Cho細胞的制作方法

專利名稱：：Cho細胞的制作方法CHO細胞本發(fā)明提供具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞。該細胞用于蛋白質(zhì)表達。因此本發(fā)明屬于哺乳動物細胞工程和蛋白質(zhì)表達的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：用于產(chǎn)生重組多肽的表達系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知，并描述于例如Marino,M.H.，Biopharm.2(1989)18-33;Goeddel，D.V"等，MethodsEnzymol.185(1990)3-7;Wurm，F(xiàn).，和Bernard,A.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-159中。這種表達系統(tǒng)包含宿主細胞和合適的表達質(zhì)粒。表達質(zhì)粒的基本元件是例如大腸桿菌(E.coli)的原核質(zhì)粒增殖單位，其包含復(fù)制起點和選擇標記、真核選擇標記和用于表達目的結(jié)構(gòu)基因的一個或更多個表達盒，每一所述表達盒包含啟動子、結(jié)構(gòu)基因和包括多聚腺苦酸化信號的轉(zhuǎn)錄終止子。對于哺乳動物細胞中的瞬時表達，可選擇哺乳動物的復(fù)制起點，如SV40Ori或OriP。作為啟動子，可選擇組成型或i秀導(dǎo)型啟動子。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)錄，在5，非翻譯區(qū)可包括Kozak序列。對于mRNA加工，尤其是mRNA剪接和轉(zhuǎn)錄終止，根據(jù)結(jié)構(gòu)基因的組成(外顯子/內(nèi)含子組成)可包括mRNA剪接信號以及多聚腺苷酸化信號。優(yōu)選在哺乳動物細胞，如CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6細胞等中產(chǎn)生用于藥物應(yīng)用的多肽。為了宿主細胞的發(fā)酵和目的多肽的表達，使用培養(yǎng)基。今天CHO細胞在實驗室中小規(guī)?；蛟谏a(chǎn)過程中大規(guī)模地廣泛用于藥物多肽的表達。由于其廣泛的分布和用途，CHO細胞的特征和遺傳背景是眾所周知的。因此，管理機構(gòu)批準CHO細胞用于產(chǎn)生應(yīng)用于人的治5療蛋白質(zhì)。但是在培養(yǎng)基方面仍然具有許多條件。使用動物來源的組分，對人有害的物質(zhì)，如病毒或朊病毒蛋白質(zhì)污染的潛在危險亟待解決。除了高成本和下游加工問題，動物來源組分的另一問題是由于批與批的差異，因為天然產(chǎn)物使獲得恒定產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量變得困難。為了克服這些條件，需要產(chǎn)品細胞系，其需要更少的動物來源組分用于其培養(yǎng)。Pak等已經(jīng)報道了能夠在完全確定成分的無蛋白質(zhì)條件下自分泌生長的超級CHO細胞系(Pak，S.C.O.，等，Cytotechnology22(1996)139-146)。這是表達運鐵蛋白和IGF-I的CHO-K1(ATCCCCL61)細胞系。Morris,A.E.，等(US2005/0170462)報道了通過調(diào)節(jié)IGF-I信號途徑在細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法。Belaus等用嵌合ErbB2v—E/IGF-I受體轉(zhuǎn)染IL-3依賴性鼠類BaF/3細胞(Belaus，A.，等，J.Steroid.Biochem.Mol.Biol.85(2003)105-115)。發(fā)明簡述本發(fā)明提供具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞，獲得這種CHO細胞的方法，和用于在這種CHO細胞中重組產(chǎn)生異源多肽的方法。本發(fā)明的一個方面是CHO細胞，其表達組成型活性促有絲分裂受體。在一個實施方案中，所述CHO細胞是CHO-Kl細胞。在另一實施方案中，所述組成型活性促有絲分裂受體是ErbB2v—E/IGF-I受體。本發(fā)明的其它方面是CHO細胞系DSMACC2851。本發(fā)明的另一方面是用于獲得具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞的方法，其中所述方法包括以下步驟a)用第一種核酸轉(zhuǎn)染CHO細胞，所述第一種核酸包含i)側(cè)翼為兩個loxP位點的編碼選擇標記的表達盒，ii)表達組成型活性促有絲分裂受體的表達盒，b)選擇用所述第一種核酸轉(zhuǎn)染的CHO細胞，c)用包含CRE重組酶表達盒的第二種核酸轉(zhuǎn)染步驟b)中選擇的CHO細胞，d)選擇轉(zhuǎn)染有所述第二種核酸的CHO細胞為具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞。在一個實施方案中，步驟b)的轉(zhuǎn)染的CHO細胞具有組成型活性促有絲分裂受體。在另一實施方案中，在步驟d)中選擇所述轉(zhuǎn)染CHO細胞的第一種核酸包含的選擇標記的缺失。在另一實施方案中，在步驟d)中選擇的轉(zhuǎn)染CHO細胞在根據(jù)第一種核酸的選擇標記的選擇劑存在下不生長。在其它實施方案中包含所述第一種核酸，其為用于表達運鐵蛋白的額外表達盒。本發(fā)明的其它方面是用于在本發(fā)明CHO細胞中重組產(chǎn)生異源多肽的方法，在所述CHO細胞中表達組成型活性促有絲分裂受體。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)染CHO細胞的核酸包含編碼異源多肽的表達盒。在一個實施方案中，所述異源多肽是人多肽。在另一實施方案中，所述異源多肽選自包含免疫球蛋白、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物的多肽。發(fā)明詳述本發(fā)明包含CHO細胞，其表達組成型活性促有絲分裂受體。例如在Ausubd，F(xiàn).M.，等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第I至III巻(1997),Wiley和Sons;Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)中描述了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和技術(shù)，其用于實施本發(fā)明。如此處所用，術(shù)語"核酸"表示由各核苷酸組成的多聚物，即多核苦酸。它指天然發(fā)生的，或部分或完全非天然發(fā)生的核酸，其例如編碼可重組產(chǎn)生的多肽。核酸可由分離的或通過化學手段合成的DNA片段構(gòu)成。核酸可整合到另一核酸中，例如表達質(zhì)粒或宿主細胞的基因組/染色體中。質(zhì)粒包括穿梭和表達載體。通常，所述質(zhì)粒還將包含原核增殖單位，其包含分別用于在細菌中載體復(fù)制和選擇的復(fù)制起點(例如ColEl的復(fù)制起點)和選擇標記(例如，青霉素或四環(huán)素抗性基因)。核酸同樣通過其由各核苷酸組成的序列或由該核酸分子編碼的氨基酸序列來表征。"表達盒"指核酸，其含有宿主細胞中至少含有的結(jié)構(gòu)基因的表達和分泌所需的元件。"基因，，表示核酸，其為例如染色體或質(zhì)粒上的區(qū)段，能夠影響肽、多肽或蛋白質(zhì)的表達。除了編碼區(qū)，即結(jié)構(gòu)基因，基因還包含其它功能元件，例如，信號序列、啟動子、內(nèi)含子和/或終止子。"結(jié)構(gòu)基因"表示不含信號序列的基因區(qū)域，即編碼區(qū)。術(shù)語"選擇標記"表示核酸，其允許在相應(yīng)"選擇劑"的存在下特異性選擇攜帶該核酸的細胞。重要的陽性選擇標記是例如抗生素抗性基因。所述選擇標記允許在相應(yīng)選擇劑的存在下選擇轉(zhuǎn)化有該選擇標記的細胞；非轉(zhuǎn)化細胞在這些選擇性培養(yǎng)條件下不能夠生長或存活。選擇標記可以是陽性的、陰性的或雙功能的。陽性選擇標記允許選擇攜帶所述標記的細胞，而陰性選擇標記允許選擇性消滅攜帶該標記的細胞。通常，選擇標記將賦予對藥物的抗性或補償細胞中的代謝或分解代謝缺陷?？捎糜谡婧思毎倪x擇標記包括，例如氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)，如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)、新霉素和G418APH、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰氨合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(選擇劑吲哚)、組氨醇脫氫酶(選擇劑組氨醇D)的基因，和提供嘌呤霉素、博來霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸抗性的基因。其它選擇標記描述于例如WO92/08796和WO94/28143。"啟動子，，指核酸，即多核苷酸序列，其控制有效連接的核酸的轉(zhuǎn)錄。啟動子包括RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的信號。所用啟動子在宿主細胞的細胞類型中將是有功能的，設(shè)想在所述宿主細胞中表達有效連接的核酸。大量啟動子，包括來自多種不同來源的組成型、誘導(dǎo)型和阻抑型啟動子為本領(lǐng)域所熟知(并在數(shù)據(jù)庫如GenBank中得以鑒定)。它們可獲得為克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸內(nèi)(來自例如保藏中心，如ATCC及其它市售或個體來源)。"啟動子"包含指導(dǎo)例如有效連接的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。通常，啟動子位于基因的5，非編碼區(qū)或5'非翻譯區(qū)(5，UTR)，靠近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點。在轉(zhuǎn)錄起始中起作用的啟動子內(nèi)的序列元件特征通常在于共有核苷酸序列。這些序列元件包括RNA聚合酶結(jié)合位點、TATA序列、CAAT序列、分化特異性元件(DSE;McGehee，R.E.，等，Mol.Endocrinol.7(1993)551-560)、環(huán)腺苷酸效應(yīng)元件(CRE)、血清效應(yīng)元件(SRE;Treisman，R.,SeminarsinCancerBiol,1(1990)47-58)、糖皮質(zhì)類固醇應(yīng)答元件(GRE)，和用于其它轉(zhuǎn)錄因子如CRE/ATF(O'Reilly,M.A"等，J.Biol.Chem.267(1992)19938-19943)、AP2(Ye，J"等，J.Biol.Chem.269(1994)25728-25734)、SP1的結(jié)合位點、cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB;Loeken,M.R"GeneExpr.3(1993)253-264)和八聚體因子(一般參閱，Watson等，編輯，MolecularBiologyoftheGene，第4版，TheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.1987，和Lemaigre，F(xiàn).P.和Rousseau,G.G.，Biochem.J.303(1994)1-14)。如果啟動子是誘導(dǎo)型啟動子，那么轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑提高。相反，如果所述啟動子是組成型啟動子，那么轉(zhuǎn)錄速率不受誘導(dǎo)劑的調(diào)節(jié)。阻抑型啟動子也是已知的。例如，c-fos啟動子在生長激素結(jié)合到細胞表面其受體上后被特異性激活?？赏ㄟ^人工雜合啟動子完成四環(huán)素(tet)調(diào)節(jié)的表達，所述啟動子由例如CMV啟動子后接兩個Tet-操縱子位點組成。Tet-阻抑物結(jié)合兩個Tet-操縱基因位點并阻斷轉(zhuǎn)錄。加入誘導(dǎo)物四環(huán)素后，Tet-阻抑物從Tet-操縱基因位點上釋放，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進行(Gossen，M.和Bujard，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)5547-5551)。對于其它i秀導(dǎo)型啟動子，包括金屬硫蛋白和熱激啟動子，參閱例如Sambrook,等(上文)，和Gossen,M.，等，Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。已經(jīng)鑒定為強啟動子用于高水平表達的真核啟動子包括SV40早期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)、中國倉鼠延伸因子la(CHEF-1，參閱例如US5,888,809)、人EF-la、泛素和人巨細胞病毒立9即早期啟動子(CMVIE)。增強子(即，在啟動子上作用增強轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA元件)在與啟動子連接中起作用以提高單獨用啟動子獲得的表達水平中是必須的，并可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件被包括在內(nèi)。通常，含有啟動子的多核苷酸區(qū)段也將包括增強子序列(例如，CMV或SV40)。"有效連接"指兩種或更多種組分的并列，其中所述組分處于允許它們以其期望方式起作用的關(guān)系中。例如，如果啟動子和/或增強子順式起作用以控制或調(diào)節(jié)連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動子和/或增強子有效連接編碼序列。通常，但不是必須的，"有效連接的"DNA序列是相鄰的，并且需要時連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)，如相鄰并符合讀框的分泌性前導(dǎo)序列/信號序列和多肽。然而，盡管有效連接的啟動子通常位于編碼序列的上游，但其不必與其相鄰。增強子不必相鄰。如果增強子增強編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該增強子有效連接編碼區(qū)。有效連接的增強子可以位于編碼序列的上游、中間或下游，和距離啟動子相當遠的位置。如果多聚腺苷酸化位點以轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進行通過編碼區(qū)到達多聚腺苷酸化序列的方式定位在編碼序列的下游末端，那么其有效連接編碼序列。通過本領(lǐng)域已知的重組方法，例如使用PCR方法，和/或通過在便利的限制性酶切位點上連接來完成連接。如果不存在便利的限制性酶切位點，那么根據(jù)一般實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。如此處所用，術(shù)語"表達"指細胞內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。可在細胞中存在的相應(yīng)mRNA量的基礎(chǔ)上測定宿主細胞中期望產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄水平。例如，可通過PCR或通過Northern雜交對從所選核酸轉(zhuǎn)錄的mRNA進行定量(參閱Sambrook，等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。可通過多種方法，例如通過ELISA，通過測定蛋白質(zhì)的生物活性，或通過使用不依賴該活性的測定，如使用識別并結(jié)合所述蛋白質(zhì)的抗體的Western印跡或放射免疫測定對由所選核酸編碼的蛋白質(zhì)進行定量(參閱Sambrook，等，1989，上文)。"宿主細胞"指向其中引入編碼異源多肽的核酸的細胞。宿主細胞包括用于增殖核酸(例如質(zhì)粒)的原核細胞，和用于表達核酸(例如結(jié)構(gòu)基因)編碼的多肽的真核細胞。通常，所迷真核細胞是哺乳動物細胞。"多肽"是通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物，其可以是天然產(chǎn)生的或合成的5低于約20個氨基酸殘基的多肽可稱作"肽"。包含兩條或更多條氨基酸鏈或包含長度為100個氨基酸或更多個氨基酸的氨基酸鏈的多肽可稱作"蛋白質(zhì)"。"蛋白質(zhì)"是包含一條或更多條氨基酸鏈的大分子，其中在一條鏈的情況下，該鏈具有100個氨基酸或更多個氨基酸的長度。多肽或蛋白質(zhì)也可包含非肽組分，如碳水化合物基團?？赏ㄟ^產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的細胞向蛋白質(zhì)添加碳水化合物和其它非肽成分，并且其根據(jù)細胞類型而有所變化。蛋白質(zhì)和多肽此處以其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)定義；如添加碳水化合物基團通常不進行明確說明，但也存在。"異源DNA"或"異源多肽"指并非給定宿主細胞中天然存在的DNA分子或多肽，或DNA分子群或多肽群。對特定宿主細胞異源的DNA分子可含有來自宿主細胞種類的DNA(即內(nèi)源DNA)，只要該宿主細胞來源DNA與非宿主細胞來源DNA(即外源DNA)組合。例如，認為含有編碼多肽的非宿主DNA區(qū)段的DNA分子是異源DNA分子，所述非宿主DNA區(qū)段有效連接包含啟動子的宿主DNA區(qū)段。相反，異源DNA分子可包含與外源啟動子有效連接的內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因。非宿主DNA分子編碼的肽或多肽是"異源"肽或多肽。"克隆質(zhì)粒"是核酸分子，如栽體、粘粒、噬菌?；蚣毦斯と旧w(BAC),其具有在宿主細胞中自主復(fù)制的能力?？寺≠|(zhì)粒通常含有一個或少量限制性內(nèi)切核酸酶識別位點，其例如允許在不丟失質(zhì)?；旧锕δ艿那闆r下以可確定的方式插入核酸，以及提供選擇標記的核苷酸序列，所述選擇標記適合用于鑒定和選擇轉(zhuǎn)化有克隆質(zhì)粒的細胞。選擇標記通常包括提供四環(huán)素、嘌呤霉素、潮霉素或氨節(jié)青霉素抗性的基因。"表達質(zhì)粒"是編碼待在宿主細胞中表達的多肽的核酸分子。通常，表達質(zhì)粒包含例如大腸桿菌(E.coli)的原核質(zhì)粒增殖單位，其包含復(fù)制起點和選擇標記，真核選擇標記，和用于表達目的核酸的一個或更多個表達盒，每一表達盒包含啟動子、結(jié)構(gòu)基因和包括多聚腺苷酸化信號的轉(zhuǎn)錄終止子?；虮磉_通常置于啟動子的調(diào)節(jié)之下，并且這樣的結(jié)構(gòu)基因稱為"有效連接"啟動子。類似地，如果調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)核心啟動子的活性，那么調(diào)節(jié)元件和核心啟動子有效連接。術(shù)語"免疫球蛋白"指基本上由免疫球蛋白基因編碼的一種或更多種多肽組成的蛋白質(zhì)。公認的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區(qū)基因以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以多種形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)或雙抗體(例如Huston,J.S.，等，PNASUSA85(1988)5879-5883;Bird,R.E.，等，Science242(1988)423-426;—般而言，Hood,L.E.，等，Immunology,BenjaminN.Y"第2版(1984);和Hunkapiller，T.和Hood,L.E.，Nature323(1986)15-16)。免疫球蛋白通常包含兩條所謂的輕鏈多肽(輕鏈)和兩條所謂的重鏈多肽(重鏈)。每條重鏈和輕鏈多肽均含有可變域(可變區(qū))(通常為多肽鏈的氨基末端部分)，其包含能夠與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。每條重鏈和輕鏈多肽均包含恒定區(qū)(通常為羧基末端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)抗體結(jié)合i)攜帶Fcy受體(FcyR)的細胞，如吞噬細胞，或ii)攜帶也稱為Brambell受體的新生兒Fc受體(FcRn)的細胞。其也介導(dǎo)結(jié)合一些因子，包括經(jīng)典的補體系統(tǒng)的因子，如組分(Clq)。免疫球蛋白輕鏈或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域依次包含不同的區(qū)段，即四個構(gòu)架區(qū)(FR)和三個高變區(qū)(CDR)。"免疫球蛋白片段"表示包含結(jié)構(gòu)域組中至少一個結(jié)構(gòu)域的多肽，所述結(jié)構(gòu)域組包含免疫球蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域、CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、CH4結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域或Q結(jié)構(gòu)域。也包含的是其衍生物和變體。此外，可存在其中一個或更多個氨基酸或氨基酸區(qū)缺失的可變結(jié)構(gòu)域。"免疫球蛋白綴合物"表示通過肽鍵與其它多肽綴合的多肽，其包含免疫球蛋白重鏈或輕鏈的至少一個結(jié)構(gòu)域。所述其它多肽是非免疫球蛋白肽，如激素、生長受體、抗融合肽等。"促有絲分裂受體"是這樣的受體，其如果激活或滅活則正面或負面影12響細胞分裂，如細胞生長。術(shù)語"正面影響細胞分裂，，表示所述促有絲分裂受體促進細胞分裂。優(yōu)選地，所述促有絲分裂受體是具有胞內(nèi)磷酸化位點的跨膜受體。如果該磷酸化位點被磷酸化，那么所述受體激活細胞增殖。優(yōu)選的促有絲分裂受體是嵌合ErbB2/IGF-I受體。術(shù)語"組成型活性"表示受體處于其活性形式，即不需要其它結(jié)合伴侶(如激活信號)而正面影響細胞分裂。這可例如通過在受體氨基酸序列中引入突變來完成。優(yōu)選的組成型活性促有絲分裂受體是嵌合ErbB2v—e/IGF-I受體。胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR，EC2.7.1.112，CD221抗原，也表示成IGF-IR)屬于跨膜蛋白質(zhì)酪氨酸激酶家族(LeRoith，D.，等，Endocrin.Rev.16(1995)143-163;Adams,T.E，，等，Cell.Mol.LifeSci.57(2000)1050-1093)。IGF-IR以高親和力結(jié)合IGF-I,并在體內(nèi)啟動對該配體的生理學響應(yīng)。IGF-IR也結(jié)合IGF-II，然而是以稍低的親和力結(jié)合。例如通過結(jié)合IGF-I(在下文中通常也表示成效應(yīng)子或配體)激活I(lǐng)GF-IR觸發(fā)細胞信號級聯(lián)放大，其可導(dǎo)致促有絲分裂效應(yīng)或代謝效應(yīng)(參閱例如Humbel，R.E.，Eur.J.Biochem.190(1990)445-462)。效應(yīng)子結(jié)合IGF-IR導(dǎo)致酪氨酸激酶的激活。利用在生長因子受體中進行點突變，可以實現(xiàn)受體酪氨酸激酶的組成型活化，例如V664ENeu或V664QNeu(Bargmann,C.I"等，Cell45(1986)649-657)、V922EIGF-IR(Takahashi，K.,等，J.Biol,Chem.270(1995)19041-19045)、L301SCSF-1R或Y969FCSF-1R(Roussel，M.F.，Cell55(1988)979-988)、C332YFGFR陽2(Neilson，K.M,和Friesel，R.E.，J.Biol.Chem.270(1995)26037-26040)、V938DIR(Longo，N.，J.Biol，Chem.267(1992)12416-12419)、V560Gc-Kit或D814Vc-Kit(Furitsa，T.，等，J.Clin.Invest.92(1993)1736-1744)。例如IGF-IR中的V922E突變導(dǎo)致突變的IGF-IR組成型增強的酪氨酸激酶活性。表達V922EIGF-IR的CHO細胞顯示了顯著激活的葡萄糖攝取，但沒有促進IGF-I缺失下的有絲分裂發(fā)生。例如通過胸苷攝取測定，或利用XTT的細胞增殖測定可以檢測細胞的右&A勁促f泉胡在iHC，'rH"容dwn"13o。4tt"Ot2rk4827-4833)。為了成為組成型活性促有絲分裂受體，促有絲分裂受體的修飾位點可以例如位于跨膜區(qū)中。引入的修飾可導(dǎo)致胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化，其導(dǎo)致所述結(jié)構(gòu)域的組成型活化。該組成型活化提供了修飾受體的配體獨立的激活。如果這種促有絲分裂受體是組成型活性，那么其為包含該受體的細胞提供提高的增殖能力。該增殖能力是在該組成型活性促有絲分裂受體的存在下，獨立于未修飾受體的配體的存在，所述配體將通常激活促有絲分裂性質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明的細胞在懸浮液中生長。在另一實施方案中是適合于在無血清培養(yǎng)基中生長的本發(fā)明細胞。提供組成型活性促有絲分裂受體的細胞的生長獨立于受體的相應(yīng)配體，即其甚至可在缺少生長促進配體下生長。組成型活性促有絲分裂受體具有胞外域、跨膜區(qū)、緊接跨膜區(qū)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和親水胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。所述受體仍然具有結(jié)合其激活配體的性質(zhì)。本發(fā)明的一個實施方案包含組成型活性促有絲分裂受體，其為包含在CHO細胞中表達的融合多肽，該融合多肽具有V659E突變的ErbB2受體的胞外及跨膜結(jié)構(gòu)域(ErbB2受體的氨基酸(AA)1-682,對于人ErbB2受體參閱SEQIDNO:09)和IGF-I受體p亞基的胞質(zhì)域(IGF-I受體的AA929-1337,對于人IGF-I受體參閱SEQIDNO:10)。術(shù)語"AA"用于"氨基酸位置"。如該申請中所用，術(shù)語"氨基酸"表示一組羧基a-氨基酸，其可直接由核酸編碼或是前體形式。氨基酸組包含丙氨酸(三字母代碼ala;—字母代碼A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、賴氨酸(lys，K)、曱硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F(xiàn))、脯氨酸(pro，P)、絲氨酸(ser，S)、蘇氨酸(thr，T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr，Y)和纈氨酸(val，V)。因此，本發(fā)明的一個方面是CHO細胞，其表達組成型活性促有絲分裂受體。在該方面的一個實施方案中是包含核酸的CHO細胞，所述核酸編碼具有V659E突變的ErbB2受體的胞外及跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸(AA)1-682)和具有SEQIDNO:03中所示氨基酸序列的IGF-I受體p亞基的胞質(zhì)域(AA929-1337)。在本發(fā)明的另一實施方案中是CHO細胞、CHO-K1細胞，或CHO-DHFR細胞(DSMZACC126)，或CHODG44細胞，優(yōu)選CHO-K1細胞。本發(fā)明的第二個方面是細胞系CHO-K1ErbB2V>E/IGF-IDSMACC2851。本發(fā)明的另一方面是用于獲得具有組成型活性促有絲分裂受體的本發(fā)明CHO細胞的方法，其中所述方法包括以下步驟a)用第一種核酸轉(zhuǎn)染CHO細胞，所述第一種核酸包含i)包含側(cè)翼為兩個loxP位點的編碼選擇標記的核酸的表達盒，所述1oxP位點一個位于表達盒的3，位置(下游)，一個位于5，位置(上游)，ii)任選地包含編碼運鐵蛋白的核酸的表達盒，iii)包含編碼組成型活性促有絲分裂受體的核酸的表達盒。b)選擇用所述第一種核酸轉(zhuǎn)染的CHO細胞，c)用包含CRE重組酶表達盒的第二種核酸轉(zhuǎn)染步驟b)中選擇的CHO細胞，d)選擇轉(zhuǎn)染有所述第二種核酸的CHO細胞為具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞。在侈'J^口Ausubel，F(xiàn).M.(編豐耳)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第I至III巻(1997);Glover,N.D.，和Hames，B.D.,編輯，DNACloning:APracticalApproach,第I至II巻(198S)，OxfordUniversityPress;Freshney,R.I.(編輯)，AnimalCellCulture—apracticalapproach,IRLPressLimited(1986);Watson,J.D.，等，RecombinantDNA，第二版，CHSLPress(1992);Winnacker，E丄.，F(xiàn)romGenestoClones;N.Y.，VCHPublishers(1987);Celis，J"編輯，CellBiology,第二版，AcademicPress(1998);Freshney,R.I.，CultureofAnimalCells:AManualofBasic15Technique,第二版，AlanR.Liss，Inc.,N.Y.(1987)中描述了用于實施本發(fā)明的重要方法和技術(shù)。loxP-CRE重組酶系統(tǒng)是位點特異性重組系統(tǒng)，其中所述loxP位點定義了重組^f立點，并且所述CRE重組酶催化核酸的重組(Sternberg，N.和Hamilton,D,，J.Mol.Biol.150(1981)467-486;Abremski，K.和Hoess，R.E"Gene25(1983)49-58;Hoess，R.E.，和Abremski，K.，J.Mol.Biol.181(1985)351-362)。本發(fā)明該方面的一個實施方案中步驟b)的轉(zhuǎn)染的CHO細胞表達組成型活性促有絲分裂受體。在優(yōu)選的實施方案中包含組成型活性促有絲分裂受體，具有V659E突變的ErbB2受體的胞外及跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸(AA)1-682)和IGF-I受體p亞基的胞質(zhì)域(AA929-1337)。在另一優(yōu)選實施方案中是具有SEQIDNO:03的氨基酸序列的組成型活性促有絲分裂受體。本發(fā)明CHO細胞是具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞，并且在另一實施方案，步驟d)中選擇轉(zhuǎn)染CHO細胞在第一種核酸中包含的可選擇標記的缺失。在另一實施方案中，步驟d)中選擇的轉(zhuǎn)染CHO細胞在第一種核酸的選擇標記的選擇劑存在下不生長，即第一種核酸為其提供抗性。目前已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)表達組成型活性嵌合ErbB2v—E/IGF-I促有絲分裂受體的本發(fā)明CHO-K1細胞具有改善的生長特性。在一個實施方案中，所述CHO細胞在培養(yǎng)中生長至至少5xl06細胞/ml的最大細胞密度。在優(yōu)選的實施方案中，所述CHO細胞在培養(yǎng)中生長至至少8xl(^細胞/ml的最大細胞密度。在其它實施方案中，從60到70ml體積中大約2到3xl05細胞/ml的細胞密度開始8到12代內(nèi)達到所述最大細胞密度。在另一實施方案中，所述CHO細胞的培養(yǎng)是補料分批培養(yǎng)。在一個實施方案中，所述CHO細胞達到的細胞密度超過至少5代，不低于如補料分批培養(yǎng)6代后達到的細胞密度的95%。在另一實施方案中，所述CHO細胞達到的細胞密度超過至少6代，不低于如補料分批培養(yǎng)6代后達到的細胞密度的75%。在其實施方案中，從60到70ml體積中大約2到3xl05細胞/ml的細胞密度開始6代培養(yǎng)后達到所述細胞密度。通過如實施例中報道的CASY測定細胞密度。本發(fā)明的第四方面是用于在本發(fā)明CHO細胞中重組產(chǎn)生異源多肽的方法，所述CHO細胞表達組成型活性促有絲分裂受體。在一個實施方案中，所述異源多肽是生物活性多肽。如此處所用，術(shù)語"生物活性多肽"指有機分子，例如生物大分子，如肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、核蛋白、黏蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白質(zhì)，當在人工生物系統(tǒng)中施用或向人工生物系統(tǒng)中施用時(所述人工生物系統(tǒng)如使用細胞系和病毒的生物測定)或在體內(nèi)向動物(其包括但不限于鳥類或哺乳動物，包括人)施用時，其引起生物學效應(yīng)。該生物學效應(yīng)可以是，但不限于酶抑制或激活、在結(jié)合位點或周圍結(jié)合受體或配體、信號觸發(fā)或信號調(diào)節(jié)。生物活性分子不限于例如免疫球蛋白、或激素、或細胞因子、或生長因子、或受體配體、或激動劑或拮抗劑、或細胞毒性劑、或抗病毒劑、或成像劑、或酶抑制劑、酶激活劑或酶活性調(diào)節(jié)劑，如別構(gòu)物質(zhì)。在一個實施方案中，所述異源多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白綴合物或抗融合肽。"抗融合肽，，是抑制于膜融合相關(guān)事件或膜融合事件本身的肽，其中包括抑制病毒因膜融合造成的對未感染細胞的感染。這些抗融合肽優(yōu)選為線性肽。例如，它們可來自gp41胞外域，例如DP107、DP178。此類肽的實例可見于US5,464,933、US5，656，480、US6,013,263、US6，017，536、US6,020,459、US6,093,794，、US6,060,065、US6,258,782、US6,348,568、US6,479,055、US6，656，906、WO1996/19495、WO1996/40191、WO1999/59615、WO2000/69902和WO2005/067960。例如，此類肽的氨基,列包含US5,464,933的SEQIDNO:1到10;US5,656,480的SEQIDNO:1到15;US6,013,263的SEQIDNO:1到10和16到83;US6,017,536的SEQIDNO:1到10，20到83和139到149;US6,093,794的SEQIDNO:1到10，17到83和210到214;US6,060,065的SEQIDNO:1到10，16到83和210到211;US6,258,782的SEQIDNO:1286和1310;US6,348,568的SEQIDNO:1129、1278-1309、1311和1433;US6,479,055的SEQIDNO:1到10和210到238;US6，656，卯6的SEQIDNO:1到171、173到216、218》J219、222至'j228、231、233至'J366、372至)J398、400至'』456、458到498、500到570、572到620、622到651、653到736、739到785、787到811、813到815、816到823、825、827到863、865到875、877到883、885、887到890、892到981、986到999、1001到1003、1006到1018、1022到1024、1026到1028、1030到1032、1037到1076、1078到1079、1082到1117、1120到1176、1179到1213、1218到1223、1227到1237、1244到1245、1256到1268、1271到1275、1277、1345到1348、1350到1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374到1376、1378到1379、1381到1385、1412到1417、1421到1426、1428到1430、1432、1439到1542、1670到1682、1684到1709、1712到1719、1721到1753、1755到1757;或WO2005/067960的SEQIDNO:5到95。在一個實施方案中，所述抗融合肽具有包含5到100個氨基酸，優(yōu)選10到75個氨基酸，并更優(yōu)選15到50個氨基酸的氨基酸序列。在另一實施方案中，所述異源多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白綴合物。本發(fā)明的該方面包含用于在本發(fā)明細胞中重組產(chǎn)生異源多肽的方法。用于重組產(chǎn)生的細胞包含第三個核酸，所述核酸包含用于表達異源多肽的表達盒。所述笫三個核酸例如在表達質(zhì)粒上被引入了細胞，并且在適合于所述異源多肽表達的條件下培養(yǎng)細胞。因此，本發(fā)明另一方面是用于重組產(chǎn)生異源多肽的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供表達組成型活性嵌合ErbB2v—E/IGF-I促有絲分裂受體的CHO-K1細胞，b)用包含表達異源多肽的表達盒的核酸轉(zhuǎn)染所述細胞，c)從所述細胞或培養(yǎng)基中回收所述異源多肽。在一個實施方案中，所迷異源多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白綴合物。免疫球蛋白分子分為五種不同類型IgA(免疫球蛋白A)、IgD、IgE、IgG和IgM。在這些中，IgG和IgE更頻繁地用于藥物應(yīng)用和診斷應(yīng)用。在這些類型中，免疫球蛋白其整體結(jié)構(gòu)不同，但結(jié)構(gòu)單元類似。所有免疫球蛋白由兩條不同的多肽鏈輕鏈和重鏈組成。"免疫球蛋白片段"包含免疫球蛋白輕鏈或重鏈的羧基末端恒定結(jié)構(gòu)域，例如其包含免疫球蛋白重鏈的至少CHl-、Ch2-、CH3-結(jié)構(gòu)域和絞鏈區(qū)，和任選地免疫球蛋白輕鏈的Ch4-結(jié)枸域，或Qr結(jié)構(gòu)域。所述片段來源的免疫球蛋白可以是天然發(fā)生的或合成的免疫球蛋白，或嚙齒類動物免疫球蛋白，或人源化免疫球蛋白，或人免疫球蛋白。在本發(fā)明一個實施方案中，所述免疫球蛋白片段額外含有重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或其變體的片段。在可變結(jié)構(gòu)域片段中，氨基酸或區(qū)域缺失。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域的一到六個氨基酸缺失。在另一實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域的一到六個區(qū)域缺失。在其它實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域缺失。在一個實施方案中，免疫球蛋白片段中包含的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域是同一抗體上的或來自同一抗體，即屬于同一抗體。對于表達，將編碼異源多肽的核酸引入表達質(zhì)粒中，所述表達質(zhì)粒包含本發(fā)明CHO細胞中有效連接形式的異源多肽進行表達所有需要的元件。在一個實施方案中，CHO細胞包含編碼異源多肽的核酸。在一個實施方案中，所述異源多肽是人多肽。在另一實施方案中，所述多肽選自免疫球蛋白，或免疫球蛋白重鏈，或免疫球蛋白輕鏈，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白綴合物。本發(fā)明的優(yōu)選細胞系CHO-K1ErbB2V〉E/IGF-I根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約在2007年6月13日保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)),保藏號為DSMACC2851。提供以下實施例、序列表和附圖幫助理解本發(fā)明，其真正范圍在所附權(quán)利要求中給出。應(yīng)理解在不背離本發(fā)明精神的情況下可對所述方法進行19修改。附圖描述圖1質(zhì)粒5519-pUC的質(zhì)粒圖。圖2質(zhì)粒4699-pUC-Hyg的質(zhì)粒圖。圖3質(zhì)粒pMC-CRE的質(zhì)粒圖。圖4適合懸浮培養(yǎng)的CHO-K1在培養(yǎng)過程中的細胞密度，CHO-K1-5519-1B6-18B3和CHO-Kl-5519畫lB6-17C5;X軸:天；Y軸:以106細胞/ml計的細胞密度；填充正方形適合懸浮生長的CHO-Kl，填充的圓形CHO-K1-5519-1B6-18B3，填充的三角形CHO誦Kl-55191B6-17C5。實施例通過從親本CHO-Kl(W)細胞系開始的3個連續(xù)的完整最佳克隆選擇活動產(chǎn)生本發(fā)明的CHO細胞系，所述親本CHO-Kl(W)細胞系是適合在懸浮培養(yǎng)中生長的CHO-K1細胞系(ATCCCCL-61)。實施例1質(zhì)粒5519-pUC的產(chǎn)生質(zhì)粒5519-pUC提供用于組成型活性促有絲分裂受體(嵌合受體ErbB2v—E/IGF-IR)的表達盒、用于運鐵蛋白表達的表達盒、和賦予嘌呤霉素抗性的選擇標記的表達盒。詳述來說，質(zhì)粒5519-pUC包含以下元件-包含側(cè)翼為兩個loxP位點(SEQIDNO:Ol)的嘌呤霉素選擇標記的核酸；在下文中將該核酸命名為puro-loxP。-用于質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制和生長的pUC復(fù)制起點，-P-內(nèi)酰胺酶基因(p-內(nèi)酰胺酶基因)，-包含運鐵蛋白結(jié)構(gòu)基因、信號肽、SV40早期啟動子和起點、和運鐵蛋白可讀框的cDNA序列的核酸(Yang，F(xiàn).，等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA81(1984)2752-6)(SEQIDNO:02),-包含SV40早期啟動子和起點序列，和編碼具有V659E突變的ErbB2受體的胞外及跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸(AA)1-682)和IGF-I受體卩亞基的胞質(zhì)域(AA929-1337)的cDNA序列的核酸(Belaus，A.，等，J.Steroid.Biochem.Mol.Biol.85(2003)105-15)(SEQIDNO:03)。將該嵌合受體命名為ErbB2v—E/IGF-IR。將質(zhì)粒5519-pUC的元件引入栽體4699-pUC-Hyg。質(zhì)粒5519-pUC的注釋質(zhì)粒圖示于圖1。通過PCR擴增載體pcDNA3.1/Hygro(+)(Cat-No.:V870-20,InvitrogenCorp.,USA)從1731位核苷酸至5590位核苷酸的3860bp的DNA片段來獲得載體4699-pUC-Hyg。通過含有Ascl、SgrAI、Ascl、Sbfl和BamHI限制性位點的PCR引物(正向引物ataatacctgcaggaaaaggccggccaaaggatccctgtggaatgtgtgtcagttagggtg(SEQIDNO:11);反向引物ttttttcctgcaggtattatcaccggtgttttggcgcgccaggtggcacttttcggggaaatgtg(SEQIDNO:04))引入額外的56bp的核酸片段，丟棄Sse38387I限制性位點之內(nèi)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，得到包含3916bp的環(huán)形質(zhì)粒4699-pUC-Hyg。質(zhì)粒4699-pUC-Hyg包含以下元件-包含潮霉素選擇標記(hyg)的核酸，-用于質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制和生長的pUC復(fù)制起點，-P-內(nèi)酰胺酶基因。質(zhì)粒4699-pUC-Hyg的注釋質(zhì)粒圖示于圖2。實施例2用質(zhì)粒5519-pUC轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞為了獲得具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞，CHO-K1細胞在無血清培養(yǎng)基中適應(yīng)生長。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCCCCL-61))獲得基本CHO畫Kl細胞系。Kao，F(xiàn).T.和Puck,T.T.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA60(1968)1275-81;和Puck,T.T.，等，J.Exp.Med.108(1958)945-56描述了該CHO-K1細胞系的衍生和產(chǎn)生。將經(jīng)適應(yīng)的細胞系命名為CHO-Kl(W)。該細胞系不包含外來DNA,例如通過轉(zhuǎn)染方法整合的DNA，并且適合在合成的無動物組分的ProCH04培養(yǎng)基(CambrexCorp.,USA)中懸浮培養(yǎng)生長。該培養(yǎng)基添加有8mM谷氨酰胺(Gin)和lxHT(次黃嘌呤-胸苷)補充物并在下文中命名為ProCH04完全培養(yǎng)基。使用靠近氨千青霉素選擇標記(基因)的單Sspl限制性位點在轉(zhuǎn)染前將質(zhì)粒5519-pUC線性化。利用具有2mm缺口的電穿孔杯，使用GenePulserXCell電穿孔設(shè)備(Bio-RadLaboratoriesGmbH,Germany)，用線性化的DNA電穿孑LCHO-Kl(W)細胞。使用的電穿孔脈沖為160V/15ms，該脈沖應(yīng)用于在總體積為200pi的Dulbecco'sPBS中的20照質(zhì)粒DNA和7.5xl06細胞(CatNo:D8537，Sigma畫AldrichGmbH，Seelze，Germany)。隨后將細胞在ProCH04完全培養(yǎng)基中重懸浮并且按5000細胞/孔接種至二十塊96孔多孔板。24小時后將生長培養(yǎng)基更換為ProCH04完全選擇培養(yǎng)基(添加有5jig/ml嘌呤霉素的ProCH04完全培養(yǎng)基)。實施例3細胞系CHO-K1-5519-1B6的產(chǎn)生實施例2的轉(zhuǎn)染細胞在ProCH04完全選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4周。為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆，進行兩步選擇步驟。a)第一選擇步驟使用兩種不同標準來挑取用于增殖的克隆視覺選擇將視覺上明顯可見的克隆轉(zhuǎn)染至24孔多孔板上(非組織培養(yǎng)處理的；BectonDickinson,表面積2.0cm2)。細胞增殖試驗根據(jù)生長參數(shù)進行WST-I細胞增殖試驗(RocheDiagnosticsGmbH，Germany)用于額外克隆的選擇。選擇具有最高吸光度的克隆并轉(zhuǎn)移至24孔多孔板。使用WST-I比色測定來確定細胞增殖和克隆活力。測定基于細胞代謝活力與積累的甲騰染料的增加量之間的正相關(guān)，所述染料通過線粒體脫氫酶切割WST-I試劑產(chǎn)生。為了測定，將細胞復(fù)制。將一等分試樣按1:10分傳至終體積100^中置于96孔多孔板的一個孔中。經(jīng)24小時的培養(yǎng)時間之后，向各孔中加入10WST-I細胞增殖試劑。隨后將細胞在37。C/5%C02額外溫育2小時。使用Tecan讀數(shù)器(Spectrafluorplus，TecanDeutschlandGmbH，Germany)以620nm參考波長在450nm處測定樣品的吸光度。b)第二選擇步驟為了進一步在24孔多孔板、6孔多孔板和最后的搖瓶形式中進行克隆選擇，使用確定的接種策略。因此在各細胞培養(yǎng)容器中接種3xl()S細胞/ml并且使用CASY細胞計數(shù)器(SchSrfeSystems,Reutlingen，Germany)測定4和7-8天后細胞密度和活力。通過將200pl的細胞懸浮液與20pi胰蛋白酶在37。C溫育30分鐘來溶解細胞團。為了測定，將50或100^解離后的細胞懸浮液在10mlCASYton緩沖液(SchSrfeSystemsGmbH，Germany)中稀釋并且使用CellCounter和Analyzer-SystemCASY(SchSrfeSystemGmbH,Germany)通過電脈沖面積分析一式三份地測定在其400pl中總的活細胞濃度。使用150nm毛細管的測定結(jié)果為大小分布曲線。將大小分布分為三類顆粒3.4-5jLim為細胞碎片；5-10nm為死亡細月包；10—30|tim為活細月包。鑒定并擴大在4天(指快速增殖)和7-8天后具有最高細胞密度的細胞克隆。示例性結(jié)果示于表l中。表1:在分批培養(yǎng)條件下125ml搖瓶中培養(yǎng)的CASY選擇的示例性結(jié)果(總體積ProCH04完全培養(yǎng)基中62.5ml)。細胞克隆細胞數(shù)目/ml第4天細胞活力第4天細胞數(shù)目/ml第8天細胞活力第8天CHO-K1-5519-1B65.5x10699%8.8x10699%23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在第一輪克隆選擇后選擇具有最佳生長特性的混合有轉(zhuǎn)染子的細胞克隆CHO-Kl-55191B6。實施例44i姿rumn/d，，t^t人AA訌>t;^h/vo。、niv^一i、i、量uuj^jwv/使用經(jīng)流式細胞儀(FluorescenceActivatedCellSorting,FACS)的單細胞沉積步驟來產(chǎn)生細胞系CHO-Kl(PuDL)。在含4jig/ml噤呤霉素的ProCH04完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)實施例3中選擇的具有最佳生長特性的轉(zhuǎn)染子混合的細胞克隆CHO-Kl-5519-lB6。收集處于對數(shù)生長期的lxl(^個細胞，將其通過流經(jīng)40jLim濾器以去除細胞團(BDFalcon;cellstrainer,BDBiosciences,USA),離心沉淀(300xg，10分鐘)并在5mlProCH04完全培養(yǎng)基中重懸浮以在培養(yǎng)基中不含選擇劑的溶液的情況下獲得濃度為l-2xl(^細胞/ml的溶液。使用FACSAria細胞分選儀(BDBiosciences,USA)，將單個細胞沉積到二十塊96孔多孔板(U-shape，Cellstar，Greinerbio-one，F(xiàn)rickenhausen，Germany)的各孑L中，所述孔含有50pi細胞受限的ProCH04完全培養(yǎng)基及50pi不含選擇劑的新鮮ProCH04完全培養(yǎng)基。在單個細胞沉積步驟后兩天，加入100含8pg/ml嘌呤霉素的兩倍濃縮的選擇性ProCH04完全培養(yǎng)基。17天后將82個最先出現(xiàn)的亞克隆在24孔多孔板中擴增。為了在24孔多孔板、6孔多孔板及搖瓶中的進一步克隆選擇，使用前文描述的確定的接種策略(見實施例3)。鑒定并擴大培養(yǎng)分別在4天和7-8天后具有最高細胞密度的細胞克隆。在ProCH04完全培養(yǎng)基中補料分批懸浮培養(yǎng)(125mlErlenmeyer瓶)中生長后其生長特性的基礎(chǔ)上選擇下文中表示為CHO-Kl(PuDL)的克隆CHO-Kl-5519-lB6-18B3。實施例5用CRE重組酶表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染CHO-Kl(PuDL)細胞系CRE重組酶表達質(zhì)粒pMC-CRE的構(gòu)建如Gu等描述(Gu，H.，等Cell73(1993)1155-1164)。它包含與啟動子/增強子一起的CRE編碼部分及來自pMClNeopA的pA區(qū)。對于注釋的質(zhì)粒圖^瞽見圖3。為了轉(zhuǎn)染，使用GenePulserXCeIl電穿孔設(shè)備(Bio-RadLaboratoriesInc.,USA)按照生產(chǎn)商iJL明書用環(huán)形質(zhì)粒DNA電穿孔實施例4的CHO-Kl(PuDL)細胞?；旌蟽纱无D(zhuǎn)染產(chǎn)物并在37.5mlProCH04完全培養(yǎng)基中重懸浮，密度為4xl05細胞/ml。實施例6細胞系CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I的選擇在經(jīng)流式細胞術(shù)的單個細胞沉積步驟之前，實施例5中的細胞在無選擇劑的ProCH04完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7代(24天)。為了該選擇，使用FACSAria細胞分選儀(BDBiosciences)來將單細胞沉積到二十塊96孔多孔板(U-shape，Cellstar，GreinerBio-OneGmbH,Frickenhausen，Germany)的每一孔中，所述孔含50pi細胞受限的ProCH04完全培養(yǎng)基和50新鮮ProCH04完全培養(yǎng)基。在單個細胞沉積步驟后三天，加入100pi新鮮ProCH04完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)15天后將最先出現(xiàn)的127個亞克隆擴大至24孔多孔板中。為了進一步的克隆篩選，使用前文描述的確定接種策略(實施例3)。9天后使用CASYCellCounter-System鑒定具有最高細胞密度的三十一個細胞克隆。在125mlProCH04完全培養(yǎng)基中的補料分批懸浮培養(yǎng)中生長后，根據(jù)其生長特征來選擇克隆CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I?？寺HO-K1ErbB2V>E/IGF-I在2007年6月13日作為CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I保藏在DSMZ，保藏號為DSMACC2851。此外，克隆CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I的特征在于對選擇標記噤呤霉素(5jug/ml)敏感，通過RT-PCR分析驗證CHO-KlErbB2V〉E/IGF-I細胞中pac-mRNA轉(zhuǎn)錄物的缺失確證了這一點。細胞增殖試驗4吏用如上文描述的WST-I比色測定來間接測定功能性核酸puro-loxP的成功去除。因此各亞克隆的細胞分別在不含或含有5|iig/ml嘌呤霉素的ProCH04完全培養(yǎng)基中重懸浮。各亞克隆的兩種細胞懸浮液以3xl0"細胞/100pl的濃度一式三份接種在五塊96孔多孔板中。在五天的時期內(nèi)，每天向含5lug/inl或不含嘌呤霉素的一個一式三份組中加入10plWST-I細胞增殖試劑/孔。細胞在37。C/5%C02中溫育2小時并使用Tecan讀數(shù)器(Spectrafluorphis)以620nm的參考波長在450nm處測定吸光度。含嘌呤霉素的ProCH04完全培養(yǎng)基與不含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中細胞增殖抑制的比較顯示31個檢測的亞克隆中有17個是噪呤霉素敏感的。用RT-PCR檢測亞克隆中的嘌呤霉素N乙酰基轉(zhuǎn)移酶mRNA分子為了檢測所選亞克隆中的噤呤霉素N乙?；D(zhuǎn)移酶mRNA,使用LightCyclerInstrument(RocheDiagnosticsGmbH,Germany)進行雜交探針RT-PCR試驗。RNA分離4吏用RNeasymini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從在6孑L多孑L板中生長的細胞中分離總RNA。按照生產(chǎn)商的方案進行提取。隨后使用TURBODNA-freeKit(AmbionInc.,Austin,TX，USA)按照生產(chǎn)商的方案去除痕量的污染DNA。通過在UVIKON9M分光光度計(KontronInstruments,Italy)中260nm及280nm處測定吸光度來測定RNA樣品的量及RNA的純度。使用實時RT-PCR用于檢測pac-mRNA的雜交探針測定在LightCycler儀器上使用一步RT-PCRLightCyclerRNAHybprobe試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH，Germany)按照生產(chǎn)商方案將各細胞克隆中分離的總RNA反轉(zhuǎn)錄并隨后擴增。使用"二次導(dǎo)數(shù)最大值方法"來測定各樣品的交叉點(Cp)。所用引物對為pacF5-AGCTGCAAGAACTCTTCCTCAC-3'(SEQIDNO:5)和pacR5TCAGGCACCGGGCTT-3'(SEQIDNO:6)，擴增pac-mRNA的45726bp片段。設(shè)計Hybprobe探針并在TIBMOLBIOL(Berlin,Germany)標記熒光素或LightCyclerRed640。所用的Hybprobes組為在3，末端用熒光素標記的pacFL:CCCGCCTTCCTGGAGACCTCC-FL(SEQIDNO:7)和在5，末端用LCRed640染料標記的pacLC:640-CGCCCCGCAACCTCCCCT-p(SEQIDNO:8)。用磷酸封閉pacLC寡核苷酸探針的游離3'羥基。為確保正確的產(chǎn)物擴增，在PCR之后用2%(w/w)瓊脂糖凝膠電泳分離所有樣品。反應(yīng)混合物含RNAMasterHybprobe混合物、500nM(每種)的正向和反向引物(pacF和pacR)、200nM的每種探針(pacFL和pacLC)、3.25mMMn(OAc)2和100納克總RNA的20pi總體積。RT-PCR條件如下RT在61。C，20分鐘和95。C，2分鐘，PCR在95。C,4秒、55。C,15秒和72。C，20秒進行45個循環(huán)。實施例7ErbB2v—E/IGF-IR蛋白質(zhì)表達的檢測蛋白質(zhì)提取和免疫印跡使用含CompleteMiniProteaseInhibitor混合物(RocheDiagnosticsGmbH，Germany)的200jtilRIPA裂解和提取緩沖液(Pierce,Rockford，IL，USA)從實施例6中鑒定的在6孔多孔板上生長的細胞中獲得總細胞裂解產(chǎn)物。通過離心去除不可溶碎片后，使用MicroBCAProteinAssayKit(PierceInc.,USA)按照生產(chǎn)商方案對蛋白質(zhì)濃度進行定量。將10jig總細胞裂解產(chǎn)物與含十二烷基硫酸鋰(LDS)的樣品緩沖液和50mMDTT混合。將樣品煮沸10分鐘并隨后在還原性條件下10%(w/w)NuPAGEBis畫TRIS凝膠(InvitrogenInc.,USA)上進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過半干方法將印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。在含5%(v/v)脫脂奶粉的TBS緩沖液(TRIS-BufferedSaline)中稀釋抗血清。在含0.1%Tween20(v/v)的TBS緩沖液中進行以下洗滌步驟。使用綴合辣根過氧化物酶的綿羊抗兔抗血清(按1:5000稀釋，RocheDiagnosticsGmbH，德國)利用增強化學發(fā)光底物(LUMI-LightplusWesternBlottingsubstrate,RocheDiagnosticsGmbH,德國)來檢測各自的一級抗血清。使用以下一級抗體針對人GF-I受體p鏈的兔多克隆抗體(按1:1000稀釋，sc-713;SantaCruzBiotechnologyInc.,美國)。FACS分析通過流式細胞儀來檢測嵌合受體的表面表達。lxl(^個細胞與rhuMab2C4(Omnitarg,F.Hoffmann-LaRocheAG,BasleSwitzerland)或作為同種型對照的人IgG(1-4506，Sigma-AldrichGmbH，Germany)溫育。用綴合藻紅蛋白的山羊抗人F(ab')2(CaltagLaboratories,InvitrogenInc.,美國)對細胞進4亍染色并用FACScan(BectonDickinson,MountainView,CA，美國)來測定表達。實施例8使用CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I細胞重組產(chǎn)生免疫球蛋白綴合物質(zhì)粒p4928對于抗CCR5的抗體綴合物的表達和產(chǎn)生，將類似例如在WO2008/019817中報道的那些輕鏈和重鏈表達盒以順時針方向置于單個表達載體中。表達栽體包括用于篩選的新霉素抗性基因。除重鏈和輕鏈表達盒之外，所述表達載體還包含以下元件-包含新霉素選擇標記(neo)的核酸，-用于質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制和生長的pUC復(fù)制起點，-P-內(nèi)酰胺酶基因。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在ProCH04完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I細胞來產(chǎn)生重組免疫球蛋白綴合物。在轉(zhuǎn)染前使用氨節(jié)青霉素選擇標記(基因)內(nèi)的單Pvul限制性位點將質(zhì)粒p4928線性化。使用帶有2mm凹口的電穿孔杯的GenePulserXCellTM(Bio-RadLaboratories)電穿孑L設(shè)備用線性化DNA電穿孑LCHO-K1ErbB2V>E/IGF-I細胞。所用電穿孔脈沖為160V/15ms，應(yīng)用于總體積200jal的Dulbecco'sPBS中的20照質(zhì)粒DNA和7.5><106細胞。將兩個轉(zhuǎn)染方法合并，重懸浮于37.5mlProCH04完全培養(yǎng)基中，密度為4x10s細胞/ml,并轉(zhuǎn)移到CellStarT75Flask中。24小時后向培養(yǎng)基中加入700照/mlG418硫酸鹽(Calbiochem，LaJoIla，CA，USA)。4天后，將細胞轉(zhuǎn)移至搖瓶形式中并在通過流式細胞術(shù)進行單個細胞沉積步驟之前在含700fig/mlG418硫酸鹽的ProCH04完全選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)6代。為了該選擇，使用FACSAria細胞分選儀來將單個細胞沉積到二十塊96孔多孔板的每孔中，所述孔含50pl細胞受限的ProCH04完全培養(yǎng)基和50新鮮ProCH04完全培養(yǎng)基。在單個細胞沉積步驟兩天后，加入100pl含兩倍濃度1400pg/mlG418硫酸鹽的新鮮ProCH04完全選擇培養(yǎng)基。培養(yǎng)14天后，用體濃度。為了選擇高產(chǎn)抗體產(chǎn)生細胞系，在24孔形式中擴繁后使用一步抗人IgGELISA再次檢測IgGl抗體濃度。最佳克隆篩選實驗得到細胞克隆CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I4928-3H6,所述克隆經(jīng)分析A蛋白HPLC分析具有>100pg/ml的生產(chǎn)力。細胞培養(yǎng)條件如下?lián)u動分批培養(yǎng)，其具有總體積30ml的不含選擇劑的ProCH04完全培養(yǎng)基和3xl05細胞/ml的起始接種細胞密度。在第10天收集含免疫球蛋白綴合物的細胞培養(yǎng)上清液并在4°C儲存24小時直至定量。在還原條件下通過SDS-PAGE驗證輕鏈和重鏈的完整性和分子量。例如在Meissner，P"等，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中給出了關(guān)于人免疫球蛋白重組表達的一般信息。用抗人IgGELISA對含表達重鏈的多肽進行定量通過一步夾層ELISA來測定細胞培養(yǎng)上清液中的免疫球蛋白濃度，所述ELISA使用作為捕獲試劑并用于檢測過氧化物酶綴合的抗人IgGF(ab，)2抗體片段的生物素化抗人IgGF(ab，)2片段。通過室溫(RT)下振蕩溫育一小時，用稀釋緩沖液(稀釋緩沖液含0.5%(w/v)牛血清白蛋白的PBS緩沖液)中的2ng/ml生物素化山羊多克隆抗人IgGF(ab，)2抗體片段((F(ab，)2<h-Fcy>Bi;Dianova，Germany,CodeNo.109-066-098)捕獲抗體(0.1ml/孔))包被鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔板(RocheDiagnosticsGmbH,Germany)。隨后，用多于0.3ml的洗滌緩沖液(洗滌緩沖液含1%(w/v)Tween20的PBS)洗滌平板三次。將含IgG免疫球蛋白綴合物的細胞培養(yǎng)上清液(樣品)在稀釋緩沖液中連續(xù)稀釋(兩倍)至濃度為2-10ng/ml，將其加入板中，并在RT下振蕩溫育一小時。使用稀釋緩沖液中的純化單克隆標準抗體(0-40ng/ml)來生成IgG蛋白質(zhì)標準曲線。用0.3ml/孔洗滌緩沖液洗滌平板三次后，用山羊多克隆抗人F(ab，)2特異IgG的綴合過氧化物酶的F(ab，)2片段(F(ab，)2<h-Fcy>POD;Dianova，CodeNo.109-036-098)檢測與人Fcgamma結(jié)合的復(fù)合體。用0，3ml/孔洗滌緩沖液洗滌平板三次后，將平板用ABTS(2，2，-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)過氧化物酶底物溶液(RocheMolecularBiochemicals，CodeNo.1684302，RocheDiagnosticsGmbH,Germany)顯色。10分鐘后在TecanSpectrafluorplus平板讀數(shù)器(TecanDeutschlandGmbH，Germany)上4十對試劑空白(溫育緩沖液+ABTS溶液)在405nm和490nm處測定吸光度。對于背景校正，按照公式I從405nm處的吸光度中減去4卯nm處的吸光度。所有樣品至少以一式兩份檢測，并且將兩次或三次的吸光度測定值進行平均。根據(jù)標準曲線計算樣品中的IgG含量。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>通過與蛋白A瓊脂糖的親和結(jié)合對免疫球蛋白多肽進行定量用ProCH04完全培養(yǎng)基按l:3稀釋2ml澄清的培養(yǎng)上清液。使用來自GEHealthcare的AktaExplorer900層析系統(tǒng)的分析A蛋白層析進行蛋白質(zhì)濃度的定量。用2xPBS平衡填充有250piA蛋白SepharoseTMCL-4B(GEHealthcare,Munich,Germany)的柱子，用2xPBS和100mM磷酸鹽緩沖液(pH5.0)洗滌并用100mM砩酸鹽緩沖液(pH2.7)洗脫。使用0.5ml/分鐘的流速及280iim處的UV檢測。將在ProCH04完全培養(yǎng)基中稀釋的純化單克隆標準抗體用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)標準曲線。SDSPAGE/考馬斯藍染色用十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離表達和分泌的多肽并用考馬斯藍試劑進行染色。將含分泌多肽的培養(yǎng)液離心以去除細胞和細胞碎片。將澄清上清液的等分試樣與1/4體積(v/v)的NuPAGE-LDS-Sample-Puffer(InvitrogenCorp.，USA)和1/10體積(v/v)的NuPAGE⑧畫10xReducingAgent(InvitrogenCorp.,USA)混合。樣品在70。C溫育10分鐘并隨后用SDS-PAGE來分離蛋白質(zhì)。按照生產(chǎn)商說明書4吏用NuPAGEPre-Cast凝膠系統(tǒng)。具體而言，10%NuPAGENovexBis-TRISPre-Cast凝膠(pH6.4)和NuPAGEMOPS電泳緩沖液與NuPAGEAntioxidant組合使用。在120V分離1小時后，將凝膠用考馬斯藍溶液(30。/。(v/v)甲醇；10%(v/v)乙酸；0.2%(w/v)考馬斯亮藍R-250Dye,Pierce,Rockford，IL，USA)輕搖染色1小時并在水中脫色過夜。實施例9培養(yǎng)中的細胞密度在125搖瓶添加有1xHT補充物、6mM谷氨酰胺和4照/ml嘌呤霉素的ProCH04培養(yǎng)基中以160rpm培養(yǎng)在實施例4中獲得的細胞克隆CHO-K1-5519-1B6-18B3和CHO-Kl-5519-lB6-17C5。作為適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)的參照CHO-Kl，也在相同條件下培養(yǎng)，除了不使用噤呤霉素但加入50ng/mlIGF-1。在總體積62.5ml中以約2至3xl05細胞/ml的量接種培養(yǎng)物。對于細胞密度分析，每天從培養(yǎng)物中取0.5至1.0ml樣品。通過將200細胞懸浮液與20pl胰蛋白酶溫育30分鐘來溶解細胞團塊。對于測定，將50或100解離后的細胞懸浮液在10mlCASYton緩沖液(ScharfeSystemsGmbH,Germany)中稀釋并且使用CellCounter和Analyzer-SystemCASY(ScharfeSystemGmbH,Germany)通過電脈沖面積分析一式三份測定其400pi中的總可見細胞濃度。結(jié)果示于表2和圖4中。表2:以1(^細胞/ml計的細胞密度。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>權(quán)利要求1.CHO細胞，其特征在于所述CHO細胞表達組成型活性促有絲分裂受體。2.權(quán)利要求1的CHO細胞，其特征在于所述CHO細胞是CHO-K1細胞。3.權(quán)利要求1或2任何一項的CHO細胞，其特征在于所迷CHO細胞表達嵌合ErbB2/IGF-I受體。4.權(quán)利要求1或2任何一項的CHO細胞，其特征在于所述CHO細胞表達嵌合ErbB2v—E/IGF-I受體。5.權(quán)利要求4的CHO細胞，其特征在于所述細胞包含組成型活性促有絲分裂受體，其為包含具有V659E突變的SEQIDNO:09的氨基酸1-682和SEQIDNO:10的氨基酸929-1337的融合多肽。6.外又利要求4的CHO細胞，其特征在于所述細胞包含編碼SEQIDNO:03的氨基酸序列的核酸。7.前述權(quán)利要求任何一項的CHO細胞，其特征在于所述細胞在懸浮液中生長。8.前述權(quán)利要求任何一項的CHO細胞，其特征在于所述細胞適應(yīng)于在無血清培養(yǎng)基中生長。9.前述權(quán)利要求任何一項的CHO細胞，其特征在于所述CHO細胞在培養(yǎng)中生長至至少5xl(^個細胞/ml的最大細胞密度。10.權(quán)利要求9的CHO細胞，其特征在于所述CHO細胞在培養(yǎng)中生長至至少8xl(^個細胞/ml的最大細胞密度。11.權(quán)利要求9到10任何一項的CHO細胞，其特征在于在60到70ml的體積中從2xl()5到3xl()S個細胞/ml的細胞密度開始8到12代內(nèi)達到所述最大細胞密度。12.權(quán)利要求9到10任何一項的CHO細胞，其特征在于所述CHO細胞的所述培養(yǎng)是補料分批培養(yǎng)。13.PTJ逸4入々'J^SC,4^'I工'I"J,的Llav^-w"Ci，穴^4^仁J廠^l±1U5W/ICi達到的細胞密度超過至少5代，不低于如補料分批培養(yǎng)6代后細胞密度的95%。14.外又利要求13的CHO細胞，其特征在于所述CHO細胞達到的細胞密度超過至少6代，不低于如補料分批培養(yǎng)6代后細胞密度的75%。15.4又利要求13到14任何一項的CHO細胞，其特征在于從60到70ml體積中2xl()S到3xl()S個細胞/ml的細胞密度開始達到6代培養(yǎng)后的所述細胞密度。16.細胞系DSMACC2851。17.用于獲得具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a)用第一種核酸轉(zhuǎn)染CHO細胞，所述第一種核酸包含i)側(cè)翼為兩個loxP位點的編碼選擇標記的表達盒，ii)用于表達組成型活性促有絲分裂受體的表達盒，b)選擇轉(zhuǎn)染有所述第一種核酸的CHO細胞，c)用包含CRE重組酶表達盒的第二種核酸轉(zhuǎn)染步驟b)中選擇的所述CHO細胞，d)選擇轉(zhuǎn)染有所述第二種核酸的CHO細胞作為具有組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞。18.權(quán)利要求17的方法，其特征在于步驟b)的所述轉(zhuǎn)染的CHO細胞具有組成型活性促有絲分裂受體。19.權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述組成型活性促有絲分裂受體具有SEQIDNO:03的氨基酸序列。20.權(quán)利要求17的方法，其特征在于在步驟d)中選擇所述轉(zhuǎn)染的CHO細胞的第一種核酸中包含的選擇標記的缺失。21.權(quán)利要求17的方法，其特征在于步驟d)中選擇的所述轉(zhuǎn)染的CHO細胞在根據(jù)第一種核酸的選擇標記的選擇劑存在下不生長。22.權(quán)利要求17的方法，其特征在于第一種核酸包含用于表達運鐵蛋白的表達盒。23.權(quán)利要求1到4任何一項的CHO細胞，其特征在于所述CHO細胞表達異源多肽。24.用于產(chǎn)生異源多肽的方法，其特征在于其包括以下步驟a)提供權(quán)利要求1的CHO細胞，b)用核酸轉(zhuǎn)染所述CHO細胞，所述核酸包含i)包含編碼所述異源多肽的核酸的第一個表達盒，H)編碼選擇標記的第二個表達盒，c)在適合于表達所述異源多肽的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的CHO細胞，d)從所述培養(yǎng)基或細胞中回收所述表達的異源多肽。25.權(quán)利要求24的方法，其特征在于用于轉(zhuǎn)染CHO細胞的核酸包含編碼異源多肽的表達盒。26.權(quán)利要求25的方法，其特載在于所述異源多肽選自免疫球蛋白、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白片度，或免疫球蛋白綴合物。全文摘要本發(fā)明包含表達組成型活性促有絲分裂受體的CHO細胞，獲得這種CHO細胞的方法，和使用本發(fā)明CHO細胞表達異源多肽的方法。文檔編號C12N5/10GK101688181SQ200880021935公開日2010年3月31日申請日期2008年6月25日優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日發(fā)明者E·科佩茨基,R·德蘭格申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司