改進的基因沉默方法

專利名稱：改進的基因沉默方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)領(lǐng)域，更特別地涉及通過提供抑制性RNA分子而修飾真 核生物的核酸表達。本發(fā)明描述了通過向真核生物提供一種以上的抑制性RNA而修飾植物 中的基因沉默的方法，其中通過不同的基因沉默途徑處理所述的不同種類的抑制性RNA。本 發(fā)明可以應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，包括農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)業(yè)或醫(yī)療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因沉默是一種真核生物中常見的現(xiàn)象，其中通過一些不同的機制，從mRNA降解 (轉(zhuǎn)錄后沉默)到抑制蛋白合成再到染色質(zhì)重塑(轉(zhuǎn)錄沉默)，從而降低或甚至消除特定基 因的表達。已經(jīng)快速采用基因沉默的現(xiàn)象而工程化不同靶分子的表達。最初，已知調(diào)節(jié)真核 生物中基因表達的兩種主要的方法，其在本領(lǐng)域中被稱為“反義”下調(diào)或“正義”下調(diào)。在過去十年中，已經(jīng)證明使用編碼RNA的嵌合構(gòu)建體可以在定量和定性水平上極 大地改進沉默效率，所述RNA能夠通過在分別與靶序列互補和同源的反義和正義RNA核苷 酸序列之間通過配對而形成雙鏈RNA。這樣的雙鏈RNA(dsRNA)被稱為發(fā)夾RNA (hpRNA)。下列參考文獻描述了這樣的方法的用途Fire 等人，1"8 (Nature 391,806-811)描述了通過在線蟲(Caenorhabditiselegans) 中實驗引入雙鏈RNA的特異性遺傳干預(yù)。WO 99/32619提供將RNA引入活細胞而抑制該細胞中靶基因的基因表達的方法。 該方法可以在體外或在體內(nèi)進行。RNA有帶有雙鏈結(jié)構(gòu)的區(qū)域。抑制是序列特異性，因為 RNA的雙鏈區(qū)的核苷酸序列和或靶基因的一部分是相同的。Waterhouse 等人 1998 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 13959-13964)描述可以通 過同時表達正義和反義RNA誘導(dǎo)植物中的病毒抗性和基因沉默。正義和反義RNA可以定位 于自我互補的一個轉(zhuǎn)錄本中。Hamilton等人1998 (Plant J. 15 :737_746)描述了具有重復(fù)DNA的轉(zhuǎn)基因，即其 5’非翻譯區(qū)的倒轉(zhuǎn)拷貝，所述轉(zhuǎn)基因造成番茄中ACC-氧化酶表達的高頻率的轉(zhuǎn)錄后抑制。WO 98/53083描述了用于增強生物中靶基因抑制的構(gòu)建體和方法，其包括將載體 中多核苷酸區(qū)所有或一部分的倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列插入基因沉默載體。WO 99/53050提供了通過引入編碼針對靶核酸的正義和反義RNA分子的嵌合基因 而減少真核細胞中特別是植物細胞中感興趣的核酸的表型表達的方法和手段。這些分子能 夠在具有正義和反義核苷酸序列的區(qū)域之間通過堿基配對或通過自身引入RNA分子而形 成雙鏈RNA區(qū)。優(yōu)選地，RNA分子同時包括正義和反義核苷酸序列。WO 99/49029大體上涉及修飾基因表達的方法并涉及修飾轉(zhuǎn)基因生物特別是轉(zhuǎn)基 因動物或植物的細胞、組織或器官中內(nèi)源基因表達的合成基因。還提供了，當引入生物時， 能夠形成可以抑制、延遲或減少生物中內(nèi)源基因或靶基因的表達的dsRNA的合成基因和遺 傳構(gòu)建體。
WO 99/61631涉及使用基因的正義和反義RNA片段改變植物中靶基因表達的方 法。正義和反義RNA片段能夠配對和形成雙鏈RNA分子，因此改變基因的表達。該發(fā)明還 涉及使用這些方法獲得的植物、其后代及其種子。WO 00/01846提供了一種鑒定負責提供細胞中特定表型的DNA的方法，該方法包 括a)在合適的載體中構(gòu)建細胞的DNA的cDNA或基因組庫，其方向為相對于啟動子的方向， 當合適的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合至啟動子時，所述啟動子能夠啟動cDNA或DNA轉(zhuǎn)錄至雙鏈(ds)RNA ； b)將庫引入含有轉(zhuǎn)錄因子的一個或多個細胞中，和c)鑒定和分離含有庫的細胞的特定表 型并鑒定來自負責提供表型的庫的DNA或cDNA片段。使用這個技術(shù)，還可以通過下列方法 確定已知DNA序列的功能a)鑒定細胞中DNA序列的同源物，b)從細胞中分離相關(guān)DNA同 源物或其片段，c)將同源物或其片段克隆進入合適的載體，其方向為相對于合適的啟動子 的方向，當合適的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合至啟動子時，所述啟動子能夠啟動來自所述DNA同源物或 片段的dsRNA的轉(zhuǎn)錄，d)將載體引入含有轉(zhuǎn)錄因子的步驟a)的細胞中。WO 00/44914還描述了使用雙鏈RNA在體內(nèi)和體外，特別是在斑馬魚中弱化基因 表達的組合物和方法。WO 00/49035描述了使細胞中內(nèi)源基因表達沉默的方法，該方法包括在細胞中過 表達內(nèi)源基因的核酸分子和反義分子，包括與內(nèi)源基因的核酸分子互補的核酸分子，其中 細胞中內(nèi)源基因的核酸分子和反義分子的過表達使內(nèi)源基因的表達沉默。Smith 等人，2000 (Nature 407:319-320)以及 WO 99/53050 描述了含有 dsRNA 的 內(nèi)含子進一步增加沉默的效率。含有發(fā)夾RNA的內(nèi)含子也被稱為ihpRNA。雖然基因沉默最初被認為是引入異常RNA分子的結(jié)果，如當引入轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)錄至 反義正義或雙鏈RNA分子)時，但是最近明確的是這些現(xiàn)象不只是實驗假象。真核生物中 RNA介導(dǎo)的基因沉默似乎在各種生物過程中起重要作用，如發(fā)育的空間上和時間上的調(diào)節(jié)， 異染色質(zhì)形成和抗病毒防御。所有真核生物具有產(chǎn)生小RNA的機制，小RNA然后用于在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié) 基因的表達。通過特異性核糖核酸酶(Dicer或Dicer樣(DCL)蛋白)的作用，各種雙鏈 RNA分子底物被加工成小的21-24個核苷酸長的RNA分子。專用的dsRNA結(jié)合(DRB)蛋白 與DCL蛋白結(jié)合而優(yōu)化將其各種dsRNA底物加工成特異性大小的小RNA。這些小RNA作為 引導(dǎo)分子被整合進入蛋白復(fù)合物(RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC))，其進一步含有保守的 Argonaute蛋白(AGO)家族的一個成員，其導(dǎo)致通過基因沉默獲得的各種效應(yīng)。植物如擬南 芥具有廣泛的內(nèi)源RNA沉默途徑，這歸因于存在幾個專門的DCL蛋白(擬南芥中有四個) 和不同的AGO旁系同源物(擬南芥中有十個)。通過與RNA或DNA的序列特異性相互作用而參與真核生物中基因表達抑制的小 RNA通常分為兩類microRNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNA)。這些類型的小RNA分子通過 其前體的結(jié)構(gòu)和通過其靶標而得以區(qū)分。miRNA從大得多的折回轉(zhuǎn)錄本的短的不完全配對 的主干上被切下并調(diào)節(jié)那些與其具有非常有限的相似性的轉(zhuǎn)錄本的表達。siRNA起源于長 的雙鏈RNA(dsRNA)并通常指導(dǎo)與其完全互補的轉(zhuǎn)錄本的切割，包括其所衍生自的轉(zhuǎn)錄本 (Yoshikawa 等人，2005，Genes& Development，19 :2164_2175)。Dicer家族成員的數(shù)量在生物中差別很大。在人類和線蟲(C. elegans)中只有一 個Dicer。在果蠅(Drosophila)中，小干擾RNA指導(dǎo)的mRNA的切割既需要Dicer-I又需要Dicer-2，而Dicer-I而非Dicer-2對于microRNA指導(dǎo)的抑制是重要的(Lee等人，2004 Cell 75 :843-854，Pham 等人，2004 Cell 117:83-94)。植物如擬南芥似乎具有至少四個Dicer樣(DCL)蛋白并且已經(jīng)在科學文獻中建議 這些 DCL 是功能上專門化的(Qi 等人，2005 Molecular Cell，19，421-428)。DCLl具有來自部分雙鏈莖環(huán)前體RNA(該前體RNA從MIR基因轉(zhuǎn)錄)的 miRNA (Kurihara 和 Watanabe，2004，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 12753-12758)。DCL3具有內(nèi)源性重復(fù)和基因間區(qū)域衍生的siRNA，其依賴于依賴RNA的RNA聚合 酶2并參與涉及DNA和組蛋白甲基化的24nt siRNA的累積(Xie等人，2004，PLosBiology， 2004，2，642-652)。DCL2似乎在一些但不是所有的植物病毒的抗病毒沉默反應(yīng)中起作用(Xie等人， 2004，PLosBiology,2004，2，642-652)。幾個出版物已經(jīng)歸結(jié)了 DCL4在產(chǎn)生反式作用siRNA (ta-siRNA)中的作用。 ta-siRNA是三個已知基因家族(在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中被稱為TASl，TAS2 和TAS3)所編碼的內(nèi)源性siRNA的特異性種類。ta-siRNA的生物發(fā)生途徑包括miRNA指 導(dǎo)的位點特異性的原始轉(zhuǎn)錄本的切割。該加工的轉(zhuǎn)錄本然后通過RDR6和SGS3的活性被轉(zhuǎn) 變成dsRNA。然后DCL4的活性催化將dsRNA轉(zhuǎn)變?yōu)橐?1_nt增加的siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)(Xie 等人 2005，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102，12984-12989 ;Yoshikawa 等人，2005，Genes & Development, 19 :2164_2175 ；Gasciolli 等人，2005 Current Biology, 15，1494—1500)。如Xie等人2005 (前述)所顯示的，還需要確定DCL4是否對于轉(zhuǎn)基因和抗病毒沉 默是必需的。Dunoyer 等人 2005 (Nature Genetics, 37 (12) ppl356 to 1360)描述了 DCL4 對于 RNA干擾是必需的并且產(chǎn)生植物細胞-細胞沉默信號的21-核苷酸的小干擾RNA成分。Dunoyer 等人 2007 (Nature Genetics 39 pp 848-856)將擬南芥中不同途徑總結(jié) 如下DCL1與DRB蛋白HYLl —起催化從不完全折回的前體轉(zhuǎn)錄本中miRNA的釋放。通常， 加載了 miRNA的AGOl然后促進帶有miRNA靶序列8的細胞轉(zhuǎn)錄本的切割。通過募集AG04 和/或AG06，DCL3產(chǎn)生指導(dǎo)異染色質(zhì)形成的與24_ntDNA重復(fù)相關(guān)的siRNA。與DRB4 —起， DCL4產(chǎn)生21-nt反式作用siRNA (tasiRNA)，其需要AGOl或AG07的功能以介導(dǎo)控制異胚體 (Heteroblasty)和葉子極性的基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。最后，DCL2產(chǎn)生指揮應(yīng)激反應(yīng)16的天 然反義轉(zhuǎn)錄本siRNA。未公開的PCT申請PCT/AU07/000583描述了并證明了在將長發(fā)夾RNA分子加工成 最終實施基因沉默的干擾RNA成分的過程中DCL4的調(diào)節(jié)和參與。雖然介導(dǎo)基因沉默的RNAi已經(jīng)成為可接受的研究工具，以及開發(fā)特定性質(zhì)的工 具，但是偶然有報道提出在特定條件下，或幾個世代的終身，特別是在植物細胞和植物中的 基因沉默的長期穩(wěn)定性的問題。例如Szittya等人2003 (EMBOJournal 22, pp 633 to 640) 報道低溫通過控制siRNA產(chǎn)生而抑制RNA沉默介導(dǎo)的防御。Karmeda等人2004報道通過果 蠅中表達的倒轉(zhuǎn)重復(fù)的溫度敏感的基因沉默(Biochem. Biophys. Res. Comm. 315,599-602)。 Niu等人2006 (NatureBiotechnology 24，1420-1428)描述通過擬南芥植物上TYMV癥狀的 病毒感染系統(tǒng)在15°C比在24°C更嚴重并且含有指導(dǎo)下調(diào)病毒表達的microRNA的轉(zhuǎn)基因植 物顯示出在15°C保持的穩(wěn)定的amiRNA介導(dǎo)的特異性病毒抗性。
另外，一些RNAi的應(yīng)用，特別是作為發(fā)展特性的工具，需要靶基因的強烈下調(diào)，優(yōu) 選甚至為了靶基因功能的所有實際方法和目的而幾乎完全或完全下調(diào)靶基因。使用不同的嵌合體基因或通過相同的SiRNA分子產(chǎn)生途徑加工的RNA分子，將 RNAi應(yīng)用于不同的靶基因可以導(dǎo)致這樣途徑的飽和。因此，以下在不同具體實施方式
中描述的實施例和權(quán)利要求是解決上述問題的基 因沉默的方法和手段，其提供和使用至少兩種抑制性RNA分子或編碼針對相同靶核酸的這 樣的RNA分子的基因，其中抑制性RNA分子通過將RNAi加工成siRNA分子的兩種或兩種以 上分開的途徑而造成基因沉默，通常由不同的Dicer蛋白或Dicer樣蛋白(可選與不同的 dsRNA結(jié)合蛋白和/或Argonaute家族成員組合)介導(dǎo)并最終造成基因沉默。為了減少RNAi 加工途徑的飽和問題，描述了提供和使用至少兩種抑制性RNA分子或編碼針對不同靶核酸 的這樣的RNA分子的基因的方法和手段，其中抑制性RNA分子通過將RNAi加工成siRNA分 子的兩種或兩種以上的單獨途徑造成基因沉默。

發(fā)明內(nèi)容
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供了一種減少真核細胞或生物，如植物細胞或 植物或動物細胞或非人類動物中的靶核酸的表達的方法，其包括引入能夠減少存在于真核 細胞中的一個靶核酸的表達的至少兩種抑制性RNA分子的步驟，其中抑制性RNA分子通過 不同的RNAi分子加工途徑被加工成21至24個核苷酸長度的寡核苷酸，例如主要通過單獨 的Dicer蛋白或單獨的Dicer樣蛋白而切割成為21至24個核苷酸長度的寡核苷酸。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供了一種減少真核細胞或生物中第一和第二 靶核酸的表達的方法，其包括引入至少兩種抑制性RNA分子的組合的步驟，其中一種抑制 性RNA分子能夠減少真核細胞或生物中的第一靶核酸的表達，另一種抑制性RNA分子能夠 減少所述真核細胞或生物中的第二靶核酸的表達，其中主要通過細胞或生物中不同的RNAi 分子加工途徑將抑制性RNA分子加工成為21至24個核苷酸長度的寡核苷酸。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，一種抑制性RNA分子主要通過DCLl或具有相似 功能或特異性的RNAse切割，另一個抑制性RNA分子主要通過DCL4或具有相似功能和特異 性的RNAse切割。在本發(fā)明的另一個具體實施方式
中，一種抑制性RNA分子主要通過DCL3或具有相 似功能和特異性的RNAse切割，另一種抑制性RNA分子主要通過DCL4或具有相似功能和特 異性的RNAse切割。還提供了其它的組合如a) 一種抑制性RNA分子主要通過DCLl或具有相似功能和特異性的RNAse切割，另 一種抑制性RNA分子主要通過DCL2或具有相似功能和特異性的RNAse切割；b) 一種抑制性RNA分子主要通過DCLl或具有相似功能和特異性的RNAse切割，另 一種抑制性RNA分子主要通過DCL3或具有相似功能和特異性的RNAse切割；c) 一種抑制性RNA分子主要通過DCL2或具有相似功能和特異性的RNAse切割，另 一種抑制性RNA分子主要通過DCL3或具有相似功能和特異性的RNAse切割；或d) 一種抑制性RNA分子主要通過DCL2或具有相似功能和特異性的RNAse切割，另 一種抑制性RNA分子主要通過DCL4或具有相似功能和特異性的RNAse切割。
還在本發(fā)明的另一個具體實施方式
中，提供了一種減少真核細胞或生物，如植物 細胞或植物或動物細胞或非人類動物中的靶核酸的表達的方法，其包括引入能夠減少存在 于真核細胞中的一種靶核酸表達的至少兩種抑制性RNA分子，其中一種抑制性RNA分子是 能夠減少靶核酸表達的miRNA分子，pre-microRNA分子或pri_mRNA分子，其中另一種RNA 分子是雙鏈RNA分子，其包括互補或?qū)嵸|(zhì)上互補的第一和第二 RNA區(qū)，第一 RNA區(qū)包含至少 19個連續(xù)的選自靶核酸的核苷酸序列的核苷酸，第二 RNA區(qū)包含至少19個連續(xù)的選自靶核 酸的核苷酸序列互補的核苷酸。在另一個具體實施方式
中，所述第一抑制性RNA分子可以 包含至少19個連續(xù)的來自靶核酸分子的啟動子區(qū)的核苷酸，第二抑制性RNA分子可以包含 至少19個連續(xù)的來自轉(zhuǎn)錄成RNA分子的靶核酸分子區(qū)的核苷酸。還在本發(fā)明的另一個具體實施方式
中，從引入真核細胞的抑制性RNA編碼基因轉(zhuǎn) 錄抑制性RNA分子。在本發(fā)明的特定具體實施方式
中，可以在被RNA聚合酶II識別的啟動 子的控制下從抑制性RNA編碼基因轉(zhuǎn)錄抑制性RNA分子，可以在被RNA聚合酶III識別的 啟動子控制下從抑制性RNA編碼基因轉(zhuǎn)錄另一種抑制性RNA。靶核酸可以是病毒核酸或基因或其轉(zhuǎn)錄區(qū)或其可以是轉(zhuǎn)基因或其可以是內(nèi)源性 基因。相對于那些通過任何抑制性RNA分子單獨在真核生物中的獲得的靶核酸表達的 減少來說，通過本發(fā)明的方法獲得的靶核酸的表達可以更加減少或更穩(wěn)定或?qū)ν獠恳蛩馗?不敏感。本發(fā)明的另一個目的是提供真核細胞，如植物或動物細胞，其包含能夠減少存在 于真核細胞中的一種靶核酸表達的至少兩種抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子通過不 同的RNAi分子加工途徑被加工成21至24個核苷酸長度的寡核苷酸。本發(fā)明還提供實質(zhì) 上或完全由上述細胞組成的非人類真核生物。還在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供物質(zhì)的組合物，其包括能夠減少存在于 真核細胞的一種靶核酸的表達的至少兩種抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子通過不同 的RNAi分子加工途徑被加工成21至24個核苷酸長度的寡核苷酸。本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含能夠減少存在于真核細胞的一種靶核酸的表達 的至少兩種抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子通過不同的RNAi分子加工途徑被加工成 21至24個核苷酸長度的寡核苷酸，所述試劑盒作為同時、分別或相繼用于減少真核生物中 靶核酸表達的組合制備物。本發(fā)明還提供物質(zhì)的組合物，其包含本文所述的至少兩種抑制性RNA分子，及其 作為藥物的用途。


圖1.圖板A 差別性處理源自CaMV35S (Poll II識別的)和AtU6_指導(dǎo)的(Pol 111識別的)PDShp42轉(zhuǎn)基因的短hpRNA 中間體RNA種類和siRNA的模式在35S和U6系之 間均不同。泳道1-6 含有CaMV35S驅(qū)動的PDS hp42轉(zhuǎn)基因的不同植物系中的小RNA種類 的Northern分析；泳道7_12 含有AtTO驅(qū)動的PDS hp42轉(zhuǎn)基因的不同植物系中的小RNA 種類的Northern分析。圖板B 含有CaMV35S驅(qū)動的PDS hp42轉(zhuǎn)基因(35S-X ；每個板的頂部)，AtU6驅(qū)動的PDS hp42轉(zhuǎn)基因(U6-XX ；每個板的底部)的不同轉(zhuǎn)基因系中的和同時含有兩個轉(zhuǎn)基 因(35S-X χ TO-XX ；每個板的中部)的植物系中的PDS表達的沉默。圖2. Northern blot分析顯示源自擬南芥中35S_GUShp93和U6_GUShp93轉(zhuǎn)基因 的hpRNA的差異性加工。圖板A. siRNA的檢測。注意35S和U6系間siRNA大小模式的總 體差異性。圖板B. siRNA的更好分離。在15% (左圖板)或18% (右)聚丙烯酰胺凝膠 中分離A中小RNA樣品的亞群并以針對A探針相同的探針雜交。注意來自35S系的siRNA 主要是21nt的大小，而來自TO系的siRNA是22和/或24nt的大小。圖板C.擬南芥植物 中35S-GUShp93和U6_GUShp93的中間體RNA的Northern blot分析。在5%的甲酸瓊脂糖 (NuSieve 3 1)凝膠中分離總的小RNA，并以32P標記的全長反義⑶S RNA雜交(頂部圖 板)。圖板D. C (#4，#6，#17和#21)中顯示的四個總的小RNA樣品不以RNaseI處理(-)或 以RNaseI處理(+)，在5%的甲醛瓊脂糖(NuSieve 3 1)凝膠中分離并以32P標記的對應(yīng) 于GUShp93 RNA的莖和環(huán)(即GUS ORF的nt. 512-697)正義RNA雜交，其應(yīng)該檢測GUShp93 的轉(zhuǎn)錄本的全長RNA和dsRNA莖而不是⑶Shp93的轉(zhuǎn)錄本的環(huán)片段。N-35S和N-U6是分別 來自混合的35S-GUShp93和TO_GUShp93的植物的核RNA制備物。圖板E.相同的四個樣品 不以RNaseI處理(-)或以RNaseI處理(+)，在5%的甲醛瓊脂糖(NuSieve 3 1)凝膠中 分離，并以32P標記的對應(yīng)于⑶Shp93 RNA環(huán)(即⑶SORF的nt. 605-697)的反義RNA雜交。 注意35S-GUShp93衍生的RNA中間體只與反義探針(C和E)雜交，但不與正義探針(D)雜 交，這表明雜交帶是環(huán)片段。圖3.含有35S-GUShp93嵌合基因或AtTOhp93嵌合基因或兩者的不同轉(zhuǎn)基因系中 的⑶S表達的分析。圖4.圖板A 含有針對EIN2的啟動子和轉(zhuǎn)錄區(qū)的hpRNA的轉(zhuǎn)基因系(hp)；含有針 對EIN2啟動子的正義RNA的轉(zhuǎn)基因系(s)或含有兩類轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因系(hp χ s)中的短 RNA分子的Northern分析。圖板B 含有編碼針對EIN2內(nèi)源性基因的啟動子的正義抑制性RNA的轉(zhuǎn)基因的不 同轉(zhuǎn)基因系(s)中的EIN2沉默；含有編碼針對EIN2內(nèi)源性基因啟動子區(qū)以及EIN2內(nèi)源性 基因的mRNA編碼區(qū)的5’UTR的雙鏈抑制性RNA的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因系(hp)中的EIN2沉默； 和含有這兩個轉(zhuǎn)基因的系(s χ hp)中的EIN2沉默。在含有ACC的培養(yǎng)基中播種種子并在 黑暗中培育。胚軸越長，EIN2基因的表達的沉默越強。
具體實施例方式本發(fā)明基于本發(fā)明人的這樣的證明相對于只提供了一種抑制性分子時在真核細 胞中觀察到的靶核酸表達的減少來說，當提供針對特定的靶核酸的至少兩種抑制性RNA分 子時，真核細胞，如植物細胞，表現(xiàn)出的更強烈的和更穩(wěn)定的特定靶核酸的表達的減少，每 個抑制性RNA分子通過不同的基因沉默途徑發(fā)揮其最終效應(yīng)。特別證明了當提供編碼在被RNA聚合酶II所識別的啟動子控制下的hpRNA的嵌 合基因和編碼在被RNA聚合酶III所識別的啟動子(特別是3類啟動子)控制下的hpRNA 的嵌合基因的組合時，通過編碼植物細胞中雙鏈RNA分子(特別是hpRNA)的嵌合基因而獲 得的基因沉默更為加強。相似地，可以通過提供兩種單獨的嵌合基因而觀察到靶核酸表達 的增強性減少，其中一種嵌合基因編碼針對啟動子區(qū)的抑制性RNA(稱為共抑制或正義基因沉默構(gòu)建體)，另一種嵌合基因編碼還針對靶核酸的轉(zhuǎn)錄區(qū)的抑制性RNA(hpRNA)。另外 從編碼microRNA的嵌合基因和編碼hpRNA的基因的組合預(yù)期得到表達的增強性減少。還 預(yù)期這樣的組合將在其他真核細胞如動物細胞中有效。因此，本發(fā)明提供一種在真核細胞或生物中減少靶核酸表達的方法，其中將能夠 減少存在于真核細胞中的一種靶核酸的表達的至少兩種抑制性RNA分子引入真核細胞中， 并且其中通過不同的RNAi分子加工途徑將抑制性RNA分子加工成21至24個核苷酸的寡 核苷酸。這樣的方法意外地造成靶核酸表達的增強性減少。另外，因為抑制性RNA分子通 過不同的途徑造成最終的基因沉默效應(yīng)，該方法不傾向于受那些干擾加工途徑中的一種而 不干擾其它種的外部刺激的影響。本文使用的“基因沉默效應(yīng)”是指宿主細胞中，優(yōu)選植物細胞中的“靶核酸的表達 的減少”，其可以通過引入沉默RNA而實現(xiàn)?！鞍泻怂岬谋磉_”是指細胞中核酸的轉(zhuǎn)錄，可以 通過轉(zhuǎn)錄本或加工產(chǎn)物例如mRNA或mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)生或積累的降低的水平而觀察或 測定表達的減少。轉(zhuǎn)錄本可以不被加工或通過例如去除內(nèi)含子而被加工，并且其可以被翻 譯或不被翻譯；“表達”包括有該過程或無該過程的轉(zhuǎn)錄。表達的減少可以是轉(zhuǎn)錄減少的結(jié) 果，包括通過染色質(zhì)重塑的甲基化，或RNA分子的轉(zhuǎn)錄后修飾；包括通過RNA降解；或包括 兩者?；虺聊槐乇唤忉尀榘泻怂峄蚧虮磉_的消除。當存在沉默RNA時靶核酸表達的 水平比不存在沉默RNA時低就足夠了。表達水平可以減少至少約10%或至少約15%或至 少約20%或至少約25%或至少約30%或至少約35%或至少約40%或至少約45%或至少 約50%或至少約55%或至少約60%或至少約65%或至少約70%或至少約75%或至少約 80%或至少約85%或至少約90%或至少約95%或至少約100%。如本文使用的，除非相 反聲明，短語“約”是指關(guān)于所考慮數(shù)值的任何合理的范圍。在優(yōu)選的具體實施方式
中，術(shù) 語“約”是指所指明數(shù)值的+/_1%。如本文使用的，“至更大的程度”是指相對于參考的至 少10%的效應(yīng)的增加。靶核酸可以包括內(nèi)源性基因，轉(zhuǎn)基因或病毒基因或通過病毒載體引 入的基因。靶核酸可以進一步包括穩(wěn)定引入宿主細胞基因組優(yōu)選宿主細胞的核基因組的基 因。如本文使用的，“沉默RNA”或“沉默RNA分子”在本文還指“抑制性RNA”或“抑制 性RNA分子”，表明當引入宿主細胞優(yōu)選植物細胞時，特別通過轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)錄后沉默而減 少靶基因的表達的任何RNA分子。這樣的沉默RNA可以是例如所謂的“反義RNA”，其中RNA 分子包含與靶核酸序列優(yōu)選靶基因的編碼序列的互補物具有至少95%序列同一性的至少 20個連續(xù)核苷酸的序列。但是，反義RNA還可以針對靶基因的調(diào)節(jié)性序列，包括啟動子序列 和轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化信號。沉默RNA進一步包括所謂的“正義RNA”，其中RNA分子 包含與靶核酸序列具有至少95%序列同一性的至少20個連續(xù)核苷酸的序列。正義RNA還 可以針對靶基因的調(diào)節(jié)性序列，包括啟動子序列和轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化信號。提及的正義或反義RNA當然可以更長并為約30nt，約50nt，約lOOnt，約200nt，約 300nt，約500nt，約IOOOnt，約2000nt或甚至約5000nt或長度更大，每個分別與靶核酸(或 其互補物)的核苷酸序列具有約40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %或100 %的總序列同一 性。序列越長，總序列同一性的要求越低。但是，具有較小的總序列同一性的較長的正義或 反義RNA分子應(yīng)該至少包含與靶核酸或其互補物的序列具有至少95%序列同一性的20個 連續(xù)核苷酸并且可以包含與靶核酸或其互補物的序列具有100%序列同一性的至少20個連續(xù)核苷酸。正義或反應(yīng)RNA的長度可以在上面數(shù)字中的任何組合之間。在具體實施方式
中，優(yōu)選用于動物細胞特別是哺乳動物細胞的正義或反義RNA的長度在20至30個核苷酸 之間。在具體實施方式
中，正義或反應(yīng)RNA的長度為21，22，23，24，25，26，27，28，或29個核 苷酸。而沉默RNA包括正義和反義RNA，每個的長度可以獨立地是上述的任何數(shù)字。在優(yōu)選 的具體實施方式
中，正義和反義RNA的長度是相同的或差異達10 %或20 %，但不多于這個 數(shù)值。兩種抑制性RNA分子可以靶向相同的區(qū)域，重疊區(qū)或優(yōu)選靶核酸的非重疊區(qū)。如 本文使用的，“重疊”意思是兩個區(qū)域在至少兩個相同的連續(xù)核苷酸重疊。在特別用于動物 細胞如哺乳動物細胞的更優(yōu)選的具體實施方式
中，兩種抑制性RNA分子中的一種是短發(fā)夾 RNA，其可以是多腺苷酸化的但優(yōu)選是非多腺苷酸化的，具有與靶基因的20-30個核苷酸的 第一區(qū)的至少95%同一性的20-30個連續(xù)核苷酸的正義核苷酸序列，以及與靶基因第一區(qū) 的互補物至少95%同一性的20-30個連續(xù)核苷酸的反義核苷酸序列，正義和反義序列通過 3-20個核苷酸的間隔區(qū)共價結(jié)合；并且兩種抑制性RNA分子中的第二種是miRNA分子，其 具有與靶基因的20-30個或20-25個核苷酸的第二區(qū)的互補物有至少95%同一性的20-30 個連續(xù)核苷酸優(yōu)選為20-25個連續(xù)核苷酸的反義核苷酸序列，但不具有與靶基因的第二區(qū) 有至少95%同一性的至少20個連續(xù)核苷酸的正義核苷酸序列。miRNA分子可以具有或不 具有與靶基因的第二區(qū)為60-95%序列同一性的20-30個連續(xù)核苷酸的正義核苷酸序列。 靶基因的第一和第二區(qū)優(yōu)選是不同的，更優(yōu)選是不重疊的。優(yōu)選地，短發(fā)夾RNA是從具有 RNA聚合酶III(RNA Pol III)啟動子的嵌合基因表達而來的，并且miRNA分子是從具有RNA Pol II啟動子的嵌合基因轉(zhuǎn)錄而來的，其作為隨后在細胞中加工的前體RNA(pri-miRNA或 pre-microRNA)。其它沉默RNA可以是“非多腺苷酸化的RNA”，其包含與靶核酸序列的互補物具有 至少95%序列同一性的至少20個連續(xù)核苷酸，如在WO 01/12824或US6423885中所描述 的(兩個文獻都并入本文作為參考)。另外另一種沉默RNA是如在WO 03/076619或WO 2005/026356中所描述的(兩個文獻都并入本文作為參考)RNA分子，其包含與靶核酸或 其互補物的序列具有至少95%序列同一性的至少20個連續(xù)核苷酸，并進一步包含如WO 03/076619或WO 2005/026356所述的大的雙鏈區(qū)(包括含有來自馬鈴薯紡錘狀塊莖類病毒 型的類病毒的核定位信號的或含有CUG三核苷酸重復(fù)的大的雙鏈區(qū))。沉默RNA還可以是 和含有如本文定義的正義和反義鏈的雙鏈RNA，其中正義和反義鏈能夠相互堿基配對而形 成雙鏈RNA區(qū)(優(yōu)選所述正義和反義RNA的至少20個連續(xù)核苷酸的是相互互補的)。正 義和反義區(qū)還可以存在于一個RNA分子內(nèi)，以便當正義和反義區(qū)形成雙鏈RNA區(qū)時可以形 成發(fā)夾RNA(hpRNA)。hpRNA在本領(lǐng)域是熟知的(參見例如WO 99/53050，并入本文作為參 考)?？梢詫pRNA分類為長hpRNA，其具有可以大部分互補但是不必完全互補的長的正義 和反義區(qū)(通常在約200bp以上，在200-1000bp的范圍內(nèi))。hpRNA還可以是相當小的，大 小從約30至約42bp的范圍，但是不比94bp長太多(參見WO 04/073390，并入本文作為參 考)。沉默RNA分子還可以包括所謂的microRNA或合成的或人工的microRNA分子或其前 體，如例如 Schwab 等人 2006，Plant Cell 18(5) :1121_1133 所描述的。沉默RNA可以直接引入宿主細胞，或通過“基因沉默嵌合基因”的轉(zhuǎn)錄非直接地引 入宿主細胞。基因沉默嵌合基因可以穩(wěn)定地引入宿主細胞(如植物細胞)基因組，優(yōu)選核基因組，或其可以瞬時地引入。本文定義的所有的沉默RNA具有中間體的階段，其中沉默RNA分子含有雙鏈RNA 區(qū)。本文使用的“雙鏈RNA區(qū)”具有兩條通過堿基配對而雜交的RNA鏈。這兩條鏈可以是分 離的鏈(未共價結(jié)合的)或可以是通過間隔或環(huán)區(qū)作為單一自我互補RNA的部分而共價結(jié) 合的。在上下文中“堿基配對”包括G:U堿基配對以及標準Watson-Crick堿基配對。單鏈 RNA通過例如依賴RNA的RNA聚合酶的作用而部分或完全轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA，或者引入的或轉(zhuǎn) 錄的抑制性RNA分子自身能夠形成這樣的雙鏈RNA區(qū)。如果真核生物含有一個以上的dicer 或dicer樣蛋白(如例如在植物細胞中)，不同的Dicer或dicer樣蛋白可以對雙鏈RNA底 物具有偏好并且產(chǎn)生的短干擾RNA的長度還可以不同，通過不同的Dicer或dicer樣蛋白 或通過Dicer或dicer樣蛋白的不同活性的加工中的這種差異被稱為“不同的RNAi分子加 工途徑”。通過與不同的專用雙鏈RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合以及通過將產(chǎn)生的小干擾RNA分子 并入含有不同的Argonaute樣蛋白的不同的RISC復(fù)合物，可以進一步延伸對于特定dsRNA 底物的活性和特異性的這種差異。如本文使用的，“Dicer蛋白”是具有核糖核酸酶活性的蛋白，其參與將雙鏈RNA分 子加工成短干擾RNA(SiRNA)。核糖核酸酶活性是所謂的核糖核酸酶III的活性，其主要或 優(yōu)先切割雙鏈RNA底物而不是單鏈RNA區(qū)，因此靶向RNA分子的雙鏈部分。如本文使用的， 術(shù)語“主要”是指至少51%直至100%并包括100%，或相對于另一種具有一種的更大的活 性。術(shù)語Dicer包括Dicer樣(DCL)蛋白。Dicer蛋白優(yōu)選參與將雙鏈RNA底物加工成約 21-24個核苷酸長度的siRNA分子。如本文使用的“植物dicer”或植物“dicer樣”蛋白是 具有雙鏈RNA底物上核糖核酸酶活性(核糖核酸酶III活性)的蛋白，其特征在于存在至 少下列結(jié)構(gòu)域=DExD或DExH結(jié)構(gòu)域(DEAD/DEAH結(jié)構(gòu)域)，螺旋酶-C結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選可以是缺 失的Duf283結(jié)構(gòu)域，PAZ結(jié)構(gòu)域，兩個RNAse III結(jié)構(gòu)域和至少一個和優(yōu)選2個dsRB結(jié)構(gòu) 域。螺旋酶C 在廣泛的各種螺旋酶和螺旋酶相關(guān)蛋白中發(fā)現(xiàn)了定義這個蛋白集合的 結(jié)構(gòu)域。其可以不是自主折疊的單元，而是螺旋酶的整體部分(PF00271 ；IPR001650)。PAZ結(jié)構(gòu)域這個結(jié)構(gòu)域因蛋白Piwi Argonaut和Zwille而得名。還在來自擬南 芥的CAF蛋白中發(fā)現(xiàn)了它。該結(jié)構(gòu)域的功能未知，但是在Argonaute蛋白家族的許多成員的 中間區(qū)中發(fā)現(xiàn)了它，其也在其C-末端區(qū)含有Piwi結(jié)構(gòu)域。該家族的幾個成員涉及通過與蛋 白Dicer相關(guān)的RNA-介導(dǎo)的基因抑制機制的干細胞的發(fā)育和保持(PF02170 ；IPR003100)。Duf283:在Dicer蛋白家族的成員中發(fā)現(xiàn)了這個推定結(jié)構(gòu)域。這個蛋白是參與 RNAi和相關(guān)過程的dsRNA核酸酶。這個約100個氨基酸結(jié)構(gòu)域無已知功能，但是確實含有 3個可能的鋅配體(PF03368，IPR005034)。DExD 該家族的成員包括DEAD和DEAH盒螺旋酶。螺旋酶參與將核酸解旋。DEAD 盒螺旋酶參與RNA代謝的各種方面，包括核轉(zhuǎn)錄、pre mRNA剪接、核糖體生物發(fā)生、核胞質(zhì) 運輸、翻譯、RNA腐爛和細胞器基因表達(PF00270，IPR011545)。RNAse III 核糖核酸酶 III 蛋白的標志(PF00636, IPR000999)。DsRB (雙鏈RNA結(jié)合基序)通過HMM_iterative_training搜集的用于種子 (seed)的序列，結(jié)合dsRNA的蛋白共有的推定基序。至少一些DSRM蛋白似乎結(jié)合至特異 性的RNA靶標。由Staufen例示，其在早期果蠅胚胎中參與至少五種不同的mRNA的定位。還有通過人類的干擾素誘導(dǎo)的蛋白激酶，其是對dsRNA的細胞反應(yīng)的一部分(PF00035， IPR001159)。這些結(jié)構(gòu)域可以通過基于計算機的搜索使用例如PR0SITE檔案資料 PD0C50821(PAZ 結(jié)構(gòu)域)，PD0C00448 (RNase III 結(jié)構(gòu)域)，PD0C50137 (dsRB 結(jié)構(gòu)域)和 PD0C00039 (DExD/DexH 結(jié)構(gòu)域)而容易地識別(PR0SITE 可從 www. expasy. ch/prosite 獲 得)?；蛘?，可以使用BLOCKS數(shù)據(jù)庫和算法(blocks, fhcrc. org)鑒定PAZ (IPB003100)或 DUF283 (IPB005034)結(jié)構(gòu)域。其它的數(shù)據(jù)庫和算法也是可以獲得的(pFAM :http //www. sanger. ac. uk/Software/Pfam/INTERPRO :http://www. ebi. ac. uk/interpro/ ；上述的 PF 數(shù)值是指PFAM數(shù)據(jù)庫和算法，IPR數(shù)值是指INTERPRO數(shù)據(jù)庫和算法)。通常，在植物中，DCL2蛋白將雙鏈RNA加工成約22個核苷酸的短干擾RNA分子， DCL3蛋白將雙鏈RNA加工成約24個核苷酸的短干擾RNA分子，DCL4將雙鏈RNA加工成約 21個核苷酸的短干擾RNA分子。DCLl參與從pre_microRNA分子至microRNA的加工。不 將本發(fā)明限制于特定的作用模式，通常認為24個核苷酸長的寡核苷酸介導(dǎo)甲基化和染色 質(zhì)重塑，而21和22個核苷酸長的寡核苷酸通常介導(dǎo)序列特異性的RNA降解(二者均與其 他蛋白和多肽組合)。Dicer樣蛋白在本領(lǐng)域中是熟知的。Dicer樣3酶是那些編碼含有氨基酸序列的 蛋白的酶，所述氨基酸序列相對于含有可按照以下登錄號NP_189978從數(shù)據(jù)庫獲得的氨基 酸序列的蛋白具有至少約60 %或至少約65 %或至少約70 %或至少約75 %或至少約80 %或 至少約85%或至少約90%或至少約95%的序列同一性或?qū)嵸|(zhì)上相同。Dicer樣4蛋白是那些編碼含有氨基酸序列的蛋白的蛋白，所述氨基酸序列相對 于含有可按照以下登錄號AAZ80387 ；P84634從數(shù)據(jù)庫獲得的氨基酸序列的蛋白具有至少 約60 %或65 %或70 %或75 %或80 %或85 %或90 %或95 %的序列同一性或?qū)嵸|(zhì)上相同。Dicer樣2蛋白是那些編碼含有氨基酸序列的蛋白的蛋白，所述氨基酸序列相對 于含有可按照以下登錄號NP_001078101從數(shù)據(jù)庫獲得的氨基酸序列的蛋白具有至少約 60%或65%或70%或75%或80%或85%或90%或95%的序列同一性或?qū)嵸|(zhì)上相同。Dicer樣1蛋白是那些編碼含有氨基酸序列的蛋白的蛋白，所述氨基酸序列相對 于含有可按照以下登錄號Q9SP32從數(shù)據(jù)庫獲得的氨基酸序列的蛋白具有至少約60%或 65 %或70 %或75 %或80 %或85 %或90 %或95 %的序列同一性或?qū)嵸|(zhì)上相同?？梢杂糜跈z測RNAseIII酶活性的酶檢測在例如Lamontagne等人，Mol CellBiol. 2000 February ； 20 (4) 1104-1115中有描述?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域中產(chǎn)生 21-24ntsiRNA的標準方法進一步分析得到的切割產(chǎn)物。為了本發(fā)明的目的，兩個相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”(以百分比表 示)，是指兩個優(yōu)化比對的序列中具有相同殘基(xlOO)的位置數(shù)目除以所比較的位置的總 數(shù)目。空隙(即比對中存在于一個序列而不存在于另一個序列的殘基的位置)被認為是具 有不相同殘基的位置。通過Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)進行 兩個序列的比對。以上的計算機輔助的序列比對可以方便地使用標準軟件程序如GAP(GAP 是 Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin， USA)的一部分)，使用具有空隙產(chǎn)生罰分為50和空隙延伸罰分為3的缺省計分陣距而進 行。當這樣的序列具有至少約75%，特別是至少約80%，更特別是至少約85%，非常特別是約90%，尤其是約95%，更尤其是約100%，更加尤其為相同的序列同一性時，序列被稱為 “實質(zhì)上相似”。然后清楚的是當RNA序列與DNA序列實質(zhì)上相似或具有某種程度的序列 同一性時，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認為與RNA序列中的尿嘧啶(U)等同。因此當本申 請中指明19個連續(xù)核苷酸的序列具有與19個核苷酸的序列至少94%的序列同一性時，這 樣意味第一序列的19個核苷酸中的至少18個與第二序列的19個核苷酸中的18個相同。因此，本發(fā)明提供了減少植物細胞或其他真核細胞(或植物或真核生物)中的靶 核酸表達的方法，該方法通過引入能夠減少存在于真核細胞的一種且相同的靶核酸的表達 的至少兩種抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子中的一種主要通過DCLl或相似的RNAse 切割，而另一種抑制性RNA分子主要通過DCL4或相似的RNAse切割。不限制本發(fā)明，這樣 的方法可以通過將靶向感興趣核酸的microRNA和靶向相同的感興趣核酸的雙鏈發(fā)夾RNA 特別是較長的hpRNA(含有例如至少50，60，90，120，150，300個核苷酸的雙鏈RNA區(qū))引入 一個細胞中而進行。本發(fā)明還提供通過減少植物細胞或其他真核細胞(或植物或真核生物)中的靶核 酸表達的方法，該方法通過引入能夠減少存在于真核細胞的一種且相同的靶核酸的表達的 至少兩種抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子中的一種主要通體DCL3或相似的RNAse切 割，而另一種抑制性RNA分子主要通過DCL4或相似的RNAse切割。不限制本發(fā)明，這樣的 方法可以通過將針對靶基因的調(diào)節(jié)區(qū)(如啟動子區(qū))的抑制性RNA引入一個細胞而進行， 而另一種抑制性RNA針對靶基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)。以另一種方式，這樣的方法可以通過給細胞提 供編碼抑制性RNA的兩個嵌合基因而進行，嵌合基因的表達由依賴DNA的RNA聚合酶II識 別的啟動子所指導(dǎo)，而另一種嵌合基因的表達是由依賴DNA的RNA聚合酶III的啟動子，如 亞型3的啟動子所指導(dǎo)。相似地，本發(fā)明提供抑制性RNA的其他組合如·一種抑制性RNA主要被DCLl或相似的RNAse切割且一種抑制性RNA主要被DCL2 或相似的RNAse切割；·一種抑制性RNA主要被DCLl或相似的RNAse切割且一種抑制性RNA主要被DCL3 或相似的RNAse切割；· 一種抑制性RNA主要被DCL2或相似的RNAse切割且一種抑制性RNA主要被DCL3 或相似的RNAse切割；和· 一種抑制性RNA主要被DCL2或相似的RNAse切割且一種抑制性RNA主要被DCL4 或相似的RNAse切割。如本文使用的，術(shù)語“啟動子”表示在轉(zhuǎn)錄起始過程中被依賴DNA的RNA聚合酶識 別和結(jié)合(直接的或非直接的)的任何DNA。啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點和轉(zhuǎn)錄起始因子的 結(jié)合位點和RNA聚合酶，并可以含有各種其他的基因表達調(diào)節(jié)蛋白可以結(jié)合的位點(例如 增強子)。如本文使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)區(qū)”意思是參與給定DNA序列(如編碼蛋白或多肽的DNA) 的轉(zhuǎn)錄驅(qū)動和轉(zhuǎn)錄時間和水平的控制(即調(diào)節(jié))的任何DNA。例如，5’調(diào)節(jié)區(qū)(或“啟動 子區(qū)”)是定位于編碼序列上游(即5’)的DNA序列并且其包含啟動子和5’非翻譯引導(dǎo) 序列。3’調(diào)節(jié)區(qū)是定位于編碼序列下游(即3’)的DNA序列并且其包含合適的轉(zhuǎn)錄終止 (和/或調(diào)節(jié))信號，包括一個或多個多腺苷酸化信號。
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，啟動子是被RNA聚合酶II識別的啟動子。RNA Pol II啟動子包括最常見的已知啟動子。在本發(fā)明的另一個具體實施方式
中，啟動子是被 RNA聚合酶III識別的啟動子。如本文使用的“被依賴DNA的RNA聚合酶III識別的啟動 子”是通過RNA聚合酶III的聚合酶作用而指導(dǎo)相關(guān)DNA區(qū)的轉(zhuǎn)錄的啟動子。這些包括編 碼5S RNA, tRNA, 7SL RNA, U6snRNA和一些其他小的穩(wěn)定RNA的基因，許多參與RNA加工。 Pol III使用的啟動子多數(shù)需要轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)的+1下游序列元件。但是少數(shù)pol III模板不需 要基因內(nèi)的啟動子元件。這些被稱為3類啟動子。換句話說?！?類Pol III啟動子”是那 些被RNA聚合酶III識別的啟動子并含有所有的順式作用元件，在正常情況下被RNA聚合 酶III轉(zhuǎn)錄的區(qū)域的上游與RNA聚合酶III相互作用。因此這樣的3類Pol III啟動子可 以輕易地在嵌合基因中與異源區(qū)結(jié)合，異源區(qū)如本發(fā)明的dsRNA編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄是需要的。通常，3類Pol III啟動子含有TATA盒(定位于人類TO snRNA基因的-25至-30 之間)和鄰近序列元件(PSE，定位于人類U6 snRNA的-47和-66之間)。其還可以含有遠 端序列元件(DSE，定位于人類U6 snRNA的-214至-244之間)?？梢园l(fā)現(xiàn)3類Pol III啟動子與例如編碼7SL RNA，U3 snRNA和U6 snRNA的基 因結(jié)合。這樣的序列已經(jīng)從擬南芥、水稻和番茄中分離出來，并可以在核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的 下列條目中找到7SL RNA(X72228)的擬南芥基因AT7SL_1、7SLRNA(X72229)的擬南芥基因 AT7SL-2、7SL RNA(AJ290403)的擬南芥基因 AT7SL-3、啤酒花(Humulus lupulus)H17SL-1 基因(AJ236706)、啤酒花 H17SL-2 基因(AJ236704)、啤酒花 H17SL-3 基因(AJ236705)、啤 酒花 H17SL-4 gene (AJ236703)、擬南芥 U6-1 snRNA 基因(X52527)、擬南芥 U6-26 snRNA gene (X52528)、擬南芥U6-29 snRNA基因(X52529)、擬南芥U6-1 snRNA基因(X52527)、玉米 (Zea mays) U3 snRNA基因(Z29641)、馬鈴薯(Solanum tuberosum) U6 snRNA基因(Z17301 ； X60506 ;S83742)、番茄 U6 smal 核 RNA 基因(X51447)、擬南芥 U3C snRNA 基因(X52630)、擬 南芥 U3B snRNA 基因(X52629)、水稻(Oryza sativa) U3 snRNA 啟動子(X79685)，番茄 U3 smal 核 RNA 基因(X14411)、小麥(Triticum aestivum)U3 snRNA 基因(X63065)、小麥 U6 snRNA 基因(X63066)。不言而喻僅需很少量的實驗即可以從其他種類的番茄、水稻或擬南芥或從其他植 物物種分離出變體3類Pol III啟動子?？梢允褂肨O snRNA, U3 snRNA或7SLRNA的編碼 序列(如通過登錄號鑒定的任何上述序列的編碼序列和另外的蠶豆(Vicia faba)U6snRNA 編碼序列(X04788)，U6 snRNA 的玉米 DNA (X52315)或 7SL RNA 的玉米 DNA (X14661))作為 探針從這樣的植物中分離基因組克隆的庫，并且上游序列，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄區(qū)上游約300-400bp 可以被分離并用作3類Pol III啟動子?；蛘撸梢允褂没赑CR的技術(shù)如反向PCR或 TAIL -PCR分離基因組序列(其包括與已知轉(zhuǎn)錄區(qū)相鄰的啟動子序列)。另外，任何相連 的3類Pol III啟動子序列或任何上述啟動子序列(通過其登錄號鑒定的)可以在嚴謹雜 交條件下用作探針或作為信息來源以產(chǎn)生PCR引物以便從其他種類或植物物種中分離相 應(yīng)的啟動子序列。本文使用的“嚴謹雜交條件”意思是如果在探針和靶序列之間有至少95%和優(yōu)選 至少97 %的序列同一性時雜交通常會發(fā)生。嚴謹雜交條件的例子是在含有下列成分的溶液 中孵育過夜50%甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH 7.6)， 5x Denhardt溶液，10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml變性的剪切的載體DNA如鮭魚精子DNA，然后在0. Ix SSC中在約65°C洗滌雜交支持物。其他雜交和洗滌條件是熟知的并在Sambrook 等人，Molecular Cloning :ALaboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY(1989)，特別是第11章中有舉例說明。雖然3類Pol III啟動子不需要定位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的順式作用元件，然而明確的是通 常定位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游的序列可以包括在本發(fā)明的嵌合構(gòu)建體中。還觀察到最初從單子葉植物中分離的3類Pol III啟動子可以在雙子葉和單子葉 植物細胞和植物中都有好的效果，而最初從雙子葉植物中分離的3類Pol III啟動子只在 雙子葉植物細胞和植物中被有效地使用。另外，當使用含有源自相同或緊密相關(guān)的物種的 3類Pol III啟動子的嵌合基因時獲得最有效的基因沉默。通常，Pol III聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的終止子區(qū)由寡dT延伸構(gòu)成，所述延伸是含有 至少4個T殘基，但是顯然可以含有更多T殘基的連續(xù)T殘基的延伸。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，啟動子是組成型啟動子。在本發(fā)明的另一個具 體實施方式中，啟動子的活性通過外部或內(nèi)部刺激(可誘導(dǎo)的啟動子)被增強，所述刺激如 但不限于激素、化學化合物、機械脈沖、無生命或有生命的應(yīng)激條件。還可以以時間或空間 的方式調(diào)節(jié)啟動子的活性(組織特異性啟動子；發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子)。在本發(fā)明的特定具體實施方式
中，啟動子是植物表達的啟動子。如本文使用的， 術(shù)語“植物表達的啟動子”意思是能夠控制(起始)植物細胞中轉(zhuǎn)錄的DNA序列。這包 括植物來源的任何啟動子，但還包括能夠指導(dǎo)植物細胞中轉(zhuǎn)錄的非植物來源的任何啟動 子，即某些病毒或細菌來源的啟動子如CaMV35S (Hapster等人，1988 Mol. Gen. Genet. 212， 182-190)、地下三葉草病毒啟動子No 4或No 7 (W09606932)、或T-DNA基因啟動子但 還有組織特異性或器官特異性的啟動子，包括但不限于種子特異性的啟動子(例如WO 89/03887)、器官原基特異性的啟動子(An等人，1996 The Plant Cell 8，15_30)、莖特 異性啟動子(Keller等人，1988 EMBO J. 7 :3625_3633)、葉特異性啟動子(Hudspeth等 人，1989 Plant Mol Biol 12 :579_589)、葉肉特異性啟動子(如光誘導(dǎo)的Rubisco啟動 子)、根特異性啟動子(Keller等人，1989Genes Devel. 3 :1639_1646)、塊莖特異性啟動 子(Keil等人，1989 EMBO J. 8 1323-1330)、脈管組織特異性啟動子(Peleman等人，1989 Gene 84 :359_369)、雄蕊選擇性啟動子(W0 89/10396，WO 92/13956)、裂開區(qū)特異性啟動 子(W097/13865)等等。本發(fā)明還考慮使用人工或人造的microRNA分子與主要通過不同于microRNA加工 途徑的RNAi加工途徑而加工的抑制性RNA組合。在植物中，這是指與Dicer樣1的RNAse III活性不同的RNAi加工途徑。針對特定靶核酸的人工microRNA分子的產(chǎn)生在本領(lǐng)域中 已經(jīng)很好地建立。如本文使用的，“miRNA”是約20-22個核苷酸長度的RNA分子，其可以被加載至 RISC復(fù)合物上并指導(dǎo)另一種RNA分子的切割，而另一種RNA分子含有與miRNA分子的核苷 酸序列實質(zhì)上互補的核苷酸序列，其中可以發(fā)生一個或多個下列錯配 所述miRNA的5’末端的核苷酸和靶RNA分子中對應(yīng)核苷酸序列之間的錯配； 所述miRNA的位置1至位置9的核苷酸的任一個和靶RNA分子中的對應(yīng)核苷酸 序列之間的錯配； 所述miRNA的位置12至位置21的核苷酸的任一個和靶RNA分子中的對應(yīng)核苷酸序列之間的三個錯配，只要沒有兩個以上連續(xù)的錯配；· miRNA的位置10和11上不允許錯配(標明了所有的miRNA位置，從miRNA分 子的5’末端開始)。從“pre-miRNA”分子通過蛋白如存在于任何植物細胞中的DCL蛋白加工miRNA，并 加載至RISC復(fù)合物上，在那里miRNA可以指導(dǎo)靶RNA分子的切割。通常從pri-microRNA分子(原始轉(zhuǎn)錄本)加工pre_microRNA分子。在動物中， 通過埋入原始轉(zhuǎn)錄本的莖環(huán)的精確切割而由Drosha-DGCR8復(fù)合物起始microRNA的成熟。 pre-microRNA側(cè)翼的單鏈RNA段對于將pri_miRNA加工成pre-miRNA是重要的。切割位 點似乎是通過距離莖-ssRNA連接點的距離確定的(Han等人2006，Cell 125,887-901, 887-901)。如本文使用的，“pre-miRNA”分子是約100至200個核苷酸的RNA分子，優(yōu)選為約 100至約130個核苷酸，其可以采用包含雙鏈RNA莖和單鏈RNA環(huán)的二級結(jié)構(gòu)并進一步包 含位于雙鏈RNA莖中的miRNA的核苷酸序列(和其互補序列)。優(yōu)選地，miRNA和其互補 物定位于距離miRNA雙鏈RNA莖的自由末端約10至約20個核苷酸。單鏈環(huán)區(qū)的長度和序 列不重要，并可以有相當大的變化，例如在30至50nt的長度之間。優(yōu)選地，非配對和配對 的RNA結(jié)構(gòu)之間的自由能差異為-20至-60kcal/mol之間，特別為約_40kcal/mol。miRNA 和miRNA*之間的互補性不需要是完全的，并且可以容忍非配對核苷酸的約1至3個凸出。 可以通過本領(lǐng)域中常規(guī)的計算機算法如mFOLD預(yù)測RNA分子所采用的二級結(jié)構(gòu)。通過5’ 末端的互補程度測定來自通過DCL活性釋放的并加載至RISC復(fù)合物的pre-miRNA的雙鏈 RNA莖的特定鏈，其中在5’末端最少參與被切割的dsRNA莖的不同鏈的核苷酸之間的氫鍵 的鏈被加載至RISC復(fù)合物上并決定靶RNA分子降解的序列特異性。但是，如果根據(jù)經(jīng)驗來 自特定合成pre-miRNA分子的miRNA分子是無功能的(引物在RSIC復(fù)合物上加載了“錯誤 的”鏈)，立即明確的是這個問題可以通過交換pre-miRNA分子的dsRNA莖的各自的鏈上的 miRNA分子和其互補物的位置而解決。如在本領(lǐng)域中已知的，涉及兩個氫鍵的A和U或涉及 兩個氫鍵的G和U之間的結(jié)合比涉及三個氫鍵的G和C之間的結(jié)合弱。天然存在的miRNA分子可以包含于其天然存在的pre-miRNA分子內(nèi)，但是也可以 被引入已有的pre-miRNA分子骨架(通過將通常從這樣的已有的pre-miRNA分子加工而來 的miRNA的核苷酸序列替換為另一種感興趣的miRNA的核苷酸序列)。pre-miRNA的骨架 也可以是完全合成的。同樣，合成的miRNA分子可以包含于或從已有的pre-miRNA分子骨 架或合成的pre-miRNA骨架加工。有趣的是，已經(jīng)觀察到一些pre-miRNA骨架因為其被正 確加工成設(shè)計的microRNA的效率而相對于其它的骨架是優(yōu)選的，特別是當被表達為嵌合 基因時，其中除了 pre-microRNA以外，其它DNA區(qū)(如非翻譯引導(dǎo)序列或轉(zhuǎn)錄終止和多腺 苷酸化區(qū))被并入原始轉(zhuǎn)錄本中。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有pre-microRNA和其它或多或少互 補區(qū)的原始轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄可以干擾原始轉(zhuǎn)錄本至pre-microRNA和最終至設(shè)計的microRNA 的正確加工。其它pre-microRNA骨架，如例如pre_microRNA398，可能對于這樣的不正確加 工傾向性較低一些?？梢灶A(yù)見的是在總的大多是雙鏈RNA的區(qū)中的pre-miRNA分子的切割 位點的特定固定位置上的一個或多個未組織的單鏈區(qū)的存在影響設(shè)計的pre-miRNA分子 的正確加工并引起一些事實相對于例如來自原始轉(zhuǎn)錄本的源自pre-miR171骨架的加工 來說，例如來自原始轉(zhuǎn)錄本的源自pre-miR398骨架的加工較小傾向于錯誤。
技術(shù)人員立即明確的是額外序列的存在可以對原始轉(zhuǎn)錄RNA分子折疊成二級RNA 結(jié)構(gòu)有影響，特別是對于突出或單鏈RNA結(jié)構(gòu)(否則的話是位于雙鏈RNA莖(sub)結(jié)構(gòu)中) 的存在和定位。應(yīng)該小心地保持單鏈RNA或凸出結(jié)構(gòu)相對于pre-miRNA的位置，即核苷酸 的距離。特定RNA核苷酸序列的二級RNA結(jié)構(gòu)可以容易地使用本領(lǐng)域中熟知的軟件工具和 算法如 MFOLD(Zucker 等人 2003Nucleic Acids Research 31,3406-3415)來預(yù)測。另外， 本領(lǐng)域完全存在這樣的技術(shù)通過在核苷酸序列中置換核苷酸而設(shè)計或修飾核苷酸，從而 新形成的核苷酸顯示對核苷酸序列的另一部分的或多或少的互補性并以這種方式影響雙 鏈RNA莖或單鏈RNA凸出的產(chǎn)生。本發(fā)明的另一個目的是提供含有根據(jù)本發(fā)明的抑制性RNA分子的組合的宿主細 胞、植物細胞、非人類真核生物和植物。通過傳統(tǒng)培育方法產(chǎn)生的含有本發(fā)明的抑制性RNA 分子的組合的配子、種子、胚胎(合子胚或體細胞胚)、后代或植物的雜交體也包括在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。如本文使用的，“人工引入的dsRNA分子”是指直接引入dsRNA分子，其可以例如通 過從編碼這樣的dsRNA分子的嵌合基因轉(zhuǎn)錄而外源性或內(nèi)源性發(fā)生，但是不指在真核細胞 或植物細胞內(nèi)部將單鏈RNA分子轉(zhuǎn)變成dsRNA。本文描述的方法和手段被認為適于所有的植物細胞和植物、裸子植物和被子植 物，雙子葉和單子葉植物細胞和植物，包括但不限于擬南芥，苜蓿，大麥，大豆，玉米(corn) 或玉米(maize)，棉花，亞麻，燕麥，豌豆，油菜(rape)，水稻，黑麥，紅花，高粱，大豆，向日 葵，煙草和其他煙草品種，包括煙草(Nicotianabenthamiana)，小麥，蘆筍，甜菜，花椰菜， 白菜，胡蘿卜，菜花，芹菜，黃瓜，茄子，生菜，洋蔥，油菜(oilseed rape)，辣椒，馬鈴薯，南 瓜(pumpkin)，蘿卜，菠菜，南瓜(squash)，番茄，西葫蘆，杏(almond)，蘋果，杏(apricot)， 香蕉，黑莓，藍莓，可可，櫻桃，椰子，蔓越莓，海棗，葡萄，柚子，番石槽，稱猴桃，梓檬，酸 橙，芒果，甜瓜，油桃，橙子，木瓜，百香果，桃子，花生，梨，菠蘿，開心果，李子，樹莓，草莓， 橘子，核桃，西瓜，蕓苔屬(Brassica)蔬菜，甘蔗，蔬菜(包括菊苣，生菜，番茄)，浮萍科 (Lemnaceae)(包括來自浮萍屬(Lemna)，Wolffiella 屬，紫萍屬(Spirodela), Landoltia 屬，無根萍屬(Wolffia)的物種)和甜菜。還相信根據(jù)本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于其它真核細胞。因此真核生物還可以是真 菌、酵母或霉菌或動物如人類、哺乳動物、魚、牛、山羊、豬、綿羊、嚙齒動物、倉鼠，小鼠，大 鼠，豚鼠，兔子，靈長類動物，線蟲，貝類，奸，蟹，龍奸，昆蟲，果蠅，鞘翅類昆蟲，雙翅目昆蟲， 鱗翅目昆蟲和同翅類昆蟲。細胞可以處于生物中或源自該生物。細胞可以在細胞培養(yǎng)物中 或在體外的組織或器官中。在優(yōu)選的具體實施方式
中，如果細胞是人類細胞或如果細胞是 動物細胞(包括人類細胞)，則細胞是在培養(yǎng)物中。細胞可以是體細胞、干細胞、造血細胞、 神經(jīng)細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、癌細胞、永生細胞系的細胞或是被病毒感染的或能夠被 病毒感染的細胞。細胞可以是肝細胞、心細胞、腎細胞、大腦細胞、眼細胞、神經(jīng)細胞、皮膚細 胞、肌肉細胞、骨細胞或其它源自人類或其它動物體的細胞?？梢酝ㄟ^各種方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、微彈轟擊、 顯微注射至核等實現(xiàn)將嵌合基因(或RNA分子)引入宿主細胞。將嵌合基因引入植物細胞的方法在本領(lǐng)域中是熟知的并包括農(nóng)桿菌 (Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、粒子槍遞送、顯微注射、完整細胞的電穿孔、聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體的電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、硅須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等。然后可以將以 這種方法獲得的轉(zhuǎn)化細胞再生為成熟的能繁殖的植物?？梢酝ㄟ^將嵌合基因注射進入受精的卵母細胞的前核，通過移植細胞，優(yōu)選移植 未分化的細胞進入發(fā)育中的胚胎而產(chǎn)生嵌合胚胎，移植重組細胞的核進入去核的胚胎或活 化的卵母細胞等而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法在本領(lǐng)域已經(jīng)很好地建 立，包括美國專利 4，873，191 ；Rudolph 等人 1999 (TrendsBiotechnology 17 :367_374)； Dalrymple 等人(1998) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 15 33-49 ；Colman (1998) Bioch. Soc. Symp. 63 141-147 ；Wilmut 等人(1997)Nature 385 :810_813 ；Wilmut 等人(1998)Reprod. Fertil. Dev. 10 639-643 ；Perry 等人(1993)Transgenic Res. 2125-133；Hogan 等人 Manipulating the Mouse Embryo,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory press,1994 及其組中引用的參考文獻。通過傳統(tǒng)培育方法產(chǎn)生的含有本發(fā)明的嵌合基因的配子、種子、胚胎、后代、植物 或動物的雜交體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除非另有說明，如本文使用的“感興趣的基因的核苷酸序列”通常是指在序列上對 應(yīng)于從這樣感興趣的基因轉(zhuǎn)錄而來的RNA的核苷酸序列的DNA鏈的核苷酸序列。明確的是上述方法可以在體內(nèi)或體外應(yīng)用于真核細胞。另外，當本文所述的方法 應(yīng)用于動物或人類時，可以包括治療、診斷和非治療和非診斷方法。人工核酸的組合如本文 所描述的抑制性RNA分子的組合也可以用作上述治療方法的目的的藥物。因此，本發(fā)明還 提供了一種含有至少兩種本文定義的抑制性RNA分子的組合物，以及含有這樣的核酸組合 的試劑盒以作為組合的制備物而用于治療方法中的同時、單獨或相繼的應(yīng)用。下列非限制性實施例描述了根據(jù)本發(fā)明的方法和手段。除非另有說明，否則在實 施例中，所有的重組DNA技術(shù)根據(jù) Sambrook等人(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 禾口 Ausubel 等 人(1994)Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA 的卷 1 和卷2所述的標準規(guī)程進行。植物分子工作的標準材料和方法在由BIOS科學出版有限 公司(UK)和Blackwell科學出版社(UK)聯(lián)合出版的R. D. D. Croy的Plant Molecular Biology Labfax (1993)中有描述。其它標準分子生物學技術(shù)的參考文獻包括Sambrook和 Russell (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, ThirdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,Brown(1998)Molecular BiologyLabFax, Second Edition, Academic Press (UK)的卷I和卷II。聚合酶鏈式反應(yīng)的標準材料和方法見于Dieffenbach 禾口 Dveksler(1995)PCR Primer :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and in McPherson at al. (2000)PCR-Basics :From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany。實施例實施例1 針對報告基因的Pol II轉(zhuǎn)錄的和Pol III轉(zhuǎn)錄的嵌合基因的組合為了測試含有從被RNA聚合酶II (例如CaMV35S啟動子)識別的啟動子表達一個 的和從被RNA聚合酶III (例如AtTO啟動子)識別的啟動子表達的另一個的編碼hpRNA的 轉(zhuǎn)基因的組合是否將增加靶基因的沉默的效應(yīng)，在含有編碼35S-或AtTO-PDShp42抑制性 RNA的轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬植物之間雜交，并且鑒定同時含有兩種轉(zhuǎn)基因的后代植物，將PDS靶基因的沉默程度與只含有一種轉(zhuǎn)基因的植物比較。以相似的方式，在表達35S驅(qū)動的或 AtU3驅(qū)動的GUS hpRNA轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬植物之間進行雜交以比較與單一轉(zhuǎn)基因相比的 組合的效應(yīng)。a)嵌合基因含有35S或AtTO指導(dǎo)的PDShp42和35S或AtU3指導(dǎo)的hp⑶S轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因的 轉(zhuǎn)基因擬南芥系已經(jīng)在WO 2004/073390中有詳細描述(并入本文作為參考；特別參見實施 例2和實施例5)。簡單地說，為了產(chǎn)生PDShp42嵌合基因，將寡核苷酸退火產(chǎn)生雙鏈DNA片段，當被 轉(zhuǎn)錄時，雙鏈DNA片段將產(chǎn)生具有自我互補(互補正義和反義區(qū)，每個為42個核苷酸)的 RNA轉(zhuǎn)錄本，以致在折疊時轉(zhuǎn)錄本具有通過9nt單鏈環(huán)連接的42個連續(xù)堿基對的雙鏈(雙 的)區(qū)。正義區(qū)的核苷酸序列對應(yīng)于擬南芥屬的八氫番茄紅素去飽和酶基因的部分序列 (AT4G14210. 2 的 1570 至 1611 位核苷酸，可以從 http://www. arabidopsis. org/servlets/ TairObject ？ type = locus&name = AT4G14210獲得)并且反義區(qū)對應(yīng)于42個核苷酸的 互補物。將DNA片段可操作地連接至CaMV35S啟動子序列和章魚堿合成酶3’末端區(qū)(轉(zhuǎn) 錄終止/多腺苷酸化信號)或連接至擬南芥的TO小RNA基因的啟動子和能夠作為Pol III 類啟動子的轉(zhuǎn)錄終止子起作用的寡dT序列(8T’s)。當將沉默構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至擬南芥時，內(nèi) 源PDS基因的表達的有效下調(diào)產(chǎn)生顯示光漂白作用的葉子(參見例如圖1B)。光漂白作用 的程度是基因沉默程度的指征，因此是沉默構(gòu)建體的有效性的指征。為了產(chǎn)生編碼⑶Shp92的嵌合基因，合成了⑶S倒轉(zhuǎn)重復(fù)DNA序列，其含有對應(yīng)于 ⑶S基因的正義序列(⑶S ORFWnt 512-697)的186個核苷酸，在3，末端與對應(yīng)于186nt 片段的最初93個核苷酸(⑶S ORF的512-604核苷酸)的反義序列融合。因此⑶S倒轉(zhuǎn)重 復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有互補的正義和反義區(qū)的RNA，能夠雜交形成93個堿基對的由單鏈環(huán) 連接的雙鏈區(qū)域。這個倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列或者可操作地連接至CaMV35S啟動子序列和章魚堿合 成酶3’末端區(qū)，或者連接至擬南芥的U3小RNA基因的啟動子和用于轉(zhuǎn)錄終止的寡dT序列 (9T’ s)，或者連接至擬南芥的TO小RNA基因的啟動子和寡dT序列。當被轉(zhuǎn)移至含有作為 靶基因的CaMV35S-GUS轉(zhuǎn)基因的擬南芥時，使用常規(guī)⑶S分析以MUG作為底物測定通過編 碼嵌合基因的抑制性RNA或其組合對GUS基因的下調(diào)的效率。b) Northern 分析Northern blot分析顯示從兩種類型的⑶Shp93轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的hpRNA被差別地加 工成轉(zhuǎn)基因植物中的較短形式(圖2)。35S系主要顯示21nt種類(圖2，圖板A泳道1_6， 圖板B泳道1，2，4，6)而TO系顯示24nt和/或22nt種類(圖2，圖板A7-22，圖板B 8,9, 10，11，12，15-18和22)。另外，在中間體RNA加工種類模式中可以看到有差別。35S-GUShp93 系顯示主要是對應(yīng)于⑶Shp93RNA環(huán)的 90nt的RNA種類，而TO_GUShp93系中主要的片段 是全長 GUShp93RNA。相似的，Northern blot分析顯示從兩種類型的PDShp42轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的hpRNA也 被差異性地加工成較短形式(圖1A)。確實，泳道1-6 (對應(yīng)于含有35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基 因的植物)顯示既有24nt又有21nt長的siRNA種類，而泳道7_12 (對應(yīng)于含有U6啟動子 驅(qū)動的PDShp42轉(zhuǎn)基因的植物)則只顯示24nt種類。另外，在中間體RNA加工種類模式中 可以看到有差別。
總之，這些結(jié)果表明TO和35S轉(zhuǎn)錄的hpRNA是被差異性加工的，主要是通過依賴 于DCL3和/或DCL2的加工途徑加工U6驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄本(如果不是全部的話)，而35S驅(qū)動 的轉(zhuǎn)錄本主要通過DCL4和/或DCL3途徑加工。這還表明觀察到的35S-和AtTO_hpRNA指 導(dǎo)的沉默通過不同的途徑起作用。因此分析植物以確定兩種類型的構(gòu)建體的組合是否將提 供程度上和/或持續(xù)時間上和/或穩(wěn)定性上的改善的沉默。c)同時含有兩種類型的hp轉(zhuǎn)基因的植物的表型分析。將含有35S_PDShp42轉(zhuǎn)基因的雜合親代植物(雄性)與AtTO_PDShp42轉(zhuǎn)基因的 雜合親代植物(雌性)雜交，獲得同時含有兩種轉(zhuǎn)基因的Fl后子代植物并與含有一個或另 一個轉(zhuǎn)基因的親代植物相比。 基于葉子漂白的強度，來自至少四個雜交的Fl植物顯示與親代TO系相比的更大 程度的PDS基因沉默(圖1B)。以相似的方式，將含有35S_GUShp93轉(zhuǎn)基因的植物與含有AtTO_GUShp93或 AtU3-GUShp93的轉(zhuǎn)基因的植物雜交并獲得同時含有兩種轉(zhuǎn)基因的后代。通過PCR從35S-和 AtU3/AtU6-指導(dǎo)的⑶Shp93系之間的雜交中鑒定出Fl種群自交產(chǎn)生的F2系，其含有單獨 的35S-或Pol III-指導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因或同時含有這兩種類型的轉(zhuǎn)基因。F2系對于編碼抑制性 RNA的基因是純合的或雜合的(分開的)。雖然本實驗不能排除拷貝數(shù)效應(yīng)，但是可以通過 分析足夠的系而確定沉默的平均程度。
因此分析含有單獨轉(zhuǎn)基因或其組合的不同轉(zhuǎn)基因植物的GUS表達。來自一個雜交 (479-AX 488-6)的F3植物的分析顯示這些植物似乎比那些只含有一種轉(zhuǎn)基因的植物具有 更均衡的沉默。圖3中圖解表示了來自35S-GUShp93x U6-GUShp93雜交的不同F(xiàn)3植物的 MUG分析的結(jié)果。Pol II和Pol III轉(zhuǎn)錄本使用的加工途徑的差別顯然不僅涉及使用的不同的啟 動子一Pol III啟動子優(yōu)先在核的核仁區(qū)有活性，而Pol II啟動子在核的其它區(qū)有活 性——還涉及轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。Pol II轉(zhuǎn)錄本還含有源自35S啟動子(用于制作構(gòu)建體) 的轉(zhuǎn)錄的5’引導(dǎo)部分，以及由所使用的0CS 3’終止子的轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的3’ UTR區(qū)，和polyA 尾。這些額外的5’和3’序列總計為35S構(gòu)建體產(chǎn)生的Pol III轉(zhuǎn)錄本的200-300nt。相 反，制作的U6構(gòu)建體表達含有發(fā)夾部分(雙鏈區(qū)加單鏈環(huán))的轉(zhuǎn)錄本，具有額外的約20nt 的5’區(qū)域，但無任何polyA尾。因此，Pol II和Pol III轉(zhuǎn)錄本將折疊成十分不同的結(jié)構(gòu)。 認為RNA轉(zhuǎn)錄本在轉(zhuǎn)錄后通過雙鏈RNA結(jié)合蛋白(DRBP)被迅速結(jié)合，不同的轉(zhuǎn)錄本可以被 不同的DRBP結(jié)合，引起差異性接近DCL蛋白并整合進入不同類型的RISC復(fù)合物。這相應(yīng) 地預(yù)期引起對轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)的不同貢獻。涉及啟動子區(qū)的特別的甲基化和PTGS。認 為Pol III驅(qū)動的產(chǎn)生對應(yīng)于啟動子區(qū)的24體的轉(zhuǎn)錄本在介導(dǎo)TGS中特別有效。實施例2 針對PHYB內(nèi)源性基因的microRNA和hpRNA的組合使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，按順序可操作地連接下列DNA區(qū)而構(gòu)建編碼針對擬南芥 的植物色素B編碼區(qū)的抑制性hpRNA的第一嵌合基因啟動子區(qū)、當被轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生正義RNA 分子的DNA區(qū)(其對應(yīng)于登錄號EF193580的789位核苷酸至809位核苷酸的PHYB編碼區(qū) 的序列)、與正義RNA分子互補的反義RNA分子和3’末端區(qū)。使用常規(guī)重組DNA技術(shù)構(gòu)建了含有編碼pri-microRNA miR159骨架的轉(zhuǎn) 錄區(qū)的第二嵌合基因，其中將microRNA適應(yīng)為含有來自PHYB編碼區(qū)的核苷酸序列 (TTATAAGTTTCATGAAGATGA)并且在microRNA*區(qū)制造相應(yīng)的改變。將pre-microRNA的編碼 區(qū)可操作地與植物表達的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)連接。將嵌合基因分別引入伴有選擇性標記的T-DNA載體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，其 含有嵌合基因的任一種(圖ZZ)。也通過雜交最初的轉(zhuǎn)化體而產(chǎn)生同時含有兩種嵌合基因 的轉(zhuǎn)基因Fl植物。然后將這些植物自交以產(chǎn)生將用于沉默程度分析的F2種子。沉默的程 度可以通過測定白光下種子中長出的苗的胚軸長度而確定。胚軸越長，PHYB基因沉默的程 度越強，因為PHYB是白光下胚軸延伸的抑制物。同時含有兩種轉(zhuǎn)基因的植物顯示比單獨含有每個轉(zhuǎn)基因的植物更高程度的PHYB基因的沉默。實施例3 針對EIN2啟動子區(qū)的正義RNA和針對EIN2編碼區(qū)和啟動子的hpRNA的
組合為了檢查編碼正義RNA和編碼hpRNA的轉(zhuǎn)基因的共表達是否可以誘導(dǎo)比單獨的每 個構(gòu)建體更強的啟動子沉默(TS)，產(chǎn)生了兩個構(gòu)建體。兩者都靶向擬南芥EIN2基因的啟動 子區(qū)，但是hpRNA構(gòu)建體進一步含有雙鏈部分中EIN2基因的部分轉(zhuǎn)錄區(qū)。將含有hpRNA啟 動子構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物與含有正義啟動子構(gòu)建體的植物雜交。通過與親代系的比較而分 析F2種群的EIN2的沉默程度。結(jié)果表明靶向EIN2啟動子區(qū)的正義-和hpRNA_EIN2轉(zhuǎn)基 因產(chǎn)生比單獨的編碼hpRNA或編碼正義RNA的轉(zhuǎn)基因更強的沉默(圖2)。a)嵌合基因使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)構(gòu)建編碼針對EIN2基因啟動子的正義RNA的第一嵌合 基因，其含有下列可操作地連接的DNA區(qū)啟動子區(qū)、當被轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生對應(yīng)于EIN2基因(登 錄號AF141202)的全長序列的nt 1-1217的RNA分子的DNA區(qū)——包括部分啟動子區(qū)( SlObp)——和章魚堿合成酶基因的3，末端區(qū)。構(gòu)建編碼針對EIN2基因啟動子的發(fā)夾RNA的第二嵌合基因，其含有下列可操作 地連接的DNA區(qū)啟動子區(qū)、當被轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生對應(yīng)于EIN2基因序列(從核苷酸1至核苷酸 1217)的正義RNA分子的DNA區(qū)(其包括部分啟動子區(qū)和部分轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū))和與正義RNA 分子互補的反義RNA分子，以及0CS 3’末端區(qū)。將嵌合基因插入伴有選擇性標記基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶或潮霉素轉(zhuǎn)移酶)的 T-DNA載體，并且產(chǎn)生含有嵌合基因的轉(zhuǎn)基因的擬南芥植物。b)表型分析通過使含有轉(zhuǎn)基因中任一種或兩種組合的轉(zhuǎn)基因種子在黑暗中在含有ACC(氨 基-環(huán)丙烷-1-羧酸)的培養(yǎng)基上發(fā)芽而分析EIN2表達的沉默。圖4B中表明了這個分析 的結(jié)果，其表明當與親代系中獲得的沉默比較時，在某些正義XhpRNA的雜交中EIN2沉默 的程度增強了。c) Northern 分析對從轉(zhuǎn)基因植物中分離的小RNA的Northern blot分析顯示當靶向EIN2啟動子 的構(gòu)建體存在時siRNA積累(圖4A)，這表明EIN2啟動子構(gòu)建體被正確地制作并正確地表 達。有趣的是，在所分析的四組正義、hpRNA和正義XhpRNA系中的兩組中，正義XhpRNA雜 交(hp-2Xs-2和hp-3Xs-3，用箭頭表示)似乎比其對應(yīng)的正義(s)和hpRNA (hp)親代系 積累更多的siRNA(圖4A)。這與顯示于圖4B的EIN2沉默的表型結(jié)果是一致的，其中EIN2 的沉默在某些產(chǎn)生于正義XhpRNA雜交的子代植物中增強。hpRNA和正義組合策略的可能改進是使用不同的啟動子分別驅(qū)動hpRNA和正義轉(zhuǎn) 基因的表達。這可以使轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄沉默最小化如果相同的啟動子用于兩種轉(zhuǎn)基因，則很 可能發(fā)生轉(zhuǎn)錄沉默。本申請要求歐洲申請?zhí)?7015956. 1和美國臨時申請?zhí)?1/013604的優(yōu)先權(quán)，其全 部內(nèi)容并入本文作為參考。本文討論和/或參考的所有出版物的全部內(nèi)容并入本文。
權(quán)利要求
一種減少真核細胞或生物中靶核酸的表達的方法，其包括下列步驟引入每種能夠減少所述真核細胞或生物中第一靶核酸的表達的至少兩種抑制性RNA分子的組合，其中所述抑制性RNA分子主要通過細胞或生物中不同的RNAi分子加工途徑被加工成為21至24個核苷酸長度的寡核苷酸。
2.一種減少真核細胞或生物中第一和第二靶核酸的表達的方法，其包括下列步驟引 入至少兩種抑制性RNA分子的組合，其中所述抑制性RNA分子的一種能夠減少所述真核細 胞或生物中第一靶核酸的表達，所述抑制性RNA分子的另一種能夠減少所述真核細胞或生 物中第二靶核酸的表達，并且其中所述抑制性RNA分子主要通過細胞或生物中不同的RNAi 分子加工途徑被加工成長度為21至24個核苷酸的寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中兩種抑制性RNA分子靶向第一靶核酸的相同 區(qū)、重疊區(qū)或非重疊區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中兩種抑制性RNA分子不共價結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其中從不同的啟動子，如依賴PolII和Pol III的啟動子表達兩種抑制性RNA分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的方法，其中主要通過不同的dicer或Dicer樣蛋白將所 述抑制性RNA分子切割成21至24個核苷酸長度的寡核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的方法，其中所述真核細胞是植物細胞或所述真核 生物是植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的方法，其中所述真核細胞是動物細胞或所述真核 生物是動物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一種主要通過 DCLl或具有相似功能和特異性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過 DCL4或具有相似功能和特異性的RNAse被切割。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一種主要通 過DCL3或具有相似功能和特異性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過 DCL4或具有相似功能和特異性的RNAse被切割。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一種主要通 過DCLl或具有相似功能和特異性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過 DCL2或具有相似功能和特異性的RNAse被切割。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一種主要通 過DCLl或具有相似功能和特異性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過 DCL3或具有相似功能和特異性的RNAse被切割。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一種主要通 過DCL2或具有相似功能和特異性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過 DCL3或具有相似功能和特異性的RNAse被切割。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一種主要通 過DCL2或具有相似功能和特異性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過 DCL4或具有相似功能和特異性的RNAse被切割。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項所述的方法，其中所述抑制性RNA分子中的一種是能夠減少第一靶核酸的表達的miRNA分子、pre-microRNA分子或pri-miRNA分子，其中所述另 一種抑制性RNA分子是含有互補的或?qū)嵸|(zhì)上互補的第一和第二 RNA區(qū)的雙鏈RNA分子，所 述第一 RNA區(qū)含有對應(yīng)于第一或第二靶核酸的核苷酸序列的至少19個連續(xù)核苷酸，并且所 述第二 RNA區(qū)含有對應(yīng)于與第一或第二靶核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的至少19 個連續(xù)核苷酸，其中所述第一和第二 RNA區(qū)彼此雜交至少18或19個堿基對。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一種含有來 自所述靶核酸分子的啟動子區(qū)的至少19個連續(xù)核苷酸，所述另一種抑制性RNA分子含有來 自被轉(zhuǎn)錄成RNA分子的所述靶核酸分子區(qū)的至少19個連續(xù)核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項所述的方法，其中從引入所述真核細胞的編碼抑制性 RNA的基因轉(zhuǎn)錄所述抑制性RNA分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在RNA聚合酶II識別的啟動子的控制下從編碼 抑制性RNA的基因轉(zhuǎn)錄所述抑制性RNA分子的一種，并且在RNA聚合酶III識別的啟動子 的控制下從編碼抑制性RNA的基因轉(zhuǎn)錄所述另一種抑制性RNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18任一項所述的方法，其中所述靶核酸是病毒核酸或基因或其 轉(zhuǎn)錄區(qū)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項所述的方法，其中所述靶核酸是轉(zhuǎn)基因或其區(qū)域。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至18任一項所述的方法，其中所述靶核酸是細胞中的內(nèi)源性基因、 其啟動子、其轉(zhuǎn)錄本或其區(qū)域。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21任一項所述的方法，其中相對于所述真核細胞或生物中單獨 的任一種抑制性RNA分子來說，兩種抑制性RNA分子的組合減少第一靶核酸的表達至更大 的程度。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的方法，其中相對于所述真核細胞或生物中的單 獨的任一種抑制性RNA分子來說，兩種抑制性RNA分子的組合更穩(wěn)定地減少第一靶核酸的表達。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23任一項所述的方法，其中相對于所述真核細胞或生物中存在 單獨任一種抑制性RNA分子時的靶核酸的減少來說，兩種抑制性RNA分子的組合對第一靶 核酸的表達的減少對外部因素敏感性較低。
25.一種真核細胞，其含有能夠減少所述真核細胞中第一靶核酸表達的至少兩種抑制 性RNA分子，其中所述抑制性RNA分子通過細胞中不同的RNAi分子加工途徑被加工成21 至24個核苷酸長度的寡核苷酸。
26.一種真核細胞，其含有能夠減少所述真核細胞中第一和第二靶核酸的表達的至少 兩種抑制性RNA分子，其中所述抑制性RNA分子的一種能夠減少所述真核細胞或生物中第 一靶核酸的表達，所述抑制性RNA分子的另一種能夠減少所述真核細胞或生物中第二靶核 酸的表達，其中所述抑制性RNA分子通過細胞中不同的RNAi分子加工途徑被加工成21至 24個核苷酸長度的寡核苷酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的細胞，其中兩種抑制性RNA分子靶向第一靶核酸的相 同區(qū)、重疊區(qū)或非重疊區(qū)。
28.根據(jù)權(quán)利要求25至27任一項所述的細胞，其中兩種抑制性RNA分子不共價結(jié)合。
29.根據(jù)權(quán)利要求25至28任一項所述的細胞，其中從不同的啟動子例如依賴PolII和Pol III的啟動子表達兩種抑制性RNA分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求18所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子主要通過不同的 dicer或Dicer樣蛋白被切割成21至24個核苷酸長度的寡核苷酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項所述的真核細胞，其在植物中。
32.根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項所述的真核細胞，其在動物中。
33.根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子的一種主 要通過DCLl或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過DCL4或相似 的RNAse被切割。
34.根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子主要通過 DCL3或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過DCL4或相似的RNAse 被切割。
35.根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子主要通過 DCLl或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過DCL2或相似的RNAse 被切割。
36.根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子主要通過 DCLl或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過DCL3或相似的RNAse 被切割。
37.根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子主要通過 DCL2或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過DCL3或相似的RNAse 被切割。
38.根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子主要通過 DCL2或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一種主要通過DCL4或相似的RNAse 被切割。
39.根據(jù)權(quán)利要求25至38任一項所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子的一種 是能夠減少所述靶核酸的表達的miRNA分子、pre-microRNA分子或pri_miRNA分子，其中 所述另一種抑制性RNA分子是含有互補的或?qū)嵸|(zhì)上互補的第一和第二 RNA區(qū)的雙鏈RNA分 子，所述第一 RNA區(qū)含有對應(yīng)于第一或第二靶核酸的核苷酸序列的至少19個連續(xù)核苷酸， 并且所述第二 RNA區(qū)含有對應(yīng)于與第一或第二靶核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的 至少19個連續(xù)核苷酸，其中所述第一和第二 RNA區(qū)彼此雜交至少18或19個堿基對。
40.根據(jù)權(quán)利要求25至38任一項所述的真核細胞，其中所述抑制性RNA分子的一種 含有來自所述靶核酸分子的啟動子區(qū)的至少19個連續(xù)核苷酸，并且所述另一種抑制性RNA 分子含有來自被轉(zhuǎn)錄成RNA分子的所述靶核酸分子區(qū)的至少19個連續(xù)核苷酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求25至40任一項所述的真核細胞，其中從引入所述真核細胞的編碼抑 制性RNA的基因轉(zhuǎn)錄所述抑制性RNA分子。
42.根據(jù)權(quán)利要求25至41任一項所述的真核細胞，其中在RNA聚合酶II識別的啟動 子控制下從編碼抑制性RNA的基因轉(zhuǎn)錄所述抑制性RNA分子的一種，并且在RNA聚合酶III 識別的啟動子控制下從編碼抑制性RNA的基因轉(zhuǎn)錄所述另一種抑制性RNA。
43.根據(jù)權(quán)利要求25至42任一項所述的真核細胞，其中所述靶核酸是病毒核酸或基因 或其轉(zhuǎn)錄區(qū)。
44.根據(jù)權(quán)利要求25至42任一項所述的真核細胞，其中所述靶核酸是轉(zhuǎn)基因或其區(qū)域。
45.根據(jù)權(quán)利要求18至34任一項所述的真核細胞，其中所述靶核酸是細胞中的內(nèi)源性 基因，其啟動子其轉(zhuǎn)錄本或其區(qū)域。
46.一種非人類真核生物，其實質(zhì)上或完全由根據(jù)權(quán)利要求25至45任一項所述的細胞 組成。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的非人類真核生物，其中相對于所述真核生物中所述真核細 胞或生物中的單獨任一種抑制性RNA分子來說，兩種抑制性RNA分子的組合減少第一靶核 酸的表達至更大的程度。
48.根據(jù)權(quán)利要求38所述的非人類真核生物，其中相對于所述真核生物中的單獨任一 種抑制性RNA分子來說，兩種抑制性RNA分子的組合更穩(wěn)定地減少第一靶核酸的表達。
49.根據(jù)權(quán)利要求38所述的非人類真核生物，其中相對于所述真核生物中存在單獨任 一種抑制性RNA分子時的靶核酸的減少來說，兩種抑制性RNA分子的組合對第一靶核酸的 表達的減少對外部因素敏感性較低。
50.一種物質(zhì)組合物，其含有權(quán)利要求1至24任一項所述的至少兩種抑制性RNA分子， 能夠減少真核細胞中第一靶核酸的表達或真核細胞中第一和第二靶核酸的表達，其中所述 抑制性RNA分子主要通過細胞中不同的RNAi分子加工途徑被加工成21至24個核苷酸長 度的寡核苷酸。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物，其中靶基因選自致病性動物病毒基因，癌癥相關(guān) 基因，致癌基因，免疫調(diào)節(jié)基因，編碼細胞因子、生長因子、酶或轉(zhuǎn)錄因子的基因。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51所述的組合物，其進一步含有藥學上可接受的載體、獸醫(yī)上 可接受的載體或農(nóng)業(yè)上可接受的載體。
53.一種試劑盒，其含有權(quán)利要求1至24任一項所述的至少兩種抑制性RNA分子，作為 組合的制備物同時、單獨或順序用于真核生物中第一靶核酸表達的減少或真核細胞中第一 和第二靶核酸的表達的減少。
54.一種根據(jù)權(quán)利要求50至52任一項所述的物質(zhì)組合物，其用作藥物。
55.根據(jù)權(quán)利要求50至52任一項所述的物質(zhì)組合物在制備用于治療由病毒感染或癌 癥引起的疾病的藥物中的用途。
56.一種治療或預(yù)防動物中疾病的方法，該方法包括向有此需要的動物給予根據(jù)權(quán)利 要求50至52任一項所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了獲得靶核酸的改進的基因沉默的方法和手段，其中提供了靶向相同核酸的至少兩種抑制性RNA分子，但是所述RNA分子通過不同的加工途徑被加工成短干擾RNA分子。還提供了獲得靶核酸的改善的基因沉默的方法和手段，其中提供了靶向不同核酸的至少兩種抑制性RNA分子，但是所述RNA分子通過不同的加工途徑被加工成短干擾RNA分子。
文檔編號C12N5/10GK101932708SQ200880102195
公開日2010年12月29日 申請日期2008年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月14日
發(fā)明者M-B·王, P·沃特豪斯 申請人:聯(lián)邦科學工業(yè)研究組織