR-155miRNA的初級-miRNA序列的DNA序列克隆至TiOR質粒中。利用 質粒進行細菌轉化。在一個實例中，初級-miRNA加工成miRNA前體在細胞中發生，伴隨在 與初級-miRNA序列相同的TMIR質粒中或在不同的細菌表達載體上人Drosha的表達。在 另一實例中，初級-miRNA加工在感染的真核細胞中發生，而不需要細菌Drosha的表達。然后用轉化的細菌感染Hela細胞并使用所述測定分析Bachl mRNA和蛋白質的水 平。miR-155 初級-miRNA 序列如下5’ -GTGGCACAAACCAGGAAGGGGAAATCTGTGGTTTAAATTCTTTATGCCTCATCCTCTGAGTGCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATGCTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTTTTTGCCTCCAACTGACTCCTACATATTAGCATTACAGTGTATGATGCCTGTTACTAGCATTCACATGGAACAAATTGCTGCCGTGGGAGGATGACAAAGAAGCATGAGTCACCCTGCTGGATAAACTTAGACTTCAGGCTTTATCATTTTTCAATCTGTTAATCATAATCTGGTCACTGGGATGTTCAACCTTAAACTAAGTTTTGAAAGTAAGG-3 ‘ (SEQ ID NO 10)實施例3 =HiiRNA雙鏈體的細菌表達將編碼人miR_155miRNA雙鏈體的兩條鏈的DNA序列克隆至TPIV 質粒中。利 用質粒進行細菌轉化。然后用轉化的細菌感染Hela細胞并使用所述測定分析k-Ras mRNA 水平。所述miR_155miRNA雙鏈體序列如下FOR 5，-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3，(SEQ ID NO :11)REV 5，-CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3，(SEQ ID NO :12)實施例4 :miRNA的細菌表達將編碼人miR-155miRNA序列的DNA序列克隆至TiOR質粒中。利用質粒進行細菌 轉化。然后用轉化的細菌感染Hela細胞并使用所述測定分析BachlmRNA和蛋白質水平。所述miR_155miRNA 序列如下5，-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3，(SEQ ID NO :11)其他實施方案在以下的權利要求中。盡管已顯示并描述了若干實施方案，在不背 離本發明精神和范圍的情況下可進行不同的修飾。
權利要求
1.至少編碼微小RNA(miRNA)或miRNA前體的DNA載體，其中所述miRNA能夠調節真 核、原核或病毒靶基因中至少一個的表達。
2.權利要求1的載體，其中所述miRNA前體是初級-miRNA。
3.權利要求1的載體，其中所述miRNA前體是miRNA前體。
4.權利要求1的載體，其中所述載體編碼雙鏈體miRNA，其中所述兩條miRNA鏈包含基 本互補的區域。
5.權利要求1的載體，其中所述miRNA是成熟的miRNA。
6.權利要求1的載體，其還包含原核啟動子。
7.權利要求1的載體，其還包含真核啟動子。
8.權利要求1的載體，其中所述至少一個靶基因是癌相關基因。
9.權利要求1的載體，其還編碼Hly基因。
10.細菌，其包含微小RNA(miRNA)、miRNA前體或至少編碼所述miRNA或所述前體的 DNA分子，其中所述miRNA能夠調節真核、原核或病毒靶基因中至少一個的表達。
11.權利要求10的細菌，其中所述前體是miRNA前體。
12.權利要求10的細菌，其中所述前體是初級-miRNA。
13.權利要求10的細菌，其中所述細菌是活的侵入性細菌。
14.權利要求10的細菌，其中所述細菌是活的侵入性細菌的衍生物。
15.權利要求10的細菌，其中所述細菌是非致病性且無毒性的。
16.權利要求10的細菌，其中所述細菌是選自利斯特氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸 桿菌和雙歧桿菌的減毒菌株。
17.權利要求10的細菌，其中所述細菌選自耶爾森菌屬物種、大腸桿菌屬物種、克雷伯 氏菌屬物種、博德特氏菌屬物種、奈瑟氏球菌屬物種、氣單胞菌屬物種、弗朗西絲氏菌屬物 種、棒桿菌屬物種、檸檬酸細菌屬物種、衣原體屬物種、嗜血菌屬物種、布魯氏菌屬物種、分 枝桿菌屬物種、軍團桿菌屬物種、紅球菌屬物種、假單胞菌屬物種、纏繞桿菌屬物種、沙門氏 菌屬物種、弧菌屬物種、芽孢桿菌屬物種、利什曼蟲屬物種和丹毒絲菌屬物種，所述細菌已 經經過遺傳改造，以模擬志賀氏菌屬物種、利斯特氏菌屬物種、立克次體屬物種和腸侵染性 大腸桿菌屬物種的侵入性質。
18.權利要求10的細菌，其還包含能夠將所述前體加工成接近成熟miRNA的酶或核酶。
19.權利要求18的細菌，其中所述酶是內切核酸酶。
20.權利要求10的細菌，其還包含細菌核糖核酸酶III、切酶、切酶樣酶、Drosha和 Pasha中的至少一種。
21.權利要求10的細菌，其還包含酶，所述酶從所述細菌中釋放到靶真核細胞的細胞 質后幫助轉運遺傳物質。
22.權利要求21的細菌，其中所述酶是Hly蛋白質。
23.權利要求10的細菌，其還包含控制所述DNA分子表達的原核啟動子。
24.權利要求23的細菌，其中所述啟動子是T7啟動子。
25.權利要求10的細菌，其還包含控制所述DNA分子表達的真核啟動子。
26.權利要求10的細菌，其中所述DNA分子還編碼Hly基因。
27.權利要求10的細菌，其中所述真核基因是動物基因。
28.權利要求10的細菌，其中所述真核基因是哺乳動物或鳥類基因。
29.權利要求10的細菌，其中所述至少一個靶基因是癌相關基因。
30.向動物細胞遞送微小RNA(miRNA)或miRNA前體的方法，所述方法包括用權利要求 10-29中任一項的所述細菌感染所述動物細胞。
31.權利要求30的方法，其中所述動物細胞是人細胞。
32.權利要求30的方法，其還包括在感染后裂解所述細菌。
33.在動物細胞中調節至少一個靶基因表達的方法，所述方法包括步驟用權利要求10的所述細菌感染動物細胞；和裂解所述細菌以釋放其內容物，由此允許來自所述內容物的miRNA或從所述內容物產 生的miRNA與靶基因的mRNA相互作用，并由此調節所述基因的表達。
34.權利要求33的方法，其中所述mRNA通過翻譯阻抑、mRNA降解或其兩者調節所述基 因表達。
35.在動物中治療或預防病征的方法，所述方法包括通過用包含微小RNA(miRNA)、 miRNA前體，或至少編碼所述miRNA或所述前體的DNA分子的細菌感染動物細胞，來調控所 述病征中已知涉及的至少一個靶基因的表達，其中所述miRNA能夠調節至少所述靶基因的表達。
36.權利要求35的方法，其中所述動物是哺乳動物或鳥類。
37.在動物中治療或預防癌的方法，所述方法包括通過用包含微小RNA(miRNA)、miRNA 前體，或至少編碼所述miRNA或所述前體的DNA分子的細菌感染動物細胞，來調控所述癌中 已知涉及的至少一個靶基因的表達，其中所述miRNA能夠調節至少所述靶基因的表達。
38.權利要求35的方法，其中所述動物是哺乳動物或鳥類。
39.在動物中治療或預防由動物中至少一個缺陷型微小RNA(miRNA)引起的病征的方 法，所述方法包括通過用包含所述miRNA的功能版本、所述功能性miRNA的RNA前體，或至 少編碼所述功能性miRNA或所述前體的DNA分子的細菌感染動物細胞。
40.權利要求37的方法，其中所述動物是哺乳動物或鳥類。
41.在動物中治療或預防由動物中至少一個上調的微小RNA(miRNA)引起的病征的方 法，所述方法包括通過用包含所述miRNA的反義版本、所述miRNA反義版本的RNA前體，或 至少編碼所述反義版本或所述前體的DNA分子的細菌感染動物細胞。
42.權利要求37的方法，其中所述動物是哺乳動物或鳥類。
43.發現或確認治療靶標的方法，所述方法包括以下步驟用權利要求10的細菌感染動物細胞；裂解所述細菌以釋放其內容物；和研究底物與來自所述內容物或從所述內容物產生的miRNA之間的相互作用。
44.權利要求39的方法，其中所述底物調節所述miRNA。
45.權利要求39的方法，其中所述miRNA調節所述底物。
46.制備微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括以下步驟用至少編碼miRNA的原核載體感染至少一種細菌；在所述細菌中表達所述miRNA ；和從所述細菌中收集所述miRNA。
47.制備微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括以下步驟用至少編碼miRNA前體的第一個原核載體和編碼將所述miRNA前體加工成miRNA的至 少一種酶的第二個原核載體感染至少一種細菌； 在所述細菌中表達所述miRNA前體和所述酶；和 從所述細菌中收獲所述miRNA。
全文摘要
本發明提供合成、加工和/或使用細菌，優選細菌的非致病性或治療性菌株向真核細胞中遞送miRNA或其前體，以在真核細胞中引起基因調節的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102149826SQ200880104973
公開日2011年8月10日 申請日期2008年6月30日 優先權日2007年6月29日
發明者C·李 申請人:波士頓生物醫藥公司