單鏈抗體的基于序列的改造和優(yōu)化的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)捂溈贵w的基于序列的改造和優(yōu)化的制作方法
單鏈抗體的基于序列的改造和優(yōu)化
相關(guān)申請(qǐng)
本申請(qǐng)要求于2007年6月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào) 60/937,112的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的名稱(chēng)為"Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies"。本中請(qǐng)還 要求于2008年3月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/069,057的優(yōu) 先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的名稱(chēng)為"S叫uence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies"。
背景技術(shù)：
已證明抗體在癌癥、自身免疫疾病和其他病癥的治療中是非常有 效和成功的治療劑。盡管一般已在臨床上使用全長(zhǎng)抗體，但存在使用 抗體片段可以提供的許多優(yōu)點(diǎn)，例如增加組織穿透力、與增加其他效 應(yīng)子功能的能力結(jié)合的Fc效應(yīng)子功能的不存在、和由較短的全身體內(nèi) 半衰期導(dǎo)致的較少全身性副作用的可能性?？贵w片段的藥代動(dòng)力學(xué)性 質(zhì)表明，它們可能特別良好地適合于局部治療方法。此外，抗體片段 在特定表達(dá)系統(tǒng)中可以比全長(zhǎng)抗體更容易產(chǎn)生。
一個(gè)類(lèi)型的抗體片段是單鏈抗體(scFv)，其由經(jīng)由接頭序列綴 合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VJ與重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)組成。因此，scFv 缺乏所有抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，并且先前的可變/恒定結(jié)構(gòu)域界面的氨基 酸殘基(界面殘基)變成溶劑暴露的。scFv可以通過(guò)已建立的重組改 造技術(shù)由全長(zhǎng)抗體(例如IgG分子)制備。然而，全長(zhǎng)抗體轉(zhuǎn)變成scFv 通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的弱穩(wěn)定性和溶解性、低產(chǎn)量和高聚集趨勢(shì)，這增加 免疫原性危險(xiǎn)。
因此，已嘗試改善scFv的性質(zhì)例如溶解性和穩(wěn)定性。例如，Nieba， L.等人(Prot. Eng. ( 1997) 10: 435-444)選擇已知為界面殘基的3
6個(gè)氨基酸殘基且使其突變。他們觀察到突變的scFv在細(xì)菌中周質(zhì)表達(dá) 增加，以及熱誘導(dǎo)聚集速率減小，盡管熱力學(xué)穩(wěn)定性和溶解性未顯著 改變。其中對(duì)scFv內(nèi)的特定氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)誘變的其他研究也已 得到報(bào)告(參見(jiàn)例如，Tan， P.H.等人(1988 )5Zo/i/^s. J. 2^: 1473-1482; W6rn， A.和Pltickthun, A. ( 1998 )5/oc/^附.^Z: 13120-13127; W6rn， A.和PHickthun， A. ( 1999 ) 5,W&附.8739-8750)。在這些各種 研究中，選擇用于誘變的氨基酸殘基基于其在scFv結(jié)構(gòu)內(nèi)的已知位置 (例如，來(lái)自分子建模研究)進(jìn)行選擇。
在另一種方法中，將來(lái)自表達(dá)極弱的scFv的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 移植到已證實(shí)具有有利性質(zhì)的scFv的構(gòu)架區(qū)內(nèi)(Jung， S.和 Pltickthun, A. ( 1997)1￡: 959-966)。所得到的scFv顯 示改善的可溶性表達(dá)和熱力學(xué)穩(wěn)定性。
改造scFv以改善功能性質(zhì)中的進(jìn)展在例如W(irn， A.和 Plttckthun, A. ( 2001 )/. Afo/.必iV /.巡989-1010中綜述。然而，仍 需要允許合理設(shè)計(jì)具有優(yōu)良功能性質(zhì)的scFv的新方法，特別是幫助技 術(shù)人員選擇潛在有問(wèn)題的氨基酸殘基用于改造的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了允許使用基于序列的分析鑒定scFv序列中對(duì)于穩(wěn) 定性和/或溶解性潛在有問(wèn)題的氨基酸殘基的方法。此外，可選擇根據(jù) 本發(fā)明的方法鑒定的氨基酸殘基進(jìn)行突變，可制備已進(jìn)行突變的經(jīng)改 造的scFv并且就提高的功能性質(zhì)(例如穩(wěn)定性和/或溶解性)對(duì)其進(jìn) 行篩選。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其中將功能性選擇 的(functionally-selected) scFv的數(shù)據(jù)庫(kù)用于鑒定氨基酸殘基位置的 方法，所述氨基酸殘基位置比種系和/或成熟抗體免疫球蛋白序列中相 應(yīng)的位置更加耐受或更不耐受變異性，從而表明此類(lèi)鑒定的殘基位置 可適合用于改造以提高scFv功能性例如穩(wěn)定性和/或溶解性。因此， 本發(fā)明提供了基于功能性選擇的scFv序列的數(shù)據(jù)庫(kù)的使用的"功能共 有區(qū)(functional consensus )，，方法并證明了其優(yōu)點(diǎn)。
7在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定免疫結(jié)合劑
(immunobinder )中目的氨基酸位置(例如，通過(guò)將具有至少一個(gè)期 望的性質(zhì)的scFv序列(如使用QC測(cè)定法選擇的)的數(shù)據(jù)庫(kù)與成熟抗 體序列的數(shù)據(jù)庫(kù)例如Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)比較而鑒定的氨基酸位置)上要置 換的優(yōu)選氨基酸殘基(或備選地，要排除的氨基酸殘基)的方法。因 此本發(fā)明還提供了用于選擇特定氨基酸殘基的"富集/排除"法。此夕卜， 本發(fā)明提供了通過(guò)突變使用本文中描述的"功能共有區(qū)"方法鑒定的 特定構(gòu)架氨基酸位置來(lái)對(duì)免疫結(jié)合劑(例如，scFv、全長(zhǎng)免疫球蛋白、 Fab片段、單結(jié)構(gòu)域抗體(例如，Dab)和納米抗體)進(jìn)行改造的方法。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)用使用本文中描述的"富集/排除"分析法發(fā) 現(xiàn)為"富集的"殘基的殘基置換現(xiàn)有的氨基酸殘基來(lái)突變構(gòu)架氨基酸
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變的氨 基酸位置的方法，所述scFv具有Vh和Vl氛基酸序列，該方法包括
a) 將scFv VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫(kù)(所述數(shù)據(jù) 庫(kù)包含大量抗體VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列)以使scFv VH、 Vl 或VH和VL氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH、 VL或VH和VL氨基酸序 列進(jìn)行比對(duì)；
b) 將scFv Vh或Vt氨基酸序列中的氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體 Vh或Vt氨基酸序列中相應(yīng)的位置相比較；
c) 確定scFv Vh或V^氨基酸序列中的氨基酸位置是否被在數(shù)據(jù)庫(kù) 的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位置上保守的氨基酸殘基占據(jù)； 和
d) 當(dāng)氨基酸位置被在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或VL氨基酸序列中的相應(yīng) 位置上不保守的氨基酸殘基占據(jù)時(shí)，將scFv Vh或Vi^氨基酸序列中的 該氨基酸位置鑒定為用于突變的氨基酸位置。
該方法還可包括突變scFv Vh或Vt氨基酸序列中經(jīng)鑒定用于突變 的氨基酸位置。例如，可用在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的 相應(yīng)位置上保守的氨基酸殘基置換經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置。另夕卜或備選地，可通過(guò)隨才幾i秀變或通過(guò)偏好性i秀變(biased mutagenesis) 突變經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置以產(chǎn)生突變的scFv的文庫(kù)，然后篩 選突變的scFv的文庫(kù)，選擇具有至少一個(gè)提高的功能性質(zhì)的scFv(例 如，通過(guò)使用酵母質(zhì)量控制系統(tǒng)(QC-系統(tǒng))篩選文庫(kù))。
各種類(lèi)型的數(shù)據(jù)庫(kù)可用于本發(fā)明的方法。例如，在一個(gè)實(shí)施方案 中，數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列是種系抗體VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)庠的抗體Vh、 Vl或Vh和Vi^氨基酸序列是重排的親和力成熟的抗體VH、 Vl或Vh 和V^氨基酸序列。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體 VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列是因具有至少一個(gè)期望的功能性質(zhì)(例 如scFv的穩(wěn)、定性或scFv的溶解性)而被選擇的scFv抗體VH、 Vl或 Va和V^氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多于一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可用于 比較目的。例如，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用因具有至少一個(gè)期 望的功能性質(zhì)而被選擇的scFv的數(shù)據(jù)庫(kù)以及一個(gè)或多個(gè)種系數(shù)據(jù)庫(kù) 或重排的親和力成熟的抗體數(shù)據(jù)庫(kù)，其中將來(lái)自scFv數(shù)據(jù)庫(kù)的序列比 較結(jié)果與來(lái)自其他數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果相比較。
本發(fā)明的方法可用于分析例如scFv的Vh區(qū)、scFv的Vl區(qū)或丙者。
雖然本發(fā)明的方法可用于分析目的scFv內(nèi)的單個(gè)目的氨基酸位 置，但更優(yōu)選該方法用于分析沿著scFv序列的多個(gè)氨基酸位置。因此， 在優(yōu)選實(shí)施方案中，在該方法的步驟b)中，將scFvVh或Vt氨基酸序 列中的多個(gè)氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng) 位置相比較。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，將scFvVh、 Vl或Vh和Vl 氨基酸序列中的各構(gòu)架位置(framework position)與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體 VH、 Vl或Vh和Vr^氨基酸序列中的各相應(yīng)構(gòu)架位置相比較。另外地 或備選地，可分析scFv的一個(gè)或多個(gè)CDR中的一個(gè)或多個(gè)位置。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，將scFvVh、 V^或Vh和Vt氨基酸序列中的各氨 基酸位置與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列中的各相應(yīng) 的氨基酸位置相比較。
9在數(shù)據(jù)庫(kù)的序列之間"保守"的氨基酸位置可被一種或多種特定 類(lèi)型的氨基酸殘基占據(jù)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，"保守的"位置 被在該位置以極高頻率出現(xiàn)的一個(gè)特定氨基酸殘基占據(jù)。即，在該方
法的步驟c)中，在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位置上 保守的氨基酸殘基是在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或V^氨基酸序列中在該位置 上出現(xiàn)頻率最高或最顯著富集的氨基酸殘基。在該情況下，為了產(chǎn)生 經(jīng)改造的scFv，經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體
Vh或VL氨基酸序列中的相應(yīng)位置上最頻繁觀察到或最顯著富集的氨
基酸殘基進(jìn)行置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在數(shù)據(jù)庫(kù)的序列之間"保 守的"氨基酸位置可被例如(i)疏水氨基酸殘基，(ii)親水氨基酸殘基， (iii)能夠形成氫鍵的氨基酸殘基或(iv)具有形成P折疊傾向的氨基酸殘 基占據(jù)。即，在該方法的步驟c)中，數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或V^氨基酸序 列中的相應(yīng)位置對(duì)于(i)疏水氨基酸殘基，(ii)親水氨基酸殘基，(iii) 能夠形成氫鍵的氨基酸殘基或(iv)具有形成P折疊傾向的氨基酸殘基 是保守的。
因此，為了產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv，當(dāng)數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸 序列中的相應(yīng)位置對(duì)于疏水氨基酸殘基是保守的時(shí)候，scFv中經(jīng)鑒定 用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的 相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率最高的疏水氨基酸殘基進(jìn)行置換，此外或備選地， scFv中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用因在scFv中的該位置上為 最適合的而被選擇的疏水氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究，最可 能保持scFv的結(jié)構(gòu)和功能的疏水殘基)置換。此外或備選地，scFv中 經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可通過(guò)定點(diǎn)誘變用一組疏水氨基酸殘基 進(jìn)行置換，從而產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv的文庫(kù)，并且最優(yōu)選的置換可通過(guò) 就期望的功能性質(zhì)篩選文庫(kù)來(lái)選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)。
此外，為了產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv，當(dāng)數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸 序列中的相應(yīng)位置對(duì)于親水氨基酸殘基是保守的時(shí)候，scFv中經(jīng)鑒定 用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或VL氨基酸序列中的 相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率最高的親水氨基酸殘基進(jìn)行置換。另外或備選地，
10scFv中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用因在scFv中的該位置上是 最合適的而被選擇的親水氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究，最可 能保持scFv的結(jié)構(gòu)和功能的親水殘基)置換。另外或備選地，scFv中 經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可通過(guò)定點(diǎn)誘變用一組親水氨基酸殘基 來(lái)置換，從而產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv文庫(kù)，并且最優(yōu)選的置換可通過(guò)就期 望的功能性質(zhì)篩選文庫(kù)來(lái)選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)。
此外，為產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv，當(dāng)數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序 列中的相應(yīng)位置對(duì)于能夠形成氬鍵的氨基酸殘基是保守的時(shí)候，scFv 中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸 序列中的相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率最高的能夠形成氫鍵的氨基酸殘基進(jìn)行 置換。另外或備選地，scFv中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用因在 scFv中的該位置上是最合適的而被選擇的能夠形成氫鍵的氨基酸殘 基(例如，基于分子建模研究，最可能保持scFv的結(jié)構(gòu)和功能的殘基) 置換。另外或備選地，scFv中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可通過(guò)定 點(diǎn)誘變用一組能夠形成氫鍵的氨基酸殘基進(jìn)行置換，從而產(chǎn)生經(jīng)改造 的scFv的文庫(kù)，并且最優(yōu)選的置換可通過(guò)就期望的功能性質(zhì)篩選文庫(kù) 來(lái)選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)。
此外，為產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv，當(dāng)數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序 列中的相應(yīng)位置對(duì)于具有形成P折疊的傾向的氨基酸殘基是保守的時(shí) 候，scFv中的經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH 或Vl氨基酸序列中的相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率最高的具有形成P折疊的 傾向的氨基酸殘基進(jìn)行置換。另外或備選地，scFv中經(jīng)鑒定用于突變 的氨基酸位置可用因在scFv中的該位置上是最合適的而被選擇的具 有形成P折疊的傾向的氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究，最可能 保持scFv的結(jié)構(gòu)和功能的殘基)置換。另外或備選地，scFv中經(jīng)鑒定 用于突變的氨基酸位置可通過(guò)定點(diǎn)誘變用 一組具有形成|3折疊的傾向 的氨基酸殘基進(jìn)行置換，從而產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv的文庫(kù)，并且最優(yōu)選 的置換可通過(guò)就期望的功能性質(zhì)篩選文庫(kù)來(lái)選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，可使用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行用于鑒定scFv中用于突 變的氨基酸位置的本發(fā)明的方法，所述數(shù)據(jù)庫(kù)是其中只有與scFv抗體 VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列具有高度相似性的抗體VH、 Vi^或Vh 和VL氨基酸序列包括在該數(shù)據(jù)庫(kù)中的受限制的數(shù)據(jù)庫(kù)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，為了定量分析的氨基酸位置(即，數(shù)據(jù)庫(kù)的 抗體Vh或V^氨基酸序列中的"相應(yīng)位置")的保守性，使用辛普森 指數(shù)(Simpson's Index )給氨基酸位置的保守程度賦值。
本發(fā)明的方法還可用于檢查scFv序列中的成對(duì)的氨基酸位置，以 鑒定彼此共變的氨基酸位置，這樣此類(lèi)共變對(duì)位置的一個(gè)或兩個(gè)位置 可被鑒定用于突變。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣 的方法，其包括
a) 對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH或VL氨基酸序列進(jìn)行協(xié)方差分析 (covariance analysis )以鑒定氨基酸位置的共變對(duì)；
b) 將氨基酸位置的共變對(duì)與scFv Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位 置相比較；
c) 確定scFv Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位置是否被在數(shù)據(jù)庫(kù)的 抗體Vh或Vt氨基酸序列中的氨基酸位置的共變對(duì)上保守的氨基酸殘 基占據(jù)；和
d) 當(dāng)scFv中的相應(yīng)位置中的一個(gè)或兩個(gè)位置被在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體
Vh或VL氨基酸序列中的氨基酸位置的共變對(duì)上不保守的氨基酸殘基
占據(jù)時(shí)，將scFvVh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置中的一個(gè)或兩個(gè)位 置鑒定為用于突變的氨基酸位置。
該協(xié)方差分析還可與單個(gè)氨基酸位置的分析組合，這樣具有步驟 a) - d)的上述鑒定scFv中用于突變的氨基酸位置的方法可進(jìn)一步包括 步驟
e) 對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序列進(jìn)行協(xié)方差分析以鑒定氨 基酸位置的共變對(duì)；
f) 將氨基酸位置的共變對(duì)與scFv Vh或VL氨基酸序列中的相應(yīng)位 置相比較；g) 確定scFv Vh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置是否被在數(shù)據(jù)庫(kù)的 抗體VH或Vl氨基酸序列中的氨基酸位置的共變對(duì)上保守的氨基酸殘 基占據(jù)；和
h) 當(dāng)scFv中的相應(yīng)位置中的一個(gè)或兩個(gè)位置被在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體 Vh或V^氨基酸序列中的氨基酸位置的共變對(duì)上不保守的氨基酸殘基 占據(jù)時(shí)，將scFv Vh或V!^氨基酸序列中的相應(yīng)位置中的一個(gè)或兩個(gè)位 置鑒定為用于突變的氨基酸位置。
可將協(xié)方差分析法用于單個(gè)共變對(duì)或，備選地，可在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗 體Vh或Vt氨基酸序列中鑒定多個(gè)氨基酸位置共變對(duì)并且將其與scFv Vh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置相比較。
該方法還可包括突變scFv中的相應(yīng)位置中的一個(gè)或兩個(gè)位置，所 述位置被在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的氨基酸位置的共變 對(duì)上不保守的氨基酸殘基占據(jù)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，scFv中的 相應(yīng)位置中的一個(gè)位置(所述位置被在氨基酸位置的共變對(duì)上不保守 的氨基酸殘基占據(jù))用在共變對(duì)氨基酸位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸 殘基進(jìn)行置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，scFv中的兩個(gè)相應(yīng)位置(所述 位置都被在氨基酸位置的共變對(duì)上不保守的氨基酸殘基占據(jù))用在共 變對(duì)氨基酸位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基進(jìn)行置換。
可將用于鑒定scFv序列中用于突變的氨基酸位置的本發(fā)明的基 于序列的方法與允許進(jìn)行scFv的結(jié)構(gòu)分析的其他方法組合。例如，在 一個(gè)實(shí)施方案中，可將基于序列的方法與分子建模法組合來(lái)進(jìn)一步分 析scFv的結(jié)構(gòu)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，具有步驟a)-d)的上述方 法還可包括例如步驟
e) 使scFvVH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列經(jīng)歷分子建模；和
f) 在scFv VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列中鑒定至少一個(gè)另外的 氨基酸位置用于突變。
該方法還可包括突變scFv VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列中的該 至少一個(gè)通過(guò)分子建模鑒定用于突變的另外的氨基酸位置。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法制備的scFv組合
13物，其中在經(jīng)鑒定用于突變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上進(jìn)行了一個(gè)或
多個(gè)突變。還提供了藥物制劑，該制劑通常包含scFv組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在單鏈抗體(scFv)中鑒定一個(gè)或多個(gè)用于突變的構(gòu)架氨基酸位置的方法，所述scFv具有Vh和V^氨基酸序列，該方法包括
a) 提供Vh、 Vl或Vh和V^氨基酸序列的第一數(shù)據(jù)庫(kù)；
b) 提供因具有至少一個(gè)期望的功能性質(zhì)而被選擇的scFv抗體VH、 Vl或Vh和V]L氨基酸序列的第二數(shù)據(jù)庫(kù)；
c) 確定第一數(shù)據(jù)庫(kù)的各構(gòu)架位置和第二數(shù)據(jù)庫(kù)的各構(gòu)架位置上的氨基酸變異性(variability);
d) 鑒定在其上氨基酸變異性的程度在第一數(shù)據(jù)庫(kù)和第二數(shù)據(jù)庫(kù)之間不同的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架位置，從而鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架氨基酸位置。
優(yōu)選，各構(gòu)架位置上的氨基酸變異性通過(guò)使用辛普森指數(shù)給保守程度賦值來(lái)測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于與第一數(shù)據(jù)庫(kù)相比在第二數(shù)據(jù)庫(kù)中具有更低的辛普森指數(shù)(SI)值的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架氨基酸位置鑒定用于突變的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架氨基酸位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基于與第一數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，種系數(shù)據(jù)庫(kù))相比在第二數(shù)據(jù)庫(kù)中具有更高的辛普森指數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架氨基酸位置鑒定用于突變的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架氨基酸位置。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第二數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，QC數(shù)據(jù)庫(kù))的氨基酸位置具有比第一數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，Kabat數(shù)據(jù)庫(kù))中的相應(yīng)的氨基酸位置的SI值低至少0.01，和更優(yōu)選低至少0.05(例如，0.06、 0.07、 0.08、 0.09或O.l)的SI值。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，第二數(shù)據(jù)庫(kù)的氨基酸位置具有比第一數(shù)據(jù)庫(kù)中的相應(yīng)的氨基酸位置的SI值低至少O.l(例如，低O.l、 0.15、 0.2、 0.25、 0.3、 0.35、 0.4、 0.45或0.5)的SI值。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定用于免疫結(jié)合劑中的置換的優(yōu)選氨基酸殘基的方法，該方法包括a) 提供已分組的Vh或Vt氨基酸序列(例如按照Kabat家族亞型分組的種系和/或成熟抗體序列)的第一數(shù)據(jù)庫(kù)；
b) 提供因具有至少一個(gè)期望的功能性質(zhì)而被選擇(例如，根據(jù)QC測(cè)定)的已分組的scFv抗體Vh或V^氨基酸序列的第二數(shù)據(jù)庫(kù)；
c) 測(cè)定第一數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)架位置和第二數(shù)據(jù)庫(kù)的相應(yīng)構(gòu)架位置上的氨基酸殘基的氨基酸頻率；
d) 當(dāng)相對(duì)于第一數(shù)據(jù)庫(kù)，氨基酸殘基以更高的頻率在第二數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)生(即，富集的殘基)時(shí)，將該氨基酸殘基鑒定為用于免疫結(jié)合劑的相應(yīng)氨基酸位置上的置換的優(yōu)選氨基酸殘基。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定待從免疫結(jié)合劑排除的氨基酸殘基的方法，該方法包括
a) 提供已分組的Vh或VL氨基酸序列(例如按照Kabat家族亞型分組的種系和/或成熟抗體序列)的第一數(shù)據(jù)庫(kù)；
b) 提供因具有至少一個(gè)期望的功能性質(zhì)而被選擇(例如，根據(jù)QC測(cè)定)的已分組的scFv抗體Vh或Vt氨基酸序列的第二數(shù)據(jù)庫(kù)；
c) 測(cè)定第一數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)架位置和第二數(shù)據(jù)庫(kù)的相應(yīng)構(gòu)架位置上的氨基酸殘基的氨基酸頻率；
d) 當(dāng)相對(duì)于第一數(shù)據(jù)庫(kù)，氨基酸殘基以更低的頻率在第二數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)生時(shí)，將該氨基酸殘基鑒定為用于免疫結(jié)合劑的相應(yīng)氨基酸位置上的置換的不利氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基的類(lèi)型是不利氨基酸殘基(即，被排除的殘基)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，如果富集因子(EF)小于l，則鑒定了不利的氨基酸殘基。
在某些實(shí)施方案中，第一數(shù)據(jù)庫(kù)包含種系VH、 VL或VH和Vi^氨
基酸序列。在其他實(shí)施方案中，第一數(shù)據(jù)庫(kù)由種系VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一數(shù)據(jù)庫(kù)包含成熟VH、Vl或Vh和V^氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一數(shù)據(jù)庫(kù)由成熟VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列組成。在示例性實(shí)施方案中，成熟VH、VL或VH和VL氨基酸序列來(lái)自Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(KDB)。
在某些實(shí)施方案中，第二數(shù)據(jù)庫(kù)包含根據(jù)QC測(cè)定選擇的scFv抗
15體Vh、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二數(shù)據(jù)庫(kù)由根據(jù)QC測(cè)定選擇的scFv抗體VH、 Vl或Vh和Vl氛基酸序列組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，期望的功能性質(zhì)是提高的穩(wěn)定性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，期望的功能性質(zhì)是提高的溶解性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，期望的功能性質(zhì)是非聚集性(non-aggregation)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，期望的功能性質(zhì)是表達(dá)的提高(例如，在原核細(xì)胞中)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是在內(nèi)含體純化方法后重折疊產(chǎn)量的提高。在某些實(shí)施方案中，期望的功能性質(zhì)不是抗原結(jié)合親和力的提高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，獲得一種或多種期望的功能的組合。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑的方法，該方法包
括
a) 在免疫結(jié)合劑內(nèi)選擇一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置用于突變；和
b) 使選擇用于突變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置突變，
其中如果選擇用于突變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置是重鏈氨基酸位置，那么所述氨基酸位置選自使用AHo編號(hào)的位置l、 6、 7、 10、 12、13、 14、 19、 20、 21、 45、 47、 50、 55、 77、 78、 82、 86、 87、 89、卯、92、 95、 98、 103和107 (使用Kabat編號(hào)的氨基酸位置1、 6、 7、
9、 11、 12、 13、 18、 19、 20、 38、 40、 43、 48、 66、 67、 71、 75、 76、78、 79、 81、 82b、 84、 89和93),和
其中如果選擇用于突變的 一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置是輕鏈氨基酸位置，那么所述氨基酸位置選自使用AHo編號(hào)的位置l、 2、 3、 4、 7、
10、 11、 12、 14、 18、 20、 24、 46、 47、 50、 53、 56、 57、 74、 82、91、 92、 94、 101和103 (使用Kabat編號(hào)的氨基酸位置1、 2、 3、 4、7、 10、 11、 12、 14、 18、 20、 24、 38、 39、 42、 45、 48、 49、 58、 66、73、 74、 76、 83和85)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑的方法，所迷方法包括
a)在免疫結(jié)合劑內(nèi)選擇一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置用于突變；和b)使選擇用于突變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置突變，其中選擇用于
突變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置選自
(i) 使用AHo編號(hào)的VH3的氨基酸位置1、 6、 7、 89和103(使用Kabat編號(hào)的氨基酸位置1、 6、 7、 78和89);
(ii) 使用AHo編號(hào)的VHla的氨基酸位置1、 6、 12、 13、 14、 19、21、 90、 92、 95和98"吏用Kabat編號(hào)的氨基酸位置1、 6、 11、 12、13、 18、 20、 79、 81、 82b和84);
(iii) 使用AHo編號(hào)的VHlb的氨基酸位置1、 10、 12、 13、 14、20、 21、 45、 47、 50、 55、 77、 78、 82、 86、 87和107(使用Kabat編號(hào)的氨基酸位置l、 9、 11、 12、 13、 19、 20、 38、 40、 43、 48、 66、67、 71、 75、 76和93);
(iv) 使用AHo編號(hào)的Vk1的氨基酸位置1、 3、 4、 24、 47、 50、57、 91和103(使用Kabat編號(hào)的氨基酸位置1、 3、 4、 24、 39、 42、49、 73和85);
(v) 使用AHo編號(hào)的Vk3的氨基酸位置2、 3、 10、 12、 18、 20、56、 74、 94、 101和103(使用Kabat編號(hào)的氨基酸位置2、 3、 10、 12、18、 20、 48、 58、 76、 83和85);和
(vi) 使用AHo編號(hào)的V入l的氨基酸位置1、 2、 4、 7、 11、 14、46、 53、 82、 92和1030吏用Kabat編號(hào)的氨基酸位置1、 2、 4、 7、11、 14、 38、 45、 66、 74和85)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選所有)選自使用AHo編號(hào)的氨基酸位置12、 13和144 (使用Kabat編號(hào)的氨基酸位置12、 85和103)的重鏈氨基酸位置的鏈置換。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，將選擇用于突變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置突變成在因具有至少一個(gè)期望的功能性質(zhì)而被選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)的抗體序列中的相應(yīng)氨基酸位置上發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將選擇用于突變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置突變成按照本發(fā)明的富集/排除分析法鑒定的氨基酸殘基(例如，"富集的氨基酸殘基")。
17優(yōu)選，免疫結(jié)合劑是scFv，但其他免疫結(jié)合劑例如全長(zhǎng)免疫球蛋
白和其他抗體片段(例如，F(xiàn)ab或Dab)也可按照該方法進(jìn)行改造。本曰/
和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
附圖簡(jiǎn)述
當(dāng)考慮本文的下列詳細(xì)描述時(shí)，本發(fā)明將得到更好地理解，并且除上文所述的那些外的目的將變得顯而易見(jiàn)。此種描述參考附圖，其中


圖1是概括根據(jù)本發(fā)明的方法的scFv的 一般的基于序列的分析的流程圖。
在第一個(gè)步驟中，提供了待在溶解性和穩(wěn)定性方面進(jìn)行改善的scFv的序列(框1)，其隨后與抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較(框2),例如開(kāi)放源種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，Vbase, IMGT;框3)、開(kāi)放源成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，KDB;框4)或全長(zhǎng)人穩(wěn)定和可溶scFv片段的數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，QC;框5)。
應(yīng)用例如框3中描述的開(kāi)放源種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)允許鑒定高度保守的位置，其在進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)行選擇，并且因此被認(rèn)為促成全長(zhǎng)抗體背景中的可變結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性(框3，)。針對(duì)開(kāi)放源成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)4的比較允許鑒定這樣的模式，其代表不依賴于各自的CDR的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合的改善(框4，)。此外，針對(duì)全長(zhǎng)人穩(wěn)定和可溶scFv片段的數(shù)據(jù)庫(kù)(框5 )的比較導(dǎo)致鑒定對(duì)于穩(wěn)定性和/或溶解性關(guān)鍵的殘基(特別是在scFv形式中)，以及鑒定這樣的模式，其代表特別是在scFv形式，例如VL和VH組合中不依賴于各自的CDR的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合的改善(框5，)。
在下一個(gè)步驟中(框6)，用各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定的最頻繁的合適氨基酸置換關(guān)鍵殘基。
最后(框7)，可以在酵母QC系統(tǒng)中進(jìn)行關(guān)鍵殘基的隨機(jī)或偏好性誘變并且隨后就改善的穩(wěn)定性和/或溶解性進(jìn)行篩選。突變體可以再次經(jīng)歷上文描述的操作(至框2的箭頭)。
圖2是用于scFv的基于序列的分析的示例性多步驟方法的流程圖。
在第一個(gè)步驟中(框1),基于生物信息學(xué)工具提供的結(jié)果，通過(guò)比較每個(gè)位置處不同氨基酸的出現(xiàn)情況，測(cè)定每一個(gè)殘基在構(gòu)架中的頻率。在第二個(gè)步驟中，例如通過(guò)使用用式0 = 2:/1/(附'-/>)/^廣〃-7)計(jì)算的辛普森(Simpson's)指數(shù)，定義每個(gè)位置處的保守程度。在第三個(gè)步驟中，測(cè)定了使總體自由能降到最低的最佳置換(例如，通過(guò)應(yīng)用玻爾茲曼(Boltzmaim，s )定律AAGth =-RTln (/親本《共l足))。最后(步驟4)，測(cè)定潛在的穩(wěn)定性突變的作用。為了這個(gè)目的，可以考慮因素例如局部和非局部相互作用、規(guī)范殘基(canonical residue )、界面、暴露程度和p-轉(zhuǎn)角傾向。
圖3是用于在酵母中選擇穩(wěn)定和可溶scFv的示例性質(zhì)量控制(QC)系統(tǒng)的示意圖。利用這個(gè)系統(tǒng)，通過(guò)誘導(dǎo)型報(bào)告構(gòu)建體的存在(所述構(gòu)建體的表達(dá)依賴于穩(wěn)定和可溶scFv-AD-Gal llp融合蛋白的存在)選擇在還原環(huán)境中能夠表達(dá)穩(wěn)定和可溶scFv的宿主細(xì)胞。融合蛋白與Gal4 (1-100)的相互作用形成激活可選標(biāo)記的表達(dá)的功能轉(zhuǎn)錄因子(參見(jiàn)圖3A)。不穩(wěn)定和/或不溶性scFv無(wú)法形成功能轉(zhuǎn)錄因子并且誘導(dǎo)可選標(biāo)記的表達(dá)，并且因此從選擇中排除(圖3B)。即使在其中二硫鍵不折疊的還原條件下，所選擇的scFv也能夠獲得穩(wěn)定和可溶的蛋白質(zhì)折疊，而不穩(wěn)定和/或不溶性scFv趨于去折疊、聚集和/或降解。在氧化條件下，所選擇的scFv仍展現(xiàn)優(yōu)良的溶解性和穩(wěn)定性特征。
圖4是另一個(gè)示例性質(zhì)量控制(QC)系統(tǒng)的示意圖。用于選擇可溶和穩(wěn)定scFv的總體概念與圖3描述的相同，然而，在這個(gè)形式中，scFv與包含活化結(jié)構(gòu)域(AD)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD )的功能轉(zhuǎn)錄因子直接融合。圖4A描述了示例性可溶和穩(wěn)定scFv，其當(dāng)與功能轉(zhuǎn)錄因子融合時(shí)，不阻礙可選標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。相比之下，圖4B描述了其中不穩(wěn)定scFv與轉(zhuǎn)錄因子融合而產(chǎn)生無(wú)功能融合構(gòu)建體的情形，所述構(gòu)建體無(wú)法激活可選標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。
圖5是體細(xì)胞突變前在天然種系序列內(nèi)的特定構(gòu)架(FW)位置處(圖5A),和在QC系統(tǒng)中選擇的體細(xì)胞突變后在成熟抗體序列內(nèi)的相應(yīng)FW位置處(圖5B)的變異性分析的示意圖?？梢再x予種系和QC序列內(nèi)分別的FW位置(例如，高度可變構(gòu)架殘基("hvFR"))不同的變異性值(即，分別為"G"和"Q"值)。如果對(duì)于特定位置G>Q，那么在那個(gè)位置處存在有限數(shù)目的合適的穩(wěn)定FW殘基。如果對(duì)于特定位置G<Q,那么這可能表明該殘基已就最佳溶解性和穩(wěn)定性進(jìn)行了天然選擇。
圖6描迷了在2S-95。C下的熱誘導(dǎo)脅迫后對(duì)于ESBA105變體觀察到的變性曲線圖。虛線表示具有至種系共有殘基的回復(fù)突變(V3Q、R47K或V103T)的ESBA-105變體。實(shí)線表示包含通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的優(yōu)選置換的變體(QC11.2、 QC15.2和QC23.2 )。
圖7描述了包含共有序列回復(fù)突變(S-2、 D-2、 D-3)、至丙氨酸(D-l)或QC殘基(QC7.1、 QC11.2、 QC15.2、 QC23.2)的突變的一組ESBA105變體的熱穩(wěn)定性的比較。提供了每種變體的熱穩(wěn)定性(以任意去折疊單位表示)。
圖8描述了在25-95'C下的熱誘導(dǎo)脅迫后對(duì)于ESBA212變體觀察到的變性曲線圖。虛線表示具有至種系共有殘基的回復(fù)突變(V3Q或R47K)的ESBA-212變體。實(shí)線表示親本ESBA212分子。
圖9描述了野生型ESBA105及其可溶性變體的PEG沉淀溶解度曲線。
圖10描述了如在廣泛溫度范圍(25-96°C)下的熱攻擊后測(cè)量的野生型ESBA105及其可溶性變體的熱變性曲線圖。
圖11描述了 SDS-PAGE凝膠，其顯示了在熱脅迫條件下溫育2周后各種ESBA105可溶性突變體的降解行為。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及用于免疫結(jié)合劑性質(zhì)，特別地scFv性質(zhì)(包括但不限
20于穩(wěn)定性、溶解性和親和力)的基于序列的改造和優(yōu)化的方法。更具
體地，本發(fā)明公開(kāi)了使用抗體序列分析鑒定scFv中待突變的氨基酸位 置來(lái)優(yōu)化scFv抗體，從而提高scFv的一個(gè)或多個(gè)物理性質(zhì)的方法。 本發(fā)明還涉及按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的經(jīng)改造的免疫結(jié)合劑例如 scFV。
本發(fā)明至少部分基于抗體序列的多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的各重鏈和輕鏈構(gòu) 架位置上的氨基酸頻率的分析。特別地，已將種系和/或成熟抗體數(shù)據(jù) 庫(kù)的頻率分析與因具有期望的功能性質(zhì)而被選擇的scFv序列的數(shù)據(jù) 庫(kù)的頻率分析相比較。通過(guò)給各構(gòu)架位置的變異性程度賦值(例如， 通過(guò)使用辛普森指數(shù))和通過(guò)比較不同類(lèi)型的抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的各 構(gòu)架位置上的變異性程度，現(xiàn)已能夠鑒定對(duì)于scFv的功能性質(zhì)(例如， 穩(wěn)定性、溶解性)是重要的構(gòu)架位置。這現(xiàn)允許對(duì)構(gòu)架氨基酸位置定 義"功能共有區(qū)"，其中已鑒定了比種系和/或成熟抗體免疫球蛋白序 列中的相應(yīng)位置更耐受變異性或更不耐受變異性的構(gòu)架位置。因此， 本發(fā)明提供基于功能性選擇的scFv序列的數(shù)據(jù)庫(kù)的使用的"功能共有 區(qū)"方法并證明了其優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明提供了通過(guò)突變使用本文中 描述的"功能共有區(qū)"方法鑒定的特定構(gòu)架氨基酸位置來(lái)對(duì)免疫結(jié)合 劑(例如，scFv)進(jìn)4亍改造的方法。
首先定義某些術(shù)語(yǔ)，這樣可使本發(fā)明更容易被理解。除非另外指 出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技 術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料 相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但下面描述 了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。本文中提及的所有公開(kāi)物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和 其他參考資料以它們的全文通過(guò)引用合并入本文。在矛盾的情況下， 以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例只是舉例 說(shuō)明性的而非限定性的。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"是免疫球蛋白的同義詞。根據(jù)本發(fā)明 的抗體可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少 一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，例如單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)v(SkerraA.和Plttckthun，A. ( 1988) 5Wg歐240: 1038-41 ) 、 scFv (Bird, R.E.等人(1988) 242: 423-26; Huston, J.S.等人(1988; / 亂胸"ca"d. ^A^4 §1: 5879-83) , Fab、 ( Fab') 2、或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其 他片段。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)"抗體構(gòu)架(antibody framework)"是指可 變結(jié)構(gòu)域VL或VH的一部分，其用作該可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)的 支架(Kabat， E.A.等人，(1991 )Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242 )。
本文中使用的"抗體CDR"是指抗體的互補(bǔ)決定區(qū)，其如Kabat E.A.等人，(1991 )Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242 )定義的由抗原結(jié)合環(huán)組成。抗體Fv片段的兩個(gè) 可變結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)包含例如3個(gè)CDR。
術(shù)語(yǔ)"單鏈抗體"或"scFv"意指包含通過(guò)接頭連接的抗體重鏈 可變區(qū)(VH)和抗體輕鏈可變區(qū)(Vj的分子。此類(lèi)scFv分子可具 有一般結(jié)構(gòu)NH2-VL-接頭-VH-COOH或NHrVH-接頭-VL-COOH。
如本文中所使用的，"同一性"是指兩個(gè)多肽、分子之間或兩個(gè) 核酸之間匹配的序列。當(dāng)兩個(gè)進(jìn)行比較的序列中的位置都被相同的堿 基或氨基酸單體亞單元占據(jù)(例如，如果兩個(gè)多肽的每一個(gè)中的位置 都被賴氨酸占據(jù))時(shí)，各個(gè)分子在該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間 的"百分?jǐn)?shù)同一性"是由這兩個(gè)序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比 較的位置數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的IO個(gè)位置中 有6個(gè)匹配，那么這兩個(gè)序列具有60%的同一性。通常，在將兩個(gè)序 列比對(duì)以產(chǎn)生最大同一性時(shí)進(jìn)行比較。這樣的比對(duì)可通過(guò)使用，例如， 通過(guò)計(jì)算機(jī)程序例如Align程序(DNAstar， Inc.)方便地進(jìn)行的 Needleman等人(1970 ) / A^/.祝o/.處443-453的方法來(lái)提供。 "相似的"序列是當(dāng)比對(duì)時(shí)共有相同和相似氨基酸殘基的序列，
換。在這點(diǎn)上r參照序列中的殘:的"保守置換":用在:理或功能 上與相應(yīng)的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性
22質(zhì)，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵的能力等)的殘基進(jìn)行的置換。因此，"經(jīng) 保守置換修飾的"序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個(gè) 或多個(gè)保守置換的序列。兩個(gè)序列之間的"百分?jǐn)?shù)相似性"是包含由 兩個(gè)序列共有的匹配殘基或保守置換的位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置
數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的IO個(gè)位置中有6個(gè)匹 配以及10個(gè)位置中有2個(gè)包含保守置換，那么這兩個(gè)序列具有80% 的正相似性。
本文中使用的"氨基酸共有序列"是指可使用至少兩個(gè)，優(yōu)選更 多的進(jìn)行比對(duì)的氨基酸序列的矩陣產(chǎn)生的氨基酸序列(允許在比對(duì)中 出現(xiàn)缺口)，其使得可能確定各位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基。 共有序列是包含在各位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸的序列。如果兩個(gè) 或更多個(gè)氨基酸等同地出現(xiàn)在單個(gè)位置上，那么共有序列包括兩個(gè)或 所有此類(lèi)氨基酸。
可在不同水平上分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列。例如，可在單個(gè)殘基 水平、多個(gè)殘基水平、具有缺口的多個(gè)殘基水平等上展示保守性或變 異性。殘基可展示相同殘基的保守性或可在種類(lèi)水平上保守。氨基酸 種類(lèi)的實(shí)例包括極性但不帶電荷的R組(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺 和谷氨酰胺)；帶正電荷的R組(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負(fù)電 荷的R組(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R組(丙氨酸、異亮氨酸、亮 氨酸、甲疏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊 氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他種類(lèi)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)是已知的并且可使用結(jié)構(gòu)測(cè)定法或其他數(shù)據(jù)來(lái)定義以估量可置 換性。在該意義上，可置換的氨基酸可以指可在該位置上進(jìn)行置換并 且保持功能保守性的任何氨基酸。
如本文中所使用的，當(dāng)一個(gè)氨基酸序列(例如，第一Vh或Vl序 列)與一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸序列(例如，數(shù)據(jù)庫(kù)中的一個(gè)或多個(gè) VH或VL序列)比對(duì)時(shí)，可將一個(gè)序列(例如，第一Vh或Vl序列) 中的氨基酸位置與一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸序列中的"相應(yīng)位置"相 比較。如本文中所使用的，"相應(yīng)位置"表示當(dāng)對(duì)序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，即當(dāng)序列進(jìn)行比對(duì)以獲得最高百分?jǐn)?shù)同 一 性或百分?jǐn)?shù)相似性時(shí)進(jìn) 行比較的序列中的等同位置。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體數(shù)據(jù)庫(kù)"是指兩個(gè)或更多個(gè)抗體 氨基酸序列("多個(gè)"序列)的集合，通常是指數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)或甚
至數(shù)千個(gè)抗體氨基酸序列的集合?？贵w數(shù)據(jù)庫(kù)可存儲(chǔ)例如抗體VH區(qū)、 抗體VL區(qū)或兩者的集合的氨基酸序列，或可存儲(chǔ)由Vh和Vl區(qū)域組 成的scFv序列的集合。優(yōu)選，可將數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)在可檢索的、固定的介 質(zhì)中，例如計(jì)算機(jī)上可檢索的計(jì)算機(jī)程序中。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗 體數(shù)據(jù)庫(kù)是包含或由種系抗體序列組成的數(shù)據(jù)庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，抗體數(shù)據(jù)庫(kù)是包含或由成熟(即，表達(dá)的)抗體序列組成的數(shù)據(jù) 庫(kù)(例如，成熟抗體序列的Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)，例如KBD數(shù)據(jù)庫(kù))。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體數(shù)據(jù)庫(kù)包含或由功能性選擇的序列(例如， 根據(jù)QC測(cè)定選擇的序列)組成。
術(shù)語(yǔ)"免疫結(jié)合劑"是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分 抗原結(jié)合位置，例如重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，這樣 免疫結(jié)合劑能夠特異性識(shí)別靶抗原。免疫結(jié)合劑的非限定性實(shí)例包括 全長(zhǎng)免疫球蛋白分子和scFv,以及抗體片段，包括但不限于(i)Fab片 段，由V。 Vh、 Cl和Ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段， 包含通過(guò)鉸鏈區(qū)上的二疏橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段，(iii) Fab，片段，其基本上是具有鉸鏈區(qū)的 一部分的Fab (參見(jiàn)， FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul編輯，3,sup.rd ed. 1993 ); (iv)由Vh和Ch1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體例如Dab 片段(Ward等人，(1989 ) A^"re Mi: 544-546 )，其由VH或VL結(jié) 構(gòu)域組成，Camelid (參見(jiàn)Hamers誦Casterman，等人,Nature 363: 446-448( 1993 )和Dumoulin等人，Protein Science 11: 500-515( 2002 )) 或Shark抗體(例如，shark Ig-NARs Nanobodies );和(vii)納米抗 體(Nanobody)，包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"功能性質(zhì)"是例如為了提高多肽的生 產(chǎn)性質(zhì)或治療功效，其提高(例如相對(duì)于常規(guī)多肽)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)
24人員來(lái)說(shuō)是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫結(jié)合劑)的性質(zhì)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是提高的穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性)。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是提高的溶解性(例如，在細(xì)胞條件下)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是非聚集性。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 功能性質(zhì)是表達(dá)(例如，在原核細(xì)胞中)的提高。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，功能性質(zhì)是在內(nèi)含體純化方法后重折疊產(chǎn)量的提高。在某些實(shí)施 方案中，功能性質(zhì)不是抗原結(jié)合親和力的提高。
scFv的基于序列的分析
本發(fā)明提供了用于分析scFv序列的方法，其允許鑒定scFv序列 中選擇用于突變的氨基酸位置。選擇用于突變的氨基酸位置是經(jīng)預(yù)測(cè) 影響scFv的功能性質(zhì)例如溶解性、穩(wěn)定性和/或抗原結(jié)合的氨基酸位 置，其中預(yù)測(cè)該位置上的突變提高scFv的性能。因此，本發(fā)明允許對(duì) scFv進(jìn)行比簡(jiǎn)單隨機(jī)突變scFv序列中的氨基酸位置更集中的改造以 優(yōu)化性能。
在圖l的流程圖中示意性地圖解了 scFv序列的基于序列的分析的 某些方面。如該圖中所示的，將待優(yōu)化的scFv序列與一個(gè)或多個(gè)抗體 數(shù)據(jù)庫(kù)(包括由因穩(wěn)定和可溶而被選擇的scFv序列組成的抗體數(shù)據(jù) 庫(kù))中的序列相比較。這可允許鑒定特別地scFv形式中對(duì)于穩(wěn)定性和 /或溶解性至關(guān)重要的殘基，以及鑒定特別地在scFv形式(例如， 和VH的組合)中顯示不依賴于各自CDR的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合 的提高的模式。在鑒定了至關(guān)重要的殘基后，它們就可用例如在各自 數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定的出現(xiàn)頻率最高的適當(dāng)?shù)陌被徇M(jìn)行置換，和/或通過(guò)隨 機(jī)或偏好性誘變進(jìn)行置換。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變 的氨基酸位置的方法，所述scFv具有Vh和Vt氨基酸序列，該方法 包括
a)將scFv VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列輸入包含許多抗體VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，以使scFv VH、 Vl或Vh和Vl氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH、 Vl或Vh和V[氨基酸序列比對(duì)；
b) 將scFv Vh或Vt氨基酸序列中的氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體 Vh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置相比較；
c) 確定scFv Vh或Vr^氨基酸序列中的氨基酸位置是否被在數(shù)據(jù) 庫(kù)的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位置上保守的氨基酸殘基占 據(jù)；和
d) 當(dāng)氨基酸位置被在數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vh或V^氨基酸序列中的相 應(yīng)位置上不保守的氨基酸殘基占據(jù)時(shí)，將scFv VH或Vl氨基酸序列中 的氨基酸位置鑒定為用于突變的氨基酸位置。
因此，在本發(fā)明的方法中，將目的scFv的序列(即，VH、 Vl或雨 者的序列)與抗體數(shù)據(jù)庫(kù)的序列相比較，然后確定目的scFv中的氨基 酸位置是否被在數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列的相應(yīng)位置上"保守的"氨基酸殘基 占據(jù)。如果scFv序列的氨基酸位置被在數(shù)據(jù)庫(kù)的序列中的相應(yīng)位置上 不"保守的，，氨基酸殘基占據(jù)，則scFv的該氨基酸位置選擇用于突變。 優(yōu)選，被分析的氨基酸位置是目的scFv中的構(gòu)架氨基酸位置。更優(yōu)選， 可分析目的scFv中的每一個(gè)構(gòu)架氨基酸位置。在備選的實(shí)施方案中， 可分析目的scFv的一個(gè)或多個(gè)CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置。在 另外的實(shí)施方案中，可分析目的scFv中的各氨基酸位置。
為了確定氨基酸殘基在抗體數(shù)據(jù)庫(kù)的序列中的特定氨基酸位置 (例如，構(gòu)架位置)上是否"保守"，可計(jì)算在特定位置上的保守程 度。存在許多不同的本領(lǐng)域內(nèi)已知的可定量給定的位置上的氨基酸多 樣性的方法，其全都可用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選，使用辛普森多樣性 指數(shù)計(jì)算保守程度，該指數(shù)是多樣性的量度。其考慮到存在于各位置 上的氨基酸的數(shù)目，以及各氨基酸的相對(duì)豐度(abundance)。辛普 森指數(shù)(S.I.)代表兩個(gè)隨機(jī)選擇的抗體序列在某些位置包含相同的氨 基酸的概率。當(dāng)測(cè)量保守性時(shí)，辛普森指數(shù)考慮了兩個(gè)主要因素，豐 富度(richness)和均勻度(evenness)。如本文中所使用的，"豐富 度"是存在于特定位置上的氨基酸的不同種類(lèi)的數(shù)目的量度(即，數(shù) 據(jù)庫(kù)中在該位置上顯示的不同氨基酸殘基的數(shù)目是豐富度的量度)。如本文中所使用的，"均勻度"是存在于特定位置上的氨基酸中的每 一個(gè)的豐度的量度(即，數(shù)據(jù)庫(kù)的序列中氨基酸殘基在該位置上發(fā)生 的頻率是均勻度的量度)。
雖然殘基豐富度獨(dú)自可用作檢查特定位置上的保守程度的量度， 但其沒(méi)有考慮存在于某些位置上的各氨基酸殘基的相對(duì)頻率。其對(duì)在 數(shù)據(jù)庫(kù)的序列中的特定位置上極少發(fā)生的氨基酸殘基與對(duì)在相同位置 以極高的頻率發(fā)生的殘基給予同樣的權(quán)重。均勻度是組成位置的豐富 度的不同氨基酸的相對(duì)豐度的量度。辛普森指數(shù)將兩者(豐富度和均 勻度)都考慮到了，從而是按照本發(fā)明定量保守程度的優(yōu)選方法。特 別地，在非常保守的位置上的低頻率殘基被認(rèn)為是潛在有問(wèn)題的，從 而其可選擇用于突變。
辛普森指數(shù)的公式為D-Siii(nrl)/N(N-1)，其中N是調(diào)查的序列 (例如，在數(shù)據(jù)庫(kù)中)的總數(shù)，ni是各氨基酸殘基在被分析的位置上 的頻率。氨基酸事件(i)在數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率是氨基酸在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)生的 次數(shù)(ni)。計(jì)數(shù)iM本身以相對(duì)頻率給出，其表示它們按照事件的總數(shù) 進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)最大多樣性發(fā)生時(shí)，S.I.值是O，當(dāng)最小多樣性發(fā)生 時(shí)，S.I.值是1。因此S.I.的范圍是O至1，多樣性和指數(shù)值呈負(fù)相關(guān)。
在圖2中更詳細(xì)地描述了概述用于分析數(shù)據(jù)庫(kù)的序列中的構(gòu)架氨 基酸位置的多個(gè)步驟的流程圖。
因此，在上述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用辛普森指數(shù)給數(shù)據(jù)庫(kù) 的抗體Vh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置的保守程度賦值。該相應(yīng)位 置的S.I.值可用作該位置的保守性的指標(biāo)。
在其他實(shí)施方案中，將密切相關(guān)的抗體序列的可信比對(duì)(trusted alignment)(即，考慮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似性的序列比對(duì))，用于本發(fā)明 以產(chǎn)生氨基酸的相對(duì)豐度和確定的位置的保守程度的矩陣。這些矩陣 經(jīng)設(shè)計(jì)用于抗體-抗體數(shù)據(jù)庫(kù)比較。計(jì)算各殘基的觀察到的頻率，并且 將其與預(yù)期的頻率(其基本上是數(shù)據(jù)集中各殘基對(duì)于各位置的頻率) 相比較。
使用所述方法對(duì)給定的scFv抗體進(jìn)行的分析提供了關(guān)于給定的
27scFv抗體中的某些位置上的生物學(xué)上允許的突變和罕見(jiàn)殘基的信息， 以及允許預(yù)測(cè)其構(gòu)架中的潛在弱點(diǎn)?？蓪⒊Ｒ?guī)技術(shù)用于對(duì)"最佳"擬 合一組氨基酸-頻率數(shù)據(jù)的氨基酸置換進(jìn)行工程設(shè)計(jì)(使用S丄值和相 對(duì)頻率作為標(biāo)準(zhǔn))。
上述基于序列的分析可用于scFv的Vh區(qū)域，scFv的Vl區(qū)域或 兩者。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將scFv VH氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫(kù) 并且與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH氨基酸序列比對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將 scFv Vt氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫(kù)并且與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體Vt氨基酸序列比 對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將scFvVh和V^氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫(kù)并 且與數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH和VL氨基酸序列比對(duì)。用于將一個(gè)序列與數(shù)據(jù) 庫(kù)中的其他序列的集合進(jìn)行比對(duì)的算法在本領(lǐng)域內(nèi)已良好地建立。將 序列進(jìn)行比對(duì)以獲得序列之間的最高百分?jǐn)?shù)同 一 性或相似性。
本發(fā)明的方法可用于分析scFv序列中的一個(gè)目的氨基酸位置或 更優(yōu)選，可用于分析多個(gè)目的氨基酸位置。因此，在上迷方法的步驟 b)中，可將scFvVh或Vt氨基酸序列中的多個(gè)氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫(kù)的 抗體Vh或VL氨基酸序列中的相應(yīng)位置相比較。待分析的優(yōu)選位置是 scFv的Vh和/或V^序列中的構(gòu)架位置(例如，可分析各VH和VL構(gòu) 架位置)。另外或備選地，可分析scFv的一個(gè)或多個(gè)CDR中的一個(gè)或 多個(gè)位置(雖然突變CDR中的氨基酸位置可能不是優(yōu)選的，因?yàn)镃DR 中的突變比構(gòu)架區(qū)中的突變更可能影響抗原結(jié)合活性)。此外，本發(fā)明 的方法允許分析scFv VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列中的各氨基酸位 置。
在本發(fā)明的方法中，可將目的scFv的序列與多種不同類(lèi)型的抗體 序列數(shù)據(jù)庫(kù)的一種或多種中的序列相比較。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中， 數(shù)據(jù)庠的抗體Vh、 V^或Vh和Vt氨基酸序列是種系抗體Vh、 Vl或 Vh和V^氛基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH、 Vl 或Vh和VL氨基酸序列是重排的親和力成熟的抗體VH、 Vl或Vh和 Vt氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體VH、 V^或 VH和氨基酸序列是因具有至少 一種期望的功能性質(zhì)例如scFv穩(wěn)定性或scFv溶解性而被選擇的scFv抗體VH、 Vl或Vh和Vl氛基酸序 列(下面進(jìn)一步論述的)。
得、匯編和/或產(chǎn)生抗體序列信息。序列的來(lái)源可包括但不限于一種或 多種下列數(shù)據(jù)庫(kù)
Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(.immuno.bme.nwu.Edu(到2007年10月為止)； Johnson和Wu ( 2001) 7Vwc/"c ^"Vfo及仏205-206; Johnson和 Wu (2000) 7V"c/"'c爿"Vfe及仏！^: 214-218)。來(lái)自2000年的原始數(shù) 據(jù)可通過(guò)在美國(guó)的FTP和在英國(guó)的鏡像獲得。
Kabatman包含允許用戶就序列的罕見(jiàn)特征檢索Kabat序列和 使用戶能夠發(fā)現(xiàn)對(duì)于特定抗體序列中的CDR的正則分配(canonical assignment)的數(shù)據(jù)庫(kù)。
AAAAA網(wǎng)站(www.bioc.imizh.ch/antibodv/ (到2007年10月 為止))，由Aimemarie Honegger制作的提供關(guān)于抗體的序列信息 和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的抗體網(wǎng)頁(yè)。
ABG:抗體的3D結(jié)構(gòu)的目錄(directory )-由Antibody Group (ABG)產(chǎn)生的目錄允許用戶訪問(wèn)匯編在Protein Data Bank (PDB)
中的抗體結(jié)構(gòu)。在該目錄中，各PDB條目(entry)具有至原始來(lái)源 的超鏈接，從而使重新獲得全部信息變得容易。
ABG:小鼠VH和VK種系區(qū)段的種系基因目錄，在Instituto de Biotecnologia, UN AM (National University of Mexico)的 Antibody Group的網(wǎng)頁(yè)的一部分。
IMGT ,國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng) ( international ImMunoGeneTics information system )-由 Marie-Paule Lefranc (Universi" Montpellier II， CNRS)于1989年創(chuàng)建，IMGT是專(zhuān)門(mén)于人 和其他脊推動(dòng)物物種的免疫系統(tǒng)的免疫球蛋白、T細(xì)胞受體和相關(guān)蛋 白質(zhì)的集成知識(shí)資源。IMGT由序列數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT/LIGM-DB，來(lái)自 人和其他脊推動(dòng)物的IG和TR的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，具有完全注釋的序列的 翻譯，IMGT/MHC-DB， IMGT/PRIMER-DB)、基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT/GENE-DB)、結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT/3Dstructure-DB)、網(wǎng)絡(luò)資源 (IMGT Repertoire)組成(IMGT， the international ImMunoGeneTics information system ; imgt.cines.fr (到2007年10月為止)；Lefranc 等人(1999)7VMc/"c爿c,Vfe及d 2: 209-212; Ruiz等人(2000 )A7ic/e/c 219-221; Lefranc等人(2001) iVwc/""c油1￡: 207-209; Lefranc等人(2003 ) A^c/e/c ^"Vfc^i: 307-310)。
V BASE-從一千多個(gè)公開(kāi)序列(包括目前從Genbank和EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)釋放的序列)匯編的所有人種系可變區(qū)序列的綜合目錄。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，從scFv文庫(kù)獲得抗體序列信息，所述scFv 文庫(kù)具有已在還原性環(huán)境中就增強(qiáng)的穩(wěn)定性和溶解性進(jìn)行選擇的確定 的構(gòu)架。更特別地，已描述了允許細(xì)胞內(nèi)選擇在還原性環(huán)境中具有增 強(qiáng)的穩(wěn)定性和溶解性的scFv構(gòu)架的酵母質(zhì)量控制(QC)-系統(tǒng)(參見(jiàn)例 如，PCT
發(fā)明者D·厄馳, L·博拉斯 申請(qǐng)人:艾斯巴技術(shù),愛(ài)爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責(zé)任公司