專利名稱：用于微陣列制備的基于3′的測序方法
技術領域：
本發明涉及使用核苷酸的3'-測序來設計核酸微陣列的方法。本發明還涉及使 用3'-測序來鑒定組織轉錄組的方法。
背景技術：
由Affymetrix和其它微陣列公司制備的常用DNA微陣列是由公開數據產生的。 雖然大部分陣列經設計具有3 ‘-偏好，但是探針設計所用的序列數據仍取自主要通過 5'-測序得到的公共數據庫。這些序列在序列的3'-末端幾乎是完整的，但并不包括 (account for)序列的3'-末端的可變聚腺苷酸化，因為它們在不同組織和疾病背景中表 達。例如，據估計超過29%的人基因具有可變聚腺苷酸化[poly(A)]位點 (Beaudoing, E (2001) Genome Res.，11，1520-1526)。可變 poly (A)位點的選擇被認為與生 物學狀況，如細胞類型和疾病狀態有關(Edwalds_Gilbert，G et al. (1997) Nucleic Acids Res.，25，2547-2561)。當3'-末端外顯子被可變剪接時，涉及可變聚腺苷酸化。根據組 織或疾病狀態，可變聚腺苷酸化會產生具有可變3 ‘-末端的mRNA或具有不同C-末端的 蛋白質。已經發現越來越多的基因受這種機制的調節。雖然正在努力構建可變聚腺苷酸化 位點的數據庫，但是目前尚不了解所有此類位點(Zhang et al. Nucleic Acids Research, 2005，Vol. 33，Database issue D116-D120)。此外，在設計組織特異性或疾病特異性微陣列 時，對可變聚腺苷酸化缺乏關注會導致次優的基因表達譜以及最終使用時的假陰性和假陽 性結果。源自公共數據庫的微陣列并不包括可變聚腺苷酸化。在公共數據庫中沒有大量的 3'-測序，也沒有很好地代表主要的可變3' _聚腺苷酸化。另有文獻報道組織特異性聚腺苷酸化經常出現，因此這也進一步強調了建立在目 標疾病或組織中表達的真實3'-末端的重要性。超過三分之一的人前體mRNA經歷可變 RNA加工修飾，這使其成為普遍的生物學過程。所產生的蛋白同種型具有不同的且有時相 反的功能，更強調了此過程的重要性。哺乳動物物種中的大量基因可能經歷可變聚腺苷酸 化，從而產生具有可變3'-末端的mRNA。由于mRNA的3'-末端常包含對mRNA穩定性、 mRNA定位和翻譯重要的順式元件，所以聚腺苷酸化調節的意義可能是多方面的。可變聚腺 苷酸化由順式元件和反式因子控制，且被認為以組織或疾病特異性的方式發生。考慮到在 mRNA代謝的其它方面(如轉錄起始和剪接)有許多可以利用的數據庫，而關于聚腺苷酸化 (包括可變聚腺苷酸化及其調控)的系統信息則顯著缺乏。因此，獲得與特定組織和疾病狀態對應的序列的真實3' _末端對于微陣列檢測 的改進非常重要。
發明內容
本文提供了使用設計序列制備微陣列的方法，所述設計序列來自通過3'-測序 進行測序的RNA轉錄本。這些方法可產生組織特異性和疾病特異性微陣列，所述微陣列包 含在常規陣列上不存在的針對可變聚腺苷酸化的轉錄本形式的探針。這些方法提供了當最 終用于表達譜分析(expression profiling)或診斷或預后方法時具有使假陽性和假陰性 結果減少的陣列。此外，本領域的普通技術人員可以理解，存在大量與組織類型和疾病狀態有關的 可變3' _聚腺苷酸化的轉錄本形式。針對這種可變性，本發明提供了轉錄本的高通量 3' _測序方法，以從所研究組織或疾病中鑒定轉錄本的真實3'-末端。在一個實施方式中，從3'-最末端(extreme 3’end)起對轉錄本測序，以得到考 慮了可變聚腺苷酸化位點的該組織或疾病狀態特異的3'-末端序列。隨后，將得到的最末 端3'-序列(extreme 3’ sequence)作為用于設計探針和產生陣列的設計序列。 在另一個實施方式中，對分離RNA樣品中的轉錄本進行高通量3 ‘-測序，直到對 RNA樣品中的基本上所有轉錄本都進行了測序。隨后將這些最末端3'-序列作為用于設 計探針和產生陣列的設計序列。與標準的商購陣列相比，本文所述的方法使陣列具有更多 的最末端3'-偏好。用于微陣列的探針設計中的3'-偏好涉及最后的300個堿基。然 而，重要的區別在于設計序列的產生。在3'-測序中獲得轉錄本的實際3'-末端，并根 據確定為在目標組織或疾病狀態中表達的轉錄本的真實和正確3'-末端的實際序列來設 計陣列。使用這些方法的優點包括鑒定組織特異性或疾病特異性3'-變體；利用新鮮冷 凍組織和福爾馬林固定石蠟包埋組織鑒定疾病/組織類型中的多種3 ‘-變體，并獲得可使 用的更正確的序列。因此，本發明的目的在于提供獲得用于設計微陣列探針的輸入序列組的方法。本發明的另一個目的在于提供用于探針設計的組織和疾病特異性序列。本發明的再一個目的在于通過使用由組織和疾病特異性探針設計的微陣列來提 高特定轉錄組檢測的準確性。
具體實施例方式I.陣列的制備方法本文提供的方法涉及由從轉錄本3' _末端測序的轉錄本庫制備微陣列，由此提供組織或疾病狀態組織的聚腺苷酸化位點的準確代表。這些方法產生的微陣列設計具有的 最末端3'-偏好大于標準的商購微陣列中存在的3'偏好。對于處理以不同方式收集和 保存的患者組織樣品，以及鑒定用于探針設計的特定組織類型或疾病狀態的特異性轉錄本 庫，這些方法也很有價值。這種對現有微陣列技術的改進允許對患者組織樣品進行更準確 且靶向性更強的分析。本文所用微陣列的“3 ‘-偏好”是指在陣列的設計中，探針選自代表性轉錄本或 設計序列的3' _區域。核酸微陣列通常具有3'-偏好，且微陣列的主要制造商普遍使用 3'-偏好的探針。例如，在大多數Affymetrix表達陣列中，探針選自最后的600個堿基。
在本文中，對用于探針設計的轉錄本所用的術語“ 3 ‘ _最末端”通常是指最靠近轉錄本3' _端的約300bp。探針設計使用從聚腺苷酸化位點計算的序列的最靠近3'-末 端(most 3，)部分。在其它實施方式中，將最后的500bp、400bp、250bp或最后的200bp作 為用于探針設計的3'-最末端。FFPE樣品對微陣列分析提出了特別的挑戰，包括RNA分子的潛在片段化和化學修 飾。通常只能檢驗新鮮冷凍組織，這是因為其RNA保存較好且降解明顯較少。遺憾的是許 多FFPE組織樣品無法使用這些微陣列進行回顧性(retrospectively)檢查。使用3 ‘-偏 好的設計消除了因RNA的5' -3'降解(例如，通過5' -3'外切酶活性)而引發的問題。 另已表明，最末端3'-偏好引起微陣列實驗中的檢測率顯著增加，信號強度更高。通過根 據轉錄本的3'-最末端設計微陣列探針，本發明的方法制備的微陣列可以對從FFPE和新 鮮冷凍組織提取的RNA進行研究，這是因為以轉錄本的3 ‘-最末端設計的探針具有更高的 轉錄本檢測效率，能夠構建部分降解的RNA(例如從FFPE組織提取的RNA)的譜圖。此外， 與簡單地使用公共數據庫中已知序列的3'-最末端相反，使用3' _測序提供用于探針設 計的組織特異性或疾病特異性轉錄本的真實3'-最末端序列。本文所使用的術語“3'-測序”是指從包括poly (A)尾的3'-末端開始對轉錄 本進行測序。常規測序方法可以用于測定轉錄本3'-末端的真實序列。術語“部分”、“片段”或“DNA片段”是指較大DNA多核苷酸或DNA的一部分。例 如，多核苷酸可以被斷裂或片段化為多個片段。本領域公知對核酸進行片段化的多種方 法。例如，這些方法可以是化學性或物理性的方法。化學的片段化可以包括使用DNAse部 分降解；使用酸部分脫嘌呤；使用限制性酶；由內含子編碼的核酸內切酶；基于DNA的裂 解方法，例如形成三鏈和雜合體方法，其依賴于核酸片段的特異性雜交以將裂解劑定位至 核酸分子的特定位置；或在已知或未知位置裂解DNA的其它酶或化合物。物理的片段化 方法可以包括使DNA經受高剪切速率處理。例如，可以通過使DNA通過具有凹陷或刺突 (spike)的室或通道，或驅使DNA樣品通過大小受限的流動通道，例如具有微米或亞微米 級截面尺寸的孔。其它物理方法包括超聲處理和霧化。也可以組合使用物理和化學斷裂 方法，如通過熱和離子介導的水解進行片段化。參見如Sambrook et al. , ‘‘ Molecular Cloning :ALaboratory Manual, “ 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N. Y. (2001) (" Sambrook et al.“)，其通過引用全文并入本文。可以對這 些方法進行優化以將核酸消化成所選大小范圍的片段。有用的大小范圍可以為20、50、100、 200或400個堿基對。使用與轉錄本3'-區域結合的探針是有利的，特別地是在用于基因表達分析的 患者組織是從石蠟包埋組織提取的RNA的情況下。每個探針將能夠與相應轉錄本中的互補 序列雜交，所述雜交發生在轉錄本3'-末端的500bp、400bp、300bp、200bp或IOObp內。與常規方法不同，為了設計其上具有60，000個轉錄本的陣列，本領域普通技術人 員利用本發明的方法無須獲取60，000個登錄號或Gene ID并根據這些序列設計探針，而實 際上只需從組織樣品中獲取60，000個轉錄本。使用3' _測序以產生這些序列(即“輸入 序列組”或設計序列)是特別相關的。本文所用術語“輸入序列組”或“設計序列”是指用于微陣列設計的序列。在第一個實施方式中，本發明提供了通過從組織樣品中分離RNA，對分離RNA中的轉錄本進行測序和在微陣列上設計針對測序轉錄本3'-最末端的核酸探針來設計核酸微陣列的方法。探針優選結合轉錄本的3'-最末端，從而包括了對分離出此RNA的組織或疾 病狀態特異的任何可變聚腺苷酸化位點。所述探針優選與轉錄本3'-最末端互補并在嚴 謹雜交條件下與其特異地結合。RNA提取方法為本領域公知，也可以使用例如RNeasy (QiagenCorporation, Valencia, CA)、Arraylt 總 RNA 提取的小試齊[J盒(TelechemInternational, Sunnyvale, CA)和ToTALLY RNA (Ambion, Foster City, CA)等的商購RNA提取試劑盒從組織樣品中分 離RNA。(Sambrook et al)。制備cDNA文庫的方法也為本領域公知，包括逆轉錄、克隆和平 板接種的方法(Sambrook et al)。針對轉錄本3'-最末端的引物對于確保從分離的RNA 正確地逆轉錄出序列的3'-最末端特別有用。例如，錨定的寡聚dT引物或寡聚dT引物對 于確保正確地轉錄出轉錄本的3' _最末端以用于生成文庫特別有用。在測序反應中用作引物的寡核苷酸還可以包含標記物。這些標記物包括但不限 于放射性核苷酸、熒光標記物、生物素、化學發光標記物。本領域已知的不同測序技術，例 如雙脫氧測序、循環測序、微測序、通過雜交測序、基于MS的測序、通過合成方法(SBS)的 DNA測序如焦磷酸測序、單個DNA分子的測序、聚合酶克隆及其任何變型，都可以用于轉錄 本3'-最末端的測序。在一個實施方式中，可以使用高通量3' _測序產生陣列的設計序列。通過對特 定組織或疾病狀態中全部或基本上全部轉錄本進行高通量測序，從而獲得輸入序列組。使 用高通量測序方法產生的探針可以比其它通用微陣列中所含探針更靠近轉錄本的3'-末端。在獲得設計序列后，設計特異地結合靶樣品中轉錄本3' _最末端的探針或探針 組。現有商業軟件可從給定序列設計探針和探針組，所述給定序列經優化從而降低了寡核 苷酸和靶標間的交叉雜交。此類軟件程序的實例包括但不限于Visual 0ΜΡ,Oligoffiζ 2.0 禾口 ArrayDesigner0使用本文所述的3'-測序方法獲得的多核苷酸序列可以用于核苷酸陣列的設計 和構建。在獲得序列后，可以選擇對應于轉錄本3'-最末端的探針組。在探針設計中要 考慮的最重要因素之一包括探針長度、解鏈溫度(Tm)和GC含量、特異性、互補探針序列和 3'-末端序列。在一個實施方式中，最佳探針的長度通常為17 30堿基，且包含約20 80%，如約50 60%的G+C堿基。Tm通常優選為50V 80°C，例如約50V 70°C。在設計探針和探針組后，制備包含這些經特異設計用于與組織或疾病狀態中的 RNA結合的探針的微陣列。微陣列可以使用多種技術制備，包括使用細針在載玻片上印制、 使用預制掩膜進行光刻、使用動態微鏡裝置進行光刻、噴墨印制或在微電極陣列上的電化 學方法。長寡核苷酸陣列由60-mers或50-mers構成，并且通過在二氧化硅基材上進行噴 墨印制(Agilent)而產生。短寡核苷酸陣列由25-mers或30-mers構成，且通過在二氧 化硅基材上進行光刻合成(Affymetrix)而制備，或通過在丙烯酰胺基質上進行壓電沉積 (Applied Microarrays)而制備。另一種方法，即來自NimbleGen Systems的無掩模陣列合 成法(Maskless Array Synthesis，使用微鏡)組合了靈活性和具有大量探針的特點。特別地，相關疾病特異性的內容物和基于3'的探針設計的組合提供了能夠對來 自新鮮冷凍組織和FFPE組織的RNA譜圖進行強效分析的獨特方法和產品。
這些方法也可以用于產生代表來自組織的基本上全部轉錄組的陣列。例如，在 一個實施方式中，在限定肺癌轉錄組時，使用基于3 ’的測序方法有助于針對每個轉錄本 3' _最末端設計引物組。此方法確保了高得多的檢測率，因此對其進行優化設計以檢測來自新鮮冷凍組織 樣品和FFPE組織樣品的RNA轉錄本。Almac Diagnostics LungCancer DSA 是能夠利用 從FFPE組織提取的RNA產生有生物學意義的可重復數據的研究工具的實例。II微陣列為了制備改進的微陣列，將經設計與轉錄本3'-最末端雜交的核酸探針排列在 固相支持物上以制備陣列。所述陣列可以代表對應于一個或多個組織或一種或多種疾病的 多個組織轉錄本。疾病特異性陣列包含在一種給定疾病背景下表達的轉錄本。使用本領域 已知的適合技術構建本文所提供的用于診斷、預后和預前分析的陣列。參見，例如美國專利 第 5，486，452 號；第 5，830，645 號；第 5，807，552 號；第 5，800，992 號和第 5，445，934 號。 在每個陣列中，單條核酸探針可以僅出現一次或可以出現多次。所述陣列也可以任選地包 含對照核酸探針，例如在陽性對照的情況下包含針對管家基因的對照核酸探針，或將已知 在組織中不表達的基因作為陰性對照。在一個實施方式中，使用本領域公知的核酸固定或結合技術，將代表轉錄本和/ 或轉錄本片段的組織特異性核酸探針固定在陣列的多個物理獨立位點上。在多個物理獨立 位點上的片段可以一起組成完整的轉錄本或完整轉錄本的單獨(discreet)部分。所述片 段可以與轉錄本的連續部分或轉錄本的不連續部分互補。來自靶樣品的核酸分子與陣列上 片段的雜交表示樣品中存在目標轉錄本。雜交和雜交的檢測通過本領域技術人員公知的常 規檢測方法進行，并在下文進行更詳細的描述。在一個實施方式中，使用多個探針序列以區分患病組織樣品中的目標序列和其它 核酸序列。在一些實施方式中，陣列上的探針組合代表了至少2%的設計序列。在其它實 施方式中，陣列上的探針代表了至少5 %、至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少 50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %的目標序列。在一個實施方式中，轉錄本與至少50 %的探針序列互補。在其它實施方式中，轉錄 本與至少60%、70%、80%、90%或100%的探針序列互補。在另一個實施方式中，將對應于轉錄本完整3' _最末端或轉錄本完整3'-最末 端的片段的核酸探針以“點陣列”形式固定在陣列的僅一個物理獨立位點上。可以將特異 核酸探針的多個拷貝結合在陣列基材的單獨位點上。優選地，此類“點陣列”包含本文新鑒 定的一個或多個核酸分子。對于給定的陣列，每個核酸探針可以為完整序列或片段化為不同長度的序列。構 成完整轉錄本的全部片段不必均呈現在陣列上。轉錄本與陣列上代表完整轉錄本的一部分 的探針的雜交可以表示該轉錄本在分離出該轉錄本的組織中的存在或表達水平。本領域技術人員可以理解，在給定陣列上的核酸探針與給定組織樣品中的轉錄本 特異性的靶標互補。也可以設計含天然序列的陣列以鑒定目標樣品中反義分子的存在。由 于近期文獻提出癌癥和其它疾病中涉及內源的反義分子，而使內源的反義RNA轉錄本引人 關注。如上所述，可將特異于某些疾病(例如特定癌癥)的陣列設計成包括針對特定聚腺苷酸化位點的探針。可以將任何適合的基材用作固定或結合核酸探針的固相。例如，所述基材可以是玻璃、塑料、金屬、金屬包被的基材或任何材料的濾膜(filter)。基材表面可以是任何合適 的結構。例如，表面可為平面，或具有隆起或凹槽以分離固定在基材上的核酸探針。在可選 的實施方式中，核酸連接到可單獨識別的小球上。將核酸探針以使其可用于雜交的任何合 適方式連接到基材上，包括共價或非共價結合。III.陣列的使用方法本文提供的陣列可以用于任何合適的目的，例如但不限于表達譜圖分析、診斷、預 后、藥物治療和藥物篩選等。通常，將RNA從組織樣品中分離并與陣列接觸，并使其在嚴謹條件下雜交，以允許 來自組織樣品的靶序列和微陣列上的互補探針之間發生特異性結合。固定在基材上的探針 適于在嚴謹條件下與來自核酸樣品的轉錄本雜交。可以通過將從目標組織提取的RNA逆轉 錄而摻入熒光核苷酸，從而生成熒光標記的核苷酸探針。用于陣列的標記探針與陣列上的 各個核苷酸特異性雜交。在嚴謹洗脫以去除非特異性結合的探針后，通過共聚焦激光顯微 鏡或其它檢測方法如CCD照相機掃描陣列。對每個陣列化元件的雜交進行定量可以評價相 應轉錄本的豐度。如本領域技術人員所理解的，術語“基本上”相同或同源或相似根據情況而改變， 通常是指至少70 %的同一性，優選是指至少80 %、更優選至少90 %且最優選至少95 %的同一性。本領域普通技術人員可以很容易地確定雜交反應的“嚴謹性”，且其通常為取決于 探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的經驗計算。通常，較長的探針需要較高溫度以進行正確退 火，而較短的探針則需要較低溫度。當互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環境中時，雜交通常 取決于變性DNA再退火的能力。探針和可雜交序列之間所需的同源程度越高，所用相關溫 度就越高。因此，較高的相關溫度使反應條件更嚴謹，而較低的溫度下反應條件嚴謹性較 低。對于雜交反應嚴謹性的其它細節和解釋，參見Ausubel et al. ,Current Protocolsin Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)。如本文所定義，“嚴謹條件”或“高嚴謹性條件”通常為(1)洗滌采用低離子強度和 高溫，例如0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1 %十二烷基硫酸鈉，50°C ； (2)雜交期間采 用變性劑，例如甲酰胺，如50% (ν/ν)甲酰胺和0. 牛血清白蛋白/0. 1% Ficoll/0. 1% 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)和750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，42°C ；或 (3)在42°C下采用50%甲酰胺、5XSSC(0. 75M NaCl，0. 075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH
6.8)、0. 焦磷酸鈉、5XDenhardt' s溶液、超聲處理的鮭魚精子DNA(50 μ g/ml)、0. 1% SDS和10%硫酸葡聚糖，在42°C下采用0. 2 XSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)洗滌以及在55°C下 采用甲酰胺洗滌，隨后為在55°C下由含EDTA的0. 1 X SSC組成的高嚴謹洗滌。可以通過 Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, NewYork =Cold Spring Harbor Press，1989的描述確定“中等嚴謹條件”，且包括使用洗滌 液和嚴謹性(例如溫度、離子強度和％ SDS)低于上述條件的雜交條件。中等嚴謹條件的實 例為于37°C下在包含20%甲酰胺、5XSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH
7.6)、5XDenhardt，S溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性的斷裂鮭魚精子DNA的溶液中溫育過夜，隨后在約37 50°C下用IX SSC洗滌濾膜(filter)。本領域技術人員知曉如何 調節溫度、離子強度等以適應如探針長度等因素。本發明的微陣列可以用于研究不同的疾病狀態。術語“疾病”和“疾病狀態”包含 能夠導致或潛在引起患病生物體中細胞的小分子圖譜、細胞區室、或細胞器變化的所有疾 病。這些疾病可以分成三個主要的類別腫瘤病、炎癥性疾病和退行性疾病。疾病的實例包含但不限于代謝性疾病(例如肥胖癥、惡病質、糖尿病、厭食癥等)； 心血管疾病(例如動脈粥樣硬化、缺血/再灌注、高血壓、心肌梗死、再狹窄、心肌病、動脈 炎等)；免疫性病癥(例如慢性炎癥性疾病和病癥，如克羅恩氏病，炎癥性腸病，反應性關節 炎，類風濕性關節炎，骨關節炎，包括萊姆病(Lyme disease)，胰島素依賴性糖尿病，器官特 異性自身免疫，包括多發性硬化癥、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto' s thyroiditis)和格雷 夫斯病，接觸性皮炎，銀屑病，移植排斥，移植物抗宿主疾病，結節病，特應性病癥，如哮喘和 變態反應，包括過敏性鼻炎，胃腸過敏，包括食物過敏，嗜曙紅細胞增多，結膜炎，腎小球性 腎炎，對某些病原體易感，如腸蟲(例如利什曼病)和某些病毒感染，包括HIV，和細菌傳染、 包括結核病和瘤型麻風等)，肌病(例如多肌炎、肌營養不良、中央軸空病、中央核(肌管) 性肌病、先天性肌強直、線狀體肌病、先天副肌強直、周期性麻痹、線粒體肌病等)；神經系 統病癥(例如神經病、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓病、肌萎縮側索硬化、運動神經 元病、外傷性神經損傷、多發性硬化癥、急性播散性腦脊髓炎、急性壞死性出血性腦白質炎、 髓鞘異常(dysmyelination)疾病、線粒體病、偏頭痛癥、細菌感染、真菌感染、中風、衰老、 癡呆、周圍神經系統疾病和精神紊亂如抑郁癥和精神分裂癥等)；腫瘤病癥(例如白血病、 腦癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌(colorectal cancer)、喉癌、乳癌、皮膚 癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、內分泌癌、子宮內膜癌、食道癌、膠質瘤、 淋巴瘤、成神經細胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂體癌和腎癌等)；和眼科疾病(例如色素性視網 膜炎和黃斑變性)。該術語還包括由已知和未知的氧化應激、遺傳性癌綜合征和代謝疾病引 起的紊亂。本發明的更多細節將在以下非限定性實例中進行描述。實施例1 使用高通量3'-測序以鑒定微陣列設計序列文庫生成和cDNA測序從組織中提取RNA根據生產商說明書使用RNA STAT-60從冷凍肺組織塊中提取RNA。對產品說明書 的改進包括在開始提取之前使用Tissue Lyser (Qiagen)在RNA-STAT-60中以20Hz對每 個組織塊勻漿6分鐘。使用Biophotometer(Eppendorf)測定RNA的產量，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer禾口RNA NanoLabChip試齊[J盒(Agilent Technologies ；Palo Alto,CA) W 驗RNA的質量。將等量的優良RNA(帶有明確28S和18S核糖體峰的RNA)混合以用于mRNA 分離。從總RNA中分離mRNA根據生產商說明書使用μ MACS mRNA分離試劑盒(Miltenyi Biotec)從混合的肺總RNA中分離mRNA。從538 μ g混合的肺總RNA中分離mRNA，并洗脫到12 μ 1無核酸酶的水 中。使用 Biophotometer (Eppendorf)測定mRNA 的產量，并使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 和 RNA Nano LabChip 試劑盒(Agilent Technologies ；Palo Alto, CA)檢驗 mRNA 的質量。使用mRNA Nano試驗測定核糖體污染的百分比。肺cDNA文庫的構建使用CloneMiner cDNA文庫構建試劑盒(Invitrogen)進行肺cDNA文庫的構建。根據生產商說明書進行非放射性標記cDNA文庫的構建。使用預先分離的3 μ g肺mRNA產 生文庫。將cDNA插入物重組到pDONR 222載體并通過電穿孔進入DH10B Tl噬菌體抗 性細胞(Invitrogen)。將1 μ 1重組的pDONR 222載體加入到40 μ 1的電感受態細胞中。 將管中的全部內容物轉移至縫隙寬度為Imm的預冷小皿中，并插入設置為1660V和5ms時 間常數(τ)的電穿孔儀2510 (Eppendorf)。在電穿孔后，將Iml SOC培養基(Invitrogen) 加入到細胞中，轉移至15ml管中，并于37°C在Innova 4300型振蕩培養箱(New Brunswick Scientific)中以225rpm振蕩1小時。隨后，向樣品中加入等體積的無菌冷凍培養基(60% SOC培養基(Invitrogen)，40%甘油(Sigma))，然后等分至多個管中，并在_80°C儲存。在含 50ug/ml卡那霉素(Sigma)的3個預熱LB平板上進行滴度測定。在每個平板上涂布1 μ 1、 5μ1或ΙΟμΙ的轉化細胞，并于37°C在BD115培養箱(Binder)中培養過夜。計算每個平 板上菌落的數量以測定文庫的平均滴度。用平均滴度乘以總體積來確定總菌落形成單位 (cfu)οcDNA 文庫的評價(qualify)通過使用BsrG 1消化24個陽性轉化體來進行cDNA文庫的進行評價。將12ul質 粒 DNA 與 3·0μ1 NE 2、0·3μ1 BSA、0. 1 μ 1 BsrG 1 禾口 14 μ 1 無核酸酶的水在 37°C 下一起 溫育16小時。隨后使用DNA 7500分析方法在Agilent 2100Bioanalyzer上分析經消化的 樣品。沒有插入物的pDONR 222載體應顯示出具有以下2. 5kb、1.4kb和790bp長度的消 化譜，每個cDNA進入克隆(entryclone)都應該具有2. 5kb的載體骨架和額外的插入物條 帶。將每個克隆的單個消化條帶的大小相加在一起得到插入物總長度。隨后計算24個轉 化體的平均插入物大小長度和轉化的百分數。以約2000cfu/皿的密度將單個cDNA文庫的細菌菌苔平鋪到生物分析皿 (QTrays(Genetix))上。使用QPix 2XT菌落挑取器挑取單個菌落，并于37°C在CircleGrow 培養基(MP Biomedicals LLC)中振蕩培養過夜。使用改進的Montage 堿性裂解法(Millipore)進行質粒的制備。此方法使用 MultiScreen Plasmid384 Minipr印清除平板來替代真空過濾進行離心裂解物的清除。在 Biomek NX工作臺(Beckman Coulter)上進行所有的液體處理步驟。準備384孔的序列反應平板，其包含約IOOng模板DNA、5yM引物(M13反向通用引 物、錨定的寡聚 dT 或寡聚 dT)、Big Dye Terminator v. 3. KAppliedBiosystems Inc.)和測 序緩沖液(Applied Biosystems Inc.)。循環測序條件為40個循環，95°C 10秒，50°C5秒， 60°C2 分 30 秒。在 Biomek NX 液體處理器上使用 CleanSEQ (Agencourt Biosciences)清除 測序反應物。使用 AppliedBiosystems 序列分析軟件在 Appled Biosystems 3730/3730x1 DNA分析儀上分析序列平板。實施例2 肺癌疾病特異性轉錄組的鑒定通過基于3'的高通量測序方法生成用于設計肺癌疾病特異性陣列(DSA )研究 工具的轉錄本信息，以確定肺癌轉錄組。從每個經鑒定的轉錄本的3'-末端生成探針，并 由 Affymetrix (Affymterix Corporation, Santa Clara, CA)為用戶設計肺癌 DSA 研究工具。這種相關疾病特異性內容物和基于3'的探針設計的組合可以對來自福爾馬林固定石 蠟包埋(FFPE)的RNA譜圖進行強效分析。 雖然已經參考具體實施方式
對本發明進行了描述，但是 應該理解本發明并不限于 這些實施方式。相反，本發明旨在涵蓋包含在所附權利要求書精神和范圍內的各種修改和 等價形式。
權利要求
設計核酸微陣列的方法，所述方法包括從組織樣品中分離RNA；從轉錄本的3′-末端對組織樣品中的轉錄本測序，直到基本上所有轉錄本都進行了測序，從而獲得所述轉錄本的3′-最末端序列；使用所述序列設計用于微陣列的探針；和制備微陣列，所述微陣列具有針對組織樣品中轉錄本的3′-最末端的探針。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述轉錄本的3'-最末端包含所述轉錄本最靠近 3'-末端的300個堿基對。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述轉錄本的3'-最末端包含所述轉錄本最靠近 3'-末端的400個堿基對。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述轉錄本的3'-最末端包含所述轉錄本最靠近 3'-末端的500個堿基對。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述轉錄本的3'-最末端包含所述轉錄本最靠近 3'-末端的200個堿基對。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述轉錄本的3'-最末端包含所述轉錄本最靠近 3'-末端的100個堿基對。
7.組織特異性或疾病特異性微陣列，其包含針對轉錄本3'-最末端的探針。
8.如權利要求7所述的微陣列，其中所述探針針對特異于特定組織或疾病狀態的聚腺 苷酸化位點。
9.如權利要求7所述的微陣列，其中所述轉錄本的3'_最末端包含所述轉錄本最靠 近3'-末端的300個堿基對。
10.如權利要求7所述的微陣列，其中所述轉錄本的3'_最末端包含所述轉錄本最靠 近3'-末端的400個堿基對。
11.如權利要求7所述的微陣列，其中所述轉錄本的3'_最末端包含所述轉錄本最靠 近3'-末端的500個堿基對。
12.如權利要求7所述的微陣列，其中所述轉錄本的3'_最末端包含所述轉錄本最靠 近3'-末端的200個堿基對。
13.如權利要求7所述的微陣列，其中所述轉錄本的3'_最末端包含所述轉錄本最靠 近3'-末端的100個堿基對。
14.使用權利要求7-13中任一項所述的微陣列分析組織表達譜的方法，所述方法包括在樣品中的核酸靶標與所述陣列上的探針特異性雜交的條件下，使來自組織的核酸樣 品與所述陣列接觸；洗滌除去所述微陣列上的未結合核酸靶標；和檢測與所述微陣列結合的靶標，其中與所述微陣列結合的靶標的存在表明基因在所述組織中表達。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述組織包括患病組織。
16.如權利要求14所述的方法，其中所述患病組織為癌癥組織。
17.如權利要求14所述的方法，其中所述癌癥選自白血病、腦癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌、喉癌、乳癌、皮膚癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、 內分泌癌、子宮內膜癌、食道癌、膠質瘤、淋巴瘤、成神經細胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂體癌或腎癌。
全文摘要
本發明描述了獲得用于制備核酸微陣列的設計序列的方法。本發明的方法使用組織樣品或疾病狀態中轉錄本的高通量3′-測序來設計用于核酸微陣列的探針。本發明還描述了具有針對組織中轉錄本3′-最末端的探針的核酸微陣列。這些微陣列優選代表了特異于獲得所述轉錄本的組織的可變聚腺苷酸化序列。本發明還描述了使用針對轉錄本3′-最末端的微陣列來評價組織中基因表達的方法，此方法中的假陽性和假陰性結果減少。
文檔編號C12Q1/68GK101821406SQ200880101835
公開日2010年9月1日 申請日期2008年8月12日 優先權日2007年8月13日
發明者保爾·哈金, 加文·奧列弗, 卡爾·馬利根, 夏蘭·富爾頓, 奧斯汀·塔內 申請人:阿爾馬科診斷有限公司