專利名稱：經修飾的人因子VII/VIIa和包含它的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明的領域涉及要用作藥物活性劑的人因子VII(FVII)/活化的因子 VII (FVIIa)的制備。本發明更具體地涉及具有高穩定性的經修飾的因子VlI/VIIa，編碼這 類經修飾的FVII/VIIa的核酸，及其制備方法。
現有技術 因子VII (FVII)是維生素K依賴性的糖蛋白，其在活化形式(FVIIa)下在存在牽丐 和組織因子時通過活化因子X和因子IX，參與凝固過程。FVII以具有406個氨基酸殘基的 單肽鏈形式分泌，其分子量約為50kDa。FVII包含四個不同的結構域N-端Y-羧基結構域 (Gla)、兩個表皮生長因子樣結構域(EGF-樣)，以及絲氨酸蛋白酶結構域。FVII到FVIIa 的活化的特征是Argl52-Ilel53鍵(精氨酸152-異亮氨酸153)的切割。因此，FVIIa由 分子量約20kDa的152個氨基酸的輕鏈和分子量約30kDa的254個氨基酸的重鏈組成，所 述輕鏈和重鏈通過單個二硫鍵(半胱氨酸135-半胱氨酸262)結合在一起。
FVII/VIIa被用于治療患有血友病并遭受因子VIII缺乏(A型血友病)或因子IX 缺乏(B型血友病)的患者，以及患有其他凝固因子缺陷(例如可遺傳的FVII缺陷)的患 者。FVII/VIIa還被推薦用于治療腦血管意外。 獲得FVIIa濃縮物的最古老方法在于從分級獲得的血漿蛋白質中純化FVIIa。
為此，EP 0 346 241描述了如何制備富含FVIIa的級分，先吸收然后再洗脫血漿 蛋白質級分副產物，所述副產物含有FVII和FVIIa和其他蛋白質例如因子IX、 X和II，包 括PPSB預洗脫物(preeluate) (P 二凝血酶原或FII， P 二轉變素原或FVII， S =司徒因子 (Stuart factor)或FX， B =抗血友病B因子或FIX)。 類似地，EP 0 547 932描述了制備高純度FVIIa濃縮物的方法，所述濃縮物基本 不含維生素K依賴性因子和FVII。 用于從血漿中獲得FVII/VIIa的這類方法的主要缺點之一是它們僅能夠獲得小 量的產物。另一方面，一個主要的缺點是獲得的產物的敏感性，所述產物全身性地提供截短 的形式，因此活性較小并且更可能引起不想要的副作用。另外，從捐血者收集的血漿的可用 度仍然有限。 為此，編碼人因子VII的DNA早在80年代就被分離(Hagen等(1986) ;Proc. Natl. Acad. Sci. USA ;Apr 83(8) :2412-6)，并且相應的蛋白質被表達進BHK哺乳動物細胞(幼倉 鼠腎)中(文件EP 0 200 421)。申請人提交的法國申請FR 06 04872也描述了在轉基因 動物中生產FVIIa。 這些生產方法能夠獲得免受可能的病毒或其他病原體污染的安全的蛋白質。這類
方法能夠獲得下述蛋白質，所述蛋白質的一級序列與人一級序列相同。 重組人FVIIa的商業制劑目前可在商品名N0V0Seven⑧(NovoNordisk )下獲
得。達到和維持想要的治療或預防效果需要相對高的劑量以及頻繁的靜脈內施用。因此，
這類治療對患者而言仍然是限制性的，并且非常昂貴。
另外，已經顯示FVII/VIIa是下述蛋白質，其對蛋白酶切割靈敏，導致形成沒有任 何凝固活性的大量分解產物(非典型性切割)。非典型性切割可發生在制備方法的多個 步驟中，也可以發生在FVII/VIIa的儲存期間。已觀察了得自血槳的FVII/VIIa的分解產 物和使用基因重組步驟產生的FVII/VIIa的分解產物。非典型性切割可在FVII被活化為 FVIIa之前涉及，例如在FVII的生產和純化期間涉及，在這樣的活化步驟期間涉及，或者在 活化產物(FVIIa)的純化和/或儲存期間涉及。 歐洲專利EP 0 370 036涉及在與FVII/VIIa非典型性切割相關的賴氨酸、精氨 酸、異亮氨酸和/或酪氨酸殘基上被修飾的FVII/VIIa，從而減少FVII/VIIa的非典型性切 割，從而獲得更穩定的FVII/VIIa。然而，該專利僅部分解決了獲得更穩定的FVII/VIIa的 困難，因為其未著眼于非典型性切割相關氨基酸的修飾所造成的有問題的FVII/VIIa構象 改變。該專利既未描述也未建議獲得下述FVII/VIIa的方式，所述FVII/VIIa會在非典型 性切割位點水平上被修飾，并且其構象應當不受氨基酸序列修飾的影響或受很小的影響。
盡管存在關于經修飾的人FVII/VIIa、特別是在非典型性切割位點水平上經修飾 的FVII/VIIa的文件，但是仍然非常需要具有改進的特性的、新的人FVII/VIIa。
發明概述 本發明涉及在至少兩個選自賴氨酸38、精氨酸290和精氨酸315的氨基酸殘基上 被修飾的高度穩定的因子FVII/VIIa，所述氨基酸殘基(1)被不同的氨基酸殘基替代，或 (ii)被缺失。 本發明還涉及編碼上文經修飾的因子FVII/VIIa的核酸，其中插入了所述核酸的 重組載體，用所述核酸或所述重組載體轉化的宿主細胞，和表達所述經修飾的因子FVI1/ VIIa的經遺傳修飾的生物。 本發明還涉及用于制備經修飾的因子FVII/VIIa、例如上文所定義的經修飾的因 子FVII/VIIa的方法。 本發明還涉及上文經修飾的因子FVII/VIIa用于制備藥物的用途，以及包含所述 經修飾的因子FVII/VIIa的藥物組合物。
圖1 :天然條件下的MALDI-TOF質譜，其顯示得自FVII非典型性切割的氨基酸序 列。 圖2 :還原條件下的MALDI-TOF質譜，其顯示得自FVII非典型性切割的氨基酸序 列。 圖3 :使用Sybyl 7. 2軟件(Tripos)制作分子模型，所述分子模型闡述含賴氨酸 38的天然人FVII (白色)和在第38位上含有谷氨酰胺的經修飾的人FVII (黑色)的結構 疊加。 圖4 :使用Sybyl 7. 2軟件(Tripos)制作分子模型，所述分子模型闡述含精氨酸 290的天然人FVII (白色)和在第290位上含有谷氨酰胺的經修飾的人FVII (黑色)的結 構疊加。 圖5 :使用Sybyl 7. 2軟件(Tripos)制作分子模型，所述分子模型闡述含精氨酸 315的天然人FVII (白色)和在第315位上含有谷氨酰胺的經修飾的人FVII (黑色)的結構疊加。
發明內容
本發明提供了新的經修飾的因子FVII/VIIa，其在(i)儲存周期期間和(ii)施用 給患者后在體內時均高度穩定。 令人驚訝的是，申請人顯示與天然人FVII/FVIIa相比，天然人FVII/FVIIa氨 基酸序列中氨基酸殘基賴氨酸38(Lys 38， K38)、精氨酸290 (Arg290， R290)和精氨酸 315 (Arg315， R315)的一些突變不改變或很少改變藉此被修飾的人FVII/FVIIa的構象。
另夕卜，申請人顯示本發明的經修飾的FVII/FVIIa(其三維構象與天然人FVI1/ FVIIa的三維構象非常相似，有時甚至相同)與天然人FVII/FVIIa相比具有改進的特性，包 括降低的非典型性切割率、更好的生產產率、減小的清除率和更高的穩定性，同時保留與天 然人FVII/FVIIa接近的構象。 在本文中使用時，"非典型性切割"表示發生在FVII或FVIIa分子中的，除活性位 點切割(Arg^-Ile^鍵的切割)之外的任何肽鍵切割。這些非典型性切割特別涉及氨基酸 賴氨酸38 (賴氨酸38-亮氨酸39鍵)、精氨酸290 (精氨酸290-甘氨酸291鍵)和精氨酸 315 (精氨酸315-賴氨酸316鍵)，并且引起結構修飾，所述結構修飾導致FVII/VIIa藥物 代謝動力學特性的改變。 在本文中使用時，"生產產率"表示每體積發酵罐(或生物反應器)或來自轉基因 動物的每體積乳或每份重量的任何生物量(動物、植物、細菌或昆蟲細胞)所產生的結構一 致并具有活性的FVII/VIIa量。因此，藉此突變的FVII/VIIa的生產成本顯著低于其一級 序列與天然人FVII/VIIa序列相同的FVII/VIIa。 在本文中使用時，"清除率"表示每單位時間的完全純化的、也就是說不再含有 FVII/VIIa的理論體積的級分。FVII/FVIIa清除率表示血槳純化系數。這對應于每單位時 間器官從給定體積的動脈血漿中完全去除FVII/FVIIa的能力。FVII/FVIIa清除率是在給 定的每單位時間完全清除了 FVII/FVIIa的動脈血漿的表觀體積(真實體積)。
在本文中使用時，"穩定性"表示FVII/VIIa在其整個儲存期中維持其化學、物理、 結構、構象和/或生物藥物特性的能力。 在本文中使用時，"構象"表示蛋白質的三級結構，也就是說多肽鏈在空間中的折 疊。構象往往被稱作三維結構，或3D結構。蛋白質的構象與其生物活性密切相關，這解釋 了當其結構被改變時，蛋白質失去其生物活性并且被變性。因此在本文中使用時，"構象改 變"表示與蛋白質三維結構相關的任何修飾，所述修飾導致所述蛋白質生物活性的喪失。
可以借助于FVII-缺陷的血漿和促凝血酶原激酶，通過測量FVII/VIIa誘導血液 凝固的能力來定量本發明的FVII/VIIa的生物活性，如例如專利US 5， 997， 864中所述。在 專利US 5， 997， 864中所述的實驗中，通過與對照樣品相比凝固時間的減少來表述生物活 性，并且通過與含有1單位/mlFVII/VIIa活性的人血清標準相比較將其轉化為"FVII/VIIa 單位"。 本發明的FVII/VIIa具有與天然人FVII/VIIa相似的翻譯后修飾特征，但是也可 以具有與得自血槳的天然人FVII/VIIa不同的翻譯后修飾，從而改進其化學、物理、結構、 構象和/或生物藥物特性。
本發明在其最廣闊的方面中涉及提供與天然人FVII/VIIa的肽序列相比經修飾 的人FVII/VIIa，其具有選自賴氨酸38、精氨酸290和精氨酸315的至少兩個氨基酸被取代 或缺失，其中 (i)賴氨酸38被選自以下的氨基酸替代谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨 酸，優選地選自谷氨酰胺、組氨酸或谷氨酸； (ii)精氨酸290被選自以下的氨基酸替代谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、
甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、
酪氨酸或纈氨酸，優選地選自谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺或谷氨酸，和/或 (iii)精氨酸315被選自以下的氨基酸替代谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰
胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨
酸、酪氨酸或纈氨酸，優選地選自谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺或谷氨酸。 在本發明的一個優選的實施方案中，FVII/VIIa包含至少兩個選自以下的替代
賴氨酸38被谷氨酰胺替代，精氨酸290被谷氨酰胺替代和精氨酸315被谷氨酰胺替代。 在本發明的第一個具體的實施方案中，FVII/VIIa在賴氨酸38和精氨酸290上包
含突變。 在本發明的第二個具體的實施方案中，FVII/VIIa在賴氨酸38和精氨酸315上包 含突變。 在本發明的第三個具體的實施方案中，FVII/VIIa在精氨酸290和精氨酸315上 包含突變。 自愛本發明的第四個具體的實施方案中，FVII/VIIa在賴氨酸38、精氨酸290和精 氨酸315上包含突變。 在本發明的一個具體的實施方案中，賴氨酸38被谷氨酰胺替代，精氨酸290被谷 氨酰胺替代，精氨酸315被谷氨酰胺替代。 可以通過進行重組DNA技術(遺傳重組)生產本發明的FVII/VIIa。通常，修飾編 碼天然人FVII/VIIa的核酸(DNA或RNA)的核酸序列，使其編碼想要的蛋白質，特別是根據 本發明的經修飾的FVII/FVIIa。然后可以將藉此經修飾的核酸插入表達載體中，然后使用 所述表達載體轉化或轉染宿主細胞。編碼天然人FVII/VIIa的核酸通過SEQ ID N° 1的核 酸展示。 因此，本發明還涉及提供編碼本發明經修飾的人FVII/VIIa的核酸，以及互補序 列的核酸。可以使用屬于本領域技術人員一般知識的任何已知的傳統技術生產或合成編碼 本發明經修飾的人FVII/VIIa的核酸。舉例而言，可以通過遺傳重組從編碼天然人FVI1/ Vila的核酸獲得編碼本發明經修飾的人FVII/VIIa的核酸。優選地，通過定點誘變從編碼 天然人FVII/VIIa的核酸獲得編碼經修飾的人FVII/VIIa的核酸。定點誘變技術是本領域 技術人員公知的，并且能夠獲得編碼想要的經修飾的人FVII/VIIa的DNA。可以完成定點誘 變技術，所述技術例如與Michael Smithin 1978 (Smith等；"Mutagenesis at a specific position in a DNAsequence〃 ；J Biol Chem. (1978)S印25 ;253(18) :6551-60)所述定點 誘變技術相同，或者來自后一技術。 有利地，本發明的FVII/VIIa是其中至少兩個下述氨基酸殘基被為了這一目的所選擇的氨基酸替代或者被缺失，所述兩個氨基酸殘基選自SEQID N° 2的天然人FVII的氨 基酸賴氨酸38、精氨酸290和精氨酸315。 在一個具體的實施方案中，可以從天然人FVII/VIIa的變體獲得根據本發明的經 修飾的FVII/VIIa，條件是該變體不比天然人FVII/VIIa更具免疫原性。因此，該變體的 肽序列可以與天然人FVII的肽序列存在至少70%的氨基酸同一性，和有利地至少80%或 90%的同一性，甚至更有利地至少99%的氨基酸同一性，并且含有至少兩個選自氨基酸賴 氨酸38、精氨酸290和精氨酸315 (根據SEQ ID N° 2的天然人FVII的氨基酸編號)的氨 基酸殘基，所述至少兩個氨基酸殘基被突變為就該目的所選擇的氨基酸或者被缺失。這樣 的變體與天然人FVII/VIIa相比具有基本相似或者更好的生物活性。 就本發明的目的而言，"核苷酸序列"可以用于表示多核苷酸或核酸。"核苷酸序 列"包括像這樣的遺傳材料，因此不限于關于所述序列的信息。 在本文中使用時，"核酸"、"多核苷酸"、"寡核苷酸"或"核苷酸序列"包括單鏈形式 或雙鏈形式的、多于一條核苷酸的RNA、 DNA、 cDNA序列或RNA/DNA雜合序列。"核苷酸"表 示天然的核苷酸[腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)]。
就本發明的目的而言，當第一核苷酸的每個堿基與具有相反方向的第二多核苷酸 的互補堿基配對時，認為第一多核苷酸與第二多核苷酸"互補"。互補性的"堿基"為A與 T(或A與U)，和C與G。 根據本發明，與第二參照核酸具有至少90%同一性的第一核酸，應與所述第二參 照核酸具有至少90%，優選地至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97. 5%、98%、 98. 3 % 、98. 6 % 、99 % 、99. 6 %的核苷酸同一性。根據本發明，與第二參照多肽具有至少90 % 同一性的第一多肽，應與所述第二參照多肽具有至少90%，優選地至少91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、97. 5%、98%、98. 3%、98. 6%、99%、99. 6%的氨基酸同一性。
如在本發明中所定義的，兩條核酸序列之間或兩條氨基酸序列之間的"同一性百 分比"通過在比較窗口中將兩條最優比對的序列進行比較來確定。 比較窗口內的核苷酸序列或氨基酸序列部分因此與參照序列(其不包含下述添 加或缺失)相比可包含添加或缺失(例如缺口 )，從而獲得兩條序列之間的最佳比對。
如下計算同一性百分比測定在兩條被比較的序列中觀察到相同核堿基或相同氨 基酸的位置數，然后用兩個核堿基之間或兩個氨基酸之間存在同一性的位置數除以比較窗
口內的位置總數，最后將結果乘以ioo，獲得兩條序列之間的核苷酸或氨基酸同一性百分比。 可以使用已知的算法通過計算機程序計算用于比較的最佳序列比對。
更優選地，使用CLUSTAL W軟件(1. 82版)測定所述序列同一性百分比，其中參數 如下設置(1)CPU模式二 ClustalW mp;(2)比對="完全"；(3)輸出格式="aln w/數"； (4)輸出順序="對齊的";(5)顏色比對="否";(6)KTUP(字長)="默認";(7)窗口長度 ="默認"；(8)得分類型="百分比"；(9)T0PDIAG ="默認"；(IO)PAIRGAP ="默認"；(11) 系統發生樹/樹類型="無"；(12)矩陣="默認"；(13)缺口開放="默認"；(14)端點缺 口="默認"；(15)缺口延伸="默認"；(16)缺口距離="默認"；(17)樹型="進化樹"和 (18)樹缺口距離="隱藏"。 本發明還涉及提供其中插入下述核酸的表達載體，所述核酸編碼根據本發明的經修飾的人FVII/VIIa。 本發明中使用的表達載體可包含能夠指導編碼本發明FVII/VIIa的核酸轉錄的 啟動子。傳統上用于哺乳動物細胞培養物的啟動子包括現有技術領域公知的病毒啟動子 和細胞啟動子。表達載體還可包含剪接位點，所述剪接位點位于啟動子下游和編碼本發明 FVII/VIIa的DNA序列的插入位點上游。表達載體還可包含多聚腺苷酸化序列，所述序列位 于編碼本發明FVII/VIIa的DNA序列的插入位點下游。表達載體還可包含下述任何類型的 DNA序列，所述DNA序列適用于FVII/VIIa、編碼本發明FVII/VIIa的DNA序列和/或含有 編碼本發明FVII/VIIa的DNA序列的表達載體的表達、選擇和/或插入。
本發明還涉及提供下述細胞，所述細胞被轉化用于生產本發明的經修飾的人 FVII/VIIa。如下獲得經轉化的細胞將編碼本發明的經修飾的人FVII/VIIa的核酸轉移進 入宿主細胞的基因組中，優選地使得由此轉化的細胞表達該DNA序列。合適的細胞轉化方 法是本領域技術人員公知的。這些方法包括但不限于，使用脂質體，使用聚乙二醇(PEG), 使用DEAE-葡聚糖，使用磷酸鈣，使用病毒(主要是逆轉錄病毒)，使用DNA槍、細胞融合、 顯微注射、電穿孔等。本發明因此還涉及下述細胞，所述細胞用編碼如上文所述經修飾的人 FVII/VIIa的核酸轉化，并且表達所述經修飾的人因子VII/VIIa。優選地，所述經轉化的細 胞是經轉化的哺乳動物細胞，特別是經轉化的鼠、牛、羊、豬、非人靈長動物細胞或經轉化的 人細胞。 根據本發明的經修飾的人FVII/VIIa可以從根據本發明轉化和培養的細胞獲 得。例如，可以提到的是以下的細胞BHK(幼倉鼠腎)和特別是BHK tk—tsl3(CRL 10314， Waechter和Baserga， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 :1106-1110，1982)， CHO(ATCC CCL 61) ， C0S-1 (ATCC CRL 1650) ， HEK293 (ATCC CRL 1573 ;Graham等，J. Gen. Virol. 36 :59-72， 1977)，大鼠H印I(大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印II (大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL 1548) ，TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065) ， NCTC1469 (ATCC CCL 9. 1)禾PDUKX細胞 (CHO細胞系)(Urlaub和Chasin， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220， 1980)，適應無 血清培養的YB2/0細胞、3T3細胞、Namalwa細胞或BHK細胞(US 6， 903， 069)。
本發明還涉及生產本發明的經修飾的人因子Vll/VIIa的經遺傳修飾的生物。根 據歐盟給出的定義，"經遺傳修飾的生物"是下述生物(除人之外)，所述生物的遺傳材料以 通過天然繁殖和/或重組不會發生的方式被修飾。在本發明的上下文中，經遺傳修飾的生 物整合編碼本發明FVII/VIIa的DNA序列，并且表達所述經修飾的人FVII的DNA序列，從 而生產本發明的所述經修飾的人FVI I/VI Ia。經遺傳修飾的生物是微生物、動物或植物。因 此本發明還涉及基因組中包含下述核酸并且表達所述經修飾的人因子Vll/VIIa的經遺傳 修飾的生物，所述核酸編碼如本說明書中所定義經修飾的人因子VII/VIIa。
微生物是微觀生物，可以是細菌、酵母或病毒。細菌可以是例如枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) (Palva等(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 :5582 ;EP 0 036 259 和EP 0 063 953 ;WO 84/04541);大腸桿菌(Escherichia coli) (Shimatake等(1981) Nature 292 :128 ;Amann等(1985) Gene 40 :183 ;Studier等(1986) J. Mol. Biol. 189 :113 ; EP 0036 776、 EP 0 136 829和EP 0 136 907);乳脂鏈球菌(Str印tococcuscremoris) (Powell等(1988) A卯l. Environ. Microbiol. 54 :655);變鉛青鏈球菌(Str印tococcus lividans) (Powell等(1988)Appl. Environ. Microbiol. 54 :655);變鉛青鏈霉菌
9(Str印tomyces lividans) (US4， 745， 056)。酵母可以是例如假絲酵母(Candida) (Kurtz等 (1986)Mol. Cell. Biol. 6 :142 ;Kunze等(1985) J. Bas ic Microbiol. 25 :141);漢遜酵母 (Hanse皿la) (Gleeson等(1986) J. Gen. Microbiol. 132 :3459 ;Roggenkamp等(1986)Mol. Gen. Genet. 202 :302);克魯維酵母(Kluyveromyces)(Das等(1984)J. Bacter iol.158 : 1165 ;DeLouven固rt等(1983) J. Bacterial. 154 :1165 ;Van den Berg等(1990)Bio/ Technology 8 :135);畢赤酵母(Pichia) (Cregg等(1985)Mol. Cell. Biol. 5 :3376 ;Kunze 等(1985) J. Basic Microbiol. 25 :141 ;美國專利號.4， 837， 148和4， 929， 555);酵母 (SaccharomyceaO(Hinnen等(1978)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 ;1929 ;Ito等(1983) J. Bacteriol. 153 :163);裂殖酵母(Schizosaccharomyces) (Beach禾口 Nurse (1981) Nature 300 :706);子囊菌酵母(Yarrowia) (Davidow等(1985)Curr. Genet. 10 :39 ;Gaillardin 等(1985)Cur r. Genet. 10 :49)。使用的病毒可以是例如逆轉錄病毒如禽類白細胞增生 病毒(Avian LeukosisVirus)、牛白血病病毒(Bovine Leukemia Virus)、鼠白血病病毒 (MurineLeukemia Virus)、貂至文細胞灶病毒(Mink-Cell Focus-Inducing Virus)、鼠肉瘤 病毒(Murine Sarcoma Virus)、網狀內皮組織增生病毒(Reticuloendotheliosis Virus) 和勞斯氏肉瘤病毒。 本發明中定義的動物是真核類型、不含任何葉綠體的非人的、活的多細胞生物。在 一個優選的實施方案中，本發明中使用的經遺傳修飾的生物是哺乳動物，優選地為雌性兔 子。有利地，本發明的經修飾的人FVII/VIIa可以在特定啟動子的控制下在哺乳動物的乳 腺中生產，所述哺乳動物優選地為雌性兔子，所述啟動子使得能夠在所述雌性兔子的乳中 表達所述FVII/VIIa。 在轉基因動物的乳中生產重組或轉基因FVII/VIIa的方法可包括以下步驟將 DNA分子整合進非人哺乳動物的胚胎中，所述DNA分子包含編碼本發明的經修飾的人FVII/ VIIa的基因，所述基因處于乳中天然分泌的蛋白質的啟動子(例如酪蛋白基因啟動子、 P _酪蛋白基因啟動子、乳清蛋白基因啟動子、P-乳球蛋白基因啟動子或WAP基因啟動子) 控制下。然后將胚胎置于相同物種的雌性哺乳動物中。 一旦來自所述胚胎的哺乳動物充分 發育，則引發哺乳動物泌乳，收集所述乳。所述乳隨即含有所述重組或轉基因的FVII/VIIa。
EP 0 527 063給出了在除人之外其他雌性哺乳動物乳中制備蛋白質的方法的例 子，可以考慮所述EP 0 527 063的教導來生產本發明的蛋白質。通過引入含有WAP基因啟 動子的序列獲得了包含WAP基因啟動子(乳清酸性蛋白)的質粒，制備該質粒使其能夠接 收置于WAP基因啟動子控制下的外來基因。使用包含所述啟動子和編碼本發明蛋白質的基 因的質粒，通過將其顯微注射進雄性原核雌性兔子的胚胎中，生產轉基因雌性兔子。然后將 胚胎轉移進用激素處理的雌性的輸卵管中。對從由此獲得的轉基因幼兔中提取的DNA進行 的Southern印跡揭示了轉基因的存在。使用特定的放射免疫測定法評估動物乳濃度。
其他文件描述了在除女性之外的其他雌性哺乳動物的乳中制備蛋白質的方法。要 提到的是US 7，045，676(轉基因小鼠)和EP 1739170 (在轉基因哺乳動物中生產血管性血 友病因子(von Willebrand factor))，但不限于此。使用來自本發明的經修飾FVII/VIIa 的DNA時，這些制備方法適用于本發明。 在一個具體的實施方案中，經遺傳修飾的生物是昆蟲，例如蛟子、蒼蠅等。 在本文中使用時，"重組或轉基因的FVII/VIla"表示得自經轉化的細胞或經遺傳修飾的生物的任何FVII/VIIa，也就是說得自微生物、動物或植物的任何FVII/VIIa。與之 對照，本發明的FVII/VIIa不是來自血漿的FVII/VIIa，也就是說不是從人或動物血漿中純 化的產物。 因此，本發明的FVII/VIIa來自下述DNA分子的轉化和之后的翻譯，并由轉基因細 胞、微生物、動物或植物生產，所述DNA分子編碼本發明的經修飾的FVII。因此，可以通過使 用本領域技術人員公知的能夠在生物體系中表達蛋白質的傳統方法，獲得本發明的重組或 轉基因FVII/VIIa。 本發明還涉及制備本發明的經修飾的人FVII/VIIa的方法，所述方法包括以下步 驟 a)用核酸轉化細胞，所述核酸編碼經修飾的人FVII/VIIa，例如本說明書中所述 的經修飾的人FVII/VIIa， b)培養步驟a)中獲得的細胞，從而所述細胞表達所述因子VII/VIIa，禾口
c)純化由步驟b)中培養的轉化細胞表達的經修飾的人因子VII/VIIa。
在使得能夠表達FVII/VIIa的合適培養基中培養經轉化的細胞。使用的培養 基由本領域技術人員根據所培養的細胞有目的地選擇。適用于細胞培養的培養基包括 IMDM(Iscove' s改良的Dulbecco ' s培養基)、DMEM(Dulbecco ' s改良的Eagle培養 基)、RPMI 1640或等同物。這些培養基主要由無機鹽、氨基酸、維生素和其他成分組成，所 述其他成分包括用于能量供應的葡萄糖，和用于緩沖效應的HEPES，基本補體例如尤其是氨 基酸，礦物質、微量元素，針對每類培養細胞的生長特異和代謝活性特異的分子補體等。
本發明還涉及在轉基因哺乳動物的乳中制備本發明的經修飾的人FVII/VIIa的 方法，所述方法包括以下步驟 a)提供轉基因哺乳動物，所述動物在其乳腺中表達下述核酸，所述核酸編碼本發 明的經修飾的人因子VlI/VIIa， b)收集含有因子VlI/VIIa的轉基因哺乳動物乳，
c)從所述收集的乳中純化經修飾的人因子VII/VIIa。 有利地，轉基因哺乳動物可以是小鼠、雌性大鼠、雌性兔子或山羊。優選地，轉基因 哺乳動物是雌性兔子。 為了提供轉基因哺乳動物，可以使用傳統方法，包括例如將編碼本發明的經修飾 的人FVII/VIIa的DNA序列顯微注射進哺乳動物胚胎中，將所述經顯微注射的胚胎引入 相同物種的雌性哺乳動物的輸卵管腔中，等待經顯微注射的胚胎所產生的幼小哺乳動物出 生，檢查所述轉基因動物的確在其乳中表達經修飾的人FVII/VIIa。 可以通過本領域技術人員公知的純化方法純化本發明的FVII/VIIa，所述純化 方法包括但不限于層析(離子交換層析、親和層析、疏水層析或尺寸排阻層析)，基于電 泳的方法例如準備的等電位聚焦(IEF)、溶解度差異(硫酸銨沉淀)或萃取(Protein Purification J.-C. Janson禾PLarsRyden，編，VCH Publishers,New York(1989))。優選地， 可以在抗-FVII抗體柱上或在抗-FVII適體柱上，通過親和層析純化本發明的FVII/VIIa。 可以使用傳統的化學純化方法例如HPLC(高效液相層析)進行另外的純化。包括檸檬酸鋇 沉淀在內的其他純化方法是本領域技術人員公知的，并可用于純化本發明的FVI I/VI Ia。
在本文中使用時，"抗體"表示免疫球蛋白或其有免疫活性的部分，例如抗原結合區。因此，抗體表示包含至少一條、優選兩條重鏈和至少一條、優選兩條輕鏈的蛋白質。
在本文中使用時，"適體"表示具有下述三級結構的核酸分子(DNA或RNA)，所述三 級結構使其與蛋白質特異性地結合(Osborne，等(1997)Curr. Opin. Chem Biol. 1 :5-9 ;和 Patel，D. J. (1997)Curr Opin Chem Bioll :32-46)。 本發明還有一個目的是提供包含本發明的經修飾的人FVII/VIIa的組合物。
本發明還有一個目的是提供藥物組合物，其包含本發明的經修飾的人FVII/VIIa 和賦形劑和/或可藥用載體。 本發明的藥物組合物可用于腸胃外、表面或局部施用，和用于預防和/或治療性 應用。因此，本發明的經修飾的人FVII/VIIa被制備成適合所選施用途徑的形式，例如制成 液體形式或凍干形式。包含本發明的經修飾的人FVII/VIIa的藥物組合物可包含賦形劑和 /或可藥用載體，優選地是水性的。可以使用許多可藥用賦形劑和/或運載體，例如水、緩沖 的水、鹽水溶液、甘氨酸溶液及其衍生物，以及再現生理條件所需的試劑，例如緩沖液和pH 調節劑，表面活性劑如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣，該列表并非用于限制。另 外，可以通過本領域技術人員公知的滅菌方法對藥物組合物滅菌。 一般而言，為了制備本發 明的藥物組合物，本領域技術人員會有利地參照最新版的European Pharmacopoeia,例如 2005年1月出版的第5版European Pharmacopoeia,或2007年6月對公眾開放的第6版 European Pharmacopoeia 本發明的經修飾的人FVII/VIIa和包含它的藥物組合物尤其適用于制備藥物。 本發明的經修飾的FVII/VIIa和包含它的藥物組合物適用于制備在患者中治療凝固障礙 的藥物。有待使用本發明的藥物組合物治療的凝固障礙包括但不限于多發性出血性創傷 (multiple hemorrhagic trauma)例如A型和B型血友病，或過量抗凝血劑引起的出血。
本發明的經修飾的人FVII/VIIa可單獨使用，或與一種或多種其它有藥物活性的 分子組合使用。
實施例 實施例1 :人FVII三維模型 基于對蛋白質數據庫(PDB)中可獲得的所有結晶結構的詳盡研究，構思了人FVII 三維模型。根據多種參數分析了 27種FVI1結構，所述參數例如表達體系、重鏈和輕鏈完 整性、組織因子的存在、分辨率(resolution) 、 0-糖基化和N-糖基化的存在、Y _羧基化 的存在和在蛋白質數據庫(PDB)中的
公開日期。根據該研究，在結構的修正、組裝和最簡 化后(minimization)構建了蛋白質結構。使用的軟件套裝為Sybyl v7. 2 (Tripos， Inc.)。 Sybyl是一種建模軟件，其依賴于總能量最小化，從而定義最穩定的結構并且似乎是最合理 的。在下述條件下進行全局最小化步驟，所述步驟包括通過剌激組織因子的出現固定蛋白 質主鏈，所述條件為-終止參數能量梯度< 0. 5kCal/mol或達到的最大迭代數=10000
-最小化方法Powell
_力場Amber7FF99 _用于計算糖蛋白電荷的方法Amber7FF99，-用于計算離子和活性位點抑制劑電荷的方法Gasteiger-Hilckel
-未鍵合的取舍點(cut-off) :8 ^.實施例2 :提取和純化在轉某閔雌件免,子的乳中獲得的FVII
a)FVII提取 用9倍體積的磷酸鈉緩沖液0. 25M， pH 8. 2稀釋體積為500ml的非脫脂生乳。 在室溫下攪拌30分鐘后，將富含FVII的水相在10000g下于15t:離心1小時(Sorvall Evolution RC離心機6700rpm轉子SLC-6000)。需要6瓶，約835ml。 離心后形成三相表面上的脂質相(奶油(cream))，澄清的、富含FVII并且非脂 質的水相(主相)和白色固體沉淀相(不溶酪蛋白和f丐化合物沉淀)。
用蠕動泵將富含FVII的非脂質水相收集至觸及奶油相。將奶油相收集在一邊。去 除固體相(沉淀物)。 通過濾器層序(filter sequence) (Pall SLK7002U010ZP 孔徑1 P m的玻璃纖維 預濾器之后是Pall SLK7002NXP孔徑O. 45 y m的Nylon66)過濾非脂質但是仍然含有非常 小量脂質的水相。在過濾結束時，使脂相通過該過濾層序，所述過濾層序完全留住乳的脂質 小球，并且濾液是澄清的。 然后通過超濾膜(Millipore Biomax 50kDa 0. lm2)透析經過濾的非脂質水相， 使其與層析相相容。與乳的鹽、糖和肽相反，分子量約50kDa的FVII未濾過膜。在第一步 中，將溶液(約5000ml)濃縮至500ml，然后超濾透析使得能夠去除電解質并且制備用于層 析步驟的生物材料，所述超濾透析將體積保持在恒定的水平。透析緩沖液為磷酸鈉緩沖液 0. 025M， pH 8. 2。 可以將包含FVII的該非脂質水相與富含FVII-tg的乳清(lactoserum)比較。在 繼續所述過程之前將該制劑儲存于-3(TC下。 在該步驟結束時，包含FVII的非脂質水相是完全澄清的，并且可以進行以下的層 析步驟。 在該階段提取了約93000IU FVII-tg。這類制劑的FVII純度約為0. 2%。 b)FVII純化 1.在M某磷灰石凝膠上的層析 用BioRad Ceramic羥基磷灰石I型凝膠(CHT-I)填充Amicon 90柱(9cm直徑 64cm2截面)。 將凝膠在緩沖液A中平衡，所述緩沖液A由0. 025M磷酸鈉和0. 04M氯化鈉的混合 物組成，pH 8.0。在37t:水浴中融化儲存于-3(TC的總體制劑，直至冰塊完全溶解，然后將 其注射到所述凝膠上(線性流速100cm/h，即105ml/分鐘)。通過下述緩沖液去除未保留 的級分直至恢復至基線(RBL)，所述緩沖液由0. 025M磷酸鈉和0. 04M氯化鈉組成，pH 8. 2。
用緩沖液B實現含FVII級分的洗脫，所述緩沖液B由0. 25M磷酸鈉和0. 4M氯化 鈉組成，pH 8.0。收集洗脫的級分，直至恢復至基線。 該層析使得能夠回收多于90^的FVII，同時去除多于95^的乳蛋白質。比活性 (SA)是原來的25倍。在該階段可獲得約85000IU純度4^的FVI1。
2.切向過濾(lOOkDa)和濃縮/透析(50kDa) 以切向模式在100kDa超濾膜(Pall OMEGA SC 100K 0. lm2)上過濾前一步驟中的 全部洗脫液。FVII濾過lOOkDa膜，而分子量高于lOOkDa的蛋白質不能濾過。
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然后將經濾過的級分濃縮至約500ml ，然后在實施例1中已描述過的50kDA超濾器 上透析。透析緩沖液是0. 15M的氯化鈉。 在所述方法的這一階段，在進行離子交換層析之前將產物儲存于_30°CT。
該步驟使得能夠減少分子量高于100kDa的蛋白質、特別是酶原中的電荷。對 100kDa膜的處理導致約50X的蛋白質(包括高分子量蛋白質)滯留，同時濾過95%的 FVII，即82000IU FVII。 該處理使得可以降低下游步驟期間的蛋白質水解風險。
3.在Q-Sepharose⑧FF凝膠上的層析 在Q—Sepharose Fast f1ow(qsff)離子交換凝膠上進行這三種連續的層析，
從而純化活性物質，使得能夠將FVII活化為有活性的FVII (FVIIa)，并最終濃縮和配制 FVII組合物。
3. lQ-Sepharose⑧FF第一步"高牽丐"洗脫 用100ml Q-SepharOSe⑧FF凝膠(GE Healthca re)填充2. 6cm直徑的柱(截 面5. 3cm2) Q 將凝膠在0. 05M Tris緩沖液，pH 7. 5中平衡。在37t:水浴中融化儲存于-301:的整個級分，直至冰塊完全溶解。然后將該級分
用平衡緩沖液稀釋至1/2濃度[v/v]，之后注射到所述凝膠上(流速13m1/分鐘，線性流速 150cm/h)，然后通過運轉緩沖液去除未保留的級分直至恢復至基線。 用Tris 0. 05M和氯化鈉0. 15M緩沖液，pH 7. 5以9ml/分鐘(即100cm/h)洗脫 具有低FVII含量的第一蛋白質級分，然后將其去除。 用Tris 0. 05M，氯化鈉0. 15M和氯化f丐0. 05M緩沖液，pH 7. 5以9ml/分鐘(即 100cm/h)洗脫具有高FVII含量的第二蛋白質級分。 在實施例1中已描述的50kDA超濾器上透析該第二級分。透析緩沖液為氯化鈉 0. 15M。將該級分在+4C下儲存過夜，之后在用于第二陰離子交換層析的柱上過柱。該步驟 使得能夠回收73 %的FVII (即60000IUFVII)，同時去除80 %伴隨的蛋白質。使得也可以將 FVII活化為FVIIa。
3. 2Q—Sepharose⑧FF 2d步i聚"低牽丐"洗脫 用30mlQ-SepharOSe⑧FF凝膠(GE Healthcare)填充2. 5cm直徑的柱(4. 9Gm2 截面)。 將凝膠在0. 05M Tris緩沖液，pH 7. 5中平衡。
稀釋儲存于+4t:下的之前洗脫的級分(第二級分)，之后注射在凝膠上(流速
9ml/分鐘，線性流速100cm/h)。在Tris 0. 05M，氯化鈉0. 05M和氯化f丐0. 005M緩沖液，pH 7. 5中以4. 5ml/min (即
50cm/h)洗脫含非常高純度FVII的級分。 純化了約23000IU FVII，即12mg FVII。 該步驟使得能夠去除多于95%的伴隨的蛋白質(雌性兔子的乳蛋白質)。 純度大于90%的該洗脫物具有與天然人FVII接近的結構和功能特征。通過在離
子交換層析柱上第三次過柱，將其濃縮并配制。
3. 3 Q—Sepharose ff第三步驟"鈉"洗脫 用10ml的Q-SepharOSe⑧FF凝膠(GE Healthcare)填充2. 5cm直徑的柱(截 面4. 9cm2)。 將凝膠在0. 05M Tris緩沖液，pH 7. 5中平衡。 用注射用純水(WFI)將前一步驟純化的洗脫級分稀釋5倍，之后注射在凝膠上 (流速4. 5ml/分鐘，線性流速50cm/h)。 然后用Tris 0. 02M和氯化鈉0. 28M緩沖液，pH 7. 0以3ml/分鐘(即36cm/h)的 流速洗脫FVII。 制備作為濃縮物的FVII組合物，制備的純度高于95X。產物可用于靜脈注射。該
方法具有22%的累積產率，使得可以使用每升乳純化至少20mgFVn。 然后可對FVII進行多種結構分析，例如以下實施例中所示結構分析。 實施例3 :通過MALDI-TOFMS鑒定FVII非A型切割 質譜MALDI-TOF MS(基質輔助的激光解吸/電離飛行時間質譜)是一種能夠以高 精密度測量分子的分子量的技術。 將所測試的蛋白質與在使用的激光波長下吸光的基質混合。主要的基質包括用于 分析肽的a-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、用于分析蛋白質的芥子酸(SA)和用于分析寡糖 的2，5-二羥基苯甲酸(DHB)。 該方法在于用激光照射基質/分析物共結晶，這引起基質分子和分析物分子的共 同解吸。在氣體電離后，分析物分子到達飛行時間檢測器。因為重量和飛行時間密切相關， 所以測量后者使得能夠確定分析物重量。可以通過測量每種蛋白質或每種肽的重量(如在 質譜中所觀察到的)并通過與來自FVII序列的理論重量比較，對其進行鑒定。使用的設備 是以TOF和T0F/T0F兩種模式運行的Bruker Autoflex II。 FVII MALDI-TOF譜在14. 7kDa處顯示形狀(圖1，多肽IV)，其對應于含Asn322的 重鏈(HC)的C-端肽[Gly別-Pro4。6]，所述Asn322主要被雙觸角(biantennary)的單唾液酸 化型(Al)寡糖和其它聚糖(A1F，A2，…)糖基化。在該圖譜中，也在34.6kDa處觀察到以 精氨酸290為結尾的N端、互補形式FVI1(圖l，多肽IV)的存在。在44.8kDa處(圖l，多 肽II)觀察到另一非典型切割，其對應于在賴氨酸38后被切割的輕鏈(LC)，也就是說Gla 結構域缺失的FVII形式，其與組織因子的親和力因此降低。 在還原條件下(圖2)，分別在29.9和19. 3kDa(多肽I)處記錄了 FVIIa重鏈和輕
鏈的存在。觀察到另一 11.9kDa形式，其對應于含糖基化Asn^的肽[Lys316-Pro4。6]。在天
然狀態下，該肽通過二硫鍵(Cys31。-Cys329)與蛋白質的N_端部分結合。 所有測試的FVII樣品都具有一個或多個這些截短的形式。全部鑒定的形式由絲
氨酸蛋白酶型切割引起。因此這些多種切割可能來自自身催化。 實施例4 :使用Edman測序進行的非典型切割定暈 基于Edman化學降解原理在微型測序儀(microsequencer， Procise491HT ; Applied Biosystem)上進行FVII N_端測序，所述Edman化學降解原理在于三個步驟偶 聯-切割和轉化，然后在反相柱上分離形成的氨基酸。然后使用標準氨基酸檢查和鑒定由 此產生的N-端氨基酸，并與所述蛋白質的理論序列進行比較。在數據收集和使用標準氨基 酸層析圖(SequencePro A卯lied Biosystems)的比較分析后，進行記錄的評估。將所測定的FVII序列與氨基酸理論序列比較。
系統性地鑒定了 2條主要的序列-N端LC序列ANAFLEELRPGSLERECKEEQCSF(SEQ ID N° 3)
-N端HC序列IVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCG(SEQ ID N° 4)
根據產物鑒定了 3條其它序列 -LC序列LFWISYSDGDQ(SEQ ID N° 5)(在賴氨酸38后非典型切割)。
-HC序列GATALELMVLNVPRLMTQ (SEQ ID N° 6)(在精氨酸290后的非典型切割)。
-HC序列KVGDSPMTE預FCAGYSDGS (SEQ ID N° 7)(在精氨酸315后非典型切割)。
粗體和斜體的氨基酸代表序列缺口，也就是說由于翻譯后修飾(例如Y-羧基化、 N-或O-糖基化)的出現而未能用Edman測序鑒定的氨基酸。進行定量評估，從而評估取決 于FVII起源的多種非典型切割的量。結果在下文表1中給出。 表l.取決于FVII起源的、與產物總體相比以百分數表示的多種非典型切割。 FVII-pd :來自血漿的人FVII ;FVII-Tg :非突變的轉基因人FVII ;FVII-rec :商業重組人 FVII(非突變的)。
序列FVII-pd(% )FVII-Tg批次 A(% )FVII-Tg批次 B(% )FVII-rec(% )
K316VGDSP."2717529
G291ATALEL."8. 58134
L39FWISYS."122684. 5 FVII輕鏈在氨基酸K38和L39之間具有取決于產物來源從4. 5%到26%變化的非 典型切割率。FVII重鏈具有R315和K316之間的非典型切割率(取決于產物來源從9%到 52%變化)，并且也在R290和G291之間被切割(取決于產物來源從4%到13%變化)。
權利要求
與天然人因子VII/VIIa的肽序列相比經修飾的人因子VII/VIIa，其在至少兩個選自賴氨酸38、精氨酸290和精氨酸315的氨基酸上被取代或缺失，其中-所述賴氨酸38被選自以下的氨基酸替代谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸；-所述精氨酸290被選自以下的氨基酸替代谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸，和/或-所述精氨酸315被選自以下的氨基酸替代谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸。
2. 根據權利要求1的經修飾的人因子VII/VIIa，其中賴氨酸38被選自谷氨酰胺、組氨酸或谷氨酸的氨基酸替代。
3. 根據權利要求1或2的經修飾的人因子VII/VIIa，其中天冬酰胺290被選自谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺或谷氨酸的氨基酸替代。
4. 根據權利要求1到3中任一項的經修飾的人因子VlI/VIIa，其中天冬酰胺315被選自谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺或谷氨酸的氨基酸替代。
5. 根據權利要求1到4中任一項的經修飾的人因子VlI/VIIa，其中賴氨酸38被谷氨酰胺替代。
6. 根據權利要求1到5中任一項的經修飾的人因子VlI/VIIa，其中精氨酸290被谷氨酰胺替代。
7. 根據權利要求1到6中任一項的經修飾的人因子VII/VIIa，其中精氨酸315被谷氨酰胺替代。
8. 編碼權利要求1到7中任一項定義的經修飾的人因子VlI/VIIa的核酸。
9. 其中插入根據權利要求8的核酸的表達載體。
10. 用根據權利要求8的核酸轉化的細胞，所述細胞表達經修飾的人因子VlI/VIIa。
11. 經遺傳修飾的生物，所述生物在其基因組中包含編碼根據權利要求1到7中任一項定義的經修飾的人因子VlI/VIIa的核酸，并且表達所述經修飾的人因子VlI/VIIa。
12. 根據權利要求ll的經遺傳修飾的生物，其為微生物、動物或植物。
13. 根據權利要求11或12的經遺傳修飾的生物，其為哺乳動物。
14. 根據權利要求13的經遺傳修飾的生物，其中所述哺乳動物是雌性兔子。
15. 根據權利要求11或12的經遺傳修飾的生物，其為昆蟲。
16. 用于制備根據權利要求1到7中任一項的因子VlI/VIIa的方法，所述方法包括以下步驟a) 用下述核酸轉化細胞，所述核酸編碼根據權利要求1到7中任一項的經修飾的人FVII/VIIa，b) 培養步驟a)中獲得的細胞，從而所述細胞表達所述因子VII/VIIa，禾口c) 純化由步驟b)中培養的轉化細胞表達的經修飾的人因子VII/VIIa。
17. 在轉基因哺乳動物的乳中制備根據權利要求1到7中任一項定義的經修飾的人因子Vll/VIIa的方法，所述方法包括以下步驟a) 提供轉基因哺乳動物，所述動物在其乳腺中表達下述核酸，所述核酸編碼根據權利要求1到7中任一項的經修飾的人因子VlI/VIIa，b) 收集含有因子VII/VIIa的轉基因動物乳，c) 從所述收集的乳中純化經修飾的人因子VlI/VIIa。
18. 根據權利要求17的方法，其中所述轉基因動物選自小鼠、雌性大鼠、山羊或雌性兔子。
19. 根據權利要求18的方法，其中所述轉基因動物是雌性兔子。
20. 因子Vll/VIIa組合物，其包含根據權利要求1到7中任一項定義的經修飾的人因子VlI/VIIa。
21. 藥物組合物，其包含根據權利要求1到7中任一項定義的經修飾的人因子VII/Vila和賦形劑和/或可藥用載體。
22. 根據權利要求1到7中任一項的因子VlI/VIIa用于制備藥物的用途。
23. 根據權利要求1到7中任一項的因子VlI/VIIa用于制備治療凝固障礙的藥物的用途。
24. 根據權利要求1到7中任一項的因子VlI/VIIa用于制備治療多發性出血性創傷的藥物的用途。
25. 根據權利要求1到7中任一項的因子VlI/VIIa用于制備治療血友病的藥物的用途。
26. 根據權利要求1到7中任一項的因子VlI/VIIa用于制備下述藥物的用途，所述藥物用于治療抗凝血劑過量引起的出血。
全文摘要
本發明涉及具有高穩定性的經修飾的因子VII/VIIa，編碼這類經修飾的因子VII/VIIa的核酸，及其制備方法。
文檔編號C12N9/64GK101743017SQ200880024853
公開日2010年6月16日 申請日期2008年6月12日 優先權日2007年6月15日
發明者E·諾尼, N·比霍羅, S·什圖魯 申請人:Lfb生物技術公司