專利名稱：：用于病毒增殖的兩階段溫度分布的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒增殖領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的病毒增殖是在取決于病毒和用于增殖的宿主體系的特性的溫度條件下進(jìn)行的。選擇特定的溫度用于細(xì)胞的生長(zhǎng)(在細(xì)胞培養(yǎng)基或者胚卵的繁殖中)，接著選定溫度用于病毒的增殖。在大多數(shù)情況下，病毒增殖溫度低于細(xì)胞增殖溫度。對(duì)溫度敏感的病毒增殖涉及到在大約圍繞用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)(隨著例如桿狀病毒產(chǎn)生)的20。C的溫度范圍內(nèi)、以及在用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒制備的直至約37。C的溫度下影響病毒增殖速度和抗原形成，使用對(duì)于每種病毒/寄主細(xì)胞組合的特定的最適條件。更高的溫度會(huì)影響感染動(dòng)力學(xué)和病毒的穩(wěn)定性。當(dāng)病毒在37。C溫度下增殖時(shí)，在后續(xù)的病毒復(fù)制期間會(huì)經(jīng)常觀察到降低的病毒滴度和更低的病毒抗原質(zhì)量。這種影響對(duì)于用于疫苗生產(chǎn)的大規(guī)模病毒增殖可能具有不利的后果。本發(fā)明的目標(biāo)在于提供改善的生長(zhǎng)條件，其不會(huì)影響生產(chǎn)的用于疫苗目的的抗原質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種用于病毒生產(chǎn)的方法，其中，一種以上寄主細(xì)胞被病毒感染，然后在第一溫度下培養(yǎng)(例如，在31。C至37。C的溫度下培養(yǎng)1至48小時(shí))；并且隨后在第二溫度下培養(yǎng)，該第二溫度比第一溫度低(例如，低1至6。C)。然后收集這些培養(yǎng)步驟中所產(chǎn)生的病毒。現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，對(duì)于許多病毒包括流感(正粘病毒)、羅斯河病毒(Alphaviridae)和西尼羅河病毒(黃病毒)，培養(yǎng)條件可以通過使用兩階段溫度分布而被實(shí)質(zhì)性地改進(jìn)。更高的溫度被應(yīng)用于病毒增殖的第一階段，其可促進(jìn)傳染性病毒顆粒的形成。在第二階段，采用較低的溫度，以便維持在更高溫度的增殖期間中獲得的初始高滴度，并且允許穩(wěn)定的抗原的形成，該抗原可以被進(jìn)一步用于免疫原性疫苗的生產(chǎn)。圖1:在Vero細(xì)胞中于(A)32。C和(B)36。C下增殖的新喀里多尼亞(NewCaledonia)病毒的抗原顯帶圖形。圖2:在感染以后在37°C下不同時(shí)間點(diǎn)羅斯河病毒(RossRiverVirus,RRV)感染的NaBr曲線圖。圖3:在感染以后在35。C下不同時(shí)間點(diǎn)羅斯河病毒感染的NaBr曲線圖。圖4:在感染之后在32。C下不同時(shí)間點(diǎn)的羅斯河病毒感染的NaBr曲線圖。圖5:在感染之后在35。C/32。C下不同時(shí)間點(diǎn)的羅斯河病毒感染的NaBr曲線圖。圖6:在37。C和35。C/32。C下感染的羅斯河病毒接種物的Westernblot。圖7:在感染之后在35。C下不同時(shí)間點(diǎn)的西尼羅河病毒感染的NaBr曲線圖，同時(shí)附有顯微圖像。圖8:在感染之后在32。C下不同時(shí)間點(diǎn)的西尼羅河病毒感染的NaBr曲線圖，同時(shí)附有顯微圖像。圖9:在感染之后在35。C/32。C下不同時(shí)間點(diǎn)的西尼羅河病毒感染的NaBr曲線圖，同時(shí)附有顯微圖像。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一個(gè)方面是實(shí)現(xiàn)允許獨(dú)立優(yōu)化和控制下述條件的在此描述的兩階段溫度分布(1)用于寄主細(xì)胞多周期感染的活性病毒的形成；(2)在后續(xù)的復(fù)制階段中獲得高滴度的維持；以及(3)在后續(xù)的生產(chǎn)工藝階段中的抗原形成。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述病毒是正粘病毒、cc-病毒或黃病毒。優(yōu)選病毒是流感病毒，并且在特定的實(shí)施方式中，優(yōu)選選自下組甲型流感和乙型流感、羅斯河病毒和西尼羅河病毒。雖然在此提供的實(shí)施例顯示了通過使用本發(fā)明的兩溫度方法進(jìn)行改進(jìn)的針對(duì)這些病毒的抗原的生產(chǎn)，但本發(fā)明預(yù)期的其他病毒的非限制性例子包括選自于由RNA病毒家族所構(gòu)成的組的病毒，比如呼腸孤病毒(Reoviridae)、小RNA病毒(Picornaviridae)、環(huán)狀病毒(Caliciviridae)、披膜病毒(Togaviridae)、沙#立病毒(Arenaviridae)、反轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviridae)、黃病毒(Flaviviridae)、正禾占病毒(Orthomyxoviridae)、畐U粘病毒(Paramyxoviridae)、本雅病毒(Bunyaviridae)、彈狀病毒(Rhabdoviridae)、纖絲病毒(Filoviridae)、冠狀病毒(Coronaviridae)、星形病毒(Astroviridae)、或波納病毒(Bornaviridae);以及選自于由DNA病毒家族所構(gòu)成的組，比如腺病毒(Adenoviridae)、乳多空病毒(Papovaviridae)、細(xì)小病毒(Parvoviridae)、皰疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒或肝DNA病毒(Hepadnaviridae)。在特定的實(shí)施方式中，病毒選自下組；甲型流感/Panama(巴拿馬)./2007/99、甲型流感/NewCaledonia(新咯里多尼亞)/20/99、乙型流感/Shangdong(商?hào)|)/7/97、乙型流感/Malaysia(馬來西亞)/2506/2004、甲型流感/Hiroshima(廣島)/52/2005、以及甲型流感/SolomonIslands(所羅門群島)/3/2006。能夠在任何適合病毒產(chǎn)生的細(xì)胞中制備出病毒。優(yōu)選細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系。這樣的細(xì)胞可以來自特定的組織或胚細(xì)胞。動(dòng)物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物或鳥。本發(fā)明的各種具體實(shí)施方式可以利用犬科細(xì)胞系、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系、鳥類細(xì)胞系或靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織細(xì)胞系。例如，在特定的實(shí)施方式中，細(xì)胞可以是MDCK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、perC6細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、或其他的通常在病毒增殖中使用的細(xì)胞。在一些特定的實(shí)施方式中，細(xì)胞是上皮細(xì)胞，尤其優(yōu)選腎上皮細(xì)胞，比如非洲綠猴的Vero細(xì)胞。在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，在不包含動(dòng)物血清蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。這樣的培養(yǎng)基不包括，例如，牛血清或其部分，比如胎牛血清。這樣的培養(yǎng)基被稱為"無血清蛋白培養(yǎng)基"。在病毒增殖期間，可以將病毒增殖所必需的蛋白酶比如胰蛋白酶加至培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方式中，這樣的蛋白酶可以由非動(dòng)物來源衍生得到，比如來自細(xì)菌或重組體來源；或者可以由動(dòng)物來源衍生得到。在在此使用的術(shù)語的意義內(nèi)，這樣的補(bǔ)加培養(yǎng)基仍然被認(rèn)為是無血清蛋白培養(yǎng)基。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，該方法在如下規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行大于50升的細(xì)胞培養(yǎng)基、50至100升的細(xì)胞培養(yǎng)基、100至500升的細(xì)胞培養(yǎng)基、500至1000升的細(xì)胞培養(yǎng)基、或者大于1000升的細(xì)胞培養(yǎng)基(例如，在6000升、10,000升、甚至更大的生物反應(yīng)器中進(jìn)行)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法在攪拌罐式生物反應(yīng)器中進(jìn)行。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，第一病毒增殖溫度低于用于給定的寄主細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)增殖溫度。在一些實(shí)施方式中，第一溫度是在32。C至37。C之間，優(yōu)選在33。C至36。C之間，更優(yōu)選在34。C至35.5。C之間，并且尤其優(yōu)選35。C。在其他實(shí)施方式中，第一溫度是在30。C至36。C之間，優(yōu)選在30。C至35。C之間，更優(yōu)選在31。C至35。C之間，更優(yōu)選在31。C至34。C之間，更優(yōu)選在32。C至34。C之間，更優(yōu)選在32。C至33.5。C之間，進(jìn)一步優(yōu)選在33。C和34。C之間，并且最優(yōu)選33.5。C;在一些實(shí)施方式中為33。C。特別地，對(duì)于較大的細(xì)胞培養(yǎng)體積(1000升和更大)，較低的第一溫度范圍可以是優(yōu)選的。第一溫度可以是至少30。C、31。C、32°C、33°C、34°C、35。C、或36。C;或者低于38。C、37.5°C、37°C、36°C、35.5°C、或35°C。在第一溫度下的細(xì)胞培養(yǎng)可以超過1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30小時(shí)；或者少于60、58、56、54、52、50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14或12小時(shí)。在附加的實(shí)施方式中，第二溫度相比第一溫度下降1.5。C至5。C，優(yōu)選下降2°C至4°C，更優(yōu)選下降2.5°C至3.5°C，并且最優(yōu)選下降3°C。溫度可以降低至少1°C、2°C、2.5°C、3°C、或4。C;或者降低小于6°C、5°C、4°C、3.5°C、3°C、2.5°C、或2°C。在其他的實(shí)施方式中，第二溫度的范圍是29°C至35°C，優(yōu)選30°C至34°C，更優(yōu)選31。C至33°C，更優(yōu)選31.5。C至32.5°C，并且最優(yōu)選是32°C。第二溫度可以高于28。C、29°C、30°C、或31。C;或者低于35°C、34°C、33°C或32°C。該方法還可以用于病毒抗原的生產(chǎn)。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)病毒或病毒抗原的方法，其中，按在此描述的方法生產(chǎn)病毒，并且分離病毒或病毒抗原?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離，所述標(biāo)準(zhǔn)方法用于分離并任選地用于提純，包括分解細(xì)胞或者收獲細(xì)胞上清液、然后分離抗原(例如，離心或?qū)游?。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在純化之前或之后使病毒破碎或失活(例如，根據(jù)WO05/11800所述的方法)。另外，可以制備病毒疫苗。疫苗是抗原物質(zhì)的免疫原性組合物，其中，抗原物質(zhì)可以是非傳染性的病毒、其外殼、顆?；蚱淇乖．?dāng)被給藥疫苗時(shí)，其在宿主(例如，哺乳動(dòng)物比如人類，或鳥)中導(dǎo)致免疫作用。疫苗接種或許會(huì)引起對(duì)疫苗的特定反應(yīng)和一些較輕的炎癥，但是與對(duì)于由完全存活的病毒所引起的感染的反應(yīng)相比，通常對(duì)疫苗接種的反應(yīng)被大大降低。以下通過下述實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是示例性的，并非是以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例許多病毒膜蛋白要求翻譯后修飾，以產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒。在流感病毒中，前體血球凝集素(HA)分子(HAO)蛋白水解裂解成HA1和HA2亞基，在HA2的氨基末端區(qū)域處產(chǎn)生致融融合功能區(qū)，該裂解對(duì)于病毒進(jìn)入細(xì)胞而言是必不可少的。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)物中傳染周期的開始不得不被添加的蛋白酶催化。對(duì)于疫苗生產(chǎn)工藝，使用經(jīng)Y射線照射的來自豬來源的胰蛋白酶。普通的用于在細(xì)胞培養(yǎng)物比如Vero細(xì)胞中的流感生長(zhǎng)的溫度分布，是一種其中溫度恒定在例如33°C(對(duì)于乙型流感菌株)至37°C(對(duì)于甲型流感菌株)處的曲線(參見，例如GovorkavaEAetal.JournalofVirology,Vol.70,Nr.8,Aug.1996,p.5519-5524)。本發(fā)明的一個(gè)方面在于，通過10L生物反應(yīng)器系統(tǒng)的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)在初始傳染階段期間升高的溫度分布，這對(duì)于流感生產(chǎn)工藝總體周期時(shí)間而言具有積極的效果。另外，可以得到在測(cè)量為Vero蛋白質(zhì)/SRD比率的抗原純度上的積極效果。為證明這些思想，按照在此描述的方法，進(jìn)行100L規(guī)模實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1:在32和36°C下的甲型流感/NewCaledonia/20/99生產(chǎn)在32°C下和在36°C下生物反應(yīng)器操作的Vero培養(yǎng)物用甲型流感/NewCaledonia/20/99病毒感染。設(shè)定的參數(shù)pH、p02、細(xì)胞密度以及加至培養(yǎng)物的胰蛋白酶含量相似，并且反映了用于流感抗原生產(chǎn)的大規(guī)模條件。上升的溫度對(duì)病毒產(chǎn)率和周期時(shí)間的影響進(jìn)行比較，結(jié)果見表l。表l:HA和殘留攝氧率(("殘留OUR")，與第0天的傳染周期*相比)的對(duì)比。溫度HAHA殘留OUR殘留OUR第2天第3天(%)*第2天(%)*第3天(2nHAU/50nL)(2nHAU/50^iL)32。C68805036°C7820<5在兩天后，觀察到36。C培養(yǎng)物的殘留攝氧率為20W，其比第3天低5%。在36。C下流感病毒的增殖導(dǎo)致高傳染性、以及因此與32。C條件下相比總培養(yǎng)時(shí)間的減少。相反，32。C培養(yǎng)導(dǎo)致分別在第2天和第3天更高的80%和50%殘留攝氧率。最終的HA滴度是相似的。然而，從經(jīng)過具有NaBr梯度的超速離心的抗原分離實(shí)驗(yàn)來看，顯帶圖形的抗原性轉(zhuǎn)變?cè)?6。C條件下在培養(yǎng)第3天出現(xiàn)(圖1B)，反之通過UV254nm檢測(cè)器測(cè)量的洗脫分布導(dǎo)致32。C培養(yǎng)下同等高的、但更對(duì)稱的波峰(圖1A)。就產(chǎn)品產(chǎn)率、尤其純度而言，36。C的條件可能因此具有一些缺點(diǎn)。對(duì)于當(dāng)前的生產(chǎn)工藝，由蔗糖梯度來收獲病毒抗原。對(duì)于36。C實(shí)驗(yàn)，可以因此推斷部分抗原將遷移至低密度部份(圖1B)。實(shí)施例2:在32、33、以及34。C下的甲型流感/Panama/2007/99生產(chǎn)8為了研究提高的培養(yǎng)溫度對(duì)Panama病毒產(chǎn)率和周期時(shí)間的影響，并行操作三個(gè)10L生物反應(yīng)器系統(tǒng)，溫度分別設(shè)置在32。C，33。C和34。C。所有其他的參數(shù)設(shè)置點(diǎn)與實(shí)施例1中描述的相似。在表2中，提供了三個(gè)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的工藝周期時(shí)間。在達(dá)到20%殘留攝氧率(代謝耗氧量減小80%)之后，停止培養(yǎng)，并且比較傳染周期動(dòng)力學(xué)。對(duì)于34。C實(shí)驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn)周期時(shí)間減少21小時(shí)(hrs)。表2:要求達(dá)到20%殘留攝氧率的作為工藝溫度函數(shù)的工藝時(shí)間的對(duì)比(與傳染周期第0天相比)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將培養(yǎng)上清液離心，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案用Benzonase核酸酶和福爾馬林處理。失活的收獲物(MVHs)通過蔗糖梯度超速離心法進(jìn)行純化(參見表3)。表3:由來自溫度實(shí)驗(yàn)的蔗糖梯度純化病毒所獲得的甲型流感/Panama/2007/99抗原產(chǎn)率、SRD/蛋白質(zhì)比率和Vero-蛋白質(zhì)雜質(zhì)的對(duì)比。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表2中可以得出結(jié)論升高的溫度條件導(dǎo)致減少的周期時(shí)間。然而，如表3所示，升高的溫度條件(例如，33。C和34。C)對(duì)總體病毒抗原產(chǎn)率和純化的病毒的質(zhì)量具有消極影響，如同通過SRD/蛋白質(zhì)比率和Vero-蛋白質(zhì)/SRD比率驗(yàn)證的那樣。因此觀察到在更高溫度下病毒抗原下降的純度。實(shí)施例3:具有在35。C下早期病毒擴(kuò)增的甲型流感/NewCaledonia/20/99生產(chǎn)該實(shí)施例涉及的培養(yǎng)試驗(yàn)中，對(duì)于流感病毒生產(chǎn)工藝的第一個(gè)24小時(shí)設(shè)置為提高的溫度。在100升規(guī)模處用甲型流感/NewCaledonia/20/99病毒感染Vero細(xì)胞培養(yǎng)物。普通的溫度分布(即，整個(gè)發(fā)酵工藝的32。C溫度設(shè)置點(diǎn))與具有在35。C下的早期病毒擴(kuò)增的改進(jìn)工藝的對(duì)比被進(jìn)行。該新工藝的特點(diǎn)在于在35。C下初始病毒復(fù)制24小時(shí)感染后(postinfection,p丄)，接著在32°C下培養(yǎng)直到91hrs感染后。在表4中，給出了來自100升規(guī)模操作的蔗糖梯度純化病毒的甲型流感/NewCaledonia/20/99抗原純度(SRD/蛋白質(zhì)比率)和Vero-蛋白質(zhì)雜質(zhì)的對(duì)比。表4:甲型流感/NewCaledonia/20/99抗原純度(SRD/蛋白質(zhì)比率)和Vero-蛋白質(zhì)雜質(zhì)作為不同的溫度分布的的函數(shù)的對(duì)比。使用蔗糖梯度來純化來自溫度實(shí)驗(yàn)的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>病毒復(fù)制的第一個(gè)24小時(shí)期間在35。C下、隨后溫度降低至32。C的甲型流感/Panama/2007/99病毒生產(chǎn)與當(dāng)前的32。C恒溫工藝相比具有數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一般來講，流感病毒抗原的質(zhì)量可以得到改善，如同被SRD/蛋白質(zhì)比率和Vero-蛋白質(zhì)/SRD比率證實(shí)的那樣。隨著感染時(shí)間的明顯下降，產(chǎn)率略微較低，但是雜質(zhì)分布明顯更好，尤其是對(duì)于Vero細(xì)胞蛋白質(zhì)的相對(duì)含量而言。流感病毒抗原純度在流感疫苗生產(chǎn)中是個(gè)因素。普遍接受的是，對(duì)于在Vero細(xì)胞中流感病毒的復(fù)制，用于前體血球凝集素裂解的蛋白水解條件和適當(dāng)?shù)臏囟葪l件是一些重要因素。在本發(fā)明的示例性實(shí)驗(yàn)中，表明在病毒復(fù)制早期階段期間具有升高的溫度的溫度分布導(dǎo)致在蔗糖梯度步驟中抗原的改進(jìn)。另外，就周期時(shí)間而論，第一個(gè)24小時(shí)在35°C下的流感病毒生產(chǎn)對(duì)應(yīng)于更好的工藝性能。甲型流感/Panama/2007/99和甲型流感/NewCaledonia/20/99被用作模型體系，用于證明兩溫度病毒增殖是有用的。以10和100升規(guī)模進(jìn)行的培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示了病毒增殖工藝的第一個(gè)24小時(shí)由32°C改變?yōu)?5°C的益處。實(shí)施例5:在35°C下早期病毒擴(kuò)增18hrsp丄的甲型流感/Hiroshima/52/2005生產(chǎn)比對(duì)在35°C卜—36hrsp丄、接著32°C直至病毒增殖結(jié)束的甲型流感/Hiroshima/S2/200S生產(chǎn)該實(shí)施例顯示了高溫周期持續(xù)時(shí)間的變化對(duì)50L被甲型流感/Hiroshima/52/2005病毒感染的Vero培養(yǎng)物的抗原產(chǎn)率、SRD/蛋白質(zhì)比率、以及Vero蛋白質(zhì)/SRD比率的影響。對(duì)于兩個(gè)單獨(dú)的樣本，在溫度下降至32。C以前，35。C溫度分別地保持18hrsp.i.和36hrsp丄。對(duì)包含病毒的上清液進(jìn)行收獲、失活、并通過超速離心進(jìn)行純化。在表6中，比較了來自50升規(guī)模操作的蔗糖梯度純化病毒的甲型流感/Hiroshima/52/2005抗原純度(SRD/蛋白質(zhì)比率)禾QVero-蛋白質(zhì)雜質(zhì)。表6:甲型流感/Hiroshima/52/2005抗原產(chǎn)率、純度(SRD/蛋白質(zhì)比率)和Vero-蛋白質(zhì)雜質(zhì)的對(duì)比。使用蔗糖梯度來純化來自溫度實(shí)驗(yàn)的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在35。C下18hrsp.i.和36hrsp丄的甲型流感/Hiroshima/52/2005病毒生產(chǎn)分別得到類似的產(chǎn)率和純度分布(表6)。從該結(jié)果看，可得出如下結(jié)論在早期病毒增殖期間提高的溫度的持續(xù)時(shí)間和降低溫度直至收獲的持續(xù)時(shí)間能在兩階段溫度分布中被較大地改變。實(shí)施例6:在不同溫度(34°C，35T和36。C)下早期病毒擴(kuò)增18hrsp丄、接著降低3。C(至31。C，32。C和33。C)直至病毒增殖結(jié)束的乙型流感/Malaysia/2506/2004生產(chǎn)該實(shí)施例涉及在32升至80升Vero培養(yǎng)物的病毒增殖期間不同的兩階段溫度分布的應(yīng)用，所述培養(yǎng)物用乙型流感/Malaysia/2506/2004病毒感染。在降低3。C以前(即，分別為31。C、32°C、以及33。C)，較高溫度34。C、35。C和36。C保持18hrsp丄。對(duì)包含病毒的上清液進(jìn)行收獲、失活、并通過超速離心進(jìn)行純化。在表7中，比較了不同溫度分布下的來自32升至80升規(guī)模操作的蔗糖梯度純化病毒的乙型流感/Malaysia/2506/2004抗原產(chǎn)率、純度(SRD/蛋白質(zhì)比率)和Vero-蛋白質(zhì)雜質(zhì)。表7:乙型流感/Malaysia/2506/2004抗原產(chǎn)率、純度(SRD/蛋白質(zhì)比率)和Vero-蛋白質(zhì)雜質(zhì)的對(duì)比。使用蔗糖梯度來純化來自溫度實(shí)驗(yàn)的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在34。C至36。C下18hrsp.i.、接著降低3。C直到病毒增殖結(jié)束的乙型流感/Malaysia/2506/2004病毒的生產(chǎn)得到類似的產(chǎn)率和純度分布(表7)。從該結(jié)果看，可得出如下結(jié)論在早期病毒增殖期間提高的溫度的范圍和降低溫度直至收獲時(shí)間的范圍能在兩階段溫度分布中被較大地改變。實(shí)施例7:在不同溫度(33.5。C,35。C和36.5。0下早期病毒擴(kuò)增18hrsp丄、接著降低3。C(至30.5。C,32。C和33.5。C)直至病毒增殖結(jié)束的甲型流感/SolomonIslands/3/2006生產(chǎn)該實(shí)施例涉及在32升至50升Vero培養(yǎng)物的病毒增殖期間不同的溫度分布的應(yīng)用，所述培養(yǎng)物用甲型流感/SolomonIslands/3/2006病毒感染。在降低3°C(即，分別為30.5。C、32。C禾卩33.5。C)以前，較高的溫度33.5。C、35。C和36.5。C保持18hrsp.i.。對(duì)包含病毒的上清液進(jìn)行收獲、失活、并通過超速離心進(jìn)行純化。在表8中，比較了來自32升至50升規(guī)模操作的蔗糖梯度純化病毒的甲型流感/SolomonIslands/3/2006抗原產(chǎn)率、純度(SRD/蛋白質(zhì)比率)和Vero-蛋白質(zhì)雜質(zhì)。表8:甲型流感/SolomonIslands/3/2006抗原產(chǎn)率、純度(SRD/蛋白質(zhì)比率)和Vero隱蛋白質(zhì)雜質(zhì)的對(duì)比。使用蔗糖梯度來純化來自溫度實(shí)驗(yàn)的病毒。生產(chǎn)條件產(chǎn)率(mgSRD/L收獲物)SRD/蛋白質(zhì)比率(mg/mg)Vero-蛋白質(zhì)/SRD比率(mg/mg)36.5。C下18hrsp.i./33.5。C直至結(jié)束(54hrsp丄)(32L生物反應(yīng)器)4.00.530.0535。C下18hrsp.i./32°C直至結(jié)束(55hrsp.i.)(50L生物反應(yīng)器)3.20.720.0333.5°C下18hrsp.i./30.5。C直至結(jié)束(69hrsp.i.)(50L生物反應(yīng)器)3.00.740.02分別在33.5。C、35。C、以及36.5。C下18hrsp.i.、接著降低3。C直至病毒增殖結(jié)束的甲型流感/SolomonIslands/3/2006病毒生產(chǎn)得到類似的產(chǎn)率和純度分布(表8)。在升高的溫度下的更高產(chǎn)率還得到降低的純度，然而，隨著降低3。C在病毒增殖的未尾，這些雜質(zhì)保持在相對(duì)低的水平。使用具有降低的溫度的兩階段溫度分布(例如33.5°C/30.5°C)，能夠取得類似的產(chǎn)率。然而需要更長(zhǎng)的病毒增殖周期時(shí)間(仍然少于70hrs)方可達(dá)到這些類似的產(chǎn)率。純度分布，尤其對(duì)于寄主細(xì)胞特異性的Vero-蛋白質(zhì)，隨著較低的溫度范圍(包括3。C溫度變化)而被典型地改進(jìn)(參見表7中在34。C/31。C下乙型流感/Malaysia的結(jié)果)。從該結(jié)果看，可得出如下結(jié)論對(duì)于甲型流感和乙型流感兩類菌株，在早期病毒增殖期間提高的溫度的范圍和降低溫度直至收獲時(shí)間的范圍能在兩階段溫度分布中被較大地改變。實(shí)施例8:羅斯河病毒生產(chǎn)在2L反應(yīng)器中于不同溫度下生產(chǎn)羅斯河病毒("RRV")。研究的溫度是37°C、35。C、32°C以及35。C下30hrs和30hrs后32。C下直至感染結(jié)束。在90hrsp丄之后，確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并且在下述時(shí)間間隔(單位小時(shí))處收集樣本1-18、1-42、1-42、1-54、1-66、I-76和I-卯。用于NaBr分析的樣本用20nL/mL福爾馬林1.85%處理，并且于37。C下保溫48hrs。在病毒增殖期間測(cè)量殘留攝氧率(OUR)，以便監(jiān)控受感染細(xì)胞的代謝活性。通過微載體培養(yǎng)物的顯微圖像來定量細(xì)胞脫附率(celldetachmentrate)。還確定了TCID50(50%組織培養(yǎng)感染劑量)。實(shí)驗(yàn)條件是，在感染前，pH7.1的PBS和20。/。pO2、1.0g/L葡萄糖。在1-18時(shí)加入1.0g/L葡萄糖，并且停止灌注。在I-42后，如果葡萄糖降低到小于1.0g/L，則加入葡萄糖。結(jié)果如表9所示。離心情況1-18:5000g;I-42I-66:10000g;I-78I-90:15000g。14表9:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>所有四個(gè)培養(yǎng)的NaBr曲線圖以4個(gè)間隔時(shí)間(A:54h;B:66h;C:78h;D:90h)顯示于圖2至5中。用下述抗體進(jìn)行Westernblot:(I)RR(ATCCVR373)，超免疫腹水液，小鼠；N.I.H.(1:1000);以及(2)抗小鼠IgG，Sigma,Cat#:A-4656,Lot#:63H8830(1:5000)。結(jié)果根據(jù)表10提供于圖6中。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在兩個(gè)高溫(37。C和35。C)下的接種中，感染動(dòng)力學(xué)相當(dāng)大地增加，同時(shí)在42hrs后細(xì)胞脫離比率為100%，并且在53hrs之后殘留的02為大約50%。在較低溫度(32。C和35。C/32。C)下的方法相對(duì)較慢。這在1-18時(shí)的滴度分析中也是顯而易見的。然而，在I-42以后，所有的方法都達(dá)到大約1E09TCID50/mL。在較低溫度下的方法顯示出接近感染結(jié)束時(shí)更穩(wěn)定的滴度(>lEO9TCID50/mL，直至1-76)。在兩種方法中，直至1-76，能夠測(cè)量出20%的殘留OUR。在所有的實(shí)驗(yàn)中，在I-53以后，達(dá)到在NaBr梯度中的最大峰高。反之，在35。C接種中，對(duì)于所有的1-66樣本以及1-90樣本，測(cè)量出較低的波峰。因?yàn)闇囟鹊奶岣?，使得?7。C和35。C實(shí)驗(yàn)期間葡萄糖水平下降更快。因?yàn)楦腥緞?dòng)力學(xué)的提高，后來沒有代謝活性是可測(cè)定的。在所有的實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖水平最后都類似。開始時(shí)快速的病毒增殖并且直至感染結(jié)束時(shí)的穩(wěn)定的滴度僅在兩階段溫度實(shí)驗(yàn)G5。C直至I-30，然后32。C)期間被建立。在這些條件下，在NaBr梯度實(shí)驗(yàn)中測(cè)量到最高波峰，其直至I-78時(shí)也是穩(wěn)定的。而且，對(duì)于35°C/32。C實(shí)驗(yàn)，在Westernblot中檢測(cè)到更多穩(wěn)定的條帶。實(shí)施例9:西尼羅河病毒實(shí)驗(yàn)在2L反應(yīng)器中于不同溫度下生產(chǎn)西尼羅河病毒。研究的溫度是35°C、32。C、以及35。C下30hrs和30hrs后32。C直至感染結(jié)束。收集90h內(nèi)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在下述時(shí)間間隔處(單位為hrs)收集樣本1-18、1-30、1-42、1-42、1-52、1-66、1-74以及1-90。用于NaBr分析的樣本用20uL/mL福爾馬林1.85%處理，并且在37°C下保溫48hrs。條件是，在感染前pH7.1，20%pO2，以及1.0g/L葡萄糖。在1-18時(shí)加入1.0g/L葡萄糖，并且停止灌注。結(jié)果提供在表ll中，并且圖7-9顯示了NaBr曲線圖和顯微圖像。通過微載體培養(yǎng)物的這些顯微圖像來定量細(xì)胞脫附率。表11:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于生產(chǎn)病毒的方法，該方法包括提供已經(jīng)被病毒感染的寄主細(xì)胞；在31℃至37℃的第一溫度下培養(yǎng)感染的寄主細(xì)胞1至48小時(shí)；隨后在比所述第一溫度低1℃至6℃的第二溫度下培養(yǎng)感染的寄主細(xì)胞；以及收集上述培養(yǎng)步驟中所產(chǎn)生的病毒拷貝。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒是正粘病毒、ot-病毒或黃病毒。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述病毒選自下組甲型流感和乙型流感。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是羅斯河病毒。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是西尼羅河病毒。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述寄主細(xì)胞來自動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述寄主細(xì)胞是上皮細(xì)胞。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述寄主細(xì)胞是腎上皮細(xì)胞。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述寄主細(xì)胞是Vero細(xì)胞。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一溫度的范圍為32。C至37。C。12.如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述第一溫度的范圍是33。C至36。C。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一溫度的范圍是34。C至35.5。C。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二溫度比所述第一溫度低1.5。C至5。C。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二溫度比所述第一溫度低2。C至4。C。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二溫度的范圍是29。C至35。C。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述第二溫度的范圍是30。C至34。C。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述第二溫度的范圍是31。C至33。C。19.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述寄主細(xì)胞在接種以后直接培養(yǎng)。20.—種用于生產(chǎn)病毒或病毒抗原的方法，其中，由如權(quán)利要求1所述方法生產(chǎn)出來的病毒獲得所述產(chǎn)生的病毒或病毒抗原，并且分離所述產(chǎn)生的病毒或病毒抗原。21.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒被破碎。22.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒被失活。23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括制備所述病毒的疫苗的步驟。24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述在第一溫度下的培養(yǎng)是至少兩個(gè)小全文摘要本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)病毒的方法，該方法包括提供已經(jīng)被病毒感染的寄主細(xì)胞并且在兩種不同溫度下培養(yǎng)被感染的寄主細(xì)胞。隨后收集培養(yǎng)步驟中所產(chǎn)生的病毒。通過使用兩階段溫度培養(yǎng)工藝，可以得到高滴度和改進(jìn)的純度。文檔編號(hào)C12N7/02GK101688186SQ200880021212公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年4月30日優(yōu)先權(quán)日2007年5月4日發(fā)明者利奧波德·格里伯格,曼弗雷德·賴特,沃爾夫?qū)っ商厣暾?qǐng)人:巴克斯特國(guó)際公司;巴克斯特保健股份有限公司