專利名稱：：用于病毒純化用連續超速離心的糖溶液配方的制作方法
技術領域：
：本發明涉及病毒純化領域。
背景技術：
：病毒，無論是自然出現的還是其重組體，皆可用于疫苗接種和基因治療領域。許多病毒或類病毒粒子可以安全并有效地在寄主細胞中增殖。有數種公開出版物描述了從寄主細胞中提純病毒的技術，主要集中于特異性的層析基質的應用，用于由寄主細胞裂解物純化病毒(參見，例如，美國專利No.6,008,036)。描述的其他方法，例如，在美國專利No.6,048,537中描述的方法使用了連續式庶糖梯度離心，其提供的產品具有較小的抗原純度，并且要求進一步通過離心提純的步驟。這些方法也還遭受抗原聚集之患，這可以導致病毒抗原的損失，或者抑制病毒失活步驟。病毒聚集還可能會抑制層析工藝的產率，其時間和成本要求高，難以適合于大規模生產。因此，本發明的目標在于提供一種純化病毒、尤其是從寄主細胞樣本中純化病毒的方法，其比較簡單，但仍能以高純度提供全病毒抗原組分，同時減少病毒抗原聚集。圖1:用普通的超速離心工藝(圖la)和本發明的超速離心工藝(圖lb)純化的PMVHs的顯微照片。
發明內容本發明提供一種用于提純病毒或病毒抗原的方法，其包括提供病毒制品并在糖梯度中離心所述病毒制品，其中該糖梯度是由在緩沖水溶液中的濃度為蔗糖當量34%至50%(w/w%)的第一糖層A和濃度為蔗糖當量50。/。至65%(w/w%)的第二糖層B所建立的，緩沖水溶液中的一種緩沖劑成分是pKa值為6.0~9.4的緩沖劑成分；以及從離心液中收集所述病毒或病毒抗原，即，離心方法的產物。本發明的一個方面在于提供一種提純病毒或病毒抗原的方法。該方法涉及到提供包含糖梯度的溶液，所述糖梯度是通過離心至少一種第一緩沖糖溶液和至少一種第二緩沖糖溶液而建立的。在第一緩沖糖溶液中的糖濃度具有35%至50%(w/w%)的蔗糖當量；在特定的實施方式中，蔗糖當量為34%至46%(w/w%)。在第二緩沖糖溶液中的糖濃度具有50%至65%(w/w%)的蔗糖當量；在特定的實施方式中，蔗糖當量為50%至60%(w/w%)。一旦建立起糖梯度，就將病毒制品加至該糖梯度。然后將病毒制品和糖梯度離心以得到波峰匯集液(peakpool)，并且萃取波峰匯集液以得到病毒或病毒抗原。具體實施例方式在病毒或病毒抗原提純期間，通過離心濃縮病毒或病毒抗原，從而使其與細胞培養基成分和/或寄主細胞和寄主細胞成分相分離。本發明的方法能夠在提純的離心步驟中使病毒聚集和病毒損失最小化。在本發明的方法中，通常將生理學緩沖液中的第一糖溶液垂直地加載入連續超速離心裝置，從而形成水平的糖溶液層A;然后將在相同或不同的生理學緩沖液中的更高濃度的第二糖溶液加載入該裝置，從而形成水平的糖溶液層B。然后啟動該裝置，形成糖梯度。最大濃度在裝置的外壁，并且濃度朝向裝置的中心逐漸變小。然后將來自細胞培養物的包含病毒的收獲液加載入裝置中，并且病毒顆粒會遷移到糖梯度中的位置，在該位置它們的密度與梯度密度相等。當糖是蔗糖時，出現該平衡的典型密度范圍是36%-48%(Ww%)蔗糖。一旦裝置停止，該梯度會向水平位置移動，并且該包含病毒顆粒的梯度部分(或者"波峰匯集液)"將從裝置中被抽出。本發明的一個方面是一個令人驚奇的發現，與慣常的利用單一濃度蔗糖水溶液從而形成蔗糖梯度的方法相比，其通過利用雙層溶液的方法，能夠增加波峰匯集液的體積。即使使用蔗糖、并且梯度中的最大蔗糖濃度與在常規方法中使用的相同，也能得到這一令人驚奇的效果。通過優化兩個蔗糖溶液層A和B的濃度和含量，能夠增加波峰匯集液體積，例如，增加兩倍。通過減小全病毒顆粒或抗原各自的濃度，該增加的波峰匯集液體積可減少它們的聚集。連續超速離心工藝對于病毒制品的提純是有用的。高濃度的糖(例如，蔗糖或山梨糖醇)或者鹽(例如CsCl2或NaBr)的溶液能夠被用于通過超速離心法產生梯度。然而，不含任何添加劑的糖溶液具有低濃度的電解質并且沒有緩沖能力。因此，本發明的一個方面是獲得如下認識糖溶液比如蔗糖溶液中的病毒制品，取決于病毒顆粒的濃度，6其具有較強的形成聚集體的傾向，這會在用于疫苗生產的進一步加工中造成問題。通過使用糖溶液(例如，55%w/w的蔗糖溶液)外加生理學濃度的鹽(例如，約4-8g/kg的NaCl)以及外加緩沖液(例如，大約10-20mmol/kg的Tris，接著調節pH)、從而在梯度中獲得生理學的電解質以及pH條件，本發明的方法能夠有效地使這些問題最小化。在特定的實施方式中，不同的糖溶液被應用以在超速離心機中構造梯度。作為實施例，將200mL的55%w/w溶液和800mL的42%w/w溶液加載至超速離心機。較小量的較高濃度的蔗糖溶液可確保在超速離心的未尾，最大蔗糖濃度保持在高于45%;并且大量的42%蔗糖可得到在約40%的范圍內更平緩的梯度，在該處會典型地出現病毒波峰最大值。通過本發明的這些方法，能夠增加波峰匯集液的體積，并且因此將病毒顆粒懸浮液稀釋并導致較少的聚集。而且，通過使用這樣的蔗糖配方，分子或顆粒在加載至超速離心機的上清液與梯度之間的擴散被改進。舉例來說，使用在20mmol/kgTris-緩沖液中大約42%和55%(w/w%)的蔗糖溶液形成的密度梯度被發現對于流感病毒是特別有用，但還可以容易地適用于其他病毒。對于pH為6.5至9.7的范圍，Tris(三羥甲基氨基甲烷)是有用的緩沖劑。雖然在本發明的具體實施方式中的這一特別的實施例中使用蔗糖，但可以使用適合于梯度離心的其他糖。另外，可以使用其他的緩沖化合物、尤其是有機緩沖化合物比如胺類。優選緩沖液的pKa值高于6、6.2、6.4、6.6、6.8、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0，并且低于9.4、9.2、9.0、8.8、8.6、8.4或8.2。合適的緩沖劑包含例如HEPES(4-(2-羥乙基)-l-哌嗪乙烷磺酸)、ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸)、二-tris-甲烷或-丙烷、CAPS(N-環己基-3.氨基丙垸磺酸)或CAPSO、PIPES(哌嗪-N，N'-二(2-乙基磺酸))、磷酸鹽緩沖劑、或者任何其他在生物化學領域中使用的緩沖劑。該緩沖劑優選對于生物分子是化學惰性的。該離心方法能夠產生波峰匯集液組分，其中在就電解質和pH條件而言的生理條件下，病毒顆粒被分散。在波峰匯集液組分中全病毒抗原的濃度能夠通過加入不同量的高濃度和低濃度糖溶液而改變，以便限定梯度并因此限定波峰組分的體積。另外，通過單獨添加鹽和合適的緩沖液(例如，Tris-緩沖鹽水(TBS))也可增加波峰組分的體積，導致抗原和蛋白質的明顯更高的產率。這一效果或許應歸因于預料不到的提高的蛋白質和病毒抗原進入包含生理學濃度的鹽和生理學pH的糖梯度的流動性。不同的超速離心條件(例如，有和沒有預澄清器以及不同的重力荷載)清楚地顯示，通過蔗糖梯度的這些改變，能夠實現顯著的產率提高和病毒顆粒聚集的減少。7優選添加的電解質大于50mOsm/kg、100mOsm/kg、150mOsm/kg、200mOsm/kg或250mOsm/kg，并且小于500mOsm/kg、450mOsm/kg、400mOsm/kg或350mOsm/kg，優選約300mOsm/kg。應注意，在不進行范霍夫斯(van'tHoffs)因子矯正的情況下，將電解質含量計算轉換為等效的水溶液滲透壓。另外，梯度形成物質(例如，蔗糖)的貢獻未被用于計算。例如，來自電解質的滲透壓計算如下8gNaCl/kg/58.44g/mo1=136.9mmol/kgx2(個離子/mol)=273.8mOsm/kg+20mM/kgTRISx2個離子/mol=40mOsm/kg;總計(NaCl+TRIS)313.8mOsm/kg)。pH值能夠在生理學范圍內，優選在5.5和9.5之間；更優選在5.5和8.5之間；尤其優選高于5.5、6、6.5或7并且低于9.5、9.0、8.5、8或7.5;尤其優選在7.0和7.5之間或者在7.0和7.4之間。在尤其優選的實施方式中，用于產生密度梯度的糖是蔗糖。然而，本發明預期還可使用其他糖，包括醇類糖在內。其非限制性的實施例是山梨糖醇。另外，本發明預期可使用氫化糖、線性糖、改性糖或任何其他糖，只要該糖的水溶性足以產生具有在此限定的密度的溶液即可。在相同層或不同層中的糖的組合(即，兩種以上的糖)也可以被用于產生在此描述的梯度，只要組成那些層的對應的糖溶液具有在此限定的密度即可。在優選的實施方式中，梯度形成制品的體積相對于超速離心轉子或對樣本施加離心力的裝置的有效體積的比率是在5%至100%之間，優選高于5%、10%、15%、20%、25%、30%、32°/。、35%、40%、45%或50%,或低于100%、90%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、48%、45%、40%、35%、30%或25%。在其他實施方式中，梯度形成制品的體積相對于超速離心轉子或對樣本施加離心力的裝置的有效體積的比率是在1%至75%之間。在優選的實施方式中，包含梯度形成材料的轉子的加載以連續地或者間斷地重復方式進行(即，或者連續超速離心，或者分批超速離心)，其中加載體積優選是高于轉子的空體積(總體積減去梯度體積)，優選大于1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍或低于300倍、250倍、200倍、150倍、120倍、100倍、80倍。在特定的優選實施方式中，使用連續超速離心。在尤其優選的實施方式中，加載體積是在20L至50L/每600mL至1000mL空體積(1600mL轉子體積減去600mL至1000mL空體積)之間，為約20倍至80倍的比率。在另一個實施方式中，加載體積是在40L至100L/每1200mL至2000mL空體積(3200mL轉子體積減去1200mL至2000mL空體積)之間，為約20倍至80倍的比率。8在離心期間，糖的連續梯度被建立。在另一個實施方式中，一小部分離心液被收集，該部分的蔗糖濃度高于24%(相當于約1.10kg/L)、26%、28%、30%、32%、34%、36%、38%、40%、42%、44%或46%(w/w%)(相當于約1.22kg/L)，并且小于66%(相當于約1.32kg/L)、63%、60%、58%、56%、54%、52%、50%、48%、46%、44%或者42%(w/w%)(相當于約1.19kg/L)。一般來講，病毒產物累積在該范圍內。優選一小部分離心液被收集，其蔗糖濃度在約30%和54%(w/w%)之間，更優選在36%和48。/。(w/w。/。)蔗糖之間。從由其他糖形成的梯度中收集的組分可以具有不同的濃度(w/w%)、但具有等效的密度。收集的組分的密度可以高于1.10kg/L、1.12kg/L、1.14kg/L、1.16kg/L或1.18kg/L、1.20kg/L、1.22kg/L，并且低于1.32kg/L、1.30kg/L、1.28kg/L、1.26kg/L、1.24kg/L、1.22kg/L或1.20kg/L。在尤其優選的實施方式中，密度可以在1.13禾口1.25kg/L之間，更優選在1.16禾Q1.22kg/L之間。在特定的實施方式中，緩沖液或緩沖劑成分(例如，Tris緩沖液鹽水)的濃度是2mmol/kg至50mmol/kg，優選5mmol/kg至40mmol/kg、10mmol/kg至40mmol/kg，更優選在10mmol/kg至30mmol/kg之間，更優選在18mmol/kg至25mmol/kg之間，并且最優選是20mmol/kg。該緩沖液優選是水溶液，具有小于5%的可與水混溶的有機溶劑，更優選小于2%的有機溶劑，并且最優選不含有機溶劑。緩沖液的濃度高于2mmol/kg、5mmol/kg、10mmol/kg、12mmol/kg、14mmol/kg、15mmol/kg、17mmol/kg、18mmol/kg、19mmol/kg或20mmol/kg，或低于50mmol/kg、40mmol/kg、35mmol/kg、30mmol/kg、25mmol/kg、23mmol/kg或21mmol/kg。優選離心能夠以至少20,000g、更優選30,000g、更優選50,000g、更優選70,000g、最優選90,000g的離心力進行。但是在其他的實施方式中，離心力小于200,000g、小于150,000g、小于120,000g、小于100,000g、或小于90,000g。在特別優選的實施方式中，初始層A對初始層B(g卩，在施加病毒制品之前)的體積比是在20:1至1:1之間、優選在10:1至1.5:1之間、更優選在8:1至2:1之間、進一步優選在6:1至3:1之間，并且最優選4:1。該比率可以小于20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、4:1、3:1，或者大于1:2、1:1、1.5:1、2:1、3:1或4:1。在尤其優選的實施方式中，含糖離心液是雙層的(即，在病毒制品添加之前，包含不同濃度的糖層A和B，在超速離心中在液體填充層的下面)。當然，在離心期間，可以形成新的濃度梯度或密度梯度。然而，本發明還預期離心液體具有超過兩個層。例如，在特定的非限制性實施方式中，離心液體由3、4、5、6、7甚至8個不同的層組成。每一個層都可以具有與其它層相同的緩沖液，或者每個層的緩沖液都可以獨立地選擇。在尤其優選的實施方式中，制備方法不包含預澄清步驟。然而，如需要，可以在超速離心法裝置的預澄清腔室中進行預澄清。在另一種實施方式中，層A包含在40。/。至44。/。(w/w%)之間的蔗糖、優選41%至43%(w/w%)的蔗糖。蔗糖濃度可以高于35%(相當于約1.15kg/L)、36%、37°/。、38%、39%、40%、41%或42%(w/w%)(相當于約1.19kg/L)，或者低于50%(相當于約1.23kg/L)、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%或42%(w/w%)(相當于約1.19kg/L)。由另一種糖形成的層A可以具有基于重量/重量單位的不同的濃度，但是該層A的密度落入在此限定的密度范圍內。在特定的實施方式中，層B包含的蔗糖溶液的濃度在50%至65%(w/w%)之間，優選在52%至58%(w/w%)之間，并且更優選在54%至56%(w/w%)之間。蔗糖濃度(w/w%)可以高于50%(相當于約1.23kg/L)、51%、52%、53%、54%或55%(相當于約1.26kg/L)，或者低于66%(相當于約1.32kg/L)、64%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%或55%(相當于約1.26kg/L)。由其他的糖形成的層B可以具有基于重量/重量單位的不同的濃度，但是該層B的密度落入在此限定的密度范圍內。在本發明的一種優選實施方式中，病毒是正粘病毒，特別是流感病毒，優選選自下組甲型流感和乙型流感。本發明預期的其他非限制性的病毒的例子包括選自于由RNA病毒家族所構成的組的病毒，比如呼腸孤病毒(Reoviridae)、小RNA病毒(Picornaviridae)、環狀病毒(Caliciviridae)、披膜病毒(Togaviridae)、沙粒病毒(Arenaviridae)、反轉錄病毒(Retroviridae)、黃病毒(Flaviviridae)、正粘病毒(Orthomyxoviridae)、畐U禾占病毒(Paramyxoviridae)、本雅病毒(Bunyaviridae)、彈狀病毒(Rhabdoviridae)、纖絲病毒(Filoviridae)、冠狀病毒(Coronaviridae)、星形病毒(Astroviridae)、波納病毒(Bornaviridae);以及選自于由DNA病毒家族所構成的組的病毒，比如腺病毒(Adenoviridae)、乳多空病毒(P叩ovaviridae)、細小病毒(Parvoviridae)、皰疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒(Poxviridae)、肝DNA病毒(Hepadnaviridae)。在特定的優選實施方式中，病毒選自下組甲型流感/Panama(巴拿馬)/2007/99、甲型流感/NewCaledonia(新喀里多尼亞)/20/99、以及乙型流感/Shangdong(商東)/7/97。在本發明的一些實施方式中，病毒收獲物是由用病毒接種的細胞制備而來的。能夠在任何適合病毒產生的細胞中制備出病毒。優選細胞是動物細胞培養物或細胞系。這樣的細胞可以來自特定的組織或胚細胞，比如胚卵。動物優選是哺乳動物或鳥。在本發明的各種實施方式中，細胞是鳥類的、犬科的、嚙齒動物的、或者靈長類動物的細胞。在特定的實施方式中，細胞是上皮細胞，尤其優選腎上皮細胞，比如非洲綠猴的Vero細胞。施加于超速離心裝置的病毒收獲物可以是全細胞培養物、或者在將細胞和/或其部分與細胞培養物分離后獲得的細胞培養上清液。在本發明的一些實施方式中，在回收細胞培養上清液之前，允許細胞培養物中的細胞置于培養容器中。在本發明的其他實施方式中，細胞可以通過化學方法或者機械方法裂解，所述方法的非限制性的例子包括低滲或高滲溶菌、洗滌劑處理、超聲處理、以及機械破碎。優選病毒在離心之前或之后被失活或破碎(例如，如WO05/11800所述)。另外，病毒疫苗可以通過本
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已知的方法制備。疫苗是抗原物質的免疫原性的組合物，即(未感染)病毒、其外殼、顆粒或其抗原。該抗原物質被用于免疫動物，例如，哺乳動物比如人類，或者鳥。以下通過實施例進一步闡明本發明，但并不限制本發明。實施例在流感病毒抗原的純化期間，通過超速離心法濃縮單價的收獲物(MVH)。以通過使用50%(w/w%)蔗糖水溶液而形成的蔗糖梯度為基礎，連續流動離心工藝能夠被用于培育病毒疫苗的Vero細胞培養物的制造。使用的離心轉子模型安裝有預澄清器。許多發酵優化方法，比如通過補充大豆水解物或者在流感病毒復制早期階段升高溫度條件而改變Vero細胞培養基，會導致更耐用的工藝以及提高的抗原產率。因此，其結果是，由于抗原結合能力的限制，50%(Ww%)蔗糖/水的梯度不可能獲得期望的回收率。另外，病毒菌株NewCaledonia(新喀里多尼亞)、Panama(巴拿馬)禾t]Shangdong(商東)的PMVHs(純化的MVH)在該特定的生產步驟顯示出預料不到的抗原聚集性。人們嘗試了數種方法來使離心步驟中的病毒聚集和病毒損失最小化。TRIS緩沖鹽水被用于代替水來溶解用于梯度物質的蔗糖。另外，引入通過使用兩種具有不同密度的梯度形成溶液而進行的改變，以便增加波峰匯集液體積。另外，在沒有預澄清器、但是增加慣性力(g-force)的情況下進行超速離心，證明是用于提高產量的有價值的手段。為了證明這些思想，評估在標準條件(水中50%蔗糖，在20,000rpn^90,000g下具有預澄清器)和新的條件(42%和55%蔗糖(w/w%)、20mmol/kgTRIS、8g/kgNaCl，在35,000rpm=90,000g下沒有預澄清器，使用來自48。/。-36。/。蔗糖組分的PMVH收獲物)下上述純化所帶來的結果。實施例l:材料和方法使用具有C40CTS轉子(轉子體積1,600mL)的連續流式超速離心機CC40S或具有等效轉子的AlfaWassermann超速離心機RK6。將蔗糖梯度溶液加載至轉子，然后加速至20,000至35,000rpm的轉速。在連續加載失活收獲物后，用緩沖液沖洗轉子以便除去尚未進入梯度的殘余蛋白質。在沖洗后，轉子被減速，并且停止超速離心，使得梯度從轉子徑向移至軸向。根據蔗糖濃度進行洗脫和分級分離。Coriolis型密度探測部件和紫外線254nm探測部件被用于監控蔗糖和蛋白質濃度。通過ELISA，根據標準化工藝測量純化后的失活收獲物樣本的總蛋白濃度、HA-SRD和Vero抗原，從而定量來自超速離心實驗的產率和純度。實施例2:使用TBS-蔗糖梯度的初始實驗用甲型流感/Panama/2007/99單價病毒收獲物進行的許多小規模純化表明，由50%w/w蔗糖與50%w/wTris緩沖液鹽水(20mmol/kgTRIS、8g/kgNaCl)(終濃度為10mmol/kgTRIS、4g/kgNaCl)的混合物產生的蔗糖梯度的應用相對于標準的蔗糖/水體系具有數個優點。使用實驗室超速離心機模型RK-6來在不同的條件下純化25升和50升MVH等分。在表1中給出了使用蔗糖/水和蔗糖/TBS體系的純化操作的參數設置和結果的概要。表1:甲型流感/Panama/2007/99抗原產率和PMVH外觀的對比。來自在30,000g下具有預澄清器的超速離心實驗的經蔗糖梯度純化的病毒。純化操作條件/設置MVH加載(升)HA-SRD/蛋白質比率(mg/mg)波峰匯集液體積(mL)抗原產率(mg抗原/升收獲物)PMVH(外觀)1蔗糖/水800mL250.513331.2聚集2蔗糖/TBS800mL250.344402.0聚集減少3蔗糖/TBS800mL500.264921.4聚集減少從表1中可以得出結論，在TBS中的蔗糖梯度與標準的在蔗糖/水體系中的梯度相比具有數個優點。對于純化操作l,能夠獲得1.2mg抗原/升(L)收獲物的產率，抗原組分(PMVH)顯示出預料不到的病毒聚集。使用在TBS中蔗糖的純化實驗(操作2)獲得了與參照操作1相比增加的抗原產率。對于TBS制品，能夠觀察到聚集體組分的明顯減少。盡管TBS蔗糖梯度與標準體系(蔗糖/水)相比具有數個優點，但在該梯度的更高加載量(50升相比25升)(操作3)下，觀察到抗原產率損失。在使用TBS代替水的兩種情況中，波峰匯集液體積增加，這表明在加載的收獲物和包含緩沖物質及其他電解質的梯度之間的更多擴散。實施例3:兩步蔗糖/TBS梯度的開發該實施例顯示了一種示例性的實施方式，其中蔗糖梯度被改進，以便在不改變對于分級分離的限制的情況下增加波峰匯集液組分的體積。使用具有降低的濃度42%(w/w%)的蔗糖梯度，導致由超速離心洗脫的較小急劇升降的蔗糖梯度。為了確保在梯度中足夠高的蔗糖濃度，在42%(w/w%)溶液之后加載濃度更高的50%(w/w%)蔗糖/TBS溶液。結果，作為更高濃度的溶液，形成了"緩沖"，從而防止抗原沉積在轉子器壁上。表2顯示了使用這樣的兩步梯度的純化操作，該兩步梯度使用卯0mL較低濃度的蔗糖/TBS溶液(42。/。w/w蔗糖，U.7mmol/kgTRIS，4.7g/kgNaCl)和100mL更高濃度的蔗糖/TBS溶液(50%w/w，10mmol/kgTRIS，4g/kgNaCl)，將該兩步梯度的純化操作與使用加載不同體積(即，600、800、以及1000mL)的僅用50。/。蔗糖/TBS溶液形成的梯度的純化操作進行了對比。在20,000rpm(RCF約為30,000g)下采用預澄清器，進行測試。通過采用不同量和濃度的蔗糖/TBS溶液，材料的產率和純度受到的影響不明顯。然而，通過42%/50%(w/w%)蔗糖/TBS的混合物構造的兩步梯度的應用導致波峰匯集液體積的顯著增加，這會通過降低抗原濃度以避免波峰匯集液組分的過載而導致更好的純化條件。表2:使用不同量蔗糖/TBS50%(w/w%)的通過超速離心進行純化的甲型流感/Panama/2007/99失活收獲物的產品產率和抗原純度與采用兩步蔗糖/TBS梯度(50%/42%(w/w%))的對比。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例4:在沒有預澄清器的情況下更高相對離心力的實施研究了用于超速離心的更高相對離心力，以便提高抗原產率。然而在這樣的條件下不得不考慮在預澄清器中的材料損失。超速離心轉子能夠在有或沒有預澄清器的情況下運行，因此，對使用預澄清器的20,000rpm(約為30,000g)與在兩步蔗糖/TBS梯度(100mL的50%w/w蔗糖，終濃度10mmol/kgTRIS，4g/kgNaCl;和900mL的39%w/w蔗糖，終濃度12.2mmol/kgTRIS，4.9g/kgNaCl)中的35,000rpm(約為90,000g)進行對比。為了評估潛在的抗原損失，用緩沖液抽吸預澄清器和轉子器壁，并且分析抗原損失。該實驗結果如表3所示。抗原產率能夠從1.7mgHA-SRD/L收獲物提高到2.8mgHA-SRD/L收獲物，提高了60%以上。遺漏的抗原的主要部分能夠從預澄清器中被抽吸出來，而在超速離心機的轉子器壁上僅損失了約5%的抗原。通過在將收獲物加載到蔗糖/TBS梯度上之前省略預澄清步驟，SRD/蛋白質比率僅略微地降低。表3:在有和沒有預澄清器的情況下，使用不同的相對離心力，通過超速離心甲型流感/Panama/2007/99的失活收獲物進行產品產率和損失以及抗原純度的對比。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例5:在蔗糖梯度中TRIS和NaCl濃度的改進通過將50%(重量)庶糖與50%(重量)TBS緩沖液(20mmol/kgTRIS，8g/kgNaCl)混合來制備50%w/w蔗糖/TBS梯度，得到10mmo/kgTRIS和4g/kgNaCl的終濃度，形成初始配方。接著，用更高含量的TBS制備較低濃度的配方42y。-39W蔗糖/TBS溶液，得到更低濃度的蔗糖、但是相對更高濃度的TRIS和NaCl(參見在前實施例)。更高濃度的溶液，比如，例如在TBS中55%(w/w)蔗糖因此具有更低濃度的TRIS和NaCl。為了標準化在這樣的制品中的TRIS和NaCl的濃度，設計新的配方，其中將42wt%-55wt。/。的蔗糖加至混合容器，加入20mmol/kg(2.42g/kg)TRIS和8g/kgNaCl并且用水補加至100wt%。則這樣的制品具有與在前述實施例中使用的配方相比明顯更高(約2倍)濃度的TRIS和NaCl。而且，由于更小的水含量，這樣的配方的折射計測量值導致折射結果高出約2。(1°-3°)Brix(白利糖度)。其中，在補加至最終100wt。/。之前水被添加的TRIS替代。在實驗中，將兩個不同版本的兩步蔗糖/TBS梯度進行比較。在用800mL的42。/。蔗糖/TBS加載之后，通過加入200mL更高濃度的蔗糖/TBS溶液來構造梯度，從而在梯度中產生更耐用的高密度蔗糖緩沖。在超速離心實驗中不同的蔗糖/TBS制品的結果如表4所示。當使用不同的TRIS和NaCl濃度時，就產率或純度而言，沒有觀察到顯著差異。表4:使用具有不同TRIS和NaCl濃度的不同蔗糖/TBS制品，通過超速離心甲型流感/Panama/2007/99的失活收獲物進行產品產率和抗原純度的對比。純化操作條件/設置HA-SRD/蛋白質比率(mg/mg)抗原產率(mg抗原/升收獲物)1TBS(12.2mmo1/kgTRIS/4.9g/kgNaCl)中42%蔗糖TBS(8.9mmo1/kgTRISS/3.6g/kgNaCl)中55%蔗糖0.425.02TBS(20mmo1/kgTRIS/8g/kgNaCl)中42%蔗糖TBS(20mmo1/kgTRIS/8g/kgNaCl)中55%蔗糖0.394.8實施例6:轉子加載量和加載流速的研究研究三個不同菌株的不同收獲物體積，評估優化超速離心工藝的容量，并且研究當更大的收獲物體積必須應用于超速離心工藝時在制造中潛在的放大結果。在1600mL轉子上加載15-17L和45-51L的失活收獲物。在該實驗中，按照前述實施例5的方法，使用相同的改進型兩步蔗糖/TBS梯度。首先，高密度溶液的濃度被增加到55。/。w/w，并且在加載800mL的42M蔗糖/TBS以后，使用更大體積的200mL以便在梯度中產生更耐用的高密度蔗糖緩沖。在兩種蔗糖/TBS溶液中，梯度中最終的TRIS濃度被增加到20mmol/kg，并且最終的NaCl濃度被增加到8g/kg。超速離心條件是在沒有預澄清器的情況下為35,000rpm(90,000g)，并且在48%至36%蔗糖之間進行分級分離。15加載量實驗的結果如表5所示。在沒有預澄清器的情況下使用本發明的梯度和更高的離心力，在不同的收獲物加載體積下僅能夠觀察到較小的約3%至6%的產率差異。這與實施例2或表1中有限的加載量相反，后者中對于菌株甲型流感/Panama/2007/99，收獲物體積從25升提高到50升，導致產率降低約30%。該提高的產率可以解釋如下提高的相對離心力、和由于兩步庶糖/TBS梯度導致的梯度分布以及波峰匯集液體積的改進。表5:使用不同的加載體積通過超速離心進行的產品產率和抗原純度的對比。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例7:本發明的超速離心工藝與普通的超速離心工藝的對比組合使用下述條件a)在沒有預澄清器的情況下90，000g(35,000rpm)(代替使用預澄清器的30,000g(20,000rpm))b)在TBS中的蔗糖梯度(代替在水中的蔗糖)，終濃度為20mmol/kgTRIS和8g/kgNaClc)形成這樣一種梯度具有兩個不同的蔗糖濃度(200mL55°/。+800mL42%)以提高波峰匯集液組分體積(代替800mL的50%蔗糖)，將其與在前的普通超速離心工藝相比較(表6)。表6:在標準條件(在水中50%蔗糖)和新條件下制造規模和小規模純化單元操作的條件和設置(按1:2比例縮小)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*未使用預澄清器使用2002/2003菌株(即，甲型流感/NewCaledonia/20/99、甲型流感/Panama/2007/99和乙型流感/Shangdong/7/97)進行三個比較實驗。對于這些操作的波峰匯集液分級分離限制被限定為48%至36%(w/w%)蔗糖。結果顯示在實施例8至實施例10中。基于產率和產品質量參數，將來自在標準條件(50%庶糖/水)和改進條件(蔗糖/TBS梯度)下使用流感NewCaledonia、Panama和Shangdong的純化操作的結果進行比較。實施例8:流感菌株甲型流感/NewCaledonia/20/99的純化使用NewCaledoniaMVH，采用根據標準方法和根據表6的新的蔗糖/TBS梯度參數的條件進行純化實驗。在表7中給出了來自純化操作的結果的對比。表7:甲型流感/NewCaledonia/20/99抗原產率、HA/蛋白質比率和Vero-蛋白質雜質的對比。采用普通的2001/2002方法比對改進的TBS梯度的蔗糖梯度純化的病毒。純化操作抗原產率(mg抗原/升收獲物)HA/總蛋白質比率Vero-蛋白質/HA比率標準2.70.410.06新的(TBS梯度)3.40.600.07從表7中數據中可得出如下結論對于流感菌株甲型流感/NewCaledonia/20/99，采用新的蔗糖/TBS梯度純化條件取得了顯著的工藝改進。對于該特定的菌株，顯示出病毒產率從2.7到3.4mg抗原/每升MVH的顯著提高。作為HA/總蛋白比率和Vero-蛋白質/HA比率測量的病毒抗原質量顯示，劑量/每升的提高不會損害抗原質量。采用新的蔗糖梯度條件，取得了HA/總蛋白從0.41到0.60的輕微提高。對于寄主細胞蛋白質/HA比率，未能檢測到顯著差異。在蔗糖/TBS梯度條件下，對于PMVH生產，略微地降低了菌株甲型流感/NewCaledonia/20/99的聚集。可以通過顯微鏡觀察證實該效果(參見，例如，圖1A和圖1B)。在400倍放大增強時，當使用前述蔗糖/水梯度時，清楚可見聚集體的形成(圖1A)。反之，不論產率提高與否，由優化的超速離心工藝得到的波峰匯集液組分表現為明顯更均一(圖1B)。實施例9:流感菌株甲型流感/Panama/2007/99的純化17使用PanamaMVH，采用根據標準方法和根據表6的新的蔗糖/TBS梯度參數的條件進行純化實驗。在表8中給出了來自純化操作的結果的對比。表8:甲型流感/Panama/2007/99抗原產率、HA/蛋白質比率和Vero-蛋白質雜質的對比。采用標準方法比對本發明TBS梯度方法的蔗糖梯度純化的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表8中的數據可得出如下結論對于流感菌株Panama,采用新的蔗糖/TBS梯度純化條件取得了顯著的工藝改進。對于該特定的菌株，通過使用新的蔗糖/TBS梯度條件，顯示出病毒產率由2.0至5.5mg抗原/每升MVH的顯著提高。取得了0.77的HA/總蛋白比率。反之，對于在標準條件下產生的PMVH，計算出的比率是1.47。對于使用兩種工藝產生的PMVH的Vero-蛋白質/HA比率，由于未能看出顯著差異，故可以推測，Panama抗原(如PanamaPMVH的顯微照片(未圖示)對比所示)的聚集可能是HA/總蛋白比率為異常的1.47的原因。對于兩種純化工藝，作為HA/總蛋白比率和Vero-蛋白質/HA比率測量的病毒抗原質量是可接受的。但是，在TBS蔗糖梯度條件下，對于PMVH生產，通過使用蔗糖/TBS梯度，菌株Panama的聚集能被明顯降低。實施例10:菌株乙型流感/Shangdong/7/97的純化使用ShangdorigMVH，采用根據標準方法和根據表6的新的蔗糖/TBS梯度參數的條件進行純化實驗。在表9中給出了來自純化操作的結果的對比。表9:乙型流感/Shangdong/7/97抗原產率、HA/蛋白質比率和Vero-蛋白質雜質的對比。采用標準方法比對新的TBS梯度方法的蔗糖梯度純化的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>從表9中的數據可得出如下結論對于流感菌株乙型流感/Shangdong/7/97，采用本發明的蔗糖/TBS梯度純化條件取得了顯著的工藝改進。對于該特定的菌株，顯示出病毒產率從2.2到5.1mg抗原/每升MVH的顯著提高。對于蔗糖/TBS純化的MVH，下降的HA/總蛋白比率0.34在流感PMVH規定范圍之內。另外，乙型流感/Shangdong/7/97病毒復制階段的改進允許通過改變胰蛋白酶劑量分布型而建立更一致的生產工藝。在TBS蔗糖梯度條件下，對于PMVH生產，乙型流感/Shangdong/7/97菌株的聚集被明顯降低，如同被采用標準條件比對TBS條件進行純化的ShangdongPMVHs顯微照片(未圖示)證實的那樣。在此處提供的示例性的大規模和小規模實驗中，證實了本發明的蔗糖梯度允許有效加載單價的收獲物。使用在此描述的本發明方法有許多優點，包括1)病毒產率提高至少25%;2)取決于菌株的HA/總蛋白的比率由0.34提高至0.77;3)取決于菌株的寄主細胞蛋白質含量由2%提高至7%;以及4)最小化在蔗糖波峰匯集液中的病毒(PMVH)聚集。權利要求1.一種用于病毒或病毒抗原純化的方法，其包括通過離心至少一種第一緩沖糖溶液和至少一種第二緩沖糖溶液，提供包含糖梯度的梯度形成溶液，其中，所述第一緩沖糖溶液的糖濃度具有35％至50％(w/w％)的蔗糖當量，所述第二緩沖糖溶液中的糖濃度具有50％至65％(w/w％)的蔗糖當量，且所述第二緩沖糖溶液的密度高于所述第一緩沖糖溶液；將病毒制品加至糖梯度；將病毒制品和糖梯度離心，以得到波峰匯集液；以及萃取所述波峰匯集液，以得到病毒或病毒抗原。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述梯度形成溶液的體積占超速離心轉子的體積的5%至100%。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述波峰匯集液的密度在1.13kg/L和1.25kg/L之間。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，收集的所述波峰匯集液的蔗糖當量在30%和54%(w/w%)蔗糖之間。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，至少一種所述緩沖液的濃度在5mM和50mM之間。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述至少一種所述緩沖液的濃度在15mM和30mM之間。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述至少一種所述緩沖液的濃度在18mM和25mM之間。8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述將病毒制品離心的步驟采用至少20,000g的相對離心力進行。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述相對離心力是至少30,000g。10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述相對離心力是至少90,000g。11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖糖溶液對所述至少一種第二緩沖糖溶液的所述體積比是20:1至1:1。12.如權利要求ll所述的方法，其特征在于，所述體積比是10:1至1.5:1。13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述體積比是8:1至2:1。14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述體積比是6:1至3:1。15.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述包含糖梯度的溶液包含兩層。16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述制品不包含預澄清劑。17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種第一緩沖糖溶液包含濃度范圍為40%至44%(w/w%)蔗糖當量的糖。18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述至少一種第一緩沖糖溶液包含濃度范圍為41%至43%(w/w%)蔗糖當量的糖。19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種第二緩沖糖溶液包含濃度范圍為52%至58%(w/w%)蔗糖當量的糖。20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述至少一種第二緩沖糖溶液包含蔗糖當量為54%至56%的糖。21.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒是正粘病毒。22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。23.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒制品包含用病毒接種的細胞。24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述細胞來自動物細胞培養物或者細胞系。25.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述細胞是上皮細胞。26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述細胞是腎上皮細胞。27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述細胞是Vero細胞。28.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒被失活。29.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒被破碎。30.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖劑成分是胺類。31.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述緩沖劑成分是TRIS。32.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述緩沖液是TRIS-緩沖鹽水。33.—種制備抗病毒或病毒抗原的疫苗的方法，其特征在于，通過使用如權利要求1所述的方法得到所述病毒或病毒抗原。34.—種用于病毒或病毒抗原純化的方法，其包括通過離心至少一種第一緩沖糖溶液和至少一種第二緩沖糖溶液，提供包含糖梯度的梯度形成溶液，其中，所述第一緩沖糖溶液的密度是1.15kg/L至1.23kg/L，所述第二緩沖糖溶液的密度是1.23kg/L至1.32kg/L，且所述第二緩沖糖溶液的密度高于所述第一緩沖糖溶液；將病毒制品加至糖梯度；將病毒制品和糖梯度離心，以得到波峰匯集液；以及萃取所述波峰匯集液，以得到病毒或病毒抗原。全文摘要本發明提供了一種用于純化病毒或病毒抗原的方法，其包括提供病毒制品；以及在通過添加兩種以上不同濃度的緩沖糖層而建立的蔗糖梯度中離心所述病毒制品。該方法通過提高波峰匯集液的體積而導致較高的產率，并且降低不希望有的病毒或病毒抗原的聚集。文檔編號C12Q1/70GK101688187SQ200880021203公開日2010年3月31日申請日期2008年4月30日優先權日2007年5月4日發明者利奧波德·格里伯格,曼弗雷德·賴特,沃爾夫岡·蒙特,阿圖爾·米特雷爾,霍斯特·沙夫豪澤申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司