專利名稱：：肺癌的多基因預后試驗的制作方法肺癌的多基因預后試驗相關申請的交叉引用本申請要求2007年6月1日提交的USSN60/941，550的優先權，其通過引用全文納入本文。在聯邦資助研發下作出發明的權利的聲明不適用對以光盤提交的“序列表”、表格或計算機程序列表附件的引用不適用
背景技術：
：借助臨床分期和組織病理學發現來確定肺癌患者的長期死亡率可能性不佳。我們的假設是多基因定量聚合酶鏈式反應(PCR)試驗可預計肺癌患者的死亡率風險。發明概述在一方面，本發明提供為對象的肺癌提供預后的方法，該方法包括以下步驟(a)將該對象的生物學樣品與特異性結合一組生物標記物的試劑接觸，所述生物標記物包括ctnnbl、wnt3a、tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2和dusp6，和(b)通過比較該樣品與對照非癌性細胞樣品來測定所述標記物在該樣品中是否差別表達；從而提供肺癌的預后。在一個實施方式中，所述試劑是核酸。在另一實施方式中，所述試劑是寡核苷酸。在另一實施方式中，所述試劑是PCR引物組(primerset)。在另一實施方式中，所述試劑是抗體。在一個實施方式中，所述樣品來自外科手術切除的腫瘤。在另一實施方式中，所述樣品來自肺組織或肺腫瘤活檢。在一方面，本發明提供裝有特異性結合一組生物標記物的試劑的試劑盒，所述生物標記物包括ctnnbI、wnt3a、tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2禾口dusp。在一個實施方式中，所述試劑是PCR引物組。在另一方面，本發明的特征在于通過定量測定生物學樣品中至少兩種(例如，至少三種或至少四種)基因的表達水平來確定患肺癌對象的預后的方法，所述基因選自下組Rnd3、wnt3a、erbb3、Ick、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3禾口brcalo在該方面，所述生物學樣品(例如，腫瘤活檢、肺活檢和血液樣品)源自該對象，而所述表達水平是預后的標志。在以上任一方面，所述表達水平可以是mRNA表達水平或蛋白質水平，或二者的組合。本發明的特征在于通過，例如定量rtPCR測定mRNA表達水平。本發明的特征在于通過，例如抗體結合試驗(例如，ELISA試驗)測定蛋白質水平。在還有另一方面，本發明的特征在于通過檢測生物學樣品中至少兩種(例如，至少三種或至少四種)基因的甲基化水平來確定患肺癌對象的預后的方法，所述基因選自下組Rnd3、wnt3a、erbb3、Ick、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3禾口brcalo在該方面，所述生物學樣品(例如，腫瘤活檢、肺活檢和血液樣品)源自該對象，而所述甲基化水平是預后的標志。在以上任一方面，肺癌可以是肺腺癌，例如I期、II期、III期或IV期。在以上任一方面，所述預后還提供長期死亡率的高或低風險評估。附圖簡述圖1顯示肺癌是癌癥死亡最常見的原因，并顯示對于1期癌癥，長期死亡率的預后(5年存活率)是約60%。圖2顯示預后的基因組模型。圖3描述了RTPCR分析所用的樣品。圖4描述了進行預后的患者群體。圖5描述了定量測(RT)PCR的方法。圖6描述了所有肺腺癌標記物的訓練組的結果。圖7描述了所有肺腺癌標記物的驗證組的結果。圖8描述了1期肺腺癌標記物的驗證和訓練組的結果。圖9列出了1期肺腺癌的RT-PCR多基因預后試驗所用的8種基因。圖10顯示了包含驗證組的分期、腫瘤尺寸和高評分的Cox模型的結果。圖Ila是利用4-基因預后模型比較低_和高_風險患者(所有階段)總存活率的卡-邁曲線(Kaplan-Meiercurve)。圖lib是比較低-和高-風險評分患者(所有階段)無疾病存活率的卡-邁曲線。圖12a是利用4-基因預后模型比較低_和高_風險評分的I期患者總存活率的卡-邁曲線。圖12b是比較低_和高_風險評分的I期患者無疾病存活率的卡-邁曲線。圖13是利用Chen及其同事公布的5_基因預后模型比較低-和高-風險評分的I期患者的卡-邁曲線。發明詳述引言本發明的特征在于鑒定到某些組合的基因的表達概況能對早期肺癌的長期死亡率作出精確預后。在一個實施方式中，我們鑒定了65種基因，這些基因在以前公布的3項微陣列研究和2項基于PCR的研究中鑒定為早期肺癌的長期死亡率預后。從肺腺癌完全切除的連續患者的124份新鮮冷凍的腫瘤樣品中提取RNA，所述患者至少臨床隨訪3年。將80份樣品隨機指定為測試組，將其余樣品指定為驗證組。采用Taq-man試驗對測試組進行65種鑒定基因的實時PCR。采用反向模型選擇(backwardsmodelselection)，利用標準化基因表達水平的比例危險率模型產生預測模型。利用模型系數和各基因表達水平計算各患者的模型評分。如果模型評分大于中值評分，則患者確定為高風險。在所有80位患者中鑒定了充分的實時PCR概況。最終模型包括18種基因。鑒定為高-風險和低-風險的患者比例分別是是52%和48%。低-風險組中卡-邁(Kaplan-Meier)預計5年存活率是82%，在高-風險組中是5%(P<0.001，時序檢驗)。高_風險組中，中值存活是22個月，低-風險組中未獲得。在多變量存活分析中，預后評分預計的存活率不依賴于腫瘤階段和尺寸(P<0.001)。根據模型log-可能性值，預后評分預計死亡率優于臨床分期(P<0.001)。臨床分期可參見，例如Mountain，CliftonF；HermanILibshitz,KayEHermes.AHandbookforStaging,Imaging,andLymphNodeClassification(分期、成像和淋巴結分類手冊).CPY公司(CharlesPYoungCompany),和Mountain,CF(1997).“Revisionsintheinternationalsystemforstaginglungcancer"(肺癌分期國際體系的修訂).Chest111:1710-1717。在另一實施方式中，本發明的特征在于定量測定作為肺癌所致死亡率的預后指標的以下基因表達:rnd3>wnt3a>erbb3>lck、sh3bgr>fut3>illl、cdc6>cdk2apKbagl>emx2>six3、和brcal(例如，wnt3a、rnd3、lck、和erbb3)(參見以下實施例2)。8成員的多-基因RT-PCR試驗(ctnnbl、wnt3a、tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2和dusp6)、13成員的多-基因RT-PCR試驗(rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3、和brcal)、或包括wnt3a、rnd3>lck、和erbb3的任{可多-基因RT-PCR試驗有助于預測肺癌患者的長期死亡率。本發明還包括多基因診斷試劑盒，其由本文所述可用于提供肺癌患者預后的標記物構成。定義“肺癌”通常指由惡性細胞的尺寸和外觀分類的主要兩類肺癌非小細胞(80%)和小細胞(約20%)肺癌。“非小細胞肺癌”(NSCLC)包括鱗狀細胞癌，約占肺癌的29%。肺腺癌是NSCLC的最常見亞型，約占肺癌的32%。肺腺癌的一種亞型是細支氣管肺泡癌，其在從不吸煙女性中更常見。大細胞癌約占肺癌的9%。“小細胞肺癌”包括SCLC(也稱為“燕麥形細胞癌”)，其是不常見的肺癌形式。肺癌的其它類型包括類癌、腺樣囊性癌、圓柱瘤、和粘液表皮樣癌。在一個實施方式中，按照I-IV期對肺癌分期，其中I是早期，IV是最晚期。“預后”指，例如總存活率、長期死亡率和無疾病存活率。在一個實施方式中，長期死亡率指診斷為肺癌后存活5年。在一個實施方式中，長期死亡率的預后是“高風險的”，例如高死亡率風險，或“低風險的”，例如低死亡率風險。癌癥的階段和預后可用于為患者定制治療以提供較好的后果，例如靶向治療和外科手術、單用外科手術或單用靶向治療。癌癥的其它形式包括癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括實體和淋巴癌癥、頭頸癌，例如口腔癌、咽和舌癌、腎癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、腦癌、頭頸癌、皮膚癌、子宮癌、睪丸癌、食道癌、和肝臟癌癥，包括肝癌、淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤(例如，伯基特、小細胞、和大細胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤、白血病、和多發性骨髓瘤。術語“標記物”指細胞中表達的、與非癌細胞相比表達在癌細胞表面上或由癌細胞分泌的分子(通常是蛋白質、核酸、碳水化合物或脂質)，其可用于診斷癌癥、提供預后以及可將藥理學制劑優先靶向癌細胞。這些標記物通常是與非癌細胞相比，在肺癌或其它癌癥細胞中過表達的分子，例如與正常細胞相比1-倍過表達、2-倍過表達、3-倍或更多倍過表達。此外，標記物可以是與正常細胞表達的分子相比，在癌癥細胞中不成比例合成的分子，例如含有缺失、添加或突變的分子。或者，這些生物標記物是與非癌癥細胞相比，在癌癥細胞中表達不足的分子，例如1-倍低表達、2-倍低表達、3-倍或更多倍低表達。此外，標記物可以是與正常細胞表達的分子相比，在癌癥中不成比例合成的分子，例如含有缺失、添加或突變的分子。技術人員應明白標記物可與任何應用，例如本文公開的癌癥預測、診斷或預后的其它標記物或測試聯用。“生物學樣品”包括組織切片，例如活檢和尸檢樣品，以及為組織學目的取得的冷凍切片。這種樣品包括血液和血液組分或產物(例如，血清、血小板、紅細胞等)、痰、支氣管肺泡灌洗液、培養細胞，例如原代培養物、外植塊、以及轉化細胞、糞便、尿液等。生物學樣品一半獲自真核生物，最優選哺乳動物，例如靈長類，如黑猩猩或人；牛；狗；貓；嚙齒類動物，例如豚鼠、大鼠、小鼠；家兔；或鳥類；爬行類；或魚類。“活檢”指為診斷或預后評價而取出組織樣品的過程，還指組織樣本自身。本領域已知的任何活檢技術適用于本發明的診斷和預后方法。所應用的活檢技術取決于待評價的組織類型(例如，肺)、腫瘤的尺寸和類型等因素。代表性活檢技術包括但不限于切除活檢、切開式活檢、針吸活檢、手術活檢和骨髓活檢。“切除活檢”指取出整個腫瘤塊以及其周圍的少量正常組織。“切開式活檢”指取出包括腫瘤橫斷面直徑的楔形組織。通過內窺鏡檢查或熒光鏡檢作出的診斷或預后可能需要“芯針活檢”或“細針抽吸活檢”，這些技術通常從靴組織內得到細胞懸液。例如，Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine(哈里森內科原理)，Kasper等編，第16版，2005，第70章，和整個V部分討論了活檢技術。術語“過表達”或“過表達的”可互換指代與正常細胞相比，通常在癌細胞中可檢測到更高水平的轉錄或翻譯的蛋白質或核酸(RNA)。該術語包括與正常細胞相比，轉錄、轉錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細胞定位(例如，細胞器、細胞質、核、細胞表面)和RNA及蛋白質穩定所致的過表達。可采用檢測mRNA(S卩，RT-PCR、PCR、雜交)或蛋白質(即，ELISA、免疫組化技術)等常規技術檢測過表達。與正常細胞相比，過表達可以是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在某些情況中，與正常細胞相比，過表達是1-倍、2-倍、3-倍、4-倍或更高水平的轉錄或翻譯。術語“低表達”、“低表達的”或“下調”可互換指代與正常細胞相比，在癌癥細胞中低于可檢測水平轉錄或翻譯的蛋白質或核酸。該術語包括與對照相比，轉錄、轉錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細胞定位(例如，細胞器、細胞質、核、細胞表面)和RNA及蛋白質穩定所致的低表達。可采用檢測mRNA(S卩，RT-PCR、PCR、雜交)或蛋白質(即，ELISA、免疫組化技術)等常規技術檢測低表達。與對照相比，低表達可以是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更低。在某些情況中，與對照相比，低表達是1-倍、2-倍、3-倍、4-倍或更低水平的轉錄或翻譯。就本發明而言，術語“差異表達”或“差異調節”通常指與至少一份其它樣品相比，一份樣品中的蛋白質或核酸過表達(上調)或低表達(下調)，通常是在癌癥患者中，與沒有癌癥的患者相比。“治療性治療”和“癌癥治療”指化療、激素治療、放療、免疫治療和生物(靶向)治療。本文的“治療有效量或劑量”或“有效量或劑量”表示產生給藥所需作用的劑量。精確的劑量取決于治療的目的，本領域技術人員采用已知技術可確定(參見，例如Lieberman,PharmaceuticalDosageForms(M^l^OM)(H1-3^,1992)；Lloyd,TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(藥物配白勺領域、禾斗學禾口技術)(1999)；Pickar，DosageCalculations(劑量計算)(1999)；和Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓藥學科學與實踐)，第20版，2003，Gennaro編，Lffff公司(Lippincott,Williams&Wilkins))。就兩條或更多條核酸或多肽序列而言，術語“相同”或“相同性”百分比指利用默認參數如下所示的BLAST或BLAST2.0序列比較算法，或通過手工比對和目測觀察(參見，例如NCBI網址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST等)測定到兩條或更多條序列或子序列相同或具有一定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，當在比較窗或指定區域進行最大對應性的比較和比對時，在特定區域上有約60%相同性，優選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高相同性)。然后稱這些序列“基本上相同”。該定義還指或可適用于測試序列的互補序列。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些序列。如下所述，優選的算法可解釋空位等。優選在至少約25個氨基酸或核苷酸長度，或更優選在50-100個氨基酸或核苷酸長度的區域具有相同性。可用探針檢測本文所述的生物標記物，所述探針(例如)在特定區域與登錄號所示參比序列有70%以上相同性，或80%以上相同性、或90%以上相同性直至100%相同性。對于序列比較，通常將一條序列用作參比序列，將測試序列與其比較。當采用序列比較算法時，將測試和參比序列輸入計算機，指定子序列座標(如果需要的話)并指定序列算法程序參數。優選利用默認參數，或者可以指定參數。然后序列比較算法根據程序參數計算測試序列相對于參比序列的序列相同性百分比。本文所用的“比較窗”包括參考選自20-600，通常約50-200，更常見約100-150中任一數量的毗連位置的區段，對兩個序列進行最優比對后，可將該區段中的序列與相同數量毗連位置的參比序列作比較。比對序列進行比較的方法是本領域熟知的。可通過，例如Smith和Waterman，Adv.App1.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和ffunsch,J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法，通過Pearson和Lipman，Proc.Nat，1.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索法，通過計算機執行這些算法(遺傳學計算組(GeneticsComputerGroup)的威斯康星遺傳學軟件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，575科學Dr.，威斯康星州麥迪遜(Madison，WI))，或通過手工比對和目測(參見例如，《新編分子生物學實驗指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(Ausubel^11,1987-2005,WI(WileyInterscience)))進行最優序列比對以便比較。適合測定序列相同性和序列相似性百分比的算法的優選例子分別是BLAST和BLAST2.0算法，參見Altschul等，Nuc.AcidsRes.25:3389_3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。使用BLAST和BLAST2.0，參數如本文所述來確定本發明核酸和蛋白質的序列相同性百分比。實施BLAST分析的軟件通過國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)為公眾所得。該算法包括首先通過在查詢序列中鑒定長度W的短字來鑒定高評分序列對(HSP)，該短字與數據庫序列中相同長度的字比對時，匹配或滿足一些正值閾值評分Τ。T稱為相鄰字評分閾值(Altschul等，同上)。這些初始相鄰字命中用作啟動搜索發現含有它們的更長的HSP的種子。該字命中在沿各序列的兩個方向上延伸，直到累積比對評分可增力口。對于核苷酸序列，利用參數M(—對匹配殘基的獎勵評分；總是>0)和N(錯配殘基的罰分；總是<0)計算累積評分。對于氨基酸序列，用評分矩陣計算累積評分。在以下情況時字命中在各個方向上的延伸中止累積比對評分比最大獲得值降低X；由于一個或多個負評分殘基比對的累積，造成累積評分變為零或零以下；或者達到各序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對核苷酸序列而言)采用的默認值如下字長(W)11，期望值(E)10,M=5,N=-4，以及比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認值為字長3，期望值(E)10，BL0SUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915(1989))比對(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及比較兩條鏈。“核酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它們的聚合物及其互補體。該術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾主鏈殘基或連接鍵的核酸，它們是合成、天然產生的和非天然產生的，它們與參比核酸的結合特性類似，并且與參比核苷酸的代謝方式類似。這類類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2_0_甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有表明，特定核酸序列也隱含包括其保守修飾變體(如，簡并密碼子取代)和互補序列，以及明確指出的序列。具體地說，可通過產生其中一個或多個選擇的(或所有)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列而獲得簡并密碼子取代(Batzer等，NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。術語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互換使用。特定的核酸序列還隱含包括“剪接變體”和編碼截短形式蛋白質的核酸序列。類似地，核酸編碼的特定蛋白質隱含包括該核酸的剪接變體或截短形式編碼的任何蛋白質。如其名稱所暗示的，“剪接變體”是基因的另路剪接產物。轉錄后，可剪接初始核酸轉錄物，因而不同的(另路)核酸剪接產物能編碼不同多肽。產生剪接變體的機制有所不同，但包括外顯子的另路剪接。該定義還包括通過通讀轉錄而源自同一核酸的另路多肽(alternatepolypeptide)。該定義包括剪接反應的任何產物，包括重組形式的剪接產物。核酸可以在5’端或3’端截短。多肽可以在N-末端或C-末端截短。截短的核酸或多肽序列可以是天然產生或重組產生的。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文可互換使用，指代氨基酸殘基的聚合物。這些術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是對應于天然產生的氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物，以及天然產生的氨基酸聚合物和非天然產生的氨基酸聚合物。術語“氨基酸”指天然產生和合成的氨基酸以及通過與天然產生氨基酸相類似方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產生的氨基酸是遺傳密碼編碼的那些，以及隨后修飾的那些氨基酸，例如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指具有與天然產生的氨基酸相同基礎化學結構，即，具有結合氫的α碳、羧基、氨基和R基團的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍(methioninemethylsulfonium)。這種類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然產生的氨基酸相同的基礎化學結構。氨基酸模擬物指結構與氨基酸的通用化學結構不同，但通過與天然產生氨基酸相類似方式起作用的化合物。本文可用IUPAC-IUB生物化學命名委員會(BiochemicalNomenclatureCommission)推薦的公知三字母標志或單字母標志指稱氨基酸。類似地，可用其一般接受的單字母密碼指稱核苷酸。“保守修飾變體”適用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，保守修飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當核酸不編碼氨基酸序列時，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶都編碼丙氨酸。因此，在密碼子指定為丙氨酸的每個位置上，可將密碼子改變為所述的任何相應密碼子而不改變編碼多肽。這種核酸變異是“沉默變異”，保守修飾變異的一種。編碼多肽的本文各核酸序列也描述該核酸的每種可能的沉默變異。本領域技術人員認識到，可修飾核酸中的各密碼子(除了AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產生功能相同的分子。因此，對于表達產物，所述各序列中暗示了編碼多肽的核酸的各沉默變異，但對于實際的探針序列不是這樣。對于氨基酸序列，本領域技術人員會認識到，核酸、肽、多肽或蛋白質序列的單個取代、缺失或添加以在編碼序列中改變、添加或刪除一個氨基酸或少部分氨基酸是“保守修飾變體”，其中改變導致用化學上相似的氨基酸取代某氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本領域熟知的。這種保守修飾的變體應加上且不排除本發明的多態性變體、種間類似物和等位基因。以下八組各含有可彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸⑷；5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)。參見例如，Creighton，Proteins(1984)。“標記物”或“可檢測部分”是能通過分光光度方法、光化學方法、生物化學方法、免疫化學方法、化學方法或其它物理方法檢測的組成物。例如，有用的標記物包括32P、熒光染料、電子密度試劑、酶(如經常用于ELISA的)、生物素、地高辛或半抗原以及可通過例如將放射性標記物摻入肽中而可檢測或可用于檢測與所述肽特異性反應的抗體的蛋白質。在述及例如細胞、核酸、蛋白質或載體時，術語“重組”表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已通過引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質作了修飾，或該細胞源自如此修飾的細胞。因此，例如重組細胞表達在天然(未重組)形式的細胞中未發現的基因或表達在其它情況下異常表達、低表達或根本不表達的基因。短語“嚴謹雜交條件”指探針與其靶子序列(通常在核酸的復雜混合物中)雜交，但不與其它序列雜交的條件。嚴謹條件是序列依賴性的，在不同情況下不同。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。有關核酸雜交的廣泛指南參見Tijssen，《生物化學和分子生物學技術-與核酸探針雜交》(TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicProbes)，“核酸測定的雜交原理和方案概覽，，(Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays)(1993)。通常，選擇的嚴謹條件比特定序列在確定離子強度、pH下的熱解鏈溫度(Tffl)低約5-10°C。Tm是50%靶標互補探針與靶序列雜交平衡時的溫度(在確定的離子強度、PH和核酸濃度下)(靶序列過量，在Tm時50%探針被平衡地占據)。也可加入去穩定齊U，如甲酰胺獲得嚴謹條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號至少是背景雜交信號的兩倍，優選10倍。示范性的嚴謹雜交條件可以如下所示50%甲酰胺、5xSSC和SDS,420C溫育，或者5xSSCU%SDS、65°C溫育，65°C用0.2xSSC禾口0.1%SDS洗滌。如果編碼的多肽基本相同，那么在嚴謹條件下不相互雜交的核酸仍然基本相同。例如，用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產生核酸拷貝時，可能發生這種情況。在這種情況下，核酸一般在中等嚴謹的雜交條件下雜交。示范性“中等嚴謹雜交條件”包括37°C，在40%甲酰胺、IMNaClU%SDS的緩沖液中雜交，45°C，IXSSC洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領域普通技術人員不難認識到，可利用其它雜交和洗滌條件提供類似的嚴謹性條件。許多參考文獻提供了確定雜交參數的其它指導，例如《新編分子生物學實驗指南》，Ausubel等編，同上。對于PCR，低嚴謹性擴增的溫度通常是約36°C，雖然退火溫度可以根據引物長度而介于約32°C和48°C之間不等。對于高嚴謹性PCR擴增，典型的溫度是約62°C，雖然高嚴謹性退火溫度可以根據引物長度和特異性而介于約50°C和約65°C之間不等。高和低嚴謹性擴增的典型循環條件包括90°C-95°C，30秒-2分鐘的變性階段，持續30秒-2分鐘的退火階段，和約72°C，1-2分鐘的延伸階段。低和高嚴謹性擴增反應的方案和指導見，例如Irmis等，(1990)PCRProtocols,AGuidetoMethodsandApplications(PCR方案，方法和應用指南)，學術出版社公司(AcademicPress,Inc.)，紐約)。“抗體”指包含免疫球蛋白基因的框架區的多肽，或其特異性結合和識別抗原的片段。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε、和μ恒定區基因以及大量免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為Y、μ、α、δ或ε，進而分別限定了免疫球蛋白類別，IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。抗體的抗原結合區對于結合的特異性和親和力至關重要。抗體可以是多克隆或單克隆的，衍生自血清、雜交瘤或重組克隆的，還可以是嵌合型、靈長類化或人源化的。示范性免疫球蛋白(抗體)結構單位包含四聚體。各四聚體由相同兩對多肽鏈構成，各對具有一條“輕鏈”(約25kDa)和一條“重鏈”(約50-70kDa)。各鏈的N-末端限定了主要負責抗原識別的約100-110或更多個氨基酸的可變區。術語可變輕鏈和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。存在的抗體可以是，例如完整的免疫球蛋白或用各種肽酶消化產生的許多充分表征的片段。因此，例如，胃蛋白酶消化抗體絞鏈區下的二硫鍵以產生F(ab)，2，即Fab的二聚體，Fab本身是通過二硫鍵連接于Vh-ChI的輕鏈。F(ab)，2可在溫和條件下還原以打開絞鏈區的二硫鍵，從而將F(ab)’2二聚體轉化成Fab’單體。Fab’實質上是具有絞鏈區部分的Fab(參見FundamentalImmunology(基礎免疫學)(Paul編，第3版，1993)。雖然根據完整抗體的消化定義了各種抗體片段，技術人員應知道，可通過化學方法或采用重組DNA技術從頭合成這種片段。因此，本文所用的術語“抗體”還包括通過修飾完整抗體產生的抗體片段，或采用重組DNA方法從頭合成的那些(例如，單鏈Fv)或利用噬菌體展示文庫鑒定的那些(參見，例如McCafferty等，Nature348:552_554(1990))。在一個實施方式中，抗體偶聯于“效應”部分。效應部分可以是任何數量的分子，包括標記物部分，例如放射性標記物或熒光標記物，或者可以是治療部分。在一方面，抗體調節蛋白質的活性。本發明的差別表達基因的核酸或它們編碼的多肽指所有形式的核酸(例如，基因、前-mRNA、RNA)或蛋白質、它們的多態變體、等位基因、突變體和種間同源物，所述這些具有以下特點(適用于核酸或蛋白質)(1)具有的氨基酸序列優選在至少約25、50、100、200,500,1000或更多氨基酸的區域上與參比核酸編碼的多肽或本文所述氨基酸序列具有高于約60%的氨基酸序列相同性，6570%,75%,80%,85%,90%、優選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的氨基酸序列相同性；(2)特異性結合抗體，例如用包含參比氨基酸序列的免疫原、其免疫原性片段產生的多克隆抗體及其保守修飾變體；(3)在嚴謹雜交條件下與編碼參比氨基酸序列的核酸及其保守修飾變體特異性雜交；(4)具有的核酸序列優選在至少約25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸上與參比核酸序列具有高于約95%，優選高于約96%、97%、98%、99%或更高的的核酸序列相同性。多核苷酸或多肽序列通常來自哺乳動物，包括但不限于靈長類，例如人；嚙齒類，如大鼠、小鼠、倉鼠；牛、豬、馬、綿羊或任何哺乳動物。本發明的核酸和蛋白質包括天然產生的或重組分子。該定義包括截短和另路剪接形式的這些抗原。述及蛋白質、核酸、抗體或小分子化合物時，短語“特異性(或選擇性)結合”指確定蛋白質或核酸的存在的結合反應，例如本發明差別表達的基因，所述蛋白質或核酸通常處于蛋白質或核酸和其它生物物質的異質群體中。以抗體為例，在指定的免疫測定條件下，特定抗體與特定蛋白質的結合至少是背景的兩倍，更典型的是背景的10-100倍以上。在這種條件下，與抗體的特異性結合要求選擇的抗體對特定蛋白質具有特異性。例如，可選擇多克隆抗體從而只獲得與所選抗原而不與其它蛋白質發生特異性免疫反應的那些多克隆抗體。可通過排除與其它分子交叉反應的抗體來實施這種選擇。可采用各種免疫測定形式來選擇與特定蛋白質發生特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定常規用于選擇與蛋白質發生特異性免疫反應的抗體(可用于測定特異性免疫反應性的免疫測定的形式禾口條件可參見，例如Harlow禾口Lane，Antibodies,ALaboratoryManual(抗體的實驗室手冊)(1988))。就測試能調節標記物蛋白質的化合物的試驗而言，短語“功能效應”包括測定間接或直接受本發明生物標記物影響的參數，例如化學的或表型的。因此，功能效應包括配體結合活性、轉錄活化或阻遏、細胞增殖的能力、遷移能力，等等。“功能效應”包括體外、體內和離體活性。“測定功能效應”表示檢驗某化合物是否能增加或降低間接或直接受本發明生物標記物影響的參數，例如檢測物理和化學或表型效應。可通過本領域技術人員已知的任何方法檢測這種功能效應，例如光譜特征(如，熒光、吸光度、折射率)的變化；流體動力學(如，形狀)、色譜特征的變化；或蛋白質的溶解特性；配體結合試驗，例如與抗體的結合；檢測誘導型標記物或標記物的轉錄活化；檢測酶活性的變化；提高或降低細胞增殖、凋亡、細胞周期停滯的能力；檢測細胞表面標記物的改變。可通過本領域技術人員已知的任何方法評估功能效應，例如定量或定性檢測形態學特征改變的顯微術、檢測胎盤組織中表達的其它基因在RNA或蛋白質水平上的變化、檢測RNA穩定性、鑒定下游或報道基因表達(CAT、螢光素酶、β-gal、GFP，等等)，例如通過化學發光、熒光、比色反應、抗體結合、誘導型標記物寸。標記物的“抑制劑”、“活化劑”和“調節劑”用于指代采用癌癥生物標記物的體外和體內試驗鑒定的活化、抑制或調節性分子。抑制劑是，例如結合、部分或完全阻斷活性、降低、阻止、延遲活化、滅活、脫敏或下調癌癥生物標記物活性或表達的化合物。“活化劑”是增加、打開、活化、促進、增強、活化、敏化、激動或上調癌癥生物標記物活性的化合物，例如激動劑。抑制劑、活化劑或調節劑還包括癌癥生物標記物的遺傳修飾形式，例如活性改變的形式，以及天然產生和合成的配體、拮抗劑、激動劑、抗體、肽、環肽、核酸、反義分子、核酶、RNAi和siRNA分子、有機小分子等。抑制劑和活化劑的這種試驗包括，例如在細胞或細胞提取物中體外表達癌癥生物標記物，施加推定的調節化合物，然后測定對活性的功能效應，如上所述。將包含癌癥生物標記物并用可能的活化劑、抑制劑或調節劑處理的樣品或試驗與不含抑制劑、活化劑或調節劑的對照樣品作比較以檢測抑制程度。對照樣品(未用抑制劑處理)指定為相對蛋白質活性值為100%。當與對照相比，活性值是約80%、優選50%、更優選25-0%時，獲得癌癥生物標記物的抑制作用。當與對照(未用活化劑處理)相比，活性值是110%、更優選150%、更優選200-500%(即，與對照相比，兩倍或五倍)、更優選1000-3000%時，獲得癌癥生物標記物的活化作用。本文所用的術語“測試化合物”或“候選藥物”或“調節劑”或其語法等價體描述了要檢驗其直接或間接調節癌癥生物標記物的能力的天然產生或合成的任何分子，例如蛋白質、寡肽(例如，長約5-約25個氨基酸，優選長約10-20或12-18氨基酸，優選長12、15或18氨基酸)、有機小分子、多糖、肽、環肽、脂質、脂肪酸、siRNA、多核苷酸、寡核苷酸等。測試化合物可以是測試化合物文庫的形式，例如提供足夠多樣性的組合或隨機文庫。測試化合物任選與融合伴侶，例如靶向化合物、拯救化合物、二聚化化合物、穩定化合物、可尋址化合物和其它功能部分相連。一般可通過鑒定具有某些所需特性或活性，例如抑制活性的測試化合物(稱為“前導化合物”)、產生該前導化合物的變體并評估那些變體化合物的特性和活性來產生具有有用特性的新化學實體。這種分析常采用高通量篩選(HTS)方法。“有機小分子”指天然產生或合成的有機分子，其分子量大于約50道爾頓并小于約2500道爾頓，優選小于約2000道爾頓，優選介于約100-約1000道爾頓之間，更優選介于約200-約500道爾頓之間。預后方法本發明提供通過檢測在癌癥中差別表達的一組標記物的表達情況而對肺癌作出預測或預后的方法。所述標記物的例子包括以下基因中的一些或全部ctrmbl、wnt3a,tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2禾口dusp6，以下基因中的一些或全部rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr>fut3>illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3、禾口brcal(例如，wnt3a>rnd3>lck、和erbb3)。預測和預后包括測定患者或患者樣品中的一組肺癌生物標記物多核苷酸或相應多肽的水平，然后將該水平與基線范圍作比較。基線水平通常代表未患或不會產生肺癌的健康人中該多核苷酸或核酸的水平，如利用生物學樣品，如肺活檢或體液樣品檢測的。本發明多核苷酸或相應多肽的水平偏離基線范圍(上調或下調)表明該患者的長期死亡率風險升高。在優選的實施方式中，利用生物學樣品，例如腫瘤組織的RNA，采用實時或定量PCR檢測檢測該組中8種生物標記物的表達。無需顯微解剖。可通過本領域技術人員已知的任何方法進行RNA提取，例如采用Trizol和RNeasy。可通過本領域技術人員已知的任何方法進行實時PCR，例如采用應用生物系統公司試驗(AppliedBiosystemassays)的Taqman實時PCR。相對于正常肺RNA計算基因表達，根據持家基因標準化表達。本領域技術人員可選擇合適的寡核苷酸引物。在一個實施方式中，所述試驗用于I期、II期、III期或IV期癌癥。在一個實施方式中，所述組織樣品來自外科手術切除的腫瘤。在一個實施方式中，利用核酸結合分子，例如探針、寡核苷酸、寡核苷酸陣列和引物檢測RNA生物標記物，從而檢查患者樣品中RNA的差別表達。在一個實施方式中，按照本領域已知的標準方法利用RT-PCR。在另一實施方式中，可采用定量PCR試驗，例如應用生物系統公司的丁aqman試驗來檢測核酸及其變體。在其它實施方式中，可利用核酸微陣列檢測核酸。可采用常規技術，例如northern分析進行核酸分析，或者本發明還包括基于核酸序列雜交的任何其它方法(例如，狹線印跡雜交)，所述核酸序列與標記物編碼序列的一部分互補。結合所選核酸生物標記物的試劑可按照本領域技術人員已知的方法制備或商品化購得。適用的PCR擴增技術描述于，例如Ausubel等，和Irmis等，同上。通用核酸雜交方法描述于Anderson，“NucleicAcidHybridization(核酸雜交)，，生物科學出版社(BIOSScientificPublishers)，1999。還可從安排在微陣列中的mRNA或cDNA序列進行多個核酸序列(例如，基因組DNA、mRNA或cDNA)的擴增或雜交。微陣列方法通常描述于Hardiman,"MicroarraysMethodsandApplications:Nuts&Bolts(微陣列方法禾口應用螺母與螺栓)”DNAPress,2003；Baldi等，“DNAMicroarraysandGeneExpressionFromExperimentstoDataAnalysisandModeling(DNA微陣列和基因表達從實驗到數據分析和建模)”，劍橋大學出版社(CambridgeUniversityPress)，2002。可采用本領域已知的方法分析核酸標記物，包括但不限于序列分析和電泳分析。序列分析的非限制性例子包括馬克西姆_吉爾伯特測序(Maxam-Gilbertsequencing)、桑格測序(Sangersequencing)、毛細管陣列DNA測序、熱循環測序(Sears等，Biotechniques，13:626-633(1992))、固相測序(Zimmerman等，MethodsMol.CellBiol.，3:39-42(1992))、質譜學測序，例如襯質輔助激光解吸與電離-飛行質譜法(MALDI-T0F/MS;Fu等，Nat.Biotechnol.，16:381-384(1998))和雜交測序。Chee等，Science，274:610-614(1996)；Drmanac等，Science,2601649-1652(1993)；Drmanac等，Nat.Biotechnol.，16:54_58(1998)。電泳分析的非限制性例子包括平板凝膠電泳，例如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳和變性梯度凝膠電泳。在另一實施方式中，可采用本領域技術人員已知的許多免疫測定，在測定中利用抗體試劑來檢測本發明蛋白質生物標記物的表達水平。免疫試驗技術和方法通常描述與Price禾口Newman，“PrinciplesandPracticeofImmunoassay(免疫測定的原理與實踐)，”第2版，格羅夫詞典公司(Grove'sDictionaries),1997；Gosling,"Immunoassays:APracticalApproach(免疫測定一種實用方法)”牛津大學出版社(OxfordUniversityPress)，2000。可采用各種免疫測定技術，包括競爭性和非競爭性免疫測定。參見，例如Self等，Curr.Opin.Biotechnol.，7=60-65(1996)術語“免疫測定”包括的技術包括但不限于酶免疫測定(EIA)，例如酶放大免疫分析技術(EMIT)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、IgM抗體捕捉ELISA(MACELISA)、和微粒酶免疫測定(MEIA)；毛細管電泳免疫測定(CEIA)；放射性免疫測定(RIA)；免疫放射測定(IRMA)；熒光極化免疫測定(FPIA)；和化學發光測定(CL)。如果需要，這些免疫測定可自動進行。免疫測定還可與激光誘導熒光聯用。參見，例如Schmalzing等，Electrophoresis,18:2184_93(1997)；Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.，699=463-80(1997)。脂質體免疫測定，例如流動-注射脂質體免疫測定和脂質體免疫傳感器也適用于本發明。參見，例如Rongen等，J.Immunol.Methods,204105-133(1997)。此外，濁度法試驗適用于本發明方法，該試驗中蛋白質/抗體復合物的形成導致可轉換成峰比率信號(peakratesignal)的光散射增加，而該信號與標記物濃度呈函數關系。濁度法試驗可商品化購自加利福尼亞州貝瑞阿市的貝克曼考特爾公司(BeckmanCoulter,Brea,CA；試劑盒編號449430)，可利用白令濁度計分析儀(Behring^phelometerAnalyzer)進行(Fink等，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,27:261_276(1989))。可檢測部分可用于本文所述試驗(直接或間接檢測)。可利用各種可檢測部分，標記物的選擇取決于所需靈敏度、與抗體偶連的便利性、穩定性要求和可用的儀器以及處置規定。合適的可檢測部分包括但不限于放射性核素、熒光染料(例如，熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、0regOnGreen、羅丹明、德克薩斯紅、異硫氰酸四羅丹明(TRITC)、Cy3、Cy5等)、熒光素標記物(例如，綠色熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白等)、由腫瘤相關蛋白酶活化的自猝滅熒光化合物、酶(例如，螢光素酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、納米顆粒、生物素、洋地黃毒苷、金屬等。利用核酸的特異性化學發光抗體的化學發光試驗適合于靈敏地非放射性檢測蛋白質水平。用熒光染料標記物的抗體也合適。熒光染料的例子包括但不限于DAPI、熒光素、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、羅丹明、德克薩斯紅和麗絲胺(Iissamine)。間接標記物包括本領域熟知的各種酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ΑΡ)、半乳糖苷酶、脲酶等。辣根過氧化物酶檢測系統可利用，例如顯色底物四甲基聯苯胺(TMB)，其在有過氧化氫存在下產生可在450nm檢測的可溶產物。堿性磷酸酶檢測系統可利用，例如顯色底物對_硝基苯基磷酸酯，其產生不難在405nm檢測的可溶產物。類似地，β“半乳糖苷酶檢測系統可利用顯色底物鄰_硝基苯基_β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，其產生可在410nm檢測的可溶產物。脲酶檢測系統可利用例如脲-溴甲酚紫等底物(西格瑪免疫化學公司(SigmaImmunochemicals)；圣路易斯，密蘇里州)。例如，可利用分光光度計檢測顯色底物的顏色；利用輻射計數器檢測輻射，例如檢測125I的Y計數器；或在有某種波長的光存在下利用熒光計檢測熒光，來分析直接或間接標記物的信號。對于檢測酶連抗體，可按照生產商的使用說明，利用分光光度計，例如加利福尼亞州門洛帕克市分子裝置公司(MolecularDevices；MenloPark,CA)的EMAX微板讀數計作定量分析。如果需要，本發明的試驗可以自動進行或由機器人實施，可同時檢測多份樣品的信號。可將抗體固定在各種固體支持物，例如磁性或色譜基質顆粒，試驗平板的表面(微量滴定板孔)、多片固體基材或膜上(例如，塑料、尼龍和紙)，等等。可通過在固體支持物上的陣列中包被抗體或多種抗體來制備測定條帶。然后可將該帶浸入測試樣品并經洗滌和檢測步驟快速處理從而產生可檢測信號，例如色斑。有用的物理形式包括具有多個離散、可尋址位置的表面，從而能檢測多個不同的標記物。這種形式包括微陣列和某些毛細管裝置。參見，例如Ng等，J.CellMol.Med.,6329-340(2002)；美國專利號6，019，944。在這些實施方式中，各離散表面位置可包含抗體以固定一種或多種標記物以便在各位置檢測。或者，表面可包含固定在表面的離散位置處的一個或多個離散顆粒(例如，微粒或納米顆粒)，這些微粒包含抗體以固定一種或多種標記物進行檢測。可采用各種物理形式進行分析。例如，可利用微量滴定板或自動設備以促進大量測試樣品的處理。或者，可開發單樣品形式，從而有助于以及時方式診斷或預后。或者，可將本發明的抗體或核酸探針應用于固定在顯微鏡載玻片上的患者活檢切片。可采用本領域已知的各種光學或熒光顯微方法目測觀察得到的抗體染色或原位雜交模式。在另一形式中，本發明的各種標記物還提供了用于體內成像的試劑，例如檢測本發明生物標記的核酸或所編碼蛋白質的標記試劑的成像。出于體內成像目的，可用合適的標記物，例如熒光標記物標記檢測癌癥生物標記所編碼蛋白質存在與否的試劑，例如抗體。報道在另一方面，本發明的特征在于表明患癌癥對象預后的報道。該報道可以是，例如電子形式或紙件形式。該報道可包括基本患者信息，包括對象標識符(例如，對象的姓名、社保號、醫療保險號或隨機產生的號碼)、對象的物理特征(例如，年齡、體重或性別)、委托醫師(requestingphysician)的姓名、進行預后的日期和收集樣品的日期。報道的預后可以是關于一定時期存活的可能性、一定時期內對某些治療(例如，化療或手術治療)起反應的可能性、和/或癌癥復發的可能性。報道預后的形式可以是一定時期存活的百分比幾率、對治療起良好反應(良好反應可定義為，例如腫瘤縮小或腫瘤生長減緩)、或在限定時期復發(例如，5年存活幾率為20%)的百分比幾率。或者，報道預后的形式可以是計算的評分。例如，評分較高或較低可表明有利的預后。在另一實施方式中，報道的預后可以是存活、對治療的反應或一定時期內復發的可能性的總體描述(例如，非常可能、可能或不可能存活5年)。在另一實施方式中，報道的預后可以是圖表的形式。除了基因表達水平，報道的預后還考慮了對象的其它特征(例如，年齡、癌癥的階段、性別、以前的治療、適合性、心血管健康狀況和精神健康狀況)。除了預后，該報道還可任選包括涉及以下至少兩種基因的表達水平的原始數據Rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3、禾口brcal0組合物、試劑盒和集成系統本發明提供利用本發明多肽的特異性抗體或對本發明多核苷酸具有特異性的核酸來實施本文所述試驗的組合物、試劑盒和集成系統。實施本發明診斷試驗的試劑盒通常裝有探針和檢測探針是否存在的標記物，所述探針包含特異性結合本發明多肽或多核苷酸的抗體或核酸序列。所述試劑盒還可裝有幾種抗體或編碼本發明多肽的多核苷酸序列，例如識別本發明生物標記所編碼蛋白質的抗體的混合物。實施例提供以下實施例是為了說明，而不是限制本發明。實施例1.CTNNBl、WNT3A、TP53、KRAS、ERBB3、MUCl、ERBB2和DUSP6本發明分析了105位手術切除肺腺瘤的患者的數據，所述患者具有至少3年隨訪并可獲得高質量組織。對65種基因和持家基因(18S和P0L2RA，也參見表1)進行實時PCR。按照可商品化購得的合并正常肺RNA和18S作為持家基因標準化PCR輸出(以周期閾值，CT計)。得到的數值(如表2所示)是與正常肺RNA相比的表達比例。在表2中，基因以行排列并采用縮寫。各基因前的數字(例如，7-FZD)是我們用于標識基因的數字，沒有其它意義。然后對這些數值取對數(表2中第二組數值)。如下所示進行分析。將樣品(患者)隨機分成兩組訓練組(η=70)和驗證組(η=35)。對訓練組中的各基因進行Cox建模，利用存活率的自由P值閾值為0.2來選擇基因。然后我們將所有這些基因一起在訓練組上作后向選擇(backwardsselection)，即，根據P值標準為0.2逐一投下(dropping)這些基因，在投下該基因在一個或多個其余基因的系數中產生有意義的變化時終止。最終的模型含有以下8種基因Ctrmbl、wnt3a、tp53、kras,erbb3,mucUerbb2和dusp6。然后將各樣品表達值輸入該模型以獲得各樣品的評分。我們選擇將高評分的割點(cutpoint)設置為評分的頂極三分位組(toptertile)。產生所有樣品以及只有I期患者的卡-邁曲線。在驗證組中重復該操作。為這些其它變量作調整后運行cox模型，包括腫瘤尺寸和腫瘤階段以及預示較高死亡風險的高評分。實施例2.WNT3A、RND3、LCK和ERBB3預后工具應能理想地提供精確的風險分類，在臨床上每日實施是可行的，并且應是節約成本的。這種試驗對于外科手術切除了I期NSCLC的患者特別有利。目前對于I期NSCLC的護理標準是葉切除術和縱隔淋巴結切除，無需輔助化療。更好地鑒定良好預后的患者亞組可能較少地采用外科手術而具有相同的存活可能性。相反，可選擇預后差的I期亞組納入檢驗新方法和新療劑的臨床試驗。考慮到目前I期疾病化療的局限性，對于化療益處有預后和預示作用的生物測定非常有利。最后，I期NSCLC的重要性在將來可能增加。雖然約20%的患者目前診斷為I期NSCLC，該比例可能因通過計算機斷層掃描篩選肺癌的最新進展而升高。我們發現Wnt3a、rnd3、lCk和erbb3的表達可預后肺癌患者的存活。所研究患者的臨床和組織學特征見表3。我們首先分析了整個數據組，隨后將分析局限于I期患者。根據年齡、腫瘤尺寸和階段強迫調整后，交叉驗證支持含有按以下順序選擇的4種基因的模型Wnt3a,rnd3,Ick和erbb3。利用這4種基因，采用該模型的風險評分(Li收縮系數)來分析總體存活率(OS)。根據年齡、疾病階段和腫瘤尺寸作調整后，作為連續變量的風險評分的危害比(HR)是6.7(95%CI:1.6-28.9，ρ=0.005)，如表4所示。基于4基因模型的二分風險評分的整個研究對象的存活曲線見圖Ila和lib。70位I期患者中二分風險評分的相應存活曲線見圖12a和12b。所有患者的5-年OS是56%，I期患者為65%。在所有患者中，低風險患者中5-年OS為62%，高風險患者中為41%(ρ=0.0054)。低-風險患者中5-年DFS為60%，高-風險患者中為28%(ρ=0.0053)。在I期患者中，低風險患者中5-年OS為87%，高風險患者中為38%(ρ=0.0002)，低風險患者中DFS為77%，高風險患者中為35%(ρ=0.0045)。將Chen及其同事的5-基因模型應用于我們的研究組，根據年齡、階段和腫瘤尺寸調節的HR為2.4(95%CI:1·3-4.3，ρ=0.0047)13。(Chen等，NEnglJMed35611-20(2007)。在所有患者中，低風險中的5-年OS為65%，高風險患者中的為43%(ρ=0.045)。在I期患者中，低風險患者中5-年OS為80%，高風險中為47%(ρ=0.022)，圖13。我們通過定量PCR，根據4種基因的基因表達鑒定了風險評分，可預后完全手術切除肺腺癌的患者的長期存活。這種根據基因表達的評分對存活(調節的HR6.7)和疾病復發的預測優于根據臨床階段和腫瘤尺寸的。我們的模型最好地預示了I期疾病患者中的死亡風險。在我們的交叉驗證組中，I期患者中的低-和高-風險評分與5-年總體存活率為87%和38%相關。對于模型選擇和模型驗證，我們采用交叉驗證。交叉驗證采用反復數據分離而不是將數據分成測試和驗證組，從而防止模型過度擬合(over-fitting)并產生模型系數的精確估計值。交叉驗證能產生經驗證的模型系數，但利用數據比簡單的數據分離更有效。該預后模型對于診斷和提供肺癌預后有重要的臨床意義，例如作為在I期肺腺癌的風險分類患者中進行臨床分階段的補充工具。目前對于I期NSCLC的護理標準是單用外科手術切除，通常是葉切除術。相反，復發風險低的切除后患者最好只進行觀察，甚至可以是徹底肺切除不足的候選對象。在我們的患者群中，與Chen及其同事(同上)的相比，我們模型的預后值更好。該發現有幾種可能的解釋。首先，我們模型的候選基因是基于以前公布的基因組-廣泛表達微陣列研究，而Chen模型中的基因是選自更有限的定制表達陣列平臺。此外，在確定我們的基因模型之前通過RT-PCR評估了較大的一組基因。另外，我們的患者隨訪時間較長，隨訪時期至少3年，中值隨訪為61個月。該因素使得我們能更精確地檢測風險組之間存活率的差異。方法患者在1997年1月-2004年9月間，經歷完全手術切除肺腺癌并保存了新鮮冷凍組織以供基因組分析的120位患者納入研究。適格的患者經歷醫療意圖的手術切除并對縱隔淋巴結進行適當分階段。接受手術前化療的患者排除出研究，從而不會混淆純粹預后工具的開發。13位患者因保存組織不足、RNA質量不夠或持家基因表達弱而排除。初級終末點是總存活率。無疾病存活(DFS)定義為從外科手術到疾病復發的χ射線照片證據的時間，或者在沒有疾病復發時到最后一次記錄在案的醫師隨訪的時間。預期患者同意組織樣本收集，該項研究由USCF研究檢查委員會批準(UCSFinstitutionalreviewboard)(CHR#H8714-28880-01)。基因選擇在以前公布的早期肺癌預后的微陣列和PCR研究中鑒定的217種基因中(參見，例如Beer等，NatMed8:816(2002)；Potti等，NEnglJMed355:570(2006)；Wigle等，CancerRes62:3005(2002)；Garber等，ProcNatlAcadSciUSA9813784(2001)；Miura等，CancerRes62:3244(2002)；Schneider等，BrJCancer83:473(2000))，通過愿意的專家或文獻查詢鑒定了76種癌癥-相關基因。15種基因由于在前導研究中無功能性引物或通過RT-PCR發現在腫瘤組織中表達非常弱而排除。其余61種基因見表5。樣品制備和分析操作時所有組織冷凍在液氮中。將組織大塊切割成Icm3切片，并在液氮中研磨。采用加利福尼亞州卡爾斯巴德市英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)的TriZol提取方案提取RNA。利用加利福尼亞州福斯特城的應用生物系統公司的Prism7900HT儀器在384-孔平板中對cDNA進行TaqmanRT-PCR0各基因的表達進行一式三份的檢驗。將樣品與加利福尼亞州芒廷維尤市克隆技術公司(Clontech，MountainView,CA)的市售購得合并正常肺RNA作比較，根據應用生物系統公司的18S核糖體rRNA標準化。從新鮮肺切片獲得約Icm3的腫瘤樣本塊，立即在液氮中速凍。-80°C保存冷凍的組織。采用英杰公司的TriZol提取方案從131份各腫瘤樣品中提取總RNA。利用安捷侖公司(Agilent)的安捷侖2100BioAnalyzer驗證RNA樣品的質量，通過納滴公司(Nanodrop)的NanodropND-1000測定各樣品的RNA-濃度。用3μg總RNA作為模板，利用拜爾萊得公司(BioRad)WiScriptcDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，利用應用生物系統公司的裝有自動化配件的ABIPRISM7900HT序列檢測系統，通過實時定量PCR檢測86種不同基因轉錄物各自的相應表達水平。一式三份進行的各20μL反應包括應用生物系統公司的TaqMan通用PCR主混合物、應用生物系統公司的適當Taqman基因表達測定和每次反應的對應于120ng總RNA的1.8μLcDNA模板。利用應用生物系統公司的序列檢測系統(SDS)2.3軟件獲得Ct值，將相對基因表達值計算成△ACt，從而產生根據相對于校準樣品(所有樣品的參比)的內源性參比基因表達水平作標準化的靶基因相對表達水平。所用的校準樣品是有克隆技術公司從正常人肺總RNA合成的cDNA(目錄號636524)。為選擇內源性參比基因，比較了早期公布的常規使用的大量參比基因在肺癌(腫瘤和正常組織)中的表達水平。選擇三種基因-編碼18S核糖體RNA亞單位、P0L2RARNA聚合酶和TBPTATA盒蛋白，比較了腫瘤和正常樣品的幾種cDNA樣本稀釋液中它們的表達水平。18SrRNA在肺樣品(腫瘤和正常)中顯示表達最穩定，因此，按照18SrRNA標準化原始基因表達值。統計學分析我們數據結構的突出特征是(i)正確檢查的存活終點(死亡)與適度的事件數量(47-構建子集以排除遺漏后)；(ii)通過RT-QPCR所得(log)基因表達值(它處所述的Δ-ACt)構成的多種(61)預測因子；和(iii)選擇臨床和人口統計學共變量(covariate)0鑒于這些特征和量綱，我們利用的基礎數據分析工具是Ll罰分的Cox相對金回歸^去(LipenalizedCoxproportionalhazardsregression)。i亥方^去>^己證明ι效的Ll罰分固有的同時系數收縮(simultaneouscoefficientshrinkage)和預測因子選擇拓展至存活數據設置。由微陣列基因表達應用主要推動的早期拓展在計算上受限制或者依賴于近似計算。我們采用交叉驗證來確定模型大小，即，所選基因的數量。然后根據模型系數產生各對象的風險評分。將得到的預測風險評分二分(在中值處)，顯示相應的卡-邁存活曲線并通過時序統計學比較。利用統計學軟件包R(版本2.3.1,2006)進行所有分析。應該知道本文所述的實施例和實施方式中只是出于說明的目的，這些實施例和實施方式對本領域技術人員提示了各種改進或改變，這些改進或改變應屬于本申請的構思和權限以及隨附權利要求書的范圍內。本文引用的所有出版物、專利和專利申請出于所有目的通過引用全文納入本文。表1Taqman試驗列表數量基因代號基因名稱NCBI參比基因試驗ID數量基因代號基因名稱NCBI參比基因試驗ID2FZD7Frizzled同NM_003507.1,AB017365.1,BC01591Hs00275833_sl源物7(果5.1蠅)6WIFlWNT抑制ΝΜ_007191·2，AF122922.1，BX64742Hs00183662_ml因子17.1，BC018037.1，AY358344.17FUT3巖藻糖轉移NM_000149.1，U27326.1，U27327.1，UHs00356857_ml酶3(半乳27328.1，AF131913.1糖苷3(4)-L-巖藻糖轉移酶，包括路易斯血液組)11NXFl核RNA輸ΝΜ_006362·3，AJ132712.1，U80073.1Hs00234741_ml出因子1，AF112880.1，AF126246.1，AK027192.1,BC004904.2，CR749674.1，AB209915.1，BC028041.115ASMTL乙酰血清素ΝΜ_004192·1，ΑΚ001090.1，BC0100Hs00414020_ml0-甲基轉移89.2，BC002508.2，AK090498.1酶-樣16CTNNBl連環蛋白NM_001904.2，Z19054.1，X87838.1，AHs00170025_ml(鈣粘蛋白-B062292.1，BC058926.1相關蛋白)，βl,88kDa17SH3BGR富含SH3結ΝΜ_001001713·1，ΝΜ_007341·2，X9Hs00201109_ml構域結合性3498.1，BC006371.2，BM474020.1谷氨酸蛋白18ARAFν-raf鼠肉NM_001654.1,X04790.1,BC007514.Hs00176427_ml瘤3611病2，BC002466.2，BT019864.1，AK13004毒癌基因同3.1源物19TYROBPTYRO蛋白NM_198125.1,NM_003332.2,AF019Hs00182426_ml酪氨酸激酶562.1，AJ010098.1，BCOl1175.1，CR45結合蛋白0342.1，CR542202.1，AY074782.1，BQ576278.1,BT009851.120MGST2微粒體谷胱NM_002413.3，U77604.1，AA122237.Hs00182064_ml甘肽S-轉移1，CR407640.1，AK130948.1，BC0254酶216.121LRP3低密度脂蛋NM_002333.1，AB009462.1，BC00740Hs00233925_ml白受體-相8.2關蛋白322PIK3CG磷酸肌醇NM_002649.2，X83368.1，AF327656.Hs00176916_ml-3-激酶，催1，BX648341.1，BC035683.1化性，γ多肽23BMP7骨形態發生NM_001719.1，M60316.1，X51801.1，Hs00233477_ml蛋白7(成BC008584.1，BC004248.1骨蛋白1)24TP53I3腫瘤蛋白NM_147184.1，NM_004881.2，AF010Hs00153280_mlp53誘導型309.1，BC000474.2，BC018819.2，BTO蛋白307149.1，AK223382.1數量基因代號基因名稱NCBI參比基因試驗ID25BAGlBCL2-相關NM_004323.3，Z35491.1，AF022224.1Hs00185390_ml永生基因，U46917.1，AFl16273.1，BC001936.1.(athanogeneBC014774.1，AK096038.1，AK222749).126MINAMYC誘導NM_032778.3,AK027299.1,AY3905Hs00262155_ml的核抗原36.1，CR627479.1，AB083190.1，AY302110.2，AY456380.1，BC014928.1，AB083189.127BCL2B—細胞NM_000633.2，M13994.1，M14745.1，Hs00608023_mlCLL/淋巴X06487.1，BC027258.1瘤228DNMT2DNA(胞嘧NM_004412.3,NM_176081.1,NM_17Hs00189402_ml啶-5-)-甲基6083.1，NM_176084.1，NM_176085.1，轉移酶2NM_176086.1，AJ223333.1，AF012128.1，AF045888.1，AF329944.1，AF329940.1，AF329941.1，AF329942.1，AF329943.1，CR450316.1，BX537961.1，BCO47733.129SCUBE2信號肽，NM_020974.1，AK131552.1，AK1230Hs00221277_mlCUB結構39.1域，EGF-樣230PRKCA蛋白激酶C，NM_002737.2，X52479.1，AB209475.Hs00176973_mlα131ILll白介素11ΝΜ_000641.2，Χ58377.1，Μ57765.1，Hs00174148_mlBC012506.132GLIl神經膠質瘤NM_005269.1，X07384.1，BC013000.Hs00171790_ml-相關癌基2因同源物1(鋅指蛋白)33GLI2GLI-KruppeNM_030379.1,NM_030380.1,NM_03Hs00257977_ml1家族成員0381.1，NM_005270.2，AB007295.1，AGLI2B007296.1，AB007297.1，AB007298.1，AB209354.1，DQ086814.134BCL7AB-細胞NM_001024808.1,NM_020993.3,X8Hs00277139_mlCLL/淋巴9984.1，BC094723.1瘤7A35MUCl粘蛋白1，NM_001018016.1,NM_001018017.1,Hs00159357_ml跨膜NM_001018021.1，NM_002456.4，M34088.1，M34089.1，J05581.1，X80761.1，X52229.1，U60259.1，U60260.1，AF125525.1，AF348143.1，AY327582.1，AY327584.1，AY327585.1，AY327586.1，AY327587.1，AY336NRP2神經粗蛋白NM_018534.3，NM_201264.1，NM_20Hs00187290_ml21266.1，NM_201267.1，NM_201279.1，NM_003872.2，AF016098.1，AF022859.1，AF022860.1，BC009222.2，AF280544.1，AF280545.1，AF280546.1，BX537423.1，AK130198.1，AL833606.137WDHDlWD重復序ΝΜ_001008396.1,NM_007086.2,AJOHs00173172_ml列和HMG-06266.1，AK001538.1，AK001585.1，A盒DNA結K001620.1，BC063041.1數量基因代號基因名稱NCBI參比基因試驗ID合蛋白138ACSL6酰基-CoAΝΜ_001009185·1，ΝΜ_015256·2，ABHs00362960_ml合成酶長鏈020644.1，AF099740.1，AF129166.1，B家族成員6C026161.1，BC047453.140MFHASl惡性纖維組NM_004225.1，AB016816.1，BC01422Hs00180264_ml織細胞瘤擴6.2增序列142NMTlN-肉豆蔻酰NM_021079.3，M86707.1，AF020500.Hs00221506_ml基轉移酶11,AF043324.1，BC008312.2，BC008579.1，BC006538.2，BC006569.2，BC007258.243UQCRC2泛醇-細胞NM_003366.2,J04973.1，BC000484.2，Hs00268685_ml色素C還原BC003136.1，AK094006.1酶核心蛋白II44EPOR促紅細胞生NM_000121.2，M34986.1，M60459.1，Hs00181092_ml成素受體BC019092.2，AK074082.145RARG視黃酸受NM_000966.3，M57707.1，M38258.1，Hs00171273_ml體，YBC064524.1,BC072462.1,BC019098.2，BC093729.1，BC093727.1，BC098421.146CAMK4依賴于鈣-ΝΜ_001744·3，L17000.1，L24959.1，DHs00174318_ml鈣調蛋白的30742.1，BC025687.1，BC016695.1蛋白激酶IV47SH2D1ASH2結構域NM_002351.1，AL023657.1，AF07293Hs00158978_ml蛋白1A，0.1，AF073019.1，AF100539.1，AF1005鄧肯病(淋41.1，CR542031.1，CR542043.1，BC02巴細胞增生0732.1綜合征)480V0L2ovo-樣2(果NM_021220.2,AL079276.1,AK0222Hs00221902_ml蠅)84.1,BC006148.1，BT007295.149VEGF血管內皮生ΝΜ_001025366.1，ΝΜ_001025367.1，Hs00900054_ml長因子ΝΜ_001025368.1，ΝΜ_001025369.1，NM_001025370.1，NM_003376.4，AB021221.1，AJ010438.1，M32977.1，M27281.1，X62568.1，AF022375.1，S85192.1，AF091352.1，AF214570.1，BC065522.1，AY263145.1，50LAMBl層粘連蛋NM_002291.1，BC026018.2，M61916.Hs00158620_ml白，β1,BX648251.153WNT3A無翅-型ΝΜ_033131·2，ΑΒ060284.1，ΑΚ0562Hs00263977_mlMMTV整78.1合位點家族成員3A54CDC6CDC6細胞NM_001254.3，U77949.1，AF022109.Hs00154374_ml分裂周期61,BC025232.1同源物(釀酒酵母)55MYBL2v-myb^髓NM_002466.2,X13293.1,BC007585.Hs00231158_ml細胞血癥病1，BC053555.1，BU178833.1，AK2234數量基因代號基因名稱NCBI參比基因試驗ID毒癌基因同82.1源物(禽)-樣256WNTlOB無翅-型NM_003394.2，U81787.1，X97057.1，AHs00559664_mlMMTV整B070724.1，BC096353.1，BC096354.1，合位點家BC096355.1，BC096356.1族，成員IOB57MMPll基質金屬蛋NM_005940.3，X57766.1，CR602252.Hs00171829_ml白酶11(間1，CR612686.1，CR626443.1，AK0754充質溶解素48.1，BC057788.1，AK129792.1，AK123)5911.158RND3Rho家族NM_005168.3，X95282.1，S82240.1，CHs00170603_mlGTP酶3R542038.1，CR542070.1，X97758.1，BC012513.1，AF498969.1，BT006769.159CTSL2組織蛋白酶NM_001333.2，AB001928.1，Y14734.Hs00952036_mlL21，AF070448.1，BC067289.1，AY358641.160CSTB抑半胱氨酸NM_000100.2，L03558.1，BC010532.1Hs00164368_ml蛋白酶蛋白，BC003370.1，CR542148.1，BT007040B(stefinB).161CD68CD68抗原ΝΜ_001251·1，S57235.1，BC015557.2Hs00154355_ml，BT009923.1，AK222492.1，AK222514.164WNT2無翅-型NM_003391.1，X07876.1，BC078170.Hs00608224_mlMMTV整1，BT019608.1，AK056742.1，BC02985合位點家族4.1成員265TP53腫瘤蛋白NM_000546.2，K03199.1，M14694.1，Hs00153349_mlp53(李弗M14695.1，X02469.1，X60011.1，X600勞明綜合12.1，X60013.1，X60014.1，X60015.1，征)X60016.1，X60017.1，X60018.1，X60019.1，X60020.1，X01405.1，AF307851.1，BC003596.1，BT019622.1，AB082923.1，AY429684.66MKI67單克隆抗體NM_002417.2，X65550.1，X65551.1，AHs00606991_mlKi-67鑒定J567756.1的抗原67KRASv-Ki_ras2NM_004985.3,M54968.1,BC013572.Hs00270666_mlKirsten大2，AF493917.1，BT007153.1鼠肉瘤病毒癌基因同源物68STK6絲氨酸/蘇NM_003600.2，AFOl1468.1，AL71107Hs00269212_ml氨酸激酶65.170BIRC5桿狀病毒NM_001012271.1，NM_001168.2，AFHs00153353_mlIAP重復-077350.1，BC008718.2，AB028869.1，含有5(生BC065497.1，CR541740.1，BC034148.存素)1，ΑΚ223428·171ERBB2v-erb_b2成NM_01005862.1,NM_004448.2,XOHs00170433_ml紅細胞白血3363.1，Ml1730.1，AK131568.1，BC08數量基因代號基因名稱NCBI參比基因試驗ID病病毒癌基0193.1因同源物2，神經/成膠質細胞瘤衍生的癌基因同源物(禽)72CCNBl細胞周期蛋NM_031966.2，M25753.1，BC006510.Hs00259126_ml白Bl2,BT020128.173CDK2AP1CDK2-相關NM_004642.2,AB006077.1,AF00648Hs00428063_ml蛋白14.1，BC034717.174CCNDl細胞周期蛋NM_053056.1，M73554.1，M74092.1，Hs00277039_ml白DlM64349.1，X59798.1，BC000076.2，CR(PRAD1536538.1，CR542099.1，BT019844.1，B甲狀旁腺腺T019845.1，BC001501.2，BC014078.2，瘤病1)BC025302.1，BC023620.275RHOHRas同源物ΝΜ_004310·2，Z35227.1，BG025818.Hs00180265_ml基因家族，1，BC014261.2，CD703012.1成員H76CTSL組織蛋白酶NM_145918.1，NM_001912.2，X1245Hs00377632_mlL1.1，AF217997.1，CR457053.1，AK055599.1，AK075100.1，BX537395.1，BX647101.1，BX647102.1，BX647413.1，BX647434.1，BX647435.1，BX648848.1，BX648849.1，BX649140.1，BCO12612.1，AL832167.177DUSP6雙特異性磷NM_001946.2，AB013382.1，X93920.Hs00169257_ml酸酶61，BC005047.1，BC003562.1，BC003143.1，CR593797.1，BC037236.1，AK091753.1，BT006895.1，DQ895701.178MMD單核細胞至NM_012329.2，X85750.1，BI546449.1，Hs00202450_ml巨噬細胞分BC026324.1，AY424289.1化-相關79STATl信號轉導物NM_139266.1，NM_007315.2，M9793Hs00234829_ml和轉錄的激6.1，M97935.1，BC002704.2，CR61828活物1，6.1，CR749636.1，AK096686.1，BT0079IkDa241.1,AK225853.180ERBB3v-erb_b2成ΝΜ_001005915.1，ΝΜ_001982.2，M2Hs00176538_ml紅細胞白血9366.1，M34309.1，S61953.1，BC00270病病毒癌基6.2，CR621450.1，BC082992.1，BM837因同源物3872.1，BT007226.1(禽)81LCK淋巴細胞-NM_001042771.1,NM_005356.3,UO特異性蛋白7236.1，M36881.1，X13529.1，X05027.酪氨酸激酶1，U23852.1，AF228313.1，CR594236.1，AJ865079.1，AK098027.182TBPTATA盒結ΝΜ_003194·3，M55654.1，Z22828.1，XHs00427620_ml合蛋白54993.1，M34960.1，CR456776.1，CR590323.1，CR612496.1，CR618783.1，BT019657.1，BC109054.1，BC109053.1，BCl10341.1數量基因代號基因名稱NCBI參比基因試驗ID8318S真核18SX03205.1Hs99999901_slrRNA84P0LR2A聚合酶NM_000937.2，X63564.1，BC067295.Hs00172187_ml(RNA)II1(DNA指導的)多肽A，220kDa持家基因不再使用(暗灰色=一式兩份)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage31</image><image>imageseeoriginaldocumentpage32</image>....-..·Γ.-ζ.ζ.866,116ESO0O6ιηρη596二浮Ζ.9shst7(NissMZZOS9!rlο/ΛΙα#&=:這-:solslz.66,0Sl￡68G051S0Oo6so_0αζειηΓΟISKHO10￡(Ν9>8寸εοοPnffsεοιιη908οο￡888ΠΙειηεS69009631卜69990S氏29￡.09<ΝΚΡ&610ΓΖ,Ss-.O86868Ν·εS6t>&rn,088ΓΠ66Γ0R￡6sr99CS150O9Ν1960S4S.06寸S6寸<Ν卜9￡1寸ESlSOS^s一fKorrngggtsrοικο浮一μ二O〔rnrn寸986Ηs2s,l9ι/ζε9·Π二69_06r)tl9ro6ZSV10160KS0S06Z寸―8S800/.,{NSOSSO96rns6ro6S88190S.￡Psdεε6￡寸60f:6ro<Ν38ι6·Ssiro8寸ΙΠ寸rMlsorzS81697./.89isST5ε9ι6819ΙΛ1寸LVi860UOIΝζ,ιοπεο(Nsol苳5二￡,1i^s86ΓS寸Π1·1η92ιη.9Α=8ε·ι8lrlu-l9rJ9O9Ε3(Ν9ε9·_6R000S6is6066Ζ.196(NsltsoS669OS59Z.寸κοο寸9o-^lo68ε5^S-OZl￡iNs69(s(N6s寸SOS8959OΡ[:21666Ζ.06Ι6Γη8εποκ6ε6οεΗοο8069396S90"rs寸9￡soΞ￡ssllo.t(Νδδ.οεδεοΓΟS56SOS68二6ι￡6ιζεο98α6οEss寸ntsro6Π9958696586rN80CNo60tSssOOZXSOO9Π=:￡§S5Ι寸6st69一S寸~ε69￡9r-09rnKCN寸91ΚΛε19//1寸.0ΚΡ2s￡iNlalooS6CNSO8689005i.o￡6ε6ποKsoo-§0.0ιλο.οS860OK690009ε3Ν0·0πζ.=0Sz69ΚΚΙΕ69寸SOSsoro6515S5S.06α5S6LK0κκΓΟ00Z6SS0Ssso59169*00￡66€{νSzε09ιοοΡ8000Sso寸ε§99Γε￡6<Ν689Κ寸6Γ0？oosniO/Aia#81S96(NΓΓηοοΝ^ssε600￡9οisw.dsOSr-ΡΟ二oolslS5K.0δεδUdroS361O^FSiK898O9s3ro9sloro6SSS9寸S6οοΝ3〕￡98πΓΝκοΓηοοτgiNslσν卜OS50pin.0oosr-l寸9s8a,lNS960·ILsr-lros66roS(NSs寸6959Γ09S3OlfN￡s8OS986.0(NSISOSR々O90S6ST6AooPK0Z.6S9寸I卜Ko寸G6L91Oρζnss9寸sa9ZOεκ6Γ0穿UZ-O966&Γ08ΚΚ9Εε6.ε6898CS寸SS69寸98lsro<N6tpl,0βSS3S5601OΚ989Γ0ggseoP^s1839Γ0εκοοΖΓΟIaKrO^1.0S^sP96S.09ΖΚΓ08Sε3ε寸SlH卜寸60·03/.寸寸189sroS960￡tζ.6￡εεο60ΠΠsoo89ro6LKiN8o8ns寸snKOSs81868ΓΙ￡915600i§.0sKfsros(N6sro二9ΚΓ0εειποοZszsro-SiSSOrO90SH.0二ouroIsSS5.0ΔκοοΟsnlro(N590一ilol^oS6Z.SOPKSO8180sssoοο0οο6ε(Ν6Κ6Π8903Γ0JZZΚΡΖΓΟ19380.08619二,96ΚΠ0επαο二86S0￡09960.010886SOeiefss.os9z.nO二ΙS6S2O9Η96K:Krisooso.o§BSI寸196Γ0/.ΠΠοο￡9οεοοζ.6Π紹Κ80ispKOsiNscosiNurnoasono6ΠS寸6ΠΠ，610soooooslsro-SSO6oofsso8OO1/.S0661(Νεο(N66IS6piNavso19'ssoK9ao_o0ΠnooSKoεοοδ寸6Γ0ssr-yoS909T0SKlSO91908Γ0S5SOS^ssofsro30ssiNlζεΝεο寸，1ιε6εεο.οZ.199S0mou.oSssd§Bd6ssroU9i9n_rPZIMZ.Oε9η6Γ05Ζ.6ΡΙ6srnHOπι<NS191sKKrl8S/.61Oοο96εεΓ090s￡<slSps00S8SOζ,ει6551.09ε3￡siroZ二60fNiNH_0ssuoKstrolDgroιοοοο2Κ/.0εεοκΓΟεζκΓι99606ssooro32二，0IS900Q.0Sl5690ερκΓΟSs-O9寸ιιο1寸3.08i6iNSOIgsoO616160Fssεεο·Τν60οSPHOosiNdO5S5S0agcoOAooS-3.0￡95300.13Γ9εο16062:0-SR3is.oSsr-ΓΟ985999O06必SI9rs^SS-O00ZS19OS86dnnpfi^69so<N寸68Ρoolrigoos.o16S6OSZ.S6O96090,1ZusroOMSw-les9iSososlst.op￡6rolss￡oGsoo￡8^900ΙΙΝκΓΟssr-roe9sz.9_0sissSeso9(6￡ι￡·U009S06fos09ze9sitror-Ksrol9s6ros899roιοιοοεεοS6996O>009·S9OSfro9￡90u(s￡ossosopss.oS-SoS16009S0SO616SO998S.0RnSOΗοοοοεοr-pooSOS=SO93SS968ZροοΝ.οζζεεοεοοεο(Ν6οooulslsooooKroS9S0.￡6§(Ν6Γ0rnsisOSs寸ilsooroS.]<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>oocnrs·寸z,￡5soοοσ>ρ(ΝιοS5CN.09^620s989s.l9s9tEOSOOSSOζ,ΙΟΔβ91<Ν819ssoolooWi-ει^πτS」SOCNS63O9nt6loRtsso§0089fs61^Osrocs二S9180OAssroΝοοΔΙΟΟΖ.Γ0￡S906(NSioosi^.oSS91“30(slz.d￡9001馮8809596SIZ.O91二ΓΙOo一苕_οS-ISZ.860Zl6srn6_i(N^sioKCNS.OIZlSrIWI^$3r-lois.osoo6o_!:99S9Z/0^ss86161Γ4NsQ.oS2S;66iLSo8S500990CN60S60990s6KtfN^io^IS80iN,08UIUIS86Z.9OLZlLWZ11S601￡66(n￡oosusz.o*o(ss9roL6S990ssloo.oIKO9snln_0Oo寸608A.080Δ36￡ι(Ν60·19S661·寸soor-o.l9ε￡οο1ΓΕ8SI90O106506896￡8I56SS.IS60Z.9Osoooln9osooooaOlesKSnooso9寸69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0Κ9699Sssο/ΛΙα#SOCNSTpfsazS516Tο/ΛΙα#^ioο/Λδ#Ut680-寸s(Nroft669o_S06Z.909r99-T6ιρδ·SSZ.60-工寸S-H·95S9￡8(Ν9Ζ.0ΠSslo-￡8S8O-9850ε-寸sso.o6S8O-ιοαοι-S86r0-￡86￡0rs-Ssrz-L6一εη-69S二1PS6.1-ooioiNlo-Sls.SS6TΖε66·0-？90+0-寸Sfo-3Ζ6Ζ.6+1-Π3Γ0-16ε006·ι-S9￡rnz-lKll-sl65_o58SCN-PL60O-Μοοιι丨ε5ιπ·3￡08吋CNn<stsOaoonl-￡8Tt-sro-εοεΓ.ε6ιζ.￡·ι-96S9O-寸6εε8ε·08<Ν969-<Λκε-二9￡一，1-9ts<N-V98s8(n-ssoqooo々ΜΟΟΟΙ-CNIS00S0-π-οιε,一srnfsto-s^-.o.rnsisO-6κΓε-lloosl-Π96606683εlsQO6Ιειη0Γιο/Λ1α#δ9^6·1oy>IQ#ssr.o5t988oo笤066Π866195Κ6ε9ε·Ssso-HiISVHJS-O寸Sguv-OOECSCDIM-9EGiisVSOH-寸￡ΖΙΟ·E￡50-isrnrd,!￡ssroinMHiQ·、οεa413.:2風險評分分析為連續變量3與所有其他患者相比，該階段的HR是I期患者，基因標志基因名稱NCBI參比基因FZD7Frizzled同ΝΜ_003507·1，ΑΒ017365.1，BC015915.1源物7WIFlWNT抑制ΝΜ_007191·2，AF122922.1，ΒΧ647427.1，B因子1C018037.1，ΑΥ358344.1FUT3巖藻糖轉移ΝΜ_000149·1，U27326.1，U27327.1，U2732酶38.1，AF131913.1NXFl核RNA輸ΝΜ_006362.3，AJ132712.1，U80073.1，AFll出因子12880.1，AF126246.1，ΑΚ027192.1，BC004904.2，CR749674.1，ΑΒ209915.1，BC028041.1ASMTL乙酰血清素ΝΜ_004192·1，ΑΚ001090.1，BC010089.2，B0-甲基轉移C002508.2，ΑΚ090498.1酶-樣CTNNBl連環蛋白，ΝΜ_001904·2，Ζ19054.1，Χ87838.1，ΑΒ062βl，88kDa292.1，BC058926.1SH3BGR富含SH3結NM_001001713·1，NM_007341.2,X93498.1構域結合谷，BC006371.2，BM474020.1氨酸的蛋白ARAFv-raf鼠肉ΝΜ_001654·1，Χ04790.1，BC007514.2，BCO瘤3611病02466.2，ΒΤ019864.1，ΑΚ130043.1毒癌基因同源物TYROBPTYRO蛋白ΝΜ_198125·1，ΝΜ_003332·2，AF019562.1，酪氨酸激酶AJ010098.1，BCOl1175.1，CR450342.1，CR5結合蛋白42202.1，ΑΥ074782.1，BQ576278.1，ΒΤ009851.1LRP3低密度脂蛋ΝΜ_002333·1，ΑΒ009462.1，BC007408.2白受體-相關蛋白3PIK3CG磷酸肌醇ΝΜ_002649·2，Χ83368.1，AF327656.1，ΒΧ6-3-激酶，催48341.1，BC035683.1化性，γ多ΒΜΡ7骨形態發生ΝΜ_001719·1，Μ60316.1，Χ51801.1，BC008蛋白7584.1，BC004248.1ΤΡ53Ι3腫瘤蛋白ΝΜ_147184·1，ΝΜ_004881·2，AF010309.1，ρ53誘導型BC000474.2，BC018819.2，ΒΤ007149.1，AK蛋白3223382.1BAGlBCL2-相關ΝΜ_004323·3，Ζ35491.1，AF022224.1，U469永生基因17.1，AFl16273.1，BC001936.1，BC014774.1，ΑΚ096038.1，ΑΚ222749.1MINAMYC誘導ΝΜ_032778·3，ΑΚ027299.1，ΑΥ390536.1，C的核抗原R627479.1，ΑΒ083190.1，ΑΥ302110.2，ΑΥ45基因標志基因名稱NCBI參比基因6380.1，BC014928.1，ΑΒ083189.1BCL2B-細胞ΝΜ_000633.2，Μ13994.1，Μ14745.1，Χ0648CLL/淋巴7.1，BC027258.1瘤2DNMT2DNA-甲基ΝΜ_004412.3,NM_176081.1,ΝΜ_176083.轉移酶21，ΝΜ_176084.1，ΝΜ_176085.1，ΝΜ_176086.1，AJ223333.1，AFO12128.1，AF045888.1，AF329944.1，AF329940.1，AF329941.1，AF329942.1，AF329943.1，CR450316.1，ΒΧ537961.1，BC047733.1SCUBE2信號月太，NM_020974.1,ΑΚ131552.1,ΑΚ123039.1CUB結構域，EGF-樣2PRKCA蛋白激酶C，ΝΜ_002737.2，Χ52479.1，ΑΒ209475.1αILll白介素11ΝΜ_000641.2，Χ58377.1，Μ57765.1，BC012506.1GLIl神經膠質瘤ΝΜ_005269.1，Χ07384.1，BC013000.2-相關癌基因同源物1GLI2GLI-KruppeNM_030379.1,NM_030380.1,ΝΜ_030381.1家族成員1，ΝΜ_005270.2，ΑΒ007295.1，ΑΒ007296.1，GLI2ΑΒ007297.1，ΑΒ007298.1，ΑΒ209354.1，DQ086814.1BCL7AB-細胞ΝΜ_001024808.1，ΝΜ_020993.3，Χ89984.1CLL/淋巴，BC094723.1瘤7AMUCl粘蛋白1,NM_001018016.1,NM_001018017.1,NM_跨膜001018021.1，NM_002456.4，M34088.1，M34089.1，J05581.1，X80761.1，X52229.1，U60259.1，U60260.1，AF125525.1，AF348143.1，AY327582.1，AY327584.1，AY327585.1，AY327586.1，AY327587.1，AY3NRP2神經粗蛋白NM_018534.3，NM_201264.1，NM_201266.21，NM_201267.1，NM_201279.1，NM_003872.2，AF016098.1，AF022859.1，AF022860.1，BC009222.2，AF280544.1，AF280545.1，AF280546.1，BX537423.1，AK130198.1，AL833606.1NM_001008396.1，NM_007086.2，AJ006266.1，AKOO1538.1，AKOO1權利要求一種為對象的肺癌提供預后的方法，所述方法包括以下步驟(a)將該對象的生物學樣品與各自特異性結合一組生物標記物中一種成員的試劑接觸，所述生物標記物包括ctnnb1、wnt3a、tp53、kras、erbb3、muc1、erbb2和dusp6；和(b)測定所述標記物在該樣品中是否差別表達；從而提供肺癌的預后。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是核酸。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是寡核苷酸。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是PCR引物組。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是抗體。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺癌是肺腺癌。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述肺腺癌癌是I期。8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述肺腺癌是II期。9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述肺腺癌是III期。10.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述肺腺癌是IV期。11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品來自外科手術切除的腫瘤。12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品來自肺組織或肺腫瘤活檢。13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述預后提供長期死亡率的高或低風險評估。14.一種裝有試劑的試劑盒，所述試劑各自特異性結合一組生物標記物中一種成員，所述生物標記物包括ctnnbl、wnt3a、tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2和dusp。15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述試劑是PCR引物組。16.一種提供患肺癌對象的預后的方法，包括定量測定生物學樣品中至少兩種選自下組的生物標記的表達水平rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagUemx2,six3和brcal，其中，所述生物學樣品源自所述對象，而所述表達水平是所述預后的標志。17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述表達水平是mRNA表達水平。18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述定量測定包括定量rtPCR。19.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述表達水平是蛋白質表達水平。20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，采用抗體結合試驗定量測定所述表達水平。21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗體結合試驗是ELISA。22.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括定量測定生物學樣品中至少三種生物標記的表達水平。23.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括定量測定生物學樣品中至少四種生物標記的表達水平。24.如權利要求16-23中任一項所述的方法，其特征在于，包括至少四種生物標記，其中所述至少四種生物標記包括erbb3、lck、wnt3a和rdn3。25.如權利要求16-23中任一項所述的方法，其特征在于，包括至少四種生物標記，其中所述至少四種生物標記包括erbb3、lck、wnt3a和rdn3。26.如權利要求16-23中任一項所述的方法，其特征在于，所述生物學樣品是血液樣品27.如權利要求16-23中任一項所述的方法，其特征在于，所述生物學樣品是腫瘤活檢。28.如權利要求16-23中任一項所述的方法，其特征在于，所述生物學樣品是肺活檢。29.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述表達水平是蛋白質表達水平與mRNA表達水平的組合。30.一種提供患肺癌對象的預后的方法，所述方法包括檢測生物學樣品中至少兩種選自下組的生物標記的甲基化水平:rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apUbagUemx2、six3和brcal；其中，所述生物學樣品源自所述對象，而所述甲基化水平是所述預后的標志。31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法包括定量測定生物學樣品中至少三種生物標記的表達水平。32.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法包括定量測定生物學樣品中至少四種生物標記的表達水平。33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述至少四種生物標記包括erbb3、lck、wnt3a禾口rdn3。34.一種包括患肺癌對象的預后的報道，所述預后通過定量測定該對象的生物學樣品中至少兩種選自下組的生物標記的表達水平來測定rnd3、wnt3a,erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3和brcal；其中，所述表達水平是所述預后的標志ο35.如權利要求34所述的報道，其特征在于，包括定量測定生物學樣品中至少三種生物標記的表達水平。36.如權利要求34所述的報道，其特征在于，包括定量測定生物學樣品中至少四種生物標記的表達水平。37.如權利要求36所述的報道，其特征在于，所述至少四種基因包括erbb3、lck、wnt3a禾口rdn3。38.一種包括生物學樣品的基因表達概況的報道，所述生物學樣品從患肺腺癌的對象分離，所述基因表達概況包括至少兩種選自下組的生物標記的表達水平rnd3、wnt3a,erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3禾口brcal。39.如權利要求38所述的報道，其特征在于，包括定量測定生物學樣品中至少三種生物標記的表達水平。40.如權利要求38所述的報道，其特征在于，包括定量測定生物學樣品中至少四種生物標記的表達水平。41.如權利要求40所述的報道，其特征在于，所述至少四種基因包括erbb3、lck、wnt3a禾口rdn3。全文摘要本發明提供為肺癌提供預后的方法，該方法利用在肺癌中差別表達的一組八種分子標記物。文檔編號C12Q1/68GK101821405SQ200880101348公開日2010年9月1日申請日期2008年5月30日優先權日2007年6月1日發明者D·J·拉茲,D·M·雅布隆斯申請人:加利福尼亞大學董事會