專利名稱：：外遺傳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及遺傳學(xué)(更明確的說，是外遺傳學(xué)(印igenetics))領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用于調(diào)查生物體的單倍體狀態(tài)的外遺傳特征的方法。
背景技術(shù)：
：外遺傳繼承指信息自細胞或多細胞生物體傳遞給后代，該信息不是在基因的核苷酸序列中編碼的。一種類型的外遺傳繼承是DNA甲基化，其已經(jīng)被證明涉及多種人類疾病。例如，DNA甲基化譜型中的變化在諸如癌癥、Beckwith-Wiedemann綜合征、Prader-Willi綜合征和Angelman綜合征等病癥中是常見的。還知道DNA甲基化涉及在人類發(fā)育過程中調(diào)控基因表達。認為啟動子區(qū)的重度甲基化在轉(zhuǎn)錄下調(diào)中是重要的，由此提供基因表達的"開關(guān)"。DNA甲基化是通常發(fā)生于CpG位點(即DNA序列中胞嘧啶后面直接跟著鳥嘌呤的地方)的外遺傳修飾；所述甲基化導(dǎo)致胞嘧啶轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶。Me-CpG的形成是由酶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化的。CpG位點在脊椎動物基因組中是不常見的，但是常常以較高密度見于脊椎動物基因啟動子附近，在那里它們統(tǒng)稱為CpG島。這些CpG位點的甲基化狀態(tài)能具有對基因活性和/或表達的重大影響。甲基化樣式最近已經(jīng)成為一項重要研究課題。例如，DNA低甲基化(甲基化減少)和DNA超甲基化(甲基化增多)都已經(jīng)與檢驗在正常與癌性組織間差異甲基化的基因的研究聯(lián)系起來。已經(jīng)與改變的甲基化聯(lián)系起來的癌癥相關(guān)基因包括那些涉及細胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、RAS信號傳導(dǎo)和侵入的。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在正常組織中，基因的甲基化主要局限于編碼區(qū)，其中CpG不多。相反，基因的啟動子區(qū)是未甲基化的，盡管該區(qū)中有高密度的CpG島。甲基化的程度在基因調(diào)控中也可能是重要的。在癌癥中，逐漸發(fā)生外遺傳介導(dǎo)的基因沉默。它以轉(zhuǎn)錄的微小降低開始，促使對CpG島免于側(cè)翼異染色質(zhì)和甲基化蔓延進入該島的保護降低。此損失導(dǎo)致各CpG位點逐漸增多，其在相同基因在不同細胞中的拷貝間有變化。另一種類型的外遺傳繼承源自DNA相關(guān)蛋白的影響。例如，已知組蛋白的乙?；癄顟B(tài)能影響與它們結(jié)合的基因的表達。認為某些組蛋白的乙?；瘜?dǎo)致基因沉默，因為DNA在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的包裝更密。雖然現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)披露了對DNA和相關(guān)蛋白的外遺傳修飾與表型之間的聯(lián)系，但是該相互作用是復(fù)雜的且尚未完全闡明。本發(fā)明的一個方面是克服或減輕現(xiàn)有技術(shù)的問題來提供利用對DNA的外遺傳修飾的樣式和相關(guān)蛋白樣式來將表型歸于以前認為可能的生物體以外的生物體的方法。僅僅出于為本發(fā)明提供背景的目的，在本說明書中包括關(guān)于文件、動作、材料、裝置、制品等等的討論。沒有提示或表示任何或所有這些事物構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的公知常識，就因為它在本申請每一項權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前就存在了。4發(fā)明概述在第一個方面，本發(fā)明提供了一種用于獲得多倍體受試者的外遺傳信息的方法，該方法包括下列步驟自所述受試者獲得生物學(xué)樣品，所述樣品含有(i)至少一種父本衍生DNA分子禾口/或相關(guān)蛋白(atleastonepaternally—derivedDNAmoleculeand/orassociatedprotein)禾口/或(ii)至少一禾中母本衍生DNA分子禾口/或相關(guān)蛋白(atleastonematernally—derivedDNAmoleculeand/orassociatedprotein);對任——禾中或多禾中所述父本或母本衍生DNA分子或相關(guān)蛋白分析修飾的存在或缺失，其中所述分析步驟確定任兩處修飾是以順式存在于一條染色體上還是以反式存在于兩條姐妹染色體間。申請人:提出外遺傳分析分開考慮母本衍生DNA(和相關(guān)蛋白)和父本衍生DNA(和相關(guān)蛋白)。這樣，重要的是要測定受試者的確定性外遺傳表征(definitive印igeneticcharacterization)，此表征提供例如疾病與受試者外遺傳狀態(tài)之間的新聯(lián)系。相反，現(xiàn)有技術(shù)的方法提供"平均"結(jié)果，因為將母本和父本DNA和相關(guān)蛋白的外遺傳修飾相加了。在所述方法的一種形式中，所述分析步驟確定所述修飾可歸于父本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白還是母本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白。在另一個實施方案中，所述修飾的存在或缺失能夠在體內(nèi)調(diào)控所述DNA分子的表達。在所述方法的一種形式中，所述分析步驟包括使用物理方法自母本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白實質(zhì)性分離父本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白。所述物理方法可以是自母本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白激光介導(dǎo)地剝離父本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白。所述分析步驟也可包括能夠與母本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白相比選擇性分析父本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白的原位方法。所述原位方法容許探查多倍體材料來提供確定性單倍體外遺傳信息，使之不必將母本與父本DNA分子物理分開。在所述方法的另一種形式中，所述DNA分子或相關(guān)蛋白存在于二倍體細胞中或是自二倍體細胞獲得的。雖然配子含有單倍體信息，但是這些細胞可能難以在臨床中獲得和/或提供關(guān)于體細胞中存在的外遺傳修飾的不正確信息。在本發(fā)明的另一種形式中，在所述分析步驟是對DNA實施的情況中，所述修飾是甲基化。所述分析可以使用任何合適的方法來執(zhí)行，然而，通常，對一個或多個位點分析甲基化的存在或缺失的步驟包含選自下組的方法使用亞硫酸氫鹽處理進行的DNA測序(DNAsequencingusingbisulfitetreatment)、限制性界標(biāo)基因組掃描(restrictionlandmarkgenomicscanning)、甲基化敏感性任意弓|發(fā)PCR(methylation-sensitivearbitrarilyprimedPCR)、使用甲基化敏感性限制酶進行的Southern分析(Southernanalysisusingamethylation-sensitiverestrictionenzyme)、甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR)、自亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA擴增的PCR產(chǎn)物的限制酶消化(restrictionenzymedigestionofPCRproductsamplifiedfrombisulfite_convertedDNA)、及其組合。在所述分析是對蛋白質(zhì)實施的情況中，所述蛋白質(zhì)可以是組蛋白且所述修飾可以是乙?；?。由本方法提供的外遺傳信息能夠提供受試者的表型信息，諸如疾病、疾患、或病癥的存在或缺失；對疾病、疾患、或病癥的素因(predisposition);有或沒有能力響應(yīng)潛在治療性分子；有或沒有能力發(fā)起針對外來抗原或自身抗原的免疫應(yīng)答；變態(tài)反應(yīng)的存在或缺失；或?qū)ψ儜B(tài)反應(yīng)的素因。發(fā)明詳述在第一個方面，本發(fā)明提供了一種用于獲得多倍體受試者的外遺傳信息的方法，該方法包括下列步驟自所述受試者獲得生物學(xué)樣品，所述樣品含有(i)至少一種父本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白和/或(ii)至少一種母本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白；對任一種或多種所述父本或母本衍生DNA分子或相關(guān)蛋白分析修飾的存在或缺失，其中所述分析步驟確定任兩處修飾是以順式存在于一條染色體上還是以反式存在于兩條姐妹染色體間。就申請人所知，本文中公開的發(fā)明是首次領(lǐng)會到在經(jīng)由DNA和蛋白質(zhì)修飾研究外遺傳繼承時狀態(tài)(phase)的重要性。首次在外遺傳現(xiàn)象(諸如DNA的甲基化和DNA相關(guān)蛋白的乙酰化)上獲得了狀態(tài)特異性信息。因此，本發(fā)明提供了分辨位于兩個位點處的外遺傳修飾是存在于同一染色體上(即順式關(guān)系)或者一個位點存在于父本衍生的染色體上而另一個位點存在于母本衍生的姐妹染色體上(即反式關(guān)系)的能力。申請人提出，通過提供"平均"結(jié)果，當(dāng)前認可的使用母本衍生DNA和父本衍生DNA二者進行的外遺傳分析方法導(dǎo)致信息丟失。此信息在鑒定個體和群體中的狀態(tài)特異性外遺傳效應(yīng)等中是重要的。外遺傳學(xué)領(lǐng)域在遺傳學(xué)領(lǐng)域中是相對較新的，指關(guān)于不依賴生物體DNA內(nèi)特定核苷酸序列的基因組功能變化的研究。外遺傳學(xué)包括關(guān)于自一個細胞世代繼承給下一個世代的效應(yīng)的研究，不管這些是在胚胎形態(tài)發(fā)生、再生、正常細胞周轉(zhuǎn)、腫瘤、細胞培養(yǎng)、或單細胞生物體復(fù)制中發(fā)生的。感興趣的具體外遺傳過程包括副突變(paramutation)、書簽(bookmarking)、基因沉默(genesilencing)、X染色體失活(Xchromosomeinactivation)、位置效應(yīng)(positioneffect)、禾呈序重排(r印rogramming)、移位(transvection)、印記(imprinting)、母體效應(yīng)(maternaleffects)、至文癌作用的進展(theprogressofcarcinogenesis)、許多致畸原的效應(yīng)(theeffectsofmanyteratogens)、及對組蛋白修飾禾口異染色質(zhì)的調(diào)控(theregulationofhistonemodificationsandheterochromatin)。在本發(fā)明的一種形式中，所述分析步驟確定所述修飾可歸于父本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白還是母本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白。假定唯一需要的信息可以是任兩處修飾是順式還是反式存在的，那么這樣的確定可能不是嚴(yán)格必需的。在所述方法的另一種形式中，所述修飾的存在或缺失能夠在體內(nèi)調(diào)控所述DNA分子的表達。正如技術(shù)人員領(lǐng)會的，基因的表達(至少部分)受到外遺傳修飾(諸如DNA甲基化)的控制。DNA甲基化是一種DNA外遺傳修飾，有人提出它在真核生物中是普遍的。在人類中，大約1X的DNA堿基發(fā)生DNA甲基化。在成年身體組織中，DNA甲基化通常發(fā)生于CpG二核苷酸背景中；非CpG甲基化在胚胎干細胞中是盛行的。在植物中，胞嘧啶被對稱地(CpG或CpNpG)和不對稱地(CpNpNp)甲基化，其中N可以是任何核苷酸。在哺乳動物中，所有CpG中60-70X是甲基化的。未甲基化的CpG在存在于許多基因的5'調(diào)控區(qū)中的、稱作"CpG島"的簇中成群。在許多疾病過程中，諸如癌癥，基因啟動子CpG島獲得異常超甲基化，這導(dǎo)致可遺傳的轉(zhuǎn)錄沉默。轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)的強化是由能結(jié)合甲基化CpG的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的。這些稱作甲基-CpG結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)募集組蛋白脫乙?；负推渌苄揎椊M蛋白的染色質(zhì)重建蛋白，由此形成致密的、無活性的染色質(zhì)，稱作異染色質(zhì)。DNA甲基化與蛋白質(zhì)之間經(jīng)由染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的這種聯(lián)系與各種表型的形成有關(guān)。例如，已經(jīng)將甲基-CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)的丟失與Rett綜合征聯(lián)系起來，而且甲基_CpG結(jié)合域蛋白2(MBD2)在癌癥中介導(dǎo)超甲基化基因的轉(zhuǎn)錄沉默。雖然DNA相關(guān)蛋白與甲基化之間可能有相互作用，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括關(guān)于與DNA甲基化沒有關(guān)系的DNA相關(guān)蛋白的分析。如上所述，與DNA相關(guān)的蛋白質(zhì)可能涉及對基因表達的調(diào)控。例如，DNA的物理結(jié)構(gòu)(像它壓實成染色質(zhì)存在)能影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(稱作轉(zhuǎn)錄因子)和RNA聚合酶找到特定基因的入口并自它們激活轉(zhuǎn)錄的能力。染色質(zhì)是指示DNA在細胞內(nèi)存在的結(jié)構(gòu)的術(shù)語。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)經(jīng)由DNA與DNA結(jié)合蛋白的相互作用來確定和穩(wěn)定。有2類DNA結(jié)合蛋白。組蛋白是涉及致密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持的DNA結(jié)合蛋白的主要類別。有5種不同的組蛋白，鑒定為Hl、H2A、H2B、H3和H4。另一類DNA結(jié)合蛋白是一組多樣的蛋白質(zhì)，簡單地稱作非組蛋白蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)包括各種轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、激素受體和其它細胞核的酶。在任何給定細胞中，有超過1000種不同類型的非組蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合DNA。組蛋白對DNA的結(jié)合產(chǎn)生稱作核小體的結(jié)構(gòu)。核小體核心含有八聚體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其由H2A、H2B、H3和H4各2個亞基組成。組蛋白Hl占據(jù)核小體間DNA，而且被鑒定為接頭組蛋白。核小體核心含有大約150bpDNA。每個核小體之間的接頭DNA可以有變化，自20bp至超過200bp。若將DNA拉成線性結(jié)構(gòu)，則這些核小體核心結(jié)構(gòu)看上去像串上的珠子。核小體核心自身盤繞成螺線管形，其自身盤繞以進一步壓實DNA。這些最終的盤繞進一步壓實成在核型分析涂片中看到的特征性染色質(zhì)。染色質(zhì)的蛋白質(zhì)-DNA結(jié)構(gòu)通過附著至稱作核基質(zhì)的非組蛋白蛋白質(zhì)支架而得到穩(wěn)定。本發(fā)明包括對與DNA相關(guān)的任何蛋白質(zhì)的修飾，而且其中所述修飾能夠調(diào)控與之相關(guān)的基因的表達。例如，組蛋白翻譯后修飾(PTM)與陽性和陰性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)相關(guān)。關(guān)于這些PTM的作用的一種典型模型是響應(yīng)通向轉(zhuǎn)錄因子的胞質(zhì)信號傳導(dǎo)，由結(jié)合至DNA的激活物和RNA聚合酶跨越啟動子和可讀框建立發(fā)揮正作用的PTM。由跨越基因組異染色質(zhì)區(qū)的結(jié)合至DNA的阻抑物募集在阻抑期間跨越基因建立發(fā)揮負作用的標(biāo)志。這兩套修飾都改變核小體表面，這然后募集調(diào)控蛋白復(fù)合物。在本發(fā)明的背景中，組蛋白PTM包括但不限于對組蛋白3(H3)、組蛋白4(H4)、組蛋白2A(H2A)、組蛋白2B(H2B)的乙?；?；對H3、H2A和H2B的磷酸化；對H3和H4的精氨酸甲基化；對H3和H4的賴氨酸甲基化；對H2A和H2B的賴氨酸遍在蛋白化；對H2A和H2B的賴氨酸蘇素化；及H3中的脯氨酸異構(gòu)化；ADP核糖基化脫亞氨基(精氨酸轉(zhuǎn)變成瓜氨酸)。變體組蛋白H2AX、H3.1、H3.3和Hztl也通過PTM來修飾。此組蛋白PTM全集(稱作"組蛋白代碼")充當(dāng)供含有特定相互作用域的效應(yīng)器蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合表面。例如，乙?；艿讲剂_莫結(jié)構(gòu)域的識別，甲基化受到Royal家族(chromo、tudor、MBT)克羅莫樣結(jié)構(gòu)域和非相關(guān)PHD結(jié)構(gòu)域的識別，而磷酸化受到14-3-3蛋白質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域的識別。感興趣的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HAT)包括GNAT[GCN5(氨基酸合成普遍控制5)相關(guān)乙?；D(zhuǎn)移酶]家族、CBP/P300(CREB結(jié)合蛋白)家族、和MYST(MOZ、YBF2/SAS3、SAS2、TIP60蛋白)家族。這些HAT及轉(zhuǎn)錄因子和核-激素相關(guān)組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶還包括GCN5、PCAF(P300/CREB結(jié)合蛋白相關(guān)因子)、GCN5L(氨基酸合成普遍控制5樣2)、ELP3、P300(ela結(jié)合蛋白p300)、CBP(CREB結(jié)合蛋白)、TIP60、M0F/MYST1、M0Z(單核細胞白血病鋅指蛋白)/MYST3、MORF(MOZ相關(guān)因子)/MYST4、HBOl(與ORC結(jié)合的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶)/MYST2、ATF2、TAF1(TATA框相關(guān)因子1)、GTF3C4:通用轉(zhuǎn)錄因子3c、多肽4)、ACTR:激活素受體、SRC-1(類固醇受體共活化物1)/NC0A1/2(核受體共活化物1)、ACTR(激活素受體)、SRC-1(類固醇受體共活化物1)、CDYL和HAT1(組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶)。感興趣的組蛋白脫乙?；?HDAC)包括I類和11類HDAC(諸如HDAC1至HDAC8和HDAC10)及Sir家族的III類NAD依賴性酶(諸如SirT2)。感興趣的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)包括I型和II型精氨酸HMT(諸如PRMT1、PRMT4、PRMT5和PRMT7)及賴氨酸HMT。感興趣的賴氨酸HMT包括MLL(混和譜系白血病)1至MLL5、與酵母Setl蛋白具有同源性的Setl家族(包括SET1A和SET1B)、SET2、SYMD2、Pr-SET7/8、CLL8、NSD1、D0T1、SUV42H1/2、EZH2、RIZ1、SUV39H1/2、E薩Tase、GLP、ESET、SETDB1、和G9a。感興趣的精氨酸和賴氨酸脫甲基酶包括蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PMRT4、PRMT5、禾口CARM1)、LSD1、JHDMla、JHDMlb、JHDM2a、JHDM2b、JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C、禾口JMJD2D。感興趣的介導(dǎo)其它組蛋白PTM(諸如脫亞氨基、磷酸化、蘇素化和遍在蛋白化)的酶是PADI4、Bmi/Ring1A、RNF20/RNF40和Ubc朋)、單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶和多-ADP-核糖聚合酶、脯氨酸異構(gòu)酶和激酶諸如單激酶、MSK1/2、CKII和Mstl。其它感興趣的是結(jié)合甲基化DNA的蛋白質(zhì)，諸如甲基-CpG結(jié)合域(MBD)蛋白，包括MeCP2、MBDl-4、和MBD3L-1、和MBD3L-2。另外，由于RNAi在昆蟲、植物和真菌中涉及異染色質(zhì)形成，而且最近的工作提示脊椎動物中存在這些機制，因此本發(fā)明包括RNAi介導(dǎo)的染色質(zhì)修飾。技術(shù)人員熟悉用于分離DNA相關(guān)蛋白的方法。可以使用高效毛細管電泳、高效液相層析或質(zhì)譜術(shù)來檢驗總體DNA5-甲基胞嘧啶含量或組蛋白PTM。可以使用外遺傳分析(諸如限制性界標(biāo)基因組掃描)來檢驗單倍體遺傳材料，然而，對利用靶序列擴增(通常通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來進行)(諸如甲基化位點間擴增(AIMS))或差異甲基化雜交(DMH)的辦法特別感興趣。另外，那些利用檢測信號(諸如促進雜交靶物滾環(huán)復(fù)制的P-LISA(下文討論)的檢測事件)放大的。為了使單染色體甲基化分析小型化，有可能可以使用諸如鄰近連接原位測定法(P-LISA)等技術(shù)，其能夠檢測蛋白質(zhì)的z印tomole量(40x10—21mol)(FredrikssonSetal.(2002)Proteindetectionusingproximity-dependentDNAligationassays.NatBiotechno1.20(5):473-7)。此辦法利用針對感興趣蛋白質(zhì)的抗體(在一個例子中，針對甲基化蛋白質(zhì)的抗體)，該抗體在通過結(jié)合它們的靶蛋白質(zhì)而鄰近時容許所偶聯(lián)的寡核苷酸雜交，該寡核苷酸在酶促連接后充當(dāng)滾環(huán)復(fù)制的模板。由于靶蛋白質(zhì)的檢測需要兩個獨立的識別事件，因此該檢測是高度特異性的且能夠檢測各蛋白質(zhì)復(fù)合物(Soderberg0(2006)Directobservationofindividualendogenousproteincomplexesinsitubyproximityligation.NatMethods.20063(12):995-1000)。此辦法最近已經(jīng)適應(yīng)了研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用，而且已經(jīng)適應(yīng)了容許對DNA-蛋白質(zhì)相互作用的原位分析，以進行局限檢測(GustafsdottirSMetal.(2007)InvitroanalysisofDNA-proteininteractionsbyproximityligation.ProcNatlAcadSciUSA.104(9):3067-72)。染色質(zhì)免疫沉淀偶聯(lián)基因陣列技術(shù)(芯片上的ChIP)。在此辦法中，使用針對經(jīng)翻譯后修飾的感興趣DNA結(jié)合蛋白的抗體來免疫沉淀經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)及其DNA靶物二者。簡言之，使用交聯(lián)將DNA結(jié)合蛋白固定至DNA，并且在DNA斷裂后，使用免疫沉淀來純化具有由所使用的抗體決定的特異性的蛋白質(zhì)-DNA片段。水解以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)后，實施對DNA的擴增和標(biāo)記，并隨后將DNA雜交至微陣列并分析以鑒定受到DNA結(jié)合蛋白結(jié)合的區(qū)域?；蛘?，可以使用基因特異性寡核苷酸通過PCR來檢驗感興趣的基因(稱作單基因ChIP)。也可以使用差異甲基化雜交來鑒定甲基化DNA。在此辦法中，利用包含所克隆的CpG島的專用DNA微陣列。在本發(fā)明的情況中，將要比較的DNA樣品(兩份單倍體DNA樣品(染色體、染色單體等))都用甲基化敏感性限制酶消化，然后將自每份樣品衍生的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增子雜交至CpG島陣列。在任一樣品中具有更強雜交信號的陣列元件代表差異超甲基化CpG島，其受到保護免于甲基化敏感性限制酶切割，且因此在樣品中通過PCR得到擴增。外遺傳分析的其它進展容許使用減少的DNA量檢驗外遺傳標(biāo)志，諸如DNA甲基化。為了分析DNA甲基化，使用基于MBD2/MBD3L1復(fù)合物對甲基化DNA的高親和力的甲基化CpG島回收測定法(MIRA)來純化甲基化DNA。簡言之，將經(jīng)過超聲處理的DNA與含有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-MBD2b的基質(zhì)一起在存在MBD3L-1(MBD2的結(jié)合配偶，其提高MBD2對甲基化DNA的親和力)的情況中溫育。自基質(zhì)洗脫特異性結(jié)合的DNA，并實施基因特異性PCR反應(yīng)以檢測CpG島甲基化。或者，可以使用微陣列分析來檢驗所結(jié)合的DNA。此技術(shù)早就能使用lngDNA檢測甲基化。通過此類"下拉"辦法或涉及生物素來提高對下拉基質(zhì)的親和力的融合物，也可以利用涉及外遺傳的其它蛋白質(zhì)的GST融合物。定量甲基化分析(諸如MethyLight和Pryosequencing)的進展在偶聯(lián)亞硫酸氫鹽測序時容許檢測甚至更小量的甲基化DNA，其中一種辦法(即HeavyMethyl)容許檢測30pg甲基化DNA。此外，自上而下蛋白質(zhì)組學(xué)(分析完整蛋白質(zhì)，而非首先將它們消化成肽)的最新進展可容許檢驗指定核小體中不同組蛋白的完整修飾樣式。雖然已經(jīng)有關(guān)于外遺傳機制的許多研究，但是現(xiàn)有技術(shù)尚未充分領(lǐng)會同時考慮對母本衍生DNA分子或蛋白質(zhì)及對父本衍生DNA分子或蛋白質(zhì)的外遺傳修飾時的混雜效應(yīng)。這是因為現(xiàn)有技術(shù)的方法使用二倍體材料分析外遺傳修飾而發(fā)生的。申請人:在此提出，受試者的外遺傳狀態(tài)的確定性表征只能通過在單倍體狀態(tài)中分開分析對DNA和相關(guān)蛋白的外遺傳修飾來提供。例如，在外遺傳修飾是甲基化的情況中，單倍體材料的使用為雜合現(xiàn)象的認識解析了狀態(tài)特異性效應(yīng)，而且甚至為單CpG位點處的變異提供了關(guān)于構(gòu)成(單一功能性)"島"的多個CpG位點上的定量變異的分析。此確定性表征產(chǎn)生更精確的表型信息，諸如某些疾病的存在和/或個體對某些疾病的素因或個體響應(yīng)某些治療性分子的能力?？紤]一個更加特定的例子，DNA甲基化是一項被認為是涉及癌癥發(fā)病機制的外遺傳特征。下表描述了被認為是對甲基化敏感的癌癥相關(guān)基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>自上表可知，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)領(lǐng)會了甲基化在癌癥的發(fā)病機制中是重要的，然而，至今只使用了二倍體材料。申請人提出，現(xiàn)有技術(shù)的方法容易提供不夠精確的信息。例如，在分析指定啟動子在腫瘤制品中的譜型后，可記錄到中等程度的甲基化。在實項中，測量得出的甲基化程度是母本衍生的啟動子序列和父本衍生的啟動子序列的甲基化的平均值，因為所述腫瘤當(dāng)然是二倍體。雖然此平均結(jié)果在有些情況中可以是真的(因為母本和父本衍生的啟動子都被相同程度地甲基化)，但是這不會普遍是真的。例如，母本啟動子序列可以是完全未甲基化的，而父本序列可以是重度甲基化的。若就啟動子活性而言，母本衍生的序列相對于父本序列是顯性的，則分開分析母本和父本序列的重要性就變得顯而易見了。自上文會理解，關(guān)于細胞的單倍體狀態(tài)來分析外遺傳修飾的存在或缺失。如此，對于所考慮指定DNA位點處的甲基化的存在或缺失可以確定母本衍生的外遺傳特征與對應(yīng)的父本衍生的外遺傳特征是否是實質(zhì)性分開的。這樣，可以在父本衍生的外遺傳特征缺失的情況中確定母本衍生的外遺傳特征的影響，反之亦然。申請人提出，通過在分析二倍體材料的情況中消除所提供的潛在不精確的(或至少不夠確定性的)結(jié)果，得到更精確的甲基化圖。技術(shù)人員會領(lǐng)會，本發(fā)明不同于基因組印記的天然過程(由此，一些基因的表達水平取決于它們是否是自母本或父本基因組繼承的)。例如，胰島素樣生長因子_2(IGF2)是一種其表達是正常胎兒發(fā)育和生長所需要的基因。IGF2的表達唯一地源自該基因的父本拷貝。所印記的基因以它們的甲基化狀態(tài)來"標(biāo)記"。在IGF2的情況中，父本基因座中的一種稱作絕緣子元件的元件被甲基化，阻斷其功能。未甲基化絕緣子的功能是結(jié)合在結(jié)合后阻斷IGF2表達激活的蛋白質(zhì)。在甲基化后，該蛋白質(zhì)不能結(jié)合絕緣子，如此容許遠端增強子元件驅(qū)動IGF2基因表達。在母本基因組中，絕緣子是未甲基化的，如此蛋白質(zhì)結(jié)合它并阻斷遠端增強子元件的作用。相反，本發(fā)明關(guān)注通過提供關(guān)于甲基化的狀態(tài)特異性信息來提供母本DNA、父本DNA或二者的確定性單倍體甲基化指派。"確定性的"意味著在將某種外遺傳修飾樣式指派給某種表型時不涉及可能性或概率的評估或推斷或確定?，F(xiàn)有技術(shù)中記載的分析外遺傳修飾的方法因父本修飾與母本修飾的組合存在而混亂。如此，雖然可以使用某些算法來推導(dǎo)或推斷給定甲基化樣式與表型之間的可能指派，例如在分析非單倍體材料的情況中，這些指派必然會有缺陷。有人提出，在將甲基化樣式指派給表型時常常記錄到的所述混亂至少部分源自二倍體材料的混亂影響。依照本方法，自受試者的生物學(xué)樣品獲得DNA和/或相關(guān)蛋白。所述生物學(xué)樣品可以是含有DNA和/或相關(guān)蛋白的任何材料，包括但不限于全血、血清、血細胞、皮膚細胞、唾液、尿液、毛發(fā)、趾甲/指甲、淚液、趾甲/指甲、諸如此類。在所述分析步驟包括自母本衍生DNA實質(zhì)性分離父本衍生DNA的情況中，技術(shù)人員可使用他或她知道的任何合適方法。應(yīng)當(dāng)理解，用于實現(xiàn)實質(zhì)性分離的手段對本發(fā)明的范圍沒有限制作用，但是在所述方法的一種形式中，所述實質(zhì)性分離父本或母本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白的步驟是通過物理手段進行的。由物理手段提供的、勝過非物理手段(諸如選擇性探查二倍體材料)的優(yōu)點在于避免了與辨別母本衍生的材料與父本衍生的材料有關(guān)的問題。例如，在使用選擇性探針的情況中，可能的是，交叉雜交是有問題的，導(dǎo)致不確定的結(jié)果。雖然可以改變雜交條件來限制交叉雜交，但是這需要實施進一步的實驗。在本發(fā)明的一種形式中，用于提供唯一含有父本衍生DNA或母本衍生DNA的單倍體DNA的物理方法是染色體顯微剝離(microdissection)。所述單倍體DNA可以是整個母本或父本染色體、染色單體或染色單體片段。方便的是，可以在著絲粒遠端做一染色體中的切口，用以將p臂與q臂分開，每個都是單倍體DNA分子。技術(shù)人員能夠鑒定染色體中感興趣的物理區(qū)域并使適宜方法適應(yīng)自二倍體、三倍體、四倍體、或具有更高水平倍性的任何其它樣品分離單倍體DNA。技術(shù)人員熟悉用于顯微操作的平臺和工具。雖然技術(shù)上是嚴(yán)格的，但是顯微剝離是例行可實現(xiàn)的。設(shè)備要求包括配備有顯微操作器和旋轉(zhuǎn)載物臺的顯微鏡(或是立式的或是倒置的)和移液管拔具(用于生成顯微針)。推薦用于顯微鏡的振動分離。雖然不需要專用潔凈室，但是顯微剝離的染色體片段只含有飛(10-15)克數(shù)量的DNA，而且必須控制外來DNA的污染。在所述方法的一種形式中，可使用用于分離單倍體DNA分子的非接觸方法。此辦法的一個例子是使用激光微束。激光微束顯微剝離可涉及使用與顯微鏡連接的高束品質(zhì)的脈沖紫外激光?？梢允褂美缟唐坊疨.A.L.M.RobotMicrobeam(P.A.L.M.GmbHBernried，Germany)來實施激光束顯微剝離。激光優(yōu)選是不損傷或破壞基因組區(qū)段的波長的，諸如337nm，其遠離核酸(諸如DNA)的最大吸收。另一種對于染色體激光顯微剝離有用的系統(tǒng)是Leica激光顯微剝離顯微鏡。該系統(tǒng)使用匿LA直立顯微鏡，包括電動物鏡旋座、電動載物臺、xyz控制元件和新匿LA顯微鏡的所有其它優(yōu)點。所使用的激光是337nm波長的紫外激光。切割期間的移動是由光學(xué)進行的，而載物臺保持靜止。感興趣區(qū)域可以在監(jiān)視器上標(biāo)記，并通過PC控制來切割。樣品下落入PCR管中，無需額外的力。切割的結(jié)果能通過自動化檢查模式容易地檢查。對單倍體DNA分子的分離可以通過例如顯微剝離來實現(xiàn)，其使用PALM激光進行對染色體區(qū)段的激光彈射。在此情況中，非接觸過程涉及靶定染色體元件周圍的激光消融，接著將限定元件以激光力彈射到管帽(諸如微量離心管帽)上，用于后續(xù)分析單臂DNA。可以使用激光壓力彈射來回收所得分離的單倍體DNA分子。激光壓力彈射可以如下實現(xiàn)，即在例如一段或多段感興趣單倍體基因組區(qū)段下聚焦激光微束，并作為高光子密度的結(jié)果生成力，其形成所需要的單倍體材料并引起所需要的單倍體材料自不需要的基因組區(qū)段彈射出來。樣品在光子波的頂部上移動并被彈射入收集管中。合適的收集管是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，而且包括諸如常用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)管或微量離心管等管?？梢酝ㄟ^制備性流式細胞術(shù)使用能夠區(qū)分母本與父本DNA的探針來實質(zhì)性分離父本或母本衍生DNA。另一種方法是通過使用輻射雜種，其中二倍體材料的發(fā)育涉及人類染色體，只是每對染色體中的一條。另一種策略是使用由GMPTechnologiesInc.開發(fā)的"轉(zhuǎn)變技術(shù)"。GMP轉(zhuǎn)變技術(shù)㊣利用將成對染色體分開成單個染色體的過程。在分開后，可以使用鑒定基因序列的遺傳探針分別分析各等位基因。此技術(shù)可用于基因、染色體、或整個人類基因組。在所述方法的另一種形式中，將污染物遺傳材料滅活或消融，使得它不再實施該污染物遺傳材料的功能。例如，在期望分離母本衍生DNA的情況中，可以滅活或消融父本貢獻。這可以通過破壞同源染色體來實現(xiàn)，其例如使用小心指導(dǎo)的激光束來進行。用于選擇性分析父本或母本衍生DNA分子的另一種方法是使用PCR選擇性擴增單倍體序列，使得單倍體DNA的拷貝數(shù)相對于污染物DNA的拷貝數(shù)大大過量。然后可以用核酸酶部分消化DNA分子混合物，使得基本上所有污染物DNA被消化掉，剩下低水平的單倍體DNA。還存在如下的可能，即通過長PCR使用摻有標(biāo)簽的引物選擇性擴增單倍體DNA，并使用該標(biāo)簽分離出所述拷貝。—旦實質(zhì)性分離父本或母本衍生DNA，那么進行分析來測定外遺傳修飾的存在或缺失。在外遺傳修飾是DNA甲基化的情況中，可以通過對胞嘧啶嘧啶環(huán)第5位碳分析甲基的存在或缺失來檢測甲基化。所述方法可以使用任何合適的方法來執(zhí)行，然而，典型的是，所述對一個或多個位點分析甲基化的存在或缺失的步驟包含選自下組的方法使用亞硫酸氫鹽處理進行的DNA測序、限制性界標(biāo)基因組掃描、甲基化敏感性任意引發(fā)PCR、使用甲基化敏感性限制酶進行的Southern分析、甲基化特異性PCR、自亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA擴增的PCR產(chǎn)物的限制酶消化、及其組合。亞硫酸氫鹽測序涉及使單鏈DNA與亞硫酸氫鈉反應(yīng)，后者將胞嘧啶選擇性脫氨基成尿嘧啶，但是不與甲基胞嘧啶反應(yīng)。通過PCR擴增在亞硫酸氫鹽反應(yīng)中生成的經(jīng)修飾DNA序列，然后將擴增得到的DNA連接入質(zhì)粒載體，用于克隆和測序。對DNA測序時，只有完整的甲基化胞嘧啶殘基作為胞嘧啶被擴增。亞硫酸氫鹽測序可使用自少于100個細胞分離的DNA來實施，這是此工具的重大優(yōu)勢之一，因為腫瘤標(biāo)本通常很小。亞硫酸氫鹽測序的其它好處包括它分析長段基因組以測定非常清楚的DNA中甲基化樣式的能力，而且它產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶殘基的定量正顯示(quantitativepositivedisplay)。MSP是一種非?？焖偾异`敏的甲基化篩選技術(shù)。MSP使用亞硫酸氫鈉來實施，其修飾DNA并將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶。用對甲基化較之非甲基化DNA特異性的引物實施后續(xù)擴增，并用簡單凝膠電泳實施分析。MethyLight是MSP測定法的下一代。樣品的準(zhǔn)備和測定法的前提是相同的。MethyLight辦法是一項進步在維持由標(biāo)準(zhǔn)MSP提供的敏銳靈敏度的同時，通過引入實時"T叫Man"PCR形式，該測定法變得更加定量，而且勞動密度降低。影響甲基化特異性PCR特異性的最關(guān)鍵參數(shù)是由引物設(shè)計決定的。在實踐中，常常優(yōu)選只處理一條鏈，最常見的是有義鏈。在所述方法的一種形式中，引物設(shè)計成擴增長度為20_30bp的一個區(qū)域，而且應(yīng)當(dāng)在原始序列中摻入足夠的胞嘧啶以確保未修飾的DNA不會充當(dāng)引物的模板。另外，CpG二核苷酸內(nèi)的胞嘧啶的位置和數(shù)目決定引物對甲基化的或未甲基化的模板的特異性。典型的是，在每種引物中包括l-3個CpG位點，而且集中在每種引物的3'區(qū)中。這提供了最佳特異性并將錯誤引發(fā)所致假陽性降至最低。為了便于在同一熱循環(huán)儀中同時分析指定基因的U和M反應(yīng)，我們調(diào)整了引物的長度以給出幾乎相等的解鏈/退火溫度。這通常導(dǎo)致U產(chǎn)物比M產(chǎn)物大少數(shù)堿基對，這提供了在電泳后識別每條泳道的便利方式。由于甲基化特異性PCR利用特異性引物識別來區(qū)分甲基化的與未甲基化的位點，優(yōu)選的是，為擴增維持嚴(yán)格條件。這意味著退火溫度應(yīng)當(dāng)接近容許退火和后續(xù)擴增的最大溫度。在實踐中，通常用比計算解鏈溫度低5-8度的初始退火溫度測試新引物。非特異性可以通過在退火溫度中的輕微升高來矯正，而缺或弱PCR產(chǎn)物可以通過溫度下降1-3攝氏度來改進。對于所有PCR方案，應(yīng)當(dāng)小心確保模板DNA和試劑不受外源DNA或PCR產(chǎn)物的污染。MSP利用亞硫酸氫鈉處理后發(fā)生的甲基化等位基因與未甲基化等位基因之間的序列差異。CpG中CpG位點的頻率促成此序列差異。為指定基因座設(shè)計引物，其在經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA中將甲基化的DNA自未甲基化的DNA區(qū)分出來。由于區(qū)別是PCR擴增的一部分，因此能在維持特異性的同時實現(xiàn)格外的靈敏度，通常是檢測O.1%的等位基因。在PCR擴增和凝膠電泳后立即得到結(jié)果，無需進一步限制性或測序分析。MSP還容許分析很小的樣品，包括石蠟包埋的和顯微剝離的樣品。在所述方法的一個實施方案中，所述對一個或多個位點分析甲基化的存在或缺失的步驟包括(a)使單倍體DNA樣品與亞硫酸氫鈉反應(yīng)以將未甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶殘基，同時保留任何5_甲基胞嘧啶殘基不變以創(chuàng)建暴露的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA樣品，其具有供對亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA樣品特異性的引物結(jié)合的位點；(b)使用上鏈或下鏈特異性引物實施PCR擴增規(guī)程；(c)分離PCR擴增產(chǎn)物；(d)使用Ms-SNuPE引物、dNTP和Taq聚合酶實施引物延伸反應(yīng)，其中所述Ms-SNuPE引物包含與所述亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA樣品互補的約15聚物至約22聚物長度引物序列且剛好在要測定的一個或多個CpG二核苷酸序列的胞嘧啶殘基的5'終止；并(f)通過測定第一引物延伸堿基的身份來確定所述一個或多個CpG二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)?？赏ㄟ^使用高通量方法鑒定潛在甲基化位點來促進甲基化分析。篩選可用的技術(shù)包括限制性界標(biāo)基因組掃描(RLGS);基因表達陣列，其可用作替代來看哪些基因在暴露于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(像氮雜胞苷，也稱作阿扎胞苷)后表達。高度平行基因組范圍測定法是本領(lǐng)域已知的，許多此類測定法披露于Fanetal，NatRevGenet2006，7(8)632-44，將其內(nèi)容完整收入本文。許多此類方法作為約定勞務(wù)是技術(shù)人員可得的，例子有GoldenGate甲基化解決方案，諸如由IlluminaInc(SanDiego，CA)提供的。111umina系統(tǒng)能夠以單位點分辨率在96份樣品間在數(shù)以百計的基因上分析多至1，536個CpG位點。此系統(tǒng)因此能每次測定提供多至147，456項定量DNA甲基化測量。還能獲得人CpG島文庫，然后排列。數(shù)據(jù)庫構(gòu)建以粗制層析圖開始。消除復(fù)制品后，將所有6，800個元件針對加利福尼亞大學(xué)(SantaCruz)高通量基因組和nrDNA序列數(shù)據(jù)庫進行基本局部比對搜索工具(BLAST)分析，并測序。在CpG島文庫中，給每個克隆指派識別號，并列出其特征，包括諸如其染色體位置、它是啟動子或是在5'側(cè)翼區(qū)中找到的、它的GC含量、和該克隆中存在什么限制性位點等信息。后一項信息對于確定限制酶分析的效用和實際序列是有用的。CGI微陣列技術(shù)在本方法的背景中也是有用的。此技術(shù)容許在單一芯片上同時評估數(shù)以千計的潛在DNA甲基化靶物。它包括在玻璃載玻片上排列CpG島克隆，制備靶物樣品擴增子，并將擴增子雜交到CGI微陣列上。例如，可使用腫瘤衍生基因組DNA樣品實施該技術(shù)，所述樣品是使用能夠剛好在CpG島外切割的限制酶(Msel)獲得的。接著，將攜帶PCR引物序列的捕捉接頭添加至Msel片段。將樣品分拆成參照部分(其充當(dāng)分母(denominator)21來確定基因組擴增運行如何)和測試部分(其用McrBC(—種甲基化敏感的限制酶，只在DNA是甲基化的情況中消化該區(qū)域)消化)。通過PCR擴增這兩部分，然后用Cy5紅色(測試)或Cy3綠色(參照)熒光染料直接標(biāo)記DNA。測試樣品中未被McrBC消化的DNA片段生成Cy5標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，而如果有被McrBC消化的甲基化片段，那么不生成帶標(biāo)記物的PCR產(chǎn)物。將帶標(biāo)記物的測試和參照PCR產(chǎn)物混和并點樣到玻璃載玻片上。掃描雜交后的載玻片，并分析所獲得的圖像以鑒定甲基化信號。正如技術(shù)人員會領(lǐng)會的，本發(fā)明會在生物學(xué)(特別是醫(yī)學(xué))領(lǐng)域中具有許多用途。如上所述，癌癥被認為是一種外遺傳。事實上，外遺傳變化(特別是DNA甲基化)易于變化，而且是解釋某些環(huán)境因素如何提高癌癥風(fēng)險的卓越候選者。甲基化和染色質(zhì)的精致組織調(diào)控基因表達樣式的正常細胞穩(wěn)態(tài)，其在癌細胞中變得無法識別。轉(zhuǎn)化細胞的基因組可同時經(jīng)歷整體基因組低甲基化和與基因調(diào)控區(qū)有關(guān)的CpG島稠密超甲基化。這些顯著變化可導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性、內(nèi)源寄生序列激活、印記丟失、不正常的表達、非整倍性、和突變，而且可促成腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄沉默。超甲基化相關(guān)失活可影響細胞網(wǎng)絡(luò)中的許多途徑，諸如DNA修復(fù)(hMLHl、服CAl、MGMT、em前導(dǎo))、細胞周期(pl6(INK4a)、p14(ARF)、p15(INK4b))、和凋亡(DAPK、APAF-1)。異常CpG島甲基化還能用作惡性細胞的生物標(biāo)志物及其行為的預(yù)在本發(fā)明的一種形式中，單倍體DNA是存在于二倍體細胞中的或是自二倍體細胞獲得的。該方法可使用體細胞的常染色體。術(shù)語"常染色體"指正常體細胞或生殖細胞內(nèi)的、除性染色體以外的任何染色體。例如，在人類中，染色體1至22是常染色體。申請人提出，避免天然單倍體材料(諸如精子和卵子中所含有的)是有利的，因為外遺傳修飾(諸如甲基化)至少被部分消除，而且常常是被完全消除。這是因為，甲基化樣式通常在減數(shù)分裂期間重設(shè)。如此，對精子細胞或卵子細胞的分析不會提供容許確定受試者表型的有用信息。由于在臨床中獲得這些性細胞的問題，也要避免天然單倍體材料(諸如精子細胞或卵子細胞)的使用。獲得卵子是一種對任何年齡女性的侵入性規(guī)程，而自兒科男性收獲精子細胞也需要醫(yī)學(xué)干預(yù)。在外遺傳單體型分型中避免性細胞具有另一項優(yōu)點，即認為減數(shù)分裂過程期間可發(fā)生重組事件，使得原來以順式連鎖的基因座變成以反式連鎖。如此，分析配子的外遺傳單體型會給出與自二倍體細胞獲得的單倍體DNA不同的(即不正確的)單體型信息。在所述方法的一種形式中，對父本衍生和母本衍生二者DNA和/或相關(guān)蛋白分析外遺傳修飾。雖然可以通過調(diào)查(例如)母本或父本任一DNA的甲基化樣式來獲得信息，但是通過對來自這兩種來源的DNA分子分析甲基化會獲得更多的信息。在本發(fā)明的一個實施方案中，對同一DNA分子上的兩個或更多個位點分析甲基化。所述方法的這種形式在確定兩個甲基化位點是以順式還是以反式天然存在于細胞中的DNA分子上是有用的。這可以通過只考慮單一染色體(或是母本衍生的或是父本衍生的)上的甲基化位點來實現(xiàn)，例如用以證明兩個甲基化位點以順式存在，因為它們二者都出現(xiàn)在同一染色體上。也可能必須分析母本和父本染色體來證明兩個甲基化位點以反式存在?；蛘?，可以在DNA和/或相關(guān)蛋白在物理上沒有分離成父本與母本衍生成分的情況中實踐所述方法。通過使用原位方法，會有可能選擇性探查父本DNA或母本DNA，使得不必在物理上分離這兩種分子。這樣，二倍體材料可用于提供關(guān)于細胞單倍體狀態(tài)的信息。通過選擇性鑒定母本或父本DNA，由此容許將外遺傳修飾定位至母本或父本染色體，諸如原位標(biāo)記引發(fā)(PRINS)等方法在這點上會是有用的。所述方法已經(jīng)與對某些染色體特異性的引物一起成功使用，其中使用分裂中期和分裂間期兩種細胞核(Hindkjaeretal，MethodsMolBiol.1994;33:95-107)。染色體原位鑒定可利用PNA探針?？墒褂肞NA化學(xué)來制作小寡聚物。當(dāng)用染料標(biāo)記后，這些寡聚物成為卓越的探針，而且提供超過常規(guī)核酸的獨特優(yōu)勢。PNA探針通常很小(12-20聚物)，而且展示強的信號和很低的背景。PNA探針能在熒光原位雜交(PNA-FISH)的背景中使用，作為強大的技術(shù)來探索分裂中期和分裂間期染色體上的染色體結(jié)構(gòu)。PNA-FISH是一種使用小PNA寡聚物探針以序列特異性方式標(biāo)記染色體的方法，其容許鑒定特定染色體中的隱藏序列。用于PNA-FISH的方法披露于Strauss2002(〃PNA-FISH〃inFISHTechnology.Rautenstrauss/Liehr編SpringerVerlag.Heidelberg)。會理解，本文所述方法可用于生物學(xué)的任何領(lǐng)域，其中必須與基因表達一起考慮甲基化和其它蛋白質(zhì)修飾的影響。這些用途不限于動物(人類或其它)，而且還可應(yīng)用于植物。自本方法獲得的表型信息包括疾病、疾患、或病癥的存在或缺失；對疾病、疾患、或病癥的素因；有或沒有能力響應(yīng)治療性分子；有或沒有能力發(fā)起針對外來抗原或自身抗原的免疫應(yīng)答；變態(tài)反應(yīng)的存在或缺失；對變態(tài)反應(yīng)的素因。下面會通過參照下列非限制性實施例更完整地描述本發(fā)明。實施例1:單倍體DNA上的甲基化特異性PCR組織制備通過標(biāo)準(zhǔn)核型分析方法在PEN膜載玻片上制備自人類受試者獲得的外周血細胞的中期涂片。制備標(biāo)準(zhǔn)Giemsa染色劑并用于鑒定制備物中的染色體。染色規(guī)程步驟過程時間1.磷酸鹽緩沖液pH6.8l分鐘2.含0.025X胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液pH6.82分鐘3.磷酸鹽緩沖液pH6.8l分鐘4.Giemsa染色劑，工作溶液15分鐘5.蒸餾水浸2-3次甩掉載玻片上過量的水，用Kimwipe弄干背面，并風(fēng)干。激光顯微剝離使用PALM顯微剝離系統(tǒng)(P.A.L.M.MicrolaserTechnologiesGmbH，Germany)。使用P.A丄.M.顯微鏡在100倍物鏡下使用中期涂片(如上制備的)進行激光捕捉。使用標(biāo)準(zhǔn)P.A丄.M.顯微鏡方案將與它們的姐妹染色體在空間上分開的單個中期染色體(包括單個染色體)彈射入裝有6ul0.1%(v/v)Triton-X-100的200ulUltraFluxFlatC即PCR管的帽中。通過離心將所彈射的材料轉(zhuǎn)移至管的底部，用于進行甲基化分析。獲得了母本衍生和父本衍生二者DNA樣品。DNA提取使用PicoPureDNA提取試劑盒(ArcturusInc，CA)遵循試劑盒方案自C即SureMacroLCM帽上的顯微剝離的染色體片段提取DNA。[cmo]甲基化檢測通過亞硫酸氫鈉處理來修飾DNA，將未甲基化的而非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶。清除亞硫酸氫鹽和化學(xué)轉(zhuǎn)變完成后，使用此經(jīng)修飾DNA作為PCR模板。對于感興趣的基因，對每份DNA樣品實施兩個PCR反應(yīng)，一個是對最初甲基化的DNA特異性的，另一個是對最初未甲基化的DNA特異性的。在6-8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上將PCR產(chǎn)物分開，并通過溴化乙啶染色來顯性各條帶。適宜分子量的一條帶的存在指示初始樣品中未甲基化的和/或甲基化的等位基因的存在。為了制備混合物，將10xPCR緩沖液、NTP和引物融化。確定要分析的樣品的數(shù)目，包括未甲基化的和甲基化的二者反應(yīng)的陽性對照及水對照。制備每個PCR反應(yīng)(甲基化的和未甲基化的)的基本混合物。對于每50反應(yīng)，應(yīng)使用如下量10xPCR緩沖液5ii125mM4種NTP混合物2.5ii1有義引物(300niU)liil反義引物(300ng/iU)liil無菌蒸餾水28.5ill將38iU此PCR混合物分配入為每份樣品標(biāo)記的各個PCR管(0.5ml管或條)中。在分配前將各成分充分混和。向每個管添加2iU經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA模板。每份樣品包括未甲基化的和甲基化的反應(yīng)，以及陽性對照和無DNA對照。向每個管添加1-2滴礦物油(約25-501)，之后放置在熱循環(huán)儀中。礦物油完全覆蓋反應(yīng)混合物的表面以防止蒸發(fā)。然后在熱循環(huán)儀中擴增PCR產(chǎn)物。PCR以5分鐘95t:變性啟動。初始變性后添加Taq聚合酶將1.25個單位的Taq聚合酶稀釋入10y1無菌蒸餾水中。將此10y1穿過油通過溫和吹打混和入40ill中。擴增以如下參數(shù)持續(xù)35個循環(huán)30秒95。C(變性)30秒72。C(延伸)最后步驟:4分鐘72°C(延伸)保存于4(TC，直至分析。如下通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。制備6_8%非變性聚丙烯酰胺凝膠。lxTBE提供更好的緩沖容量和更銳利的條帶來解析這些產(chǎn)物。通常通過MSP分析生成的產(chǎn)物的大小在80-200bp范圍內(nèi)，使得丙烯酰胺凝膠對于大小解析是最適的。高百分比水平瓊脂糖凝膠可作為備選使用?！疬\行來自每份樣品的反應(yīng)以容許直接比較未甲基化的與甲基化的等位基因。包括陽性和陰性對照。垂直凝膠以10V/cm運行l(wèi)-2小時。將凝膠在溴化乙啶中染色，并在紫外照射下顯現(xiàn)。對指定的DNA區(qū)域進行母本衍生DNA與父本衍生DNA的甲基化狀態(tài)比較。最后，要理解，可以在不背離本文所述發(fā)明的精神的情況中進行各種其它改良和/24或改變。未來可以在澳大利亞或海外提交新的專利申請，其以本申請為基礎(chǔ)或要求本申請的優(yōu)先權(quán)。要理解，所附臨時權(quán)利要求僅僅作為舉例而提供，而非意圖限制在任何此類未來申請中可能要求保護的范圍?？梢院髞硐鄬τ谂R時權(quán)利要求添加或省略特征以便進一步限定或重新限定一項或多項發(fā)明。權(quán)利要求一種用于獲得多倍體受試者的外遺傳信息的方法，該方法包括下列步驟自所述受試者獲得生物學(xué)樣品，所述樣品含有(i)至少一種父本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白和/或(ii)至少一種母本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白；對任一種或多種所述父本或母本衍生DNA分子或相關(guān)蛋白分析修飾的存在或缺失，其中所述分析步驟確定任兩處修飾是以順式存在于一條染色體上還是以反式存在于兩條姐妹染色體間。2.依照權(quán)利要求l的方法，其中所述分析步驟確定所述修飾可歸于父本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白還是母本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白。3.依照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述修飾的存在或缺失能夠在體內(nèi)調(diào)控所述DNA分子的表達。4.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述分析步驟包括使用物理方法自母本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白實質(zhì)性分離父本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白。5.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述物理方法包括自母本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白激光介導(dǎo)地剝離父本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白。6.依照權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中所述分析步驟包括能夠與母本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白相比選擇性分析父本衍生DNA和/或相關(guān)蛋白的原位方法。7.依照權(quán)利要求l-6任一項的方法，其中所述DNA分子或相關(guān)蛋白存在于二倍體細胞中或是自二倍體細胞獲得的。8.依照權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中在所述分析步驟是對DNA實施的情況中，所述修飾是甲基化。9.依照權(quán)利要求8的方法，其中所述分析包括測定二核苷酸CpG的甲基化。10.依照權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法，其中所述分析包括選自下組的方法使用亞硫酸氫鹽處理進行的DNA測序、限制性界標(biāo)基因組掃描、甲基化敏感性任意引發(fā)PCR、使用甲基化敏感性限制酶進行的Southern分析、甲基化特異性PCR、自亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA擴增的PCR產(chǎn)物的限制酶消化、及其組合。11.依照權(quán)利要求10的方法，其中在所述分析包括使用亞硫酸氫鹽處理進行的DNA測序的情況中，所述分析包括(a)使DNA與亞硫酸氫鈉反應(yīng)以將未甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶殘基，同時保留任何5-甲基胞嘧啶殘基不變以創(chuàng)建暴露的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA樣品，其具有供對亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA樣品特異性的引物結(jié)合的位點；(b)使用上鏈或下鏈特異性引物實施PCR擴增規(guī)程；(c)分離PCR擴增產(chǎn)物；(d)使用Ms-SNuPE引物、dNTP和Taq聚合酶實施引物延伸反應(yīng)，其中所述Ms-SNuPE引物包含與所述亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變DNA樣品互補的約15聚物至約22聚物長度引物序列且剛好在要測定的一個或多個CpG二核苷酸序列的胞嘧啶殘基的5'終止；并(f)通過測定第一引物延伸堿基的身份來確定所述一個或多個CpG二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)。12.依照權(quán)利要求ll的方法，其中所述dNTP是經(jīng)過標(biāo)記的，且測定第一引物延伸堿基的身份是通過經(jīng)標(biāo)記dNTP的摻入來測量的。13.依照權(quán)利要求l-7任一項的方法，其中在所述分析是對蛋白質(zhì)實施的情況中，所述蛋白質(zhì)是組蛋白且所述修飾是乙?；?。14.依照權(quán)利要求l-13任一項的方法，其中所述外遺傳信息能夠提供所述受試者的表型信息。15.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述表型信息選自下組疾病、疾患、或病癥的存在或缺失；對疾病、疾患、或病癥的素因；有或沒有能力響應(yīng)潛在治療性分子；有或沒有能力發(fā)起針對外來抗原或自身抗原的免疫應(yīng)答；變態(tài)反應(yīng)的存在或缺失；對變態(tài)反應(yīng)的素因。全文摘要本發(fā)明提供了用于獲得多倍體受試者的外遺傳信息的方法，該方法包括下列步驟自所述受試者獲得生物學(xué)樣品，所述樣品含有(i)至少一種父本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白和/或(ii)至少一種母本衍生DNA分子和/或相關(guān)蛋白；對任一種或多種所述父本或母本衍生DNA分子或相關(guān)蛋白分析修飾的存在或缺失，其中所述分析步驟確定任兩處修飾是以順式存在于一條染色體上還是以反式存在于兩條姐妹染色體間。文檔編號C12Q1/68GK101784673SQ200880100779公開日2010年7月21日申請日期2008年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日發(fā)明者馬爾科姆·J·西蒙斯申請人:西蒙斯單倍體有限公司