專(zhuān)利名稱(chēng)：：向具有細(xì)胞壁的細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及向具有細(xì)胞壁的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入核酸(DNA、RNA)、蛋白質(zhì)等外來(lái)物質(zhì)的方法。特別涉及利用碳納米管的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入方法。并且，本國(guó)際申請(qǐng)主張2007年6月21日提出的日本專(zhuān)利申請(qǐng)2007-163867號(hào)的優(yōu)先權(quán)，在本說(shuō)明書(shū)中引用該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以作參昭。
背景技術(shù)：
：為了將DNA或RNA這樣的多核苷酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的活性物質(zhì)作為外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，已知各種方法。例如，作為導(dǎo)入DNA等基因的方法，已知使用脂質(zhì)體的方法(脂質(zhì)體法lipofection)、顯微注射法、電穿孔法、使用病毒載體的方法、DEAE-葡聚糖法、使用基因槍的方法等。但是，通常，與動(dòng)物細(xì)胞相比，向植物細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)更困難。這是由于植物細(xì)胞被含有纖維素的堅(jiān)固的細(xì)胞壁包圍，該細(xì)胞壁的存在成為外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入的障礙。另外，為了提高外來(lái)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率，也經(jīng)常預(yù)先進(jìn)行酶處理(例如纖維素酶處理)，從而將細(xì)胞原生質(zhì)體化。但是，原生質(zhì)體化是繁瑣并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力的操作。并且，對(duì)原生質(zhì)體化后的細(xì)胞的操作要求熟練性和慎重性。作為這樣的現(xiàn)有技術(shù)，例如在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中記載了利用激光所具有的高加工特性，切斷構(gòu)成植物細(xì)胞壁的高分子的化學(xué)鍵，由此將基因等外來(lái)物質(zhì)(活性物質(zhì))導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)的方法。但是，該文獻(xiàn)中記載的方法需要昂貴的激光照射裝置，并且沒(méi)有改變需要進(jìn)行繁瑣且費(fèi)時(shí)費(fèi)力的操作(激光照射處理等)的現(xiàn)狀。專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2002-325572號(hào)公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了解決向植物細(xì)胞等具有細(xì)胞壁的細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)(例如活性物質(zhì)，特別是DNA等遺傳物質(zhì))時(shí)的現(xiàn)有問(wèn)題而完成的，其目的在于提供一種能夠簡(jiǎn)便且容易地向靶細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)的方法。本發(fā)明的目的在于提供一種能夠簡(jiǎn)便且高效地向靶細(xì)胞導(dǎo)入特別是DNA、RNA等遺傳物質(zhì)(典型的是外來(lái)基因)的方法。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供的方法是向具有細(xì)胞壁的細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)的方法。這里所公開(kāi)的方法，包括準(zhǔn)備載持有至少一種細(xì)胞壁分解酶的碳納米管的步驟；向含有上述細(xì)胞的處理對(duì)象(典型的是含有該細(xì)胞的處理液)供給上述載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管和作為導(dǎo)入對(duì)象的外來(lái)物質(zhì)的步驟；通過(guò)與上述細(xì)胞接觸的碳納米管所具有的上述分解酶的作用，分解該細(xì)胞的細(xì)胞壁的步驟；和通過(guò)上述細(xì)胞壁被分解的部位，向上述細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入目的外來(lái)物質(zhì)的步驟。本說(shuō)明書(shū)中的"外來(lái)物質(zhì)(導(dǎo)入物質(zhì))"是指能夠向靶細(xì)胞內(nèi)供給的大小和性狀的物質(zhì)。可以是天然存在的物質(zhì)，或者人工制造的物質(zhì)。作為典型例，可以列舉各種活性分子。例如，多核苷酸(DNA、RNA)、多肽、蛋白質(zhì)等活性分子是包括在這里所說(shuō)的外來(lái)物質(zhì)(導(dǎo)入物質(zhì))的優(yōu)選例。另外，本說(shuō)明書(shū)中的"碳納米管"是由碳骨架形成的構(gòu)造體，是納米尺寸(典型的是200nm以下、例如1200nm左右)的直徑的筒狀或纖維狀的一層或多層巻成的碳構(gòu)造體。除了所謂單層碳納米管(single-walledcarbonnanotube:SWNT)禾卩多層碳纟內(nèi)米管(multi-walledcarbonnanotube:MWNT)之夕卜，本說(shuō)明書(shū)的碳納米管也包括根據(jù)形態(tài)的特征而被稱(chēng)為碳納米纖維(碳納米晶須)或碳納米錐的物質(zhì)。本發(fā)明的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入方法中，通過(guò)使用所期望的細(xì)胞壁分解酶被固定化的碳納米管，能夠通過(guò)該碳納米管上固定化的細(xì)胞壁分解酶在靶細(xì)胞的細(xì)胞壁上打開(kāi)微小的孔(納米孔)。因此，能夠從該微小的孔向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入目的的外來(lái)物質(zhì)。另外，由于通過(guò)該方法在靶細(xì)胞的細(xì)胞壁上形成的孔非常微小，處理后細(xì)胞的生存率極高(換言之，導(dǎo)入處理后容易進(jìn)行穿孔的自我修復(fù))，能夠得到維持細(xì)胞本來(lái)具有的機(jī)能的正常的細(xì)胞(無(wú)缺陷細(xì)胞)。另外，細(xì)胞的操作不需要特別的慎重。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠不進(jìn)行繁瑣且費(fèi)時(shí)費(fèi)力的操作，有效地得到高效率地導(dǎo)入目的外來(lái)物質(zhì)的細(xì)胞。由此，本發(fā)明的另一方面提供一種通過(guò)導(dǎo)入外來(lái)遺傳物質(zhì)而發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(進(jìn)一步為由該轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的組織)的生產(chǎn)方法，該方法的特征在于通過(guò)本發(fā)明的導(dǎo)入方法，將作為外來(lái)物質(zhì)的多核苷酸(包括DNA或RNA形成的基因、含有該基因的蛋白質(zhì)類(lèi)、以及多核苷酸和其它物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的復(fù)合體)導(dǎo)入靶細(xì)胞。這里公開(kāi)的方法的一個(gè)優(yōu)選方式的特征在于作為上述酶，使用至少一種的纖維素酶。通過(guò)使用纖維素酶，能夠有效地在耙細(xì)胞、特別是植物細(xì)胞的細(xì)胞壁上形成微小的孔。因此，特別是在上述細(xì)胞是植物細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選將纖維素酶在碳納米管上固定化。另外，這里公開(kāi)的方法的其它優(yōu)選方式的特征在于作為上述碳納米管，使用全長(zhǎng)(平均值)為10pm以下的碳納米管。通過(guò)使用上述比較短的碳納米管作為碳納米管，提高各向異性的碳納米管顆粒在處理液中的無(wú)規(guī)運(yùn)動(dòng)性(典型的是平移、旋轉(zhuǎn)等的布朗運(yùn)動(dòng))，結(jié)果，能夠提高與靶細(xì)胞的接觸頻率，能夠更高效地通過(guò)固定化在碳納米管上的酶處理進(jìn)行對(duì)細(xì)胞壁的穿孔及隨之的外來(lái)物質(zhì)的導(dǎo)入。另外，這里公開(kāi)的方法的其它優(yōu)選方式中，預(yù)先將上述準(zhǔn)備好的載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管添加在含有表面活性劑(優(yōu)選非離子型表面活性劑和/或陽(yáng)離子型表面活性劑)的溶液中，配制外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液，向含有上述細(xì)胞的處理對(duì)象供給該配制得到的溶液。在向含有靶細(xì)胞的處理對(duì)象供給之前，將載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管向含有表面活性劑(優(yōu)選非離子型表面活性劑和/或陽(yáng)離子型表面活性劑)的溶液中添加，預(yù)先配制外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液，通過(guò)使用該配制得到的溶液，能夠進(jìn)一步促進(jìn)載持細(xì)胞壁分解酶的碳納米管的無(wú)規(guī)運(yùn)動(dòng)。另外，對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞壁的穿孔被活化，能夠進(jìn)一步提高外來(lái)物質(zhì)的導(dǎo)入效率。另外，上述外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液除了使用載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管以外，還可以添加并使用所希望的外來(lái)6物質(zhì)。另外，優(yōu)選上述細(xì)胞處理對(duì)象是含有上述細(xì)胞的處理液，其特征在于，該細(xì)胞處理液含有表面活性劑、特別是非離子型表面活性劑和/或陽(yáng)離子型表面活性劑。更優(yōu)選作為非離子型表面活性劑，使用n-辛基-(3-D-葡萄糖苷。由于處理液中含有這樣的表面活性劑，能夠促進(jìn)碳納米管在處理液中的無(wú)規(guī)運(yùn)動(dòng)，并且能夠提高外來(lái)物質(zhì)的導(dǎo)入效率(特別是DNA或RNA這樣多核苷酸)。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種細(xì)胞，該細(xì)胞的特征在于，通過(guò)這里公開(kāi)的方法，將規(guī)定的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。作為其優(yōu)選例，提供一種植物細(xì)胞(進(jìn)一步為由該植物細(xì)胞得到的組織或植物個(gè)體)。典型地提供一種細(xì)胞，其特征在于，將規(guī)定的外來(lái)物質(zhì)和載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管一起導(dǎo)入(進(jìn)入)細(xì)胞內(nèi)。另外，本發(fā)明提供一種試劑盒，其為適于實(shí)施這里公開(kāi)的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入方法的材料的組合，即，用于向植物細(xì)胞那種具有細(xì)胞壁的細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)。本發(fā)明提供的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用的試劑盒，具備至少一種細(xì)胞壁分解酶、碳納米管和含有至少一種表面活性劑(優(yōu)選非離子型表面活性劑和/或陽(yáng)離子型表面活性劑)的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液。在優(yōu)選方式的試劑盒中，試劑盒中所含有的碳納米管中預(yù)先載持有上述至少一種的細(xì)胞壁分解酶。根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，能夠容易地配制上述外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液，并且上述碳納米管所載持的細(xì)胞壁分解酶與上述細(xì)胞接觸，分解該細(xì)胞的細(xì)胞壁，能夠容易地從該細(xì)胞壁被分解的部位向該細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入目的的外來(lái)物質(zhì)。在一種優(yōu)選方式的試劑盒中，上述酶是至少一種的纖維素酶。另外，在另一種優(yōu)選方式的試劑盒中，上述非離子型表面活性劑是n-辛基-P-D-葡萄糖苷。通過(guò)使用這樣的試劑盒，能夠通過(guò)簡(jiǎn)單的操作，適當(dāng)?shù)貙?duì)具有細(xì)胞壁的細(xì)胞(典型的是植物細(xì)胞)，向細(xì)胞內(nèi)同時(shí)導(dǎo)入規(guī)定的外來(lái)物質(zhì)和載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管。圖1A是表示一個(gè)實(shí)施例中使用的碳納米管的形態(tài)的顯微鏡照片。圖1B是表示一個(gè)實(shí)施例中，在碳納米管的表面固定纖維素酶后的碳納米管的形態(tài)的顯微鏡照片。圖2A是表示一個(gè)實(shí)施例中，在添加載持有纖維素酶的碳納米管后，經(jīng)過(guò)1小時(shí)時(shí)的靶植物細(xì)胞的狀態(tài)的顯微鏡照片。圖2B是表示一個(gè)實(shí)施例中，在添加載持有纖維素酶的碳納米管后，經(jīng)過(guò)2小時(shí)時(shí)的靶植物細(xì)胞的狀態(tài)的顯微鏡照片。圖2C是表示一個(gè)實(shí)施例中，在添加載持有纖維素酶的碳納米管后，經(jīng)過(guò)3小時(shí)時(shí)的靶植物細(xì)胞的狀態(tài)的顯微鏡照片。圖2D是表示一個(gè)實(shí)施例中，在添加載持有纖維素酶的碳納米管后，經(jīng)過(guò)5小時(shí)時(shí)的靶植物細(xì)胞的狀態(tài)的顯微鏡照片。圖3是表示一個(gè)實(shí)施例中，載持有纖維素酶的碳納米管通過(guò)細(xì)胞壁而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)的顯微鏡照片(利用投射照明的亮視野觀察)。圖4是表示一個(gè)實(shí)施例的利用載持有纖維素酶的碳納米管的纖維素水解物的解析結(jié)果的圖譜。圖5是示意性地表示一個(gè)實(shí)施例的導(dǎo)入方法概要的說(shuō)明圖。圖6是一個(gè)實(shí)施例中攝入外來(lái)物質(zhì)后的靶植物細(xì)胞的三維重構(gòu)圖。圖7A是表示導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)后的靶細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)的熒光顯微鏡照片(載持有纖維物酶的碳納米管的觀察)。圖7B是表示導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)后的靶細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)的熒光顯微鏡照片(核酸的觀察)。圖7C是表示導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)后的靶細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)的熒光顯微鏡照片(載持有纖維物酶的碳納米管和核酸的觀察)。圖7D是表示導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)后的靶細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)的熒光顯微鏡照片(載持有纖維物酶的碳納米管和核酸的亮視野觀察)。具體實(shí)施例方式以下，說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。其中，本說(shuō)明書(shū)中除了特別言及的事項(xiàng)(例如，載持細(xì)胞壁分解酶的碳納米管的制造方法、向含有靶細(xì)胞的處理對(duì)象(典型的是含有細(xì)胞的處理液)供給該碳納米管的方法)以外，實(shí)施本發(fā)明的必要事項(xiàng)(例如，所期望的外來(lái)物質(zhì)的供給裝置和配制方法)可以基于本領(lǐng)域中的現(xiàn)有技術(shù)，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員的設(shè)計(jì)事項(xiàng)進(jìn)行把握。本發(fā)明能夠基于本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的內(nèi)容和本領(lǐng)域的技術(shù)常識(shí)實(shí)施。如上所述，這里公開(kāi)的方法的特征在于，向靶細(xì)胞同時(shí)供給載持有適當(dāng)?shù)募?xì)胞壁分解酶的碳納米管、和規(guī)定的外來(lái)物質(zhì)，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的，對(duì)使用的碳納米管的性狀、細(xì)胞壁分解酶的種類(lèi)、靶細(xì)胞的種類(lèi)、處理對(duì)象的構(gòu)成(例如處理液的組成)、培養(yǎng)基(具體的是培養(yǎng)本發(fā)明的導(dǎo)入處理前的細(xì)胞的培養(yǎng)基、處理液、培養(yǎng)處理后的細(xì)胞的培養(yǎng)基)的組成沒(méi)有特別限制。作為適用本發(fā)明方法的靶細(xì)胞、即"具有細(xì)胞壁的細(xì)胞"，可以使用具有細(xì)胞壁的各種生物的細(xì)胞。高等植物的細(xì)胞壁中，果膠和半纖維素等多糖類(lèi)基質(zhì)充滿(mǎn)纖維素形成的微小纖維間隙而構(gòu)成。另外，細(xì)菌類(lèi)的細(xì)胞壁以肽聚糖為主要構(gòu)成成分。另外，絲狀菌的細(xì)胞壁以幾丁質(zhì)和P-l，3-葡聚糖為主要構(gòu)成成分。因此，根據(jù)靶細(xì)胞使用的細(xì)胞壁分解酶不同。作為實(shí)施本發(fā)明時(shí)優(yōu)選使用的細(xì)胞壁分解酶，可以列舉切斷纖維素的纖維素酶、切斷果膠的果膠酶、切斷半纖維素的半纖維素酶、切斷幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶，切斷P-l,3-葡聚糖的(3-l,3-葡聚糖酶、分解細(xì)菌類(lèi)的細(xì)胞壁的溶菌酶等。本發(fā)明特別優(yōu)選將難以適用上述現(xiàn)有的導(dǎo)入方法的植物細(xì)胞(典型的是高等植物)作為靶細(xì)胞的方式。另外，適用本發(fā)明的處理對(duì)象中的靶細(xì)胞的存在方式?jīng)]有特別限定。典型地可以將細(xì)胞懸濁液作為處理對(duì)象(處理液)，但處理液中也可以含有植物活性組織的一部分(例如葉、根、莖、種子、花粉、花瓣或愈傷組織)。或者，本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中的"含有靶細(xì)胞的處理對(duì)象"也包括在植物的一部分中水滴狀地添加處理液(即含有碳納米管和外來(lái)物質(zhì)的液體)的方式、或?qū)⒅参矬w的一部分浸漬在該處理液中的方式。將植物細(xì)胞作為耙細(xì)胞時(shí)，作為細(xì)胞分解酶，特別優(yōu)選使用纖維素酶。纖維素酶只要是能夠水解(3-l，4-葡聚糖(纖維素)的糖苷鍵的酶即可，可以沒(méi)有特別限制地使用，但是，特別優(yōu)選作為葡聚糖內(nèi)切酶進(jìn)行作用的酶(EC3.2丄4)。另外，也可以組合使用作為葡聚糖內(nèi)切酶進(jìn)行作用的纖維素酶、和作為外葡糖酶(纖維二糖水解酶EC3.2.1.91)進(jìn)行作用的纖維素酶。另外，使用的纖維素酶的來(lái)源沒(méi)有特別限定，可以使用一般市售的酶。例如，能夠購(gòu)入并使用絲狀菌(曲霉菌屬等)產(chǎn)生的纖維素酶精制品0對(duì)使用的碳納米管的性狀和制法沒(méi)有特別限定。可以使用SWNT、MWNT等。從能夠在處理液中無(wú)規(guī)且活躍地運(yùn)動(dòng)、提高與靶細(xì)胞的接觸頻率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選全長(zhǎng)(鏈長(zhǎng))較短的物質(zhì)。例如，全長(zhǎng)(平均值)為10pm的碳納米管，更優(yōu)選全長(zhǎng)(平均值)為5)Lim以下(例如0.1fim5)im)左右的短鏈碳納米管。特別優(yōu)選全長(zhǎng)(平均值)為lpm以下(例如0.1)Liml^im)左右的短鏈碳納米管。直徑?jīng)]有特別限定，優(yōu)選為200nm以下，例如l200nm左右。這種短鏈碳納米管優(yōu)選采用化學(xué)氣相成長(zhǎng)(CVD)法制造，在該方法中，使用金屬(催化劑)微粒作為成長(zhǎng)核，使用烴等含碳?xì)怏w作為材料。另外，采用該方法得到的碳納米管的取向性高，能夠大量配制外形相對(duì)一致的同形態(tài)、同性質(zhì)的碳納米管，故而優(yōu)選。因此，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，優(yōu)選使用通過(guò)化學(xué)氣相成長(zhǎng)(CVD)法制造的短鏈碳納米管。例如，優(yōu)選使用商品名為Carbere(注冊(cè)商標(biāo))(GSICREOS公司商品)的鏈長(zhǎng)較短、重疊底部打開(kāi)的杯狀物的疊層構(gòu)造的多層型碳納米管。這種形態(tài)的較短的碳納米管在處理液中無(wú)規(guī)且活躍地進(jìn)行平移運(yùn)動(dòng)(變換位置的運(yùn)動(dòng))和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，故而在本發(fā)明的實(shí)施中優(yōu)選。將纖維素酶等細(xì)胞壁分解酶載持在碳納米管上(固定化)的方法，可以使用一直以來(lái)進(jìn)行的一般方法。例如，通過(guò)在酶溶液中添加碳納米管，能夠?qū)⒚腹潭ㄓ谔技{米管的表面。優(yōu)選對(duì)碳納米管迸行酸處理、臭氧處理、等離子體處理、加熱處理等，將碳納米管的表面氧化，由此能夠在碳納米管表面上產(chǎn)生各種官能團(tuán)(例如羰基、羥基)。由此，能夠利用該官能團(tuán)，使纖維素酶等細(xì)胞壁分解酶與碳納米管化學(xué)結(jié)合。其中，向碳納米管導(dǎo)入官能團(tuán)的方法(酸處理、等離子體處理、臭氧處理、加熱處理等)是現(xiàn)有公知的方法，不是本發(fā)明特征的方法，故而省略以上的詳細(xì)說(shuō)明。作為實(shí)施本發(fā)明向靶細(xì)胞(植物細(xì)胞等)導(dǎo)入的外來(lái)物質(zhì)，可以根據(jù)目的，使用各種天然物質(zhì)(典型的是DNA、RNA等的多核苷酸、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類(lèi)、DNA與各種有機(jī)聚合物(例如多肽)的復(fù)合體這種活性分子，或者顆粒狀的金屬或金屬化合物或者陶瓷及其它的無(wú)機(jī)物質(zhì)，或者不溶性的高分子或有機(jī)體)、或者人工構(gòu)筑的物質(zhì)(典型的是各種人工載體或重組基因、脂質(zhì)體、非天然型酶等人工蛋白質(zhì))。特別是由于本發(fā)明是適合得到植物細(xì)胞等的轉(zhuǎn)化體的方法，因此，優(yōu)選使用作為基因的多核苷酸本身或構(gòu)筑成含有該基因的各種載體作為外來(lái)物質(zhì)。在本發(fā)明的方法中，利用通過(guò)載持于碳納米管上的細(xì)胞壁分解酶的作用在耙細(xì)胞的細(xì)胞壁上產(chǎn)生的微孔(典型的是直徑為納米尺寸的洞)，主要以物理方式導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)，因此不需要對(duì)外來(lái)物質(zhì)進(jìn)行特別的前處理，進(jìn)行基于現(xiàn)有的外來(lái)物質(zhì)向細(xì)胞的導(dǎo)入方法的前處理即可。例如，在使用由DNA或RNA形成的基因或載體這種多核苷酸作為外來(lái)物質(zhì)時(shí)，可以與顯微注射法、電穿孔法等現(xiàn)有的基因?qū)敕椒ㄏ嗤嘏渲仆鈦?lái)物質(zhì)(和含有該物質(zhì)的溶液或培養(yǎng)基)。另外，用于進(jìn)行本發(fā)明的導(dǎo)入法的處理對(duì)象(例如細(xì)胞懸濁液)，除了調(diào)節(jié)用于使細(xì)胞壁分解酶高效作用的條件(pH或鹽濃度等)、添加細(xì)胞生存所必須的營(yíng)養(yǎng)素、藥品類(lèi)(各種培養(yǎng)基、抗生素、pH調(diào)節(jié)用的鹽類(lèi)等)之外，優(yōu)選含有能夠提高外來(lái)物質(zhì)的導(dǎo)入效率的成分。例如，作為典型例可以列舉表面活性劑。優(yōu)選使用垸基糖苷類(lèi)、聚氧乙烯烷基醚類(lèi)、聚氧乙烯烷基酚基醚類(lèi)、聚氧乙烯脂肪酸酯類(lèi)(聚乙二醇類(lèi))、蔗糖脂肪酸酯類(lèi)、山梨糖醇酐脂肪酸酯類(lèi)、脂肪酸烷醇酰胺類(lèi)、聚乙烯醇類(lèi)這種非離子型表面活性劑。其中，特別優(yōu)選使用作為較低分子量的表面活性劑的烷基糖苷類(lèi)。例如可以列舉n-辛基-p-D-葡萄糖苷、n-辛基-P-D-麥芽苷、n-癸基-p-D-麥芽苷、n-庚基-p-D-硫葡糖苷等。還可以使用烷基三甲基銨鹽類(lèi)、二烷基二甲基銨鹽類(lèi)、烷基二甲基芐基銨鹽類(lèi)和胺鹽等陽(yáng)離子型表面活性劑。其中，這種表面活性劑除了在上述處理液中添加外，還可以在配制上述外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液時(shí)使用。因此，優(yōu)選這些表面活性劑作為本發(fā)明提供的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用試劑盒的構(gòu)成要素。可以向處理液(即靶細(xì)胞)直接供給外來(lái)物質(zhì)，也可以根據(jù)外來(lái)物質(zhì)的性狀，使其載持(或者含有)于導(dǎo)入用的載體(carrier)而供給。這里的載體是用于向細(xì)胞內(nèi)供給外來(lái)物質(zhì)的介質(zhì)(搬運(yùn)體)。例如，可以列舉脂質(zhì)體、金屬(金、鎢等)或無(wú)機(jī)物(例如硅化合物)形成的顆?；蛘呔ы?、藻酸珠子、病毒性物質(zhì)(例如編碼蛋白質(zhì))。因此，作為本發(fā)明提供的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用試劑盒的優(yōu)選方式，可以列舉具有至少一種的這樣的導(dǎo)入用載體的試劑盒。另外，本發(fā)明也提供用于導(dǎo)入某種特定外來(lái)物質(zhì)的試劑盒(例如預(yù)先具備由規(guī)定的氨基酸序列構(gòu)成的肽(寡肽、多肽)或者蛋白質(zhì)、規(guī)定堿基序列構(gòu)成的多核苷酸等作為該特定外來(lái)物質(zhì)的試劑盒)。另外，本發(fā)明提供的試劑盒中，除了上述主要構(gòu)成要素(酶、碳納米管、表面活性劑，根據(jù)期望的外來(lái)物質(zhì)和載體)之外，還可以包括后述的幾個(gè)實(shí)施例中列舉的用于進(jìn)行外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入法而使用的各種試劑類(lèi)、溶劑、器具類(lèi)(典型的是經(jīng)過(guò)滅菌的一次性處理管、培養(yǎng)皿等的容器類(lèi))。它們可以選擇性地含有于試劑盒中，這些次要成分和器具類(lèi)的有無(wú)不影響本發(fā)明的試劑盒所涉及的權(quán)利范圍和技術(shù)范圍的變動(dòng)。通過(guò)以下實(shí)施例，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入方法，但本發(fā)<第一實(shí)施例>在本實(shí)施例中，作為靶細(xì)胞，使用來(lái)自采自高等植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的胚軸的植物細(xì)胞懸濁液。這樣的細(xì)胞懸濁液通過(guò)以下操作配制。培養(yǎng)基使用MS培養(yǎng)基(添加有30g/L的蔗糖、0.2g/L的肌醇，下同)。艮P，將滅菌后的擬南芥種子在含有8g/L的含瓊脂MS培養(yǎng)基(pH5.7)的平板上培養(yǎng)(暗條件)，發(fā)芽后用小刀切取采集胚軸。接著，將采集后的胚軸組織移至愈傷組織培養(yǎng)用MS瓊脂培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基通過(guò)在含有0.5mg/L的芐氮基嘌呤(BAP)、lmg/L的萘乙酸12(NAA)、lmg/L的卩引哚乙酸(IAA)、lmg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的愈傷組織培養(yǎng)用MS培養(yǎng)基(pH5.7)上添加8g/L的瓊脂而配制。這樣，在暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)約4周，直至形成愈傷組織。生出的愈傷組織每四周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)在暗條件下以23土rc進(jìn)行。接著，向含有50mL的上述愈傷組織培養(yǎng)用MS培養(yǎng)基的100mL容積的三角燒瓶(Erlenmeyerflask)中添加約lg的愈傷組織，使其緩慢旋轉(zhuǎn)，將愈傷組織分散，配制細(xì)胞懸濁液。將培養(yǎng)燒瓶載置于軌道式振蕩器上，以100rpm進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)在暗條件下以23士TC進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)液(懸濁液)每四周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。另一方面，在本實(shí)施例中，作為細(xì)胞壁分解酶使用市售的纖維素酶。另外，作為碳納米管，從制造商購(gòu)入上述的Carbere(注冊(cè)商標(biāo))使用。該碳納米管材料含有大約數(shù)^m數(shù)十^im左右的長(zhǎng)鏈長(zhǎng)的物質(zhì)，但是從顯微鏡-AFM觀察求得的平均鏈長(zhǎng)(全長(zhǎng))約為0.5)iim。通過(guò)以下操作配制載持有纖維素酶的碳納米管。首先，在60。/。的硝酸中添加20mg上述碳納米管，進(jìn)行30分鐘的超聲波處理。之后，在12(TC進(jìn)行12個(gè)小時(shí)的回流加熱。由此，在試樣碳納米管的表面導(dǎo)入羧基作為官能團(tuán)。上述加熱處理完成后，通過(guò)孔徑為0.2(am的聚乙酸纖維素膜進(jìn)行過(guò)濾，回收導(dǎo)入羧基的碳納米管。用適量的純水對(duì)回收的碳納米管進(jìn)行6次洗凈，在8(TC干燥一晚。接著，在lmL的MES(2-(N-嗎啉)乙磺酸2-(N-Morpholino)ethanesulfonicAcid)緩沖液中混合lmg導(dǎo)入羧基的碳納米管，進(jìn)行10分鐘的超聲波處理。接著在含有上述導(dǎo)入羰基的碳納米管的MES液lmL中添加400mM的EDC(1-(3-二甲氨丙基)-3-碳二亞胺鹽酸鹽l-(3陽(yáng)(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride)溶液禾口100mM的NHSS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺N-hydroxysulfosuccinimide)溶液各lmL，充分?jǐn)嚢杌旌?5分鐘。由此進(jìn)行碳納米管表面的羧基的活化。之后以15000rpm進(jìn)行5分鐘離心分離，去上清。該用EDC和NHSS溶液的混合攪拌和離心處理重復(fù)共計(jì)6次。接著，在上述操作配制的碳納米管的表面固定纖維素酶。其中，纖維素酶購(gòu)入使用Sigma公司生產(chǎn)的C1794-5KU。具體而言，使上述碳納米管分散在pH調(diào)節(jié)為7的0.1M磷酸緩沖液中。向其中添加上述購(gòu)入的纖維素酶粉末，形成10mg/mL。并且在室溫條件下攪拌一晚。由此，得到通過(guò)碳納米管表面的羧基與纖維素酶分子中的氨基的酰胺鍵將纖維素酶固定在表面上的"載持有纖維素酶的碳納米管"。第二天，以15000rpm對(duì)上述分散液進(jìn)行7分鐘的離心分離，去上清。接著，在Murashige&Skoog培養(yǎng)基(MurashigeandSkoogmedium:以下稱(chēng)為"MS培養(yǎng)基")中將離心分離回收物(即載持有纖維素酶的碳納米管組分)洗凈。該離心分離處理和洗凈處理重復(fù)進(jìn)行4次。之后，最終在離心分離回收物中添加含有10%(w/v)n-辛基-P-D-葡萄糖苷的MS培養(yǎng)基lmL，得到載持有纖維素酶的碳納米管分散液(外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)。另外，該分散液在4'C保存，每次使用時(shí)用含有表面活性劑n-辛基-(3-D-葡萄糖苷的MS培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。使用原子力顯微鏡(AFM)觀察配制的載持有纖維素酶的碳納米管的狀態(tài)。懸臂前端的曲率為20nm。結(jié)果如圖1A和圖1B所示。圖1A是觀察在碳納米管表面固定纖維素酶之前的碳納米管的顯微鏡照片，圖1B是觀察上述配制好的固定纖維素酶之后的碳納米管的顯微鏡照片。其中，圖中黑色的箭頭表示本實(shí)施例中使用的碳納米管Carbere(注冊(cè)商標(biāo))特征的重疊底部打開(kāi)的杯狀物的疊層構(gòu)造。另外，白色的小箭頭表示碳納米管，白色的大箭頭表示纖維素酶。從這些圖可知，配制前的圖1A中，碳納米管的表面沒(méi)有附著任何物質(zhì)，而圖1B中碳納米管的表面固定有纖維素酶。作為外來(lái)物質(zhì)使用直徑為110nm左右的量子點(diǎn)，具體使用硒化鎘(CdSe)顆粒。該量子點(diǎn)從Invitrogen公司購(gòu)入。具體而言，將購(gòu)入的CdSe顆粒與三辛基氧膦(TOPO)在120°C反應(yīng)2小時(shí)。之后使用0.2pm的針筒過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將過(guò)濾得到的CdSe顆粒添加到含有0.5mg載持有纖維素酶的碳納米管的分散液(外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)中，在室溫保持原樣靜置2小時(shí)。之后以15000rpm進(jìn)行5分鐘離心分離，去上清。將離心分離回收物在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行4次洗凈，除去剩余的CdSe顆粒，得到吸附CdSe顆粒的載持有纖維素酶的碳納米管(含CdSe的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)。該CdSe顆粒在細(xì)胞內(nèi)具有作為熒光探針的作用，在該顆粒導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)時(shí)，能夠通過(guò)熒光檢測(cè)容易地進(jìn)行觀察。在含有的10%(w/v)OG的細(xì)胞懸濁液10mL中添加如上所述配制的吸附CdSe顆粒的載持有纖維素酶的碳納米管(含CdSe的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)。之后在37'C培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察添加后經(jīng)過(guò)1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)時(shí)的細(xì)胞的狀態(tài)。其中，光源使用汞燈。激發(fā)波長(zhǎng)為480nm。結(jié)果如圖2A圖2D所示。圖2A表示添加碳納米管后經(jīng)過(guò)1小時(shí)時(shí)的細(xì)胞，圖2B表示經(jīng)過(guò)2小時(shí)時(shí)的細(xì)胞，圖2C表示經(jīng)過(guò)3小時(shí)時(shí)的細(xì)胞，圖2D表示經(jīng)過(guò)5小時(shí)時(shí)的細(xì)胞。從這些圖(顯微鏡照片)可知，通過(guò)利用載持有纖維素酶的碳納米管，能夠在靶植物細(xì)胞的細(xì)胞壁上開(kāi)孔，從而快速且簡(jiǎn)便地向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入目的的外來(lái)物質(zhì)(在此為量子點(diǎn))。另外，從添加載持有纖維素酶的碳納米管開(kāi)始經(jīng)過(guò)5小時(shí)后，能夠觀察到導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的量子點(diǎn)大半存在于小泡(液泡)內(nèi)。另外，如圖3所示，通過(guò)顯微鏡觀察(利用投射照明的亮視野觀察)能夠確認(rèn)處理中使用的載持有纖維素酶的碳納米管也通過(guò)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。圖示的數(shù)據(jù)為從添加載持有纖維素酶的碳納米管開(kāi)始經(jīng)過(guò)30秒的時(shí)刻的數(shù)據(jù)。另外，可以觀察到進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的碳納米管接著在小泡(液泡)中聚集。但是，沒(méi)有發(fā)生由于碳納米管本身的導(dǎo)入而引起的細(xì)胞損傷性，從細(xì)胞維持的觀點(diǎn)出發(fā)，碳納米管本身向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入沒(méi)有問(wèn)題。另外，為了確認(rèn)圖2AD所示的結(jié)果是碳納米管的纖維素酶活性所引起的，在上述配制的載持有纖維素酶的碳納米管分散液(外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)10mL中，添加200mg市售的纖維素粉末(Sigma公司產(chǎn)品)，并進(jìn)行攪拌混合，配制纖維素處理液。將得到的處理液在37'C孵育一晚。孵育結(jié)束后，使用日立SV1100裝置對(duì)纖維素處理液(水液)進(jìn)行電泳并觀察。其結(jié)果，如圖4的曲線圖可知，檢測(cè)出纖維素的水解產(chǎn)物葡萄糖(圖中的遷移時(shí)間(MigrationTime):80秒附近的峰)和纖維素二糖(圖中的遷移時(shí)間(MigrationTime):100秒附近的峰)。這顯示本實(shí)施例中使用的載持(固定)于碳納米管的纖維素酶沒(méi)有失去酶活性，在細(xì)胞處理液(細(xì)胞懸濁液)中維持能夠分解纖維素的功能。另外，圖5是本實(shí)施例中外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入方法的示意圖。符號(hào)1表示植物細(xì)胞，2表示載持有纖維素酶的碳納米管，3表示量子點(diǎn)。該圖描述了從通過(guò)固定于碳納米管的纖維素酶產(chǎn)生的微小孔4，量子點(diǎn)3和碳納米管2向植物細(xì)胞1內(nèi)導(dǎo)入的狀態(tài)。另外，對(duì)于向靶植物細(xì)胞(Arabidopsisthaliana)內(nèi)導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)時(shí)，表面活性劑n-辛基-P-D-葡萄糖苷(以下稱(chēng)為"OG")和細(xì)胞壁分解酶纖維素酶對(duì)導(dǎo)入效率的影響進(jìn)行研究。在0.75%(w/v)15%(w/v)的不同濃度的含有OG的細(xì)胞懸濁液中分別添加如上所述配制的吸附CdSe顆粒的載持有纖維素酶的碳納米管(含CdSe的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)，在25C培養(yǎng)3小吋。研究培養(yǎng)后各自向植物細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率。另外，對(duì)使用不載持纖維素酶的碳納米管時(shí)的導(dǎo)入效率也用同樣的方法進(jìn)行研究。該結(jié)果表示于表1中。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表l所示的結(jié)果可知，含有OG的細(xì)胞懸濁液(以下稱(chēng)為"OG溶液")的OG濃度越高，導(dǎo)入效率越大。向10%(w/v)的OG溶液中添加時(shí)的導(dǎo)入效率最大，為20.2%。但是，向15n/。(w/v)的OG溶液中添加時(shí)的導(dǎo)入效率小于向10%(w/v)的OG溶液中添加時(shí)的導(dǎo)入效率，為17.5%。另外，用不含OG的細(xì)胞懸濁液嘗試導(dǎo)入時(shí)，導(dǎo)入效率顯著降低至3%。另一方面，使用不含OG的細(xì)胞懸濁液并且使用不載持纖維素酶的碳納米管時(shí)，導(dǎo)入效率為0%，相對(duì)于此，即使在不載持纖維素酶的碳納米管的情況下，向含有10n/。(w/v)OG的OG溶液中添加時(shí)，導(dǎo)入效率為9%。由此顯示，高效率地向植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)，與OG和纖維素酶的存在，特別是與OG的存在有關(guān)。并且，顯示導(dǎo)入效率依賴(lài)于OG溶液的濃度。另夕卜，準(zhǔn)備不含細(xì)胞懸濁液的0.75。/。(w/v)、6。/。(w/v)和10%(w/v)的OG溶液，向各OG溶液中添加載持有纖維素酶的碳納米管(外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)，在電子顯微鏡下觀察拍攝碳納米管的狀態(tài)。其結(jié)果，雖未圖示，但是向0.75%(w/v)的OG溶液中添加時(shí)幾乎觀察不到碳納米管的無(wú)規(guī)運(yùn)動(dòng)，但是向6%(w/v)和10%(w/v)的OG溶液中添加時(shí)觀察到碳納米管的平移、旋轉(zhuǎn)等的布朗運(yùn)動(dòng)。另外，可以確認(rèn)該運(yùn)動(dòng)在向10%(w/v)的OG溶液中添加時(shí)最為活躍。由此，可以確認(rèn)，通過(guò)預(yù)先在細(xì)胞培養(yǎng)液或載持有纖維素酶的碳納米管(外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)中添加OG，能夠進(jìn)一步促進(jìn)載持有纖維素酶的碳納米管的無(wú)規(guī)運(yùn)動(dòng)。<第二實(shí)施例>在本實(shí)施例中，作為靶細(xì)胞，使用來(lái)自采自高等植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的胚軸的細(xì)胞懸濁液。該細(xì)胞懸濁液的配制方法與上述第一實(shí)施例相同。另一方面，向2.5mL的含有10%(w/v)n-辛基-P-D-葡萄糖苷的MS培養(yǎng)基中添加與實(shí)施例1相同地制作的載持有纖維素酶的碳納米管2.5mg，得到本實(shí)施例的載持有纖維素酶的碳納米管分散液。將得到的分散液分別注入5個(gè)直徑3.5cm的皮氏培養(yǎng)皿。接著，在各皮氏培養(yǎng)皿中添加0.5mL上述細(xì)胞懸濁液。接著小心混合。在本實(shí)施例中，作為外來(lái)物質(zhì)，使用含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因、半乳糖苷酶基因的市售的植物細(xì)胞用DNA載體(Ckmtech公司的產(chǎn)品，pBI系載體，這里為pBI121)。具體而言，用MS培養(yǎng)基稀釋該DNA載體，在各皮氏培養(yǎng)皿中添加，使DNA濃度為2,5嗎/mL、5|ug/mL、7.5|ig/mL、10昭/mL、12.5pg/mL的5個(gè)階段。將如上所述的添加有碳納米管和DNA載體的細(xì)胞懸濁液(處理液)在25。C培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將懸濁液中的細(xì)胞移至含有l(wèi)mg/mL的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D，合成植物生長(zhǎng)激素)和0.5mg/mL的激動(dòng)素(N、呋喃甲基腺嘌呤(N6-furfUryladenine)，細(xì)胞分裂素的類(lèi)似物)的MS培養(yǎng)基上，在25。C培養(yǎng)24小時(shí)。之后，回收細(xì)胞，進(jìn)一步將該回收的細(xì)胞在含有上述濃度的2，4-D和激動(dòng)素、還含有50|ig/L的卡那霉素的MS培養(yǎng)基上在25。C繼續(xù)培養(yǎng)。開(kāi)始在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天后，確認(rèn)培養(yǎng)細(xì)胞的生存。這顯示上述DNA載體導(dǎo)入培養(yǎng)中的植物細(xì)胞中，該載體中含有的卡那霉素耐性基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因)進(jìn)行表達(dá)。因此，可以確認(rèn)在本實(shí)施例中，通過(guò)本發(fā)明的方法，能夠容易并且簡(jiǎn)便地將目的外來(lái)物質(zhì)(特別是基因等的活性分子)向植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入。另外，本實(shí)施例顯示通過(guò)實(shí)施本發(fā)明的導(dǎo)入方法，能夠容易地得到轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。<第三實(shí)施例>在本實(shí)施例中，作為外來(lái)物質(zhì)，使用包含GFP(綠色熒光蛋白GreenFluorescentProtein)表達(dá)基因的市售的植物細(xì)胞用DNA載體(Invitrogen公司制品，pBI系載體，這里為pBI-GW-NOS載體)。另外，除了變更外來(lái)物質(zhì)以外，按照與第一實(shí)施例相同的方法，使用來(lái)自釆自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的胚軸的細(xì)胞懸濁液和配制的載持有纖維素酶的碳納米管。具體而言，向IO嗎含有載持有纖維素酶的碳納米管的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液中添加pBI-GW-NOS載體，使得濃度達(dá)到750ng/pL，在25°C靜置2小時(shí)。之后，向含有10%(w/v)OG的細(xì)胞懸濁液(每liuL含10個(gè)細(xì)胞)lOmL中添加該溶液，在25'C培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時(shí)后，確認(rèn)GFP的表達(dá)。圖6是培養(yǎng)后的Arabidopsisthaliana細(xì)胞的三維重構(gòu)圖。由圖6可以確認(rèn)Arabidopsisthaliana細(xì)胞中綠色發(fā)光的GFP的表達(dá)。另外，可以確認(rèn)在細(xì)胞內(nèi)部存在大量的碳納米管。這顯示pBI-GW-NOS載體向植物細(xì)胞中導(dǎo)入，該載體中含有的GFP進(jìn)行表達(dá)。另外，本實(shí)施例的導(dǎo)入效率平均為6%。由此，可以確認(rèn)在本實(shí)施例中，通過(guò)本發(fā)明的方法，利用載持有纖維素酶的碳納米管，在靶植物細(xì)胞的細(xì)胞壁上開(kāi)孔，能夠快速且簡(jiǎn)便地將目的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。另外，本實(shí)施例顯示通過(guò)實(shí)施本發(fā)明的導(dǎo)入方法，能夠容易地得到轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。<第四實(shí)施例>在本實(shí)施例中，作為耙細(xì)胞，使用來(lái)自采自其它的高等植物豆科的甘草(Glycyrrhizaglabra)的胚軸的細(xì)胞懸濁液，嘗試載持有纖維素酶的碳納米管向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入。該細(xì)胞懸濁液通過(guò)以下操作配制。培養(yǎng)基使用Linsmaier&Skoog培養(yǎng)基(LinsmaierandSkoogmedium,以下稱(chēng)為"LS"培養(yǎng)基)。其中，除了變更靶細(xì)胞以外，使用與第一實(shí)施例同樣的方法配制的載持有纖維素酶的碳納米管和外來(lái)物質(zhì)。艮f]，將采自滅菌后的甘草種子的胚軸組織移至愈傷組織培養(yǎng)用LS瓊脂培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基通過(guò)在含有O.lmM的萘乙酸(NAA)、l)aM的芐基腺嘌呤(BA)的愈傷組織培養(yǎng)用LS培養(yǎng)基(pH5.8)上添加瓊脂而配制。這樣，在暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)約3周，直至形成愈傷組織。生出的愈傷組織每三周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)在暗條件下以25。C進(jìn)行。接著，將愈傷組織添加到25mL的上述愈傷組織培養(yǎng)用LS培養(yǎng)基中，通過(guò)使其緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)，將愈傷組織分散，配制細(xì)胞懸濁液。培養(yǎng)在暗條件下以25。C進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)液(懸濁液)每四周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。向含有10%(w/v)OG的細(xì)胞懸濁液10mL中添加按照與第一實(shí)施例相同的方法配制的吸附CdSe的載持有纖維素酶的碳納米管(含有CdSe的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液)，在25"C培養(yǎng)8小時(shí)。培養(yǎng)后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)。該觀察時(shí)拍攝的照片表示于圖7A圖7D中。每一個(gè)圖拍攝的都是同一視野。圖7A是拍攝綠色發(fā)光的吸附CdSe的載持有纖維素酶的碳納米管的照片。圖7B是拍攝以DAPI染色的靶細(xì)胞的核酸的照片。圖7C是拍攝載持有纖維素酶的碳納米管和核酸的照片。圖7D是利用投射照明的亮視野觀察照片。由圖7A圖7D可以確認(rèn)，在細(xì)胞內(nèi)、特別是在核內(nèi)存在大量綠〃、-、1,JJx_U4^/,亇八tVneb厶/-T山/.丄、，/ZrA"、_X*I=t~\1=1.、Arrjn/~t上L十!、-色次兀tr、j執(zhí)付fl5T難系鵬tf、J碳別不苜。込並不守八細(xì)肥hJtf」載持有纖維素酶的碳納米管被輸送至小泡(液泡)內(nèi)，也在核內(nèi)局部存在。因此可以確認(rèn)，通過(guò)本發(fā)明的方法，利用載持有纖維素酶的碳納米管，在靶植物細(xì)胞Glycyrrhizaglabra的細(xì)胞壁上開(kāi)孔，能夠快速且簡(jiǎn)便地將目的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。另外，本實(shí)施例顯示通過(guò)實(shí)施本發(fā)明的導(dǎo)入方法，能夠容易地得到轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。如上所述，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)使用載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管，能夠取代現(xiàn)有的用于導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)的繁瑣且成功率低的方法，簡(jiǎn)便且容易地將所期望的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的細(xì)胞(特別是植物細(xì)胞)內(nèi)。另外，通過(guò)作為外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入能夠在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因(多核苷酸)或基因構(gòu)筑物(載體等)，育b夠容易地獲得轉(zhuǎn)化體。產(chǎn)業(yè)上的可利用性另外，本發(fā)明的方法不限于上述試驗(yàn)例，能夠適用于例如將質(zhì)粒DNA以外的多核苷酸(反義寡DNA、RNA等)、蛋白質(zhì)(酶等)、或者功能性肽、寡糖等的低分子物質(zhì)作為封入物質(zhì)的微小膠囊的制造。另外，本方法中使用的基材能夠與現(xiàn)有方法中使用的微片同樣容易地進(jìn)行批量生產(chǎn)。權(quán)利要求1.一種向具有細(xì)胞壁的細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)的方法，其特征在于，包括準(zhǔn)備載持有至少一種細(xì)胞壁分解酶的碳納米管的步驟；向含有所述細(xì)胞的處理對(duì)象供給所述載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管和作為導(dǎo)入對(duì)象的外來(lái)物質(zhì)的步驟；通過(guò)與所述細(xì)胞接觸的碳納米管所具有的所述分解酶的作用，分解該細(xì)胞的細(xì)胞壁的步驟；和從所述細(xì)胞壁被分解的部位，向所述細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入目的外來(lái)物質(zhì)的步驟。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于作為所述酶，使用至少一種的纖維素酶。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于作為所述碳納米管，使用全長(zhǎng)(平均值)為10pm以下的碳納米管。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于預(yù)先向含有表面活性劑的溶液中添加所述準(zhǔn)備好的載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管，配制外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液，向含有所述細(xì)胞的處理對(duì)象供給該配制得到的溶液。5.如權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞處理對(duì)象是含有所述細(xì)胞的處理液，該細(xì)胞處理液含有表面活性劑。6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于作為所述表面活性劑，使用n-辛基-p-D葡萄糖苷。7.如權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于作為所述外來(lái)物質(zhì)，導(dǎo)入多核苷酸。8.如權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。9.一種細(xì)胞，其特征在于.-通過(guò)權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的方法，外來(lái)物質(zhì)被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其特征在于該細(xì)胞是植物細(xì)胞。11.如權(quán)利要求9或IO所述的細(xì)胞，其特征在于載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管與所述外來(lái)物質(zhì)一起導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。12.—種外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用的試劑盒，其用于向具有細(xì)胞壁的細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)，其特征在于包括至少一種細(xì)胞壁分解酶、碳納米管、和含有至少一種表面活性劑的外來(lái)物質(zhì)導(dǎo)入用溶液。13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于所述酶是至少一種的纖維素酶。14.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于所述表面活性劑是n-辛基-(3-D-葡萄糖苷。15.如權(quán)利要求1214中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述碳納米管上載持有所述至少一種的細(xì)胞壁分解酶。全文摘要本發(fā)明的方法向具有細(xì)胞壁的細(xì)胞(1)導(dǎo)入外來(lái)物質(zhì)(3)。該方法包括準(zhǔn)備載持有至少一種細(xì)胞壁分解酶的碳納米管(2)的步驟，向含有上述細(xì)胞(1)的處理液中供給載持有細(xì)胞壁分解酶的碳納米管(2)和作為導(dǎo)入對(duì)象的外來(lái)物質(zhì)(3)的步驟，通過(guò)與上述細(xì)胞(1)接觸的碳納米管(2)所具有的細(xì)胞壁分解酶的作用分解該細(xì)胞(1)的細(xì)胞壁的步驟，和通過(guò)細(xì)胞壁被分解的部位向細(xì)胞(1)內(nèi)導(dǎo)入目的外來(lái)物質(zhì)(3)的步驟。文檔編號(hào)C12N15/82GK101688218SQ20088002118公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年6月11日優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日發(fā)明者I·M·F·S·E·巴尤米,加地范匡,渡慶次學(xué),馬場(chǎng)嘉信申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人名古屋大學(xué)