微米和納米顆粒與血小板一起的遞送的制作方法

專利名稱：微米和納米顆粒與血小板一起的遞送的制作方法
微米和納米顆粒與血小板一起的遞送
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及將活性藥物和成像納米顆粒遞送至需要的患者的方法和組合物。2.相關領域的簡述維管組織的損傷和感染的治療和診斷通常是個問題，并且結果是給予這些損傷或 感染部位適當?shù)闹委熓抢щy的。這些困難阻礙了對這些特定疾病和病癥的有效治療的發(fā) 展，以下將描述其實例。例如，特別是由于觸染的嚴重性和常常致命的結果，出血熱病毒感 染給醫(yī)學提出了重要的挑戰(zhàn)(Borio等，JAMA 287,1-51 (2002)) 0出血熱是由不同組的病毒 引起的，這些病毒發(fā)揮高度不同的病理作用。然而，在這些病毒的發(fā)病機理中存在兩個共同 的步驟(一個早期，一個晚期)。首先，占優(yōu)勢的證據(jù)表明作為先天免疫系統(tǒng)組分的巨噬細 胞(單核細胞)的感染在出血熱病毒的繁殖中起著重要的初始作用。其次，出血病毒的感 染導致出血，并且在許多情況中，傷口部位是病毒損害脈管細胞的結果。出血熱病毒是絲狀病毒科(Filoviridae)、沙狀病毒科(Arenaviridae)、布尼亞 病毒科(Bunyaviridae)和黃病毒科(Flaviviridae)的成員并具有由單鏈RNA組成的基因 組。通常，病毒通過以下機理起作用(1)血小板減少-血小板水平的降低是出血熱病毒感 染幾乎全有的結果；(2)血小板機能不全-血小板功能障礙加劇了出血熱中的血小板減少 癥狀；(3)降低的體液凝血因子濃度-體液凝血因子循環(huán)水平的下降可能是由于降低的因 子合成而由肝組織的消耗(和傷口部位的血小板或DIC—起)和/或損傷引起的；和(4) 血管完整性的失去-內皮完整性的失去，導致血漿滲漏和微血管傷口部位的形成，是出血 熱疾病中的常見特征。因此，用于處理這些病毒的藥物選擇受到了限制。病毒唑是在1972年初次報道的核苷類似物，其具有廣譜抗病毒活性。盡管病毒唑 (單磷酸鹽)已經顯示出抑制肌苷單磷酸鹽脫氫酶，用于降低細胞GTP，更近的研究表明該 核苷類似物通過提高病毒對于“致死誘變”的內在突變率來起作用。在組織培養(yǎng)物中，病毒 唑具有對抗多種病毒的抗病毒活性，包括黃病毒、沙粒病毒和本楊病毒。更重要的，病毒唑 已經由FDA批準用于治療黃病毒科成員丙肝病毒，并且已經在有限數(shù)量的沙粒病毒感染患 者的治療中顯示出功效。另一方面，三個觀察結果降低了對病毒唑作為抗病毒劑的關注。首先，基于病毒唑 體內性能的預示沒有在臨床中完全實現(xiàn)。例如，已經報道了病毒唑在治療絲狀病毒科和黃 病毒科成員感染中是無效的(Borio等，出處同上)。其次，已經表明該核苷類似物在感染丙 肝病毒的患者中限制了肝組織損傷，但需要使用干擾素的雙重治療來用于病毒清除。最后， 病毒唑化療的副作用是誘發(fā)了貧血，這是紅血球滲透和裂解的結果。因此，需要新的方式來 給藥病毒唑和其他這樣的活性劑。另一個實例是跌打損傷的診斷。組織損傷的精確判定在跌打損傷控制中最為重 要。該判定中的關鍵要素，特別是在血流動力學不穩(wěn)定或臨界穩(wěn)定的患者中，是內出血部位 位置的確定。身體檢查，傳統(tǒng)的造影劑的X-射線血管造影術和血管外造影劑的CT定位可 以用來確定活動性出血部位的位置?；跇擞浖t血球的放射性方法是有用的，但常常未能檢測出血部位。這些技術可能是有效的，特別是一起使用時。然而，血管痙攣和血管阻塞， 以及幾個出血部位的共同定位可能導致鑒定出血部位的失敗。此外，造影劑的密度可能使 較小的出血部位閉塞。這后一問題已經通過使用較低χ-射線密集的C02造影劑得到了部 分改善。研發(fā)用于檢測出血轉化中血管缺損的MRI方法的應用有希望作為用于一些類型損 傷中傷口部位定位的工具，這些類型的損傷包括腦創(chuàng)傷和脊髓損傷。然而，使用上述方法的 基礎問題是成像是基于血管內含物從循環(huán)系統(tǒng)移動出來，而沒有使血管破裂的確切血管病 部位直接成像。另一個實例是癌癥的治療，如前列腺癌。前列腺癌仍然是中老年美國男性發(fā)病率 和死亡率的主要誘因。盡管在活組織檢查后看到了幾種組織學類型的前列腺癌，大多數(shù)前 列腺癌是腺性來源的腺癌。診斷的進展導致所有前列腺癌的大約90%是在前列腺內或附 近發(fā)現(xiàn)的。對于相對早期檢測到的90%的情況，五年存活率達到100%。相反，10%代表彌 散性疾病只經歷34%的五年存活率。只有皮膚癌和四種常見組織學類型的肺癌的聯(lián)合死 亡率在該人群中更常見。在2007年，美國癌癥協(xié)會預期218，890新病例的臨床癥狀，是大 約27，050例死亡的主要誘因。六名美國男性中將有一名值得注意的在某個時間產生前列 腺癌，34名中的一名將死于惡性腫瘤。與目前護理標準的治療相關的潛在嚴重不利事件的簡要概括說明了入侵較少、更 小心地靶向、腫瘤特異性診斷和治療方法的希求。理想的是最小化對健康前列腺、神經和其 他前列腺外部組織的損傷，同時與目前護理標準的外科手術或放療相比，保持或提高腫瘤 殺滅功效。與前列腺癌外科手術(開腹恥骨后前列腺切除術、開腹經會陰前列腺切除術、腹 腔鏡前列腺切除術或前列腺的經尿道切除)相關的嚴重不利情況包括陽痿、失禁和術后感 染。放療后的陽痿率與外科手術的相同，超過十分之七的男性在外部束放療的五年內變成 陽痿。盡管失禁比外科手術后少見，但失禁的風險在放療后直至治療后六年每年遞增，比例 幾乎和外科手術相關的一樣高。雄激素切除仍然是晚期前列腺癌的標準療法，并在大部分 男性中引起疾病緩解。然而，癌癥最終復發(fā)，并且此后患者的中值存活低于一年。對研發(fā)用 于定向能量傳遞的納米顆粒負載血小板所提出項目的結果對改進這些困難中的多個困難 抱有希望。關鍵需要改善目前前列腺癌中的護理標準，而本發(fā)明可能是對該需求的響應。另一個實例是心血管疾病及其相關血管病理學的治療。對于心血管疾病治療需求 未滿足的性質通過美國超過60百萬診斷為心血管系統(tǒng)障礙患者每年超過$300十億的花費 得到證明。大部分心血管疾病由血管損傷部位的血栓形成、炎癥和增殖性過程的協(xié)調機能 障礙引起。例如，急性心肌梗塞是炎癥和增殖性過程導致動脈粥樣硬化斑破裂時產生的冠 狀循環(huán)的血栓形成閉塞的結果。相似地，血管成形術和心臟分流術后的再狹窄是最初血栓 形成，然后在程序的最初血管損傷部位的炎癥和增殖性過程的結果。對基于心血管疾病中 形成血栓、炎癥和動脈粥樣硬化過程的分子機理日增的理解形成用于基因治療干涉的各種 策略，包括干擾胞內信號和細胞周期控制，擴大抗血栓形成胞內信號，抑制致動脈粥樣硬化 脂質代謝。目前使用幾種方法來獲得位點特異性基因遞送，用于心血管基因治療，包括使用 導管介導的基因轉移和直接針注射至外膜的物理靶向。通過使用組織特異性啟動子(例 如，用于平滑肌細胞遞送的SM2》獲得另外的特異性水平。然而，期望有更多將治療化合物 特異性地遞送至損傷部位(包括血管損傷)的工具。血小板是體內循環(huán)血液系統(tǒng)的成分，并且是本領域公知的。美國專利申請公開2005/0025748和2005/0272161公開了攜帶活性劑并用于將活性劑遞送至目標部位的固定 的-干燥的血細胞和固定的-干燥的血小板。這些申請中的血細胞和血小板通過化學處理 來“固定”，將至少一種化合物摻入至少一部分細胞中，以在結構上穩(wěn)定和/或延長細胞的 保存期。公開的固定劑包括甲醛、多聚甲醛和戊二醛，以及高錳酸鹽溶液。然而，理想的是 消除固定步驟，以便更快速和清潔地處理攜帶所需活性劑的血小板。發(fā)明概述本發(fā)明是裝載納米顆粒的血小板以及用于給血小板裝載納米顆粒的方法。將所得 到的裝載納米顆粒的血小板用于將治療法和成像藥征遞送至血管損傷部位以及人體中的 巨噬細胞和獸醫(yī)藥物?？梢詫⒀b載納米顆粒的血小板灌輸至體循環(huán)中或局部應用于損傷表在一個方面中，本發(fā)明涉及含有微米或納米大小顆粒的血小板，微米或納米大小 的顆粒含有活性劑。在另一個方面中，本發(fā)明涉及含有藥物學上可接受的載體和血小板的藥物組合 物，該血小板含有微米或納米大小的顆粒，該微米或納米大小的顆粒含有活性劑和藥物學 上可接受的載體。再一個方面中，本發(fā)明涉及將血小板遞送至患者體內目標部位的方法，該血小板 含有微米或納米大小的顆粒，該顆粒含有活性劑，該方法包括步驟提供上述血小板，并將 所述血小板給予患者。從以下本發(fā)明的附圖和詳述將更全面地了解這些和其他方面。附圖簡述結合附圖，從以下的詳述將更全面地了解本發(fā)明。

圖1是電子透射顯微照片，其描繪了用于納米顆粒的PEI與質粒DNA的聚集。圖2是電子透射顯微照片，其描繪了血小板中基于PEI的納米顆粒。圖3是電子透射顯微照片，其描繪了血小板中超-順磁氧化鐵納米顆粒。圖4是電子透射顯微照片，其描繪了血小板中SPIO納米顆粒的自組織。圖5是電子透射顯微照片，其描繪了通過磁場調節(jié)后裝載SPIO的顆粒。圖6是電子透射顯微照片，其描繪了臍靜脈中裝載SPIO顆粒的B-模式成像。圖7顯示了裝載SPIO顆粒的磁共振和回聲響應。圖8顯示了電子透射顯微照片，其描繪了雄激素除去后定位于前列腺腫瘤的顆 粒。圖9是電子透射顯微照片，其描繪了前列腺異種移植組織中的顆粒。圖10顯示了聚乙烯亞胺/基于聚陰離子的納米顆粒的制備。圖11顯示了電子透射顯微照片，其描繪了標記的納米顆粒與血小板的結合。圖12顯示了熒光顯微照片和生物工程化血小板的流式細胞計數(shù)特征；圖13顯示了幾種血小板的顯微鏡熒光。圖14顯示了裝載病毒唑的血小板。圖15顯示了吞噬標記的血小板的單核細胞的結果。圖16顯示了基于小單層泡囊的納米顆粒的解剖。圖17顯示了附著于血小板的SUV納米顆粒。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及血小板作為載體來攜帶各種治療或成像劑的用途。血小板是合理的載 體，并且出于幾個原因，對于將治療劑遞送至兩種類型的血管部位是有利的。首先，廣泛地認識到血小板結合到血管破裂部位上以提供止血，并且有利地將裝 載治療劑的血小板集中至血管損傷部位。例如，如果將抗癌劑遞送至脈管系統(tǒng)受損的腫瘤， 將是有利的。如果將抗病毒劑遞送至出血熱中的血管破裂部位，也將是有利的。此外，將出 血部位成像的需求對于跌打損傷的診斷以及外科手術指引都是重要的。其次，結合到血管損傷部位上的血小板的最終命運是在傷口愈合過程中由巨噬細 胞吞噬。或者，輸入的細胞通過網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)(RES)的巨噬細胞從自由循環(huán)中清除出去。 巨噬細胞是許多類型的病毒(包括出血熱病毒)感染的重要部位，并且與病理性炎癥反應 的產生密切相關。因此，存在許多醫(yī)學情況，其中應當靶向巨噬細胞，用于成像和抗炎治療 劑遞送。巨噬細胞驅使的炎癥常常是血管破裂的基本原因，例如在出血熱、炎性腸病和中風 中的出血性轉化中。相反也是正確的；血管破裂可以是巨噬細胞驅使的炎癥狀態(tài)的基礎原 因。例如，在涉及外傷過量失血的嚴重失血性休克中，炎性介質的大量全身性釋放可以使止 血系統(tǒng)失活，因此加劇了失血。相似地，巨噬細胞活化是過量失血后多個器官衰竭的重要誘 因。因此，炎癥和血液學過程與協(xié)同的因果方式密切相關。因此，對于裝載治療和成像納米 顆粒的血小板，存在許多潛在的醫(yī)學應用。待用本發(fā)明的方法和組合物治療的患者包括人患者以及用于獸醫(yī)學和藥物研發(fā) 目的的動物患者。通常，動物患者是哺乳動物患者，包括但不限于豬、綿羊、奶牛、馬、山羊、 貓、狗、小鼠和大鼠患者，在此所用的術語“形成血栓的表面”指的是任何天然的或人造的形成血栓的表面， 包括但不限于創(chuàng)傷組織，血管斑，如動脈粥樣硬化斑，由于局部或全身性炎癥活化的內皮， 患者體內由于抗癌、抗腫瘤或抗增殖藥劑的給藥引起的毒性副作用而致使形成血栓的血 管、表面或組織，患者體內外源或植入物體的表面，包括金屬、聚合物等，如在支架、導管、生 物醫(yī)學植入物(如起搏器和引線)、整形外科植入物(如人造關節(jié))等中發(fā)現(xiàn)的?？梢詫⒒?合物給予形成血栓的表面，用于任何目的，如用于治療目的或診斷目的(例如，通過任何合 適的方式成像或檢測形成血栓的表面，如放射性成像、活組織檢查、植入物取出和是否在植 入物表面發(fā)現(xiàn)遞送的化合物的確定等)。如在此限定的術語“血小板”通常是動物來源的，并優(yōu)選是哺乳動物來源的(例 如，豬、綿羊、奶牛、馬、山羊、貓、狗、小鼠、大鼠、人等)。血小板可以源自將血小板引入其中 的相同物種，或來自將血小板引入其中的不同物種。在一個實施方案中，從患者收集血小 板，用于制備在此所述的活性劑，并在如此制備后，在稍后的時間將其返回從其收集血小板 的同一患者。血小板可以是新鮮的、自體同源的、同種異體的或再水合-凍干的(“RL”)。在此“固定的”指的是已經用至少一種化合物化學處理過的血小板，該化合物被引 入至少部分細胞，以在結構上穩(wěn)定和/或延長細胞的保存期。優(yōu)選，本發(fā)明的血小板是未固 定的。在此“固定-干燥的”指的是血小板已經固定并另外通過任何合適的技術(如干 燥、脫水、凍干或冷凍干燥等)從其除去水分以進一步在結構上穩(wěn)定和/或延長其保存期。“再水合”指的是已經與水溶液接觸或混合的固定-干燥的血小板，使得水吸收至胞內空間。如在此所用的“凝血蛋白”包括任何合適的凝血蛋白，包括但不限于因子VII、因子 IX、因子X以及產生因子VII或FVIIa(如因子XII或因子XIIa)或因子X或因子)(a，蛋白 C，蛋白S和凝血酶原的凝血蛋白。這樣的蛋白質可以是天然的或合成的，并包括含有天然 產生蛋白質少量修飾的蛋白質(即，類似物)。其中天然產生蛋白質可以是任何物種來源 的，優(yōu)選如在此所述的哺乳動物或人，并且在一個實施方案中，與待給藥的患者是相同的物 種來源。如在此所用的“抗凝血蛋白，，包括任何合適的抗凝血蛋白，包括但不限于活化蛋白 C、蛋白S、肝素和類肝素等。這樣的蛋白質可以是天然的或合成的，并包括含有天然產生蛋 白質少量修飾的蛋白質(即，類似物)。其中天然產生蛋白質可以是任何物種來源的，優(yōu)選 如在此所述的哺乳動物或人，并且在一個實施方案中，與待給藥的患者是相同的物種來源。
如在此所用的“AAV”指的是“腺伴隨病毒”。如在此所用的術語“治療”指的是給予患病患者益處的任何類型的治療，包括患者 病癥的改善(例如，一個或多個癥狀)、疾病進展的延遲等。如在此所用的術語“藥物學上可接受的”意思是化合物或組合物適于給予患者以 實現(xiàn)在此所述的治療，根據(jù)疾病的嚴重程度和治療的必要性沒有不適當?shù)挠泻Ω弊饔?。?在此所用的“載體”意思是制藥領域已知的與活性劑聯(lián)合使用來制備藥物組合物的載體。 藥物載體的實例包括固體、液體或含水載體，如離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血 清蛋白，如人血清白蛋白，緩沖物質，如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸 的偏甘油酯混合物，水，鹽或電解質，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉(鹽 水)，鋅鹽，硅膠，三硅酸鎂，聚烯吡咯烷酮，纖維素基物質，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙 烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚樣丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂，及其組合。關于顆粒使用術語“微”和“納”時，指的是顆粒的直徑大小。前綴“微”指的是具 有大于300納米直徑的顆粒。前綴“納”指的是具有300nm或更小直徑的顆粒。本發(fā)明的微米和/或納米顆?？梢詮母鞣N材料制得，包括但不限于天然和合成的 聚合物，樹枝狀骨架，小分子的聚集體，鐵磁性材料，磷脂囊，膠束，脂質體及其組合。可以使 用本領域已知的技術制得本發(fā)明的微和/納米顆粒，包括聚集，如在陽離子納米顆粒的情 況中(參見，例如，Lu W, Wan J, She Ζ, Jiang X，J Control Release. (2007) 118 :38-53 ； Feng Μ, Lee D, Li P, Int. J. Pharm. (2006)311 :209-214 ；Gupta K, Ganguli M, Pasha S, Maiti S.Biophys. Chem. (2006) 119 :303-306 ；Dawson M, Krauland E, Wirtz D, Hanes J, Biotechnol. Prog. (2004) 20 :851-857 ；Sennerfors Τ, Solberg D, Tiberg F.J.Colloid Interface Sci. (2002) 254 :222-226)，和飽和點沉淀，如在氧化鐵超順磁納米顆粒的情況 中(參見，例如，CorotC，Robert P, Idee JM, Port Μ, Adv. Drug Deliv. Rev. (2006)58 1471-1504 ；Ma HL, Qi XR, Maitani Y, Nagai Τ.Int. J. Pharm. (2007)333 :177-186 ；Thorek DL,Chen AK,Czupryna J,TsourkasA. Ann. Biomed. Eng. (2006)34 :23-38 ；Babes L,Denizot B, Tanguy G, Le Jeune JJ, Jallet P.J. Colloid Interface Sci. (1999)212:474—482)。本發(fā)明的微米和/或納米顆粒可以采用幾種形式。在一個實施方案中，顆粒是由 活性劑制得的固體均勻顆粒。在另一個實施方案中，這些固體顆粒覆蓋惰性材料，如聚乙烯 亞胺(PEI)或葡聚糖。本發(fā)明的組合物和方法中所用的活性劑包括治療和成像劑，包括但不限于蛋白質、RNA、DNA、螯合功能、放射性化合物、鐵磁化合物、超順磁復合物、小分子及其 組合?；钚詣┑钠渌麑嵗ㄑ跆畛浞肿?，其在受輻射時變成自由基。惡性腫瘤常常比其 正常的組織對應物具有更低的氧水平，并且通過輻射殺滅腫瘤細胞的主要機理是細胞毒性 自由基的形成，即，含有高度反應性自由電子的化學物質?；钚詣└嗟钠渌麑嵗?，但不限于，核酸，如RNA、DNA、蛋白質或肽(酶、抗體 等)、病毒、細菌、小有機化合物(例如，單體)、合成的和半合成的聚合物、納米顆粒、螯合的 金屬和離子等。根據(jù)特定的治療目的或方法，這樣的化合物可以具有任何合適的功能或活 性，包括但不限于抗微生物、抗細菌或抗病毒活性；凝血或抗凝血活性；報道或可檢測的活 性等?？梢耘c血小板偶聯(lián)以產生本發(fā)明的活性劑的化合物的更多其他實例包括，但不限于， 血管活性藥、抗氧化劑、抗血栓藥、抗癌藥、抗動脈粥樣硬化藥、抗有絲分裂藥、抗血管生成 藥和抗增殖化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，活性劑是抗病毒化合物?？梢允褂萌魏魏线m的抗病 毒化合物，包括但不限于唾液酸類似物、金剛胺、金剛乙胺、疊氮胸苷、阿糖腺苷、碘苷、三氟 尿苷、磷酸膽堿鈣等。在一個實施方案中，抗病毒化合物是嘌呤核苷類似物，其實例包括但 不限于無環(huán)鳥苷、去羥肌苷、病毒唑、更昔洛韋和阿糖腺苷，以及反義核苷，RNA和DNA。在本 發(fā)明的一個實施方案中，將攜帶裝載抗病毒化合物的顆粒的血小板以足以治療病毒感染的 量給予患有病毒感染的患者。在一個實施方案中，患者感染了出血熱病毒，如絲狀病毒科、 沙狀病毒科、布尼亞病毒科或黃病毒科的病毒。顆粒的活性劑還可以是藥物凝血蛋白，如因子VII，因子IX，因子X，因子XII，蛋 白C，蛋白S，凝血酶原，抗凝血蛋白，如活化蛋白C，蛋白S，肝素和類肝素，以及爬行動物或 昆蟲來源的促-或抗-凝血蛋白，以及其他。這樣的化合物是已知的。例如，可以用于本 發(fā)明實施中的因子VII或因子VIIa(該術語包括修飾的因子VII或因子VIIa或因子VII 類似物，其保留因子VII的凝血活性)特別描述于美國專利Nos. 6，461，610 ；6, 132，730 ； 6，329，176 ；6，183，743 ；6，186，789 ；5，997，864 ；5，861，374 ；5，824，639 ；5，817，788 ； 5，788，965 ；5, 700,914 ；5，344，918和5，190，919。在一個實施方案中，優(yōu)選重組人因子 Vila。在本發(fā)明的另一個實施方案中，將攜帶裝載凝血蛋白的顆粒的血小板以有效促進傷 口部位凝血和/或傷口愈合的量給予帶有傷口的患者。欲在本發(fā)明的顆粒中攜帶的核酸可以編碼可檢測的蛋白質或肽，如Lac-Z，β-葡 糖苷酸酶，辣根過氧化物酶，熒光蛋白，如綠色熒光蛋白等。在本發(fā)明的一個實施方案中，將 攜帶編碼可檢測蛋白的核酸的顆粒以在血管中的動脈粥樣硬化組織或斑中有效表達可檢 測蛋白的量給予患者，因此產生改良的動脈粥樣硬化的動物模型。這樣的動物(其優(yōu)選是 通過飲食和/或飼養(yǎng)易患動脈粥樣硬化的動物)可以給藥推定的抗動脈粥樣硬化化合物， 和/或抗動脈粥樣硬化飲食，然后與沒有給藥推定的抗動脈粥樣硬化化合物和/或抗動脈 粥樣硬化飲食的對照動物相比較，通過觀察由可檢測蛋白表達顯示的斑來比較實驗動物相 對于對照動物的動脈粥樣硬化斑形成的程度。在本發(fā)明的其他實施方案中，核酸可以編碼 治療性蛋白或肽。實例包括，但不限于，編碼抗動脈粥樣硬化蛋白或肽的核酸，如編碼ras 效應物蛋白RGL2 Wras結合結構域(RBD)的DNA (例如，用于抑制增殖)，編碼內皮一氧化 氮合成變體的DNA (例如，用于抑制血小板功能)、編碼NF-KB超-阻抑物的DNA (例如，用于 抑制炎性過程)。
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本發(fā)明的微-和納米顆粒對于各種用途可以是金屬性的，如回聲檢測?；蛘撸?微-或納米顆粒可以是鐵磁的、順磁的或超-順磁的，如超-順磁氧化鐵納米顆粒。超-順 磁氧化鐵納米顆粒的一個實例是FERI DEX(ferumoxides注射溶液)，可從Bayer購得。這 樣的鐵磁顆?？梢杂猛獠繎玫碾姶艌鰜聿倏v(通過包括但不限于洛倫茨力、磁致伸縮、 鐵磁共振及其組合的機理)，用于產生熱(低溫療法)或聲學信號。還可以使用外部應用的 電磁場或磁共振來操縱鐵磁顆粒，如氧化鐵顆粒，釓顆粒，磁鐵粒或其他已知磁性材料，用 以產生熱或聲學信號。這樣引入的物理力是有用的，因為它們允許血小板-顆粒體系破裂 的機械移動和細胞干擾，以及局部組織床中凝血的誘導。例如，SPIO(超順磁氧化鐵)納米 顆?？梢越邮荑F磁共振頻率的調幅微波場，以產生聲學和/或熱響應。本發(fā)明的這個方面 在用于人和動物的醫(yī)學診斷目的的體內成像中特別有用，特別是如果結合FDA批準的磁共 振成像劑使用。多糖覆蓋的超順磁氧化物膠體，如美國專利No. 5，262, 176中公開的，也可 以用于本發(fā)明中?？梢允褂帽绢I域已知的常規(guī)技術將活性劑摻入微-或納米顆粒中，如用化合物覆 蓋活性劑顆粒?；蛘?，顆粒自身可以是活性劑的固體球。血小板優(yōu)選是新鮮的，并且可以來 自任何來源，如個體，或來自貯存的儲備。一種有用類型的血小板是凍干的血小板，或再水 合的凍干(RL)血小板?？梢杂霉潭▌?如甲醛或多聚甲醛)將這些血小板固定。再水合凍 干血小板來源的一個實例是 STASIX (可獲自 Entegrion，Inc.，Research Triangle Park, NC)。通過以下方法為血小板裝載本發(fā)明的微-或納米顆粒將血小板和顆?；旌?，并將兩 者在血漿或選定的介質中培養(yǎng)限定的時間段，因此通過吞噬作用的天然機制和/或與血小 板的先天性免疫功能相關的閉合使血小板吸收微米和/或納米顆粒。在備選的實施方案 中，如果在納米顆粒中的天然吸收沒有發(fā)生，則可以通過連接物將微米和/或納米顆粒共 價或非共價地連接到表面膜上。然后使用方法(包括但不限于差速離心、密度梯度離心、大 小排阻色譜、親和性色譜、淘析、電泳及其組合)將血小板與胞外(未摻入的)微米和/或 納米顆粒分離。根據(jù)本發(fā)明的備選實施方案，可以從患者中分離血小板，裝載微米和/或納米顆 粒，然后輸回到患者中用于治療和/或成像應用。在另一個實施方案中，可以從患者中分離 裝載的血小板，裝載微米和/或納米顆粒，然后輸回到另一個患者中用于治療和/或成像應 用。在另一個實施方案中，血小板通常是來自單一供體或供體集合的液體貯存血小板，裝載 微米和/或納米顆粒，然后輸回到一個或多個患者中用于治療和/或成像應用。在另一個實 施方案中，血小板取自單一供體或來自單一供體或供體集合的正常液體貯存的血小板，裝 載微米和/或納米顆粒，然后低溫保存，用于輸回到一個或多個患者中用于治療和/或成像 應用。在再一個實施方案中，血小板取自單一供體或來自單一供體或供體集合的正常液體 貯存的血小板，裝載微米和/或納米顆粒，然后根據(jù)已知的技術將裝載的血小板固定，如美 國專禾Ij No. 4，287，087 ；5，651，966 ；5，902，608 ；5，891，393 和 5，993，084 中所述的，冷凍和 凍干。通常，這樣的方法包括使所述人血小板與固定劑(例如，醛)接觸，持續(xù)足以固定所述 血小板的時間；從血小板除去所述固定劑；然后將血小板干燥，以產生具有裝載的微米和/ 或納米顆粒的固定-干燥的血小板。將所得到的冷凍干燥治療劑再水合，然后輸回到一個 或多個患者中用于治療和/或成像應用。血小板優(yōu)選移動至所需的目標部位，例如，形成血 栓的表面(例如，傷口組織、血管斑、發(fā)炎部位等)。優(yōu)選，每個血小板含有約1至約10，000個顆粒，更優(yōu)選約100至約1，000個顆粒。最近的研究證明血小板容易使不同類型的微米和納米大小的顆粒內在化。這些吸 收現(xiàn)象可能與血小板從體循環(huán)中清除小顆粒的作用相關。與模型病毒一起培養(yǎng)血小板導致 納米大小的病原體內在化至血細胞中。相似地，將細菌加入富含血小板的血漿中導致明顯 的細菌內在化U。血小板使微米和納米大小顆粒內在化的機理還不清楚，并且顆粒轉移至 血小板中的最終部位也了解的不多。用細菌培養(yǎng)后的血小板透射電子顯微鏡(TEM)分析表 明病原體吸留在連接開放微管系統(tǒng)的表面中。這些導致血小板“蓋細胞(covercytes) ”的 禁錮(terming)1’2。根據(jù)情況，存在納米顆?？梢赞D運到內部血小板細胞器(如溶酶體、α 顆粒或致密顆粒)中的可能性。這些結果表明血小板在從血液中清除病原體中起著先天性 免疫作用，并且這些功能可以用來指引納米顆粒進入這種血細胞中?？梢詮倪@些細胞怎樣與外源表面相互作用的知識收集涉及納米顆粒的血小板吸 收的機理的線索。假定血小板對外源表面的響應以三個階段發(fā)生最初血漿蛋白的快速吸 附，吸附的血漿蛋白的構象變形，然后通過血小板表面受體的功能反應，這是吸附的蛋白的 構象改變的結果(對于綜述，參見Fischer等3)。這些事件對于纖維蛋白原可能是最好的 了解，其行為類似用于血小板的“生物傳感器”。使用玻璃4和基于烴聚合物的材料5_7的實 驗表明纖維蛋白原以變形的構象結合，然后與血小板整聯(lián)蛋白相互作用。目前對整聯(lián)蛋白 從外到里信號傳導過程的理解表明整聯(lián)蛋白結合到吸附的類似纖維蛋白的纖維蛋白原分 子上的結構域上，然后在血小板膜上聚簇，以組織細胞骨架相關的信號機制，用于從外到里 信號的激活8?；趯⒂眠@些蛋白標記的IgG、纖維蛋白原和小的金納米顆粒轉運至α顆粒 的觀察9，可以假定一些類型的結合IgG和/或纖維蛋白原的納米顆?？赡鼙晦D移至α顆 粒。對導致引導納米顆粒到表面相關的開放微管系統(tǒng)中而沒有內在化的因素還不了解，對 于一些病原體來說情況明顯是這樣1A然而，如果將納米顆粒優(yōu)化，合乎邏輯的是推測可能 涉及Fc-和補體受體系統(tǒng)。預期對這些機理更復雜的理解可以提高我們用內在化的成像和 治療顆粒工程化血小板的能力。本發(fā)明的裝載納米顆粒的血小板可以具有重要的醫(yī)學用途。全身灌輸時，血小板 定位于傷口部位，它們在此可提供止血，并且在傷口愈合過程中最終由巨噬細胞吞噬?；?者，通過網(wǎng)狀內皮細胞(RES)的巨噬細胞從自由循環(huán)中清除灌輸?shù)募毎Ｒ虼?，本發(fā)明的血 小板可以作為載體(特洛伊木馬)，其可以在血管損傷部位和在巨噬細胞中集中治療和成 像劑。本發(fā)明的其他用途和應用包括醫(yī)學或獸醫(yī)診斷，超聲波，核或紅外成像，傷口或腫瘤 定位，放射性腫瘤學，以及治療用途，例如，前列腺和乳房中的腫瘤切除，和凝血療法。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術的一些實際問題。盡管血小板是用于將指引的能量轉導劑 遞送至前列腺腫瘤中失去穩(wěn)定的脈管系統(tǒng)中的合理載體，但是收集和貯存血小板的邏輯問 題使得血小板的這種應用變得困難。除了利用率和無菌性的問題，由于貯存損傷，目前通 過血庫系統(tǒng)提供的血小板產品在功能上是不可靠的?；颊咦陨淼难“鍖τ谧泽w的“arm back to arm”治療可能是有用的，但是預期患者亞群中與血小板減少和血小板機能不全相 關的繼發(fā)性健康問題會限制這種方法。本發(fā)明的研發(fā)，作為基于血小板的凍干產品，消除了 這些限制。實施例通過以下實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。所有份數(shù)和百分比均以重量計，并且 所有溫度均為攝氏度，除非另外明確指出。實施例1 顆粒的吸收在此用實驗證明了血小板通過天然機制吸收微米以下大小顆粒的能力，所述實驗 使用聚乙烯亞胺(PEI)納米顆粒和葡聚糖覆蓋的超順磁氧化鐵(SPIO)納米顆粒。通過與 綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA —起培養(yǎng)PEI來制備基于PEI的納米顆粒，獲得一群大約 200-400nm的納米顆粒(圖1)。將所得到的納米顆粒加入到新鮮制備的人富含血小板的血漿中，按照別處所述的 使用檸檬酸鹽抗凝劑“1’11，并使其在室溫下?lián)u擺培養(yǎng)兩小時。然后通過在2000xg下將細 胞離心十分鐘從過量納米顆粒中分離出血小板，然后使血小板接受在檸檬酸鹽化的鹽水 (3.75mM檸檬酸鹽，146mM NaCl, pH = 7. 4)中的再一次離心洗滌。然后使用標準方法1(iai 對血小板進行透射電子顯微鏡觀察。該分析(圖2、顯示出大部分血小板(參見圖A)含有 一個或多個PEI/DNA納米顆粒，并且該納米顆粒包含在具有附帶雙層膜的內部結構中(參 見圖B和C)。實施例2 =SPIO納米顆粒的內在化還研究了血小板內在化SPIO納米顆粒的能力。按照使用PEI納米顆粒研究所 述的分離血小板，然后用SPIO-納米顆粒培養(yǎng)，該顆粒由覆蓋葡聚糖(FERIDEX，從Bayer Healthcare購得)的 IOnm鐵磁氧化鐵核心組成，這是由美國FDA批準用于磁共振成像顯 影的灌輸級產品。將SPIO產品以1/10稀釋至富含血小板的血漿中，并搖擺培養(yǎng)12小時。 然后將混合物隨密度梯度分層，并在2，OOOxg下室溫離心10分鐘。從分界面收集裝載SPIO 納米顆粒的血小板，用檸檬酸鹽化的鹽水稀釋，并在2，OOOxg下室溫離心10分鐘。按照對 PEI所述的，用透射電子顯微鏡檢測最終的SPIO血小板。和PEI的情況相同，SPIO納米顆 粒集中在具有雙層膜的內部空間中，雙層膜很可能是表面相關的開放脈管系統(tǒng)(圖3)。納 米顆粒通過磁引力自組織成聚集物。該實施例說明本發(fā)明在用于人和動物體內的醫(yī)學診斷 目的的體內成像中的效用。實施例3 用于傷口部位成像的超-順磁血小板顆粒這些實驗的目的是使用用于攜帶用于定向能量吸收的超順磁氧化鐵(SPIO)納米 顆粒的血小板基顆粒遞送成像能力并在內部出血點提供止血。兩個進展為本發(fā)明提供了基 礎。首先，已經發(fā)現(xiàn)血小板容易使磁性SPIO納米顆粒內在化(如上所示)。其次，利用用于 處理血小板的相同冷凍干燥方法，血小板作為用于止血的灌輸劑，SPIO標記的血小板可以 冷凍干燥來獲得裝載SIPO的顆粒。結果是血小板基產品原則上可以在內部傷口部位操作， 使用外部磁場來產生聲學和熱能量。本發(fā)明者認為使用外部磁場，可以使用各種可用的超 聲波和熱成像方法在內部出血點使裝載SPIO的顆粒成像，并可以操縱以提供止血。本發(fā)明者已經發(fā)現(xiàn)了血小板以強烈的方式使特定類型的超順磁氧化鐵納米 顆粒內在化。用新鮮分離的人富含血小板的血漿將FERIDEX(從Bayer Healthcare Pharmaceuticals)培養(yǎng)十二小時，F(xiàn)ERIDEX由具有葡聚糖涂層的 IOnm超順磁氧化鐵核組 成。通過將混合依據(jù)密度梯度分層、離心和從介質-血漿分界面取出血小板，將血小板與過 量的顯影劑分離。然后將裝載!^eridex的血小板接受醛穩(wěn)定化并凍干來獲得凍干的產品，在此稱為SPI0-STASIX顆粒。圖4顯示了使用透射電子顯微鏡觀察，F(xiàn)ERIDEX納米顆粒(參 見箭頭)內在化，在表面相關的開放脈管系統(tǒng)中形成聚簇。STASIX顆粒中的SPIO納米顆粒 自組織形成具有矩形橫截面的結構。在FERIDEX的自由懸浮液或血小板之間的空間中，沒 有觀察到這些類型的結構，這可能是通過最接近的鄰近磁偶極子相互作用得到了穩(wěn)定。暴露于磁場時，發(fā)現(xiàn)SPI0-STASIX顆粒經歷了強烈的激活響應，用于聚集物的形 成。在圖5所示的透射電子顯微照片中證明了該結果，其中將血漿中裝載氧化鐵的顆粒接 受0. 6Testla場三十秒鐘。所得到的SPI0-STASIX顆粒高度聚集，并呈現(xiàn)出激活的形態(tài)學。 這種類型的觀察結果，在使用60Hz振蕩磁場時也出現(xiàn)了該觀察結果(數(shù)據(jù)未顯示)，提供了 可以在傷口部位調節(jié)SPI0-STASIX顆粒來提供止血的證據(jù)。盡管不希望受到任何特定理論的束縛，但是血小板可以吸收氧化鐵納米顆粒的觀 察不是前所未有的。已經注意到血小板吸收幾種類型的顆粒物質，包括碳，乳膠和陽離子鐵 蛋白，用纖維蛋白原和IgG衍生的膠體金，模型病毒和細菌也被充分證明。細菌被吸留在表 面相關的開放脈管系統(tǒng)中。這些觀察表明血小板起著比廣泛認知的更重要的先天性免疫作 用(宿主防御)，并且SPIO納米顆粒通過這組免疫性機制得到累積。已經證明氧化鐵納米顆粒作為動物和人用途中的灌輸治療是安全的。與許多類 型的由于毒性成分的存在而潛在不安全的納米顆粒相反，由于身體貯存和轉運大量鐵的能 力，鐵基納米顆粒具有良性安全性特征。Feridex 是由美國FDA批準作為MRI顯影劑，用 于與網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)相關的肝臟損傷成像的T2增強。灌輸至人時，F(xiàn)eridex 納米顆粒通過 網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)可測量地從血液中清除，然后從第二天開始逐漸轉化為血清鐵。到給藥后第 七天，血清鐵水平已經恢復正常。這些結果與規(guī)范的鐵代謝循環(huán)的更新相一致。SPIO的物理特性導致使用外加電磁場誘導內部聲學、熱和止血響應的可能性。由 于氧化鐵核心中聲音速度的差異，已經發(fā)現(xiàn)SPIO納米顆粒是產生回聲的，并因此可使用超 聲波檢測。相似地，由于與每個超-順磁核心相關的磁偶極子，因此可以用電磁場操縱SPIO 顆粒。這種特性成為SPIO顆粒作為MR成像松弛顯影劑用途廣泛使用的基礎。還可以使用 無線電頻率電磁場(無線電波或微波的形式)操縱SPIO納米顆粒，以產生用于體內溫熱治 療的聲或熱。因為未配對狗電子的旋轉傾向于排列，氧化鐵是鐵磁材料。在大于數(shù)十納米 的氧化鐵顆粒中，旋轉在微結構域(Weiss結構域)中排列；鄰近的微結構域很可能具有反 平行排列，并且出于熱動力學觀點，結構域的分界面(Bloch壁)是需要代價的。較小的氧 化鐵納米顆粒，如i^eridex 核，是“超順磁的”，因為由于在小顆粒中形成Bloch壁分界面的 高熱動力學成本，在較小的氧化鐵納米顆粒中排列的未配對的狗電子的單個結構域是有 利的。在原則上，這些獨特特性的結果是SPIO納米顆?？梢员徽T導以經歷振動機械運動， 使用外加的電磁場，用于聲學信號產生。本發(fā)明使用STASIX顆粒中SPIO的聲和電磁場調 節(jié)之間的相互作用來產生更靈敏的成像形式。可以在前列腺惡性腫瘤中將SPIO納米顆粒成像，使用熱(用近場RF或微波誘導 的)、超聲波(內在或誘導的共振)或MRI成像形式。在一個實施方案中，電磁場，如無線電 波或微波，可以用來調節(jié)SIPO顆粒，來形成聲學信號或熱。存在三種潛在的機制，通過其， 可以用電磁場調節(jié)SPIO納米顆粒，以產生聲學信號。第一種機制是洛倫茲力。在此，所用 電磁場的磁性成分可以直接偶聯(lián)于SPIO納米顆粒的磁偶極子力矩，產生用于排列和吸引 納米顆粒的力(洛倫茲力)。如果所用的電磁場是電磁輻射，那么SPIO顆粒將以輻射的頻率振動，并且納米顆粒將通過在某些方面類似揚聲器怎樣工作的機制以輻射的頻率產生聲 學信號。第二種方法是磁致伸縮。在此，電磁輻射場以振動方式扭曲氧化鐵納米顆粒的物 質結構(磁致伸縮)，因此產生聲學信號。磁致伸縮效應(在用于產生超聲波的設備中以 宏觀規(guī)模使用)也可用SPIO納米顆粒以微觀規(guī)模工作。第三種機制是鐵磁共振。在此，微 波(GHz)電磁輻射可以驅動未配對！^電子旋轉-旋轉狀態(tài)轉換，用于鐵磁共振。與對納米 顆粒的洛倫茲力和磁致收縮效應(其可以以傳統(tǒng)材料機械術語來描述)相反，鐵磁共振基 本上是量子過程。磁性納米顆粒的鐵磁共振表示用于將電磁輻射場強烈結合機械運動的機 制，該機械運動用于產生熱，如果輻射是連貫的，如通過MASOR產生的，機械運動還用于產 生超聲波。此外，如果鐵磁共振頻率的微波場是調幅的，SPIO納米顆粒將產生調制頻率的 聲音。洛倫茲力、磁致伸縮和鐵磁共振怎樣導致從SPIO納米顆粒產生熱和聲音的理論方面 是非常確定的。在“完整器官”臍帶模型中使用SPI0-STASIX進行實驗，以開始更好地理解體內條 件下血小板相連的SPIO納米顆粒的產生回聲特性。簡而言之，將獲自正在經歷非急需進行 的剖腹產術的健康供體的臍靜脈系緊進入循環(huán)回路中。將從壓縮紅血球和冷凍的血漿配制 的仿制血液通過回路循環(huán)，同時用B-模式超聲波成像。將1. Oml推注的SPIOSTASIX/μ 1 直接灌輸臍帶上游，同時成像。圖6描繪了 SPIO標記的細胞通過未受損傷的靜脈的自由運 動。圖A、B和C各自描繪了使用單獨的鹽水、鹽水+氣泡和鹽水+推注的SPI0-STASIX顆 粒(紅色箭頭)的臍靜脈。圖C中的綠色箭頭是氣泡。進行了更多的實驗來確定是否可以用超聲波來檢測SPI0-STASIX顆粒為血纖維 蛋白凝塊的成分。將SPI0-STASIX與不同稀釋度的血漿混合，然后通過加入1. 0單位/ml 凝血酶來形成血塊。然后將得到的血塊置于瓊脂糖平板上，并用磁共振和B-模式超聲波成 像。圖7顯示了可以用MR和B-模式超聲波檢測跨過生理學相關濃度范圍的裝載氧化鐵的 顆粒。實施例4 使用裝載超-順磁氧化鐵的顆粒的抗癌治療這些實驗的目的是研發(fā)提高的定向能量傳遞方法，用于成像、組織切除和前列腺 腫瘤治療的治療劑釋放。將人前列腺腫瘤切除組織植入免疫受損小鼠的肋腹，給小鼠供應了超生理濃度的 雄激素。在這些條件下，異種移植組織增殖，并且所得到的腫瘤產生脈管系統(tǒng)，超過90% 的內皮具有人類特點。此外，保持了在人前列腺組織中觀察到的內皮細胞混亂的星狀結 構。和使用人雄激素切除治療情況的相同，停止激素導致內皮的大規(guī)模凋亡，使得腫瘤脈 管系統(tǒng)大規(guī)模的不穩(wěn)定。從新鮮的人血小板用多聚甲醛穩(wěn)定來制備固定的干燥血小板 (Read,M. S.等，Preservation of hemostaticand structural properties of rehydrated lyophilized platelets :potential for long-term storage of dried platelets fortransfusion(再水合的凍干血小板的止血和結構特性的保持用于輸血的干燥血小板 長期保存的可能)，Proc Natl Acad Sci USA 92，397-401 (1995))，并且用綠色熒光劑標 記)，并用綠色熒光CMFDA染料標記。這些固定的-干燥的血小板也可以以商品名Masix /A Entegrion, Inc. (Research Triangle Park, NC)購得。用人前列腺組織制備小鼠，然后 停止雄激素。在雄激素去除之前或兩天后，灌輸推注劑量2. OxlO9綠色熒光Masix 顆粒/ 小鼠。將動物處死，然后取出前列腺腫瘤和其他組織，并制備用于組織學分析。
圖8描繪了失去穩(wěn)定后腫瘤脈管系統(tǒng)中的綠色熒光血小板治療劑(參見左圖中的 箭頭)。在雄激素取出之前，在腫瘤組織(右圖)，或肺、肝臟或心臟組織中(數(shù)據(jù)未顯示) 沒有注意到Masix 顆粒。圖9是雄激素停止和綠色熒光STASIX灌輸后來自前列腺腫瘤 共焦圖像的3D重建。在用于人內皮細胞，尤其是腫瘤脈管系統(tǒng)共同追蹤的橙色熒光標記的 附近觀察到STASIX顆粒。實施例5 具有內在化納米顆粒的血小板的制備聚乙烯亞胺(PEI)，作為聚陽離子，已經廣泛用于凝集cDNA，用于細胞培養(yǎng)物和體 內的基因轉染目的。本發(fā)明者利用了 PEI與大小范圍非常不同的聚陽離子(從小分子如病 毒唑三磷酸鹽至大分子如cDNA)形成高度濃縮的納米顆粒結構的能力。以下部分中呈現(xiàn)了 該方法的兩個實例，其涉及PEI與病毒唑核糖寡核苷酸和DNA質粒的聚集，血小板內在化， 然后遞送至組織培養(yǎng)物中的巨噬細胞。
_0] (A)PEi-mmmm-Mm^mm^mm^At如圖10中所述的，PEI與八殘基病毒唑核糖-寡核苷酸稠合?？梢栽跍睾蜅l件下 用成像部分(例如，熒光團或MRI試劑)和/或用于連接的官能團(例如，生物素，his6)標 記PEI的伯胺。圖10描繪了 PEI與含有兩個病毒唑殘基和3’-端FITC熒光團的八-基體 核糖-寡核苷酸聚集時，IOOnm至300nm球形顆粒的透射電子纖維照片。發(fā)現(xiàn)血小板容易使PEI-基納米顆粒內在化。圖11中描繪的透射電子纖維照片顯 示出表面相關的開放微管系統(tǒng)中的PEI/病毒唑核糖-寡聚物納米顆粒。低功率下大量血 小板的檢測(數(shù)據(jù)未顯示)證明了實際上所有血小板含有一個或多個PEI納米顆粒。連接 開放維管系統(tǒng)表面中的PEI/陽離子納米顆粒的位置與使用SPIO納米顆粒觀察到的相似， 表明在納米顆粒吸留事件中涉及血小板的先天性免疫功能。(B)基因轉移至巨噬細胞以下的研究證明了 cDNA-納米顆粒生物工程化的血小板可以將基因轉移至組織 培養(yǎng)物中的巨噬細胞中。在用于實驗的基因轉移部分的準備中，通過不影響轉錄的連接用 Cy3將綠色熒光蛋白cDNA標記。然后通過以上所述的方法將紅色熒光cDNA與PEI稠合，以 獲得PEI/cDNA納米顆粒。圖12描繪了細胞已經將納米顆粒內在化之后，生物工程化血小 板的熒光顯微鏡圖像和流式細胞計數(shù)特征。基因表達實驗利用了使用密度梯度方法從人外周血分離的單核細胞。使用供體特 異性介質使單核細胞分化成巨噬細胞，然后用GFP-納米顆粒血小板將先天性免疫細胞培 養(yǎng)12小時。再一個M小時階段后，檢測培養(yǎng)物的顯微鏡熒光，以測定巨噬細胞中是否存在 Cy3-標記的cDNA (紅色熒光)和是否表達了 GFP (綠色熒光)。進行合適的陰性對照來證 明巨噬細胞和/或血小板內在熒光沒有影響實驗分析。結果顯示于圖13中。該分析的主 要結果是幾乎所有巨噬細胞使血小板內在化，并且超過一半表達了 GFP基因。實施例6 含有表面附著的病毒嗶的血小板的制備以與別處所述的正常Masix 顆粒制造方法相似的方式來制備病毒唑生物工程 化的Masix 顆粒。將細胞與過量血漿蛋白分離，然后接受醛穩(wěn)定化。然后用膜不通透性 NHS生物素類似物將表面膜生物素化。用過量抗生物素蛋白([抗生物素蛋白] >> [生物 素])培養(yǎng)生物素化的血小板，并凍干。SDS-PAG電泳(與抗生物素蛋白標準品一起，數(shù)據(jù)未 顯示)證明了每個血小板結合6. 7百萬抗生物素蛋白分子。將抗生物素蛋白化的Masix 顆粒再水合并用含有兩個病毒唑堿的病毒唑核糖寡核苷酸(5’ -生物素’ UUU-病毒唑-病 毒唑-UUU-FITC-3’)、用于追蹤的綠色熒光團和用于偶聯(lián)的生物素培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)核糖寡核苷 酸在數(shù)秒內反應，與抗生物素蛋白化的血小板形成緊密的復合物。熒光顯微鏡檢查(參見 圖14)證實了病毒唑探針連接血小板。該圖的右圖中呈現(xiàn)的流失細胞計數(shù)滴定表明表面系 鎖的抗生物素蛋白以大約均一的分子比例結合核糖寡核苷酸，該比例為13. 5百萬病毒唑 部分/血小板。以以上所述的cDNA納米顆粒巨噬細胞吞噬作用實驗類似的方式來測定單核細胞 內在化病毒唑綴合的Masix 顆粒的能力。用病毒唑-綴合的Stasix 顆粒培養(yǎng)單核細 胞12小時，然后用共焦顯微鏡檢查來檢測。該分析(參見圖1 顯示出單核細胞內在化血 小板。在該圖中，箭頭指向幾個沒有內在化的血小板。選定細胞的三維共焦重建(數(shù)據(jù)未 顯示)揭示大部分單核細胞內在化五至二十個裝載的STASIX顆粒。基于每個單核細胞的 內在體積和每個血小板上的核糖寡核苷酸數(shù)量，一個血小板由單個單核細胞的內在化導致 21 μ Molar的局部胞內病毒唑濃度。因此，如果幾個血小板被吞噬，獲得大大超過在組織培 養(yǎng)系統(tǒng)中用病毒唑測量的IC-50的內部病毒唑濃度。_仿丨丨7 :/丨、·泡劍血應鎖:如果治療性納米顆粒內含物對醛固定敏感，可以在醛固定和冷凍干燥后，使用以 下類型的表面膜連接策略來將納米顆粒連接血小板。使用小單層泡囊(SUV)納米顆粒， 通過以下實驗證明了該方法的實用性。按照別處詳述的(Fischer，Τ. Molecular Crystal Liquid Crystal 102，141-145 (1984)，通過將磷脂和去污劑辛基糖苷的混合膠束快速稀釋 至最終去污劑水平低于關鍵膠束濃度(對于辛基糖苷未25mM)來形成磷脂SUV (圖16)。對 于這個實驗，雙層含有用于追蹤的紅色熒光PKH染料，并用生物素共價修飾磷脂酰乙醇胺 的伯胺。通過標準制造程序制備STASIX顆粒，除了一個例外；在醛固定步驟后，用NHS-生 物素類似物共價修飾表面膜的外側。然后將生物素化的STASIX顆粒與摩爾過量的抗生物 素蛋白反應，以獲得抗生物素蛋白化的膜。將顆粒接受SDS-PAG電泳和密度掃描(連同含 有已知含量抗生物素蛋白的泳道)來計算抗生物素蛋白數(shù)量/血小板；每個冷凍干燥的細 胞含有 七百萬抗生物素蛋白。隨后將生物素化SUV與抗生物素蛋白化的Masix 顆粒 混合，以將泡囊連接表面膜。圖17描繪了紅熒光SUV與表面膜的連接。透射電子纖維照片 顯示了外部表面膜上的SUV(箭頭所示)。已知TEM切片的厚度和細胞的圓盤狀，在該實驗 中，每個Masix 顆粒與三十至六十個SUV連接。該實驗證明用生物素-抗生物素蛋白橋 方法，納米顆?？梢匀菀椎亟Y合生物工程化血小板的表面。實施例8 治療劑遞送至動脈粥樣硬化斑本發(fā)明可以用于將治療劑遞送至血管受傷部位。該能力顯示于圖18中。在該研 究中，高膽固醇血癥豬，其中給予高膽固醇飲食三個月，以誘發(fā)動脈粥樣硬化斑形成。將股 動脈的Icm片段結扎，然后在鹽水中灌注含有Lac Z基因的AAV構建體。一個小時后，除去 AAV介質，并將動脈重新打開，用于循環(huán)。一個月后，將血管分離并通過組織學分析Lac Z基 因產物活性。在動脈粥樣斑中選擇性地表達AAV轉導產物。實施例9 用定向能量傳遞的前列腺腫瘤成像和止血(A)人前列腺組織的初級異種移植物的制備
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外科切除的前列腺組織的新鮮切片的初級異種移植物的建立是常規(guī)實驗方案。簡 而言之，將八周大的免疫受損小鼠(SCID或Nu/Nu)閹割，并在移植人組織之前的3-7天植 入持續(xù)釋放的睪酮丸。在外科手術過程中在中斷器官血液供應的2小時內，通過組織學證 實并接受了來自根治性前列腺切除術(前列腺癌)或膀胱前列腺切除術(良性前列腺)的 新鮮人組織。將前列腺組織立即置于冰冷器官保存液中(例如，ViaSpan )，并轉運用于移 植至準備好的免疫受損宿主中。將八個獨立的組織片皮下植入每只小鼠中(每側四片)， 并使動物持續(xù)四周，用于建立異種移植物。從歷史看，所有新鮮移植的異種移植物大約有 80%成功建立，通過異種移植物的人血管網(wǎng)絡與小鼠宿主的脈管系統(tǒng)在異種移植物的外周 處吻合來標記。在移植后的最初十四天中，與移植前的組織相比，異種移植物內人脈管系統(tǒng) 的微血管密度提高>5-倍。在四周后的任何時間，將小鼠宿主閹割(除去睪酮丸)，選擇 性地誘導人內皮細胞中的凋亡波，在閹割后的2天達到峰值，并在閹割后的5-7天回到基線 水平。已經確定前列腺異種移植物對移植的血管生成響應和由于閹割所引起的人脈管系統(tǒng) 的血管退化是在所有分析的樣本中一致地發(fā)生了并且不是患者特異性響應。比較了第0天 (無顆粒定位)和第2天(最大顆粒定位)存在的穩(wěn)定脈管系統(tǒng)之間顆粒與特異性損傷內 皮層的結合。(B)定位的直接成像用低、中等和高水平的SPI0-STASIX顆粒灌輸小鼠宿主，并用B-模式超聲波和MRI 監(jiān)控。如下將動物分組3，000 SPI0-STASIX/1血液體積第0天3只小鼠和第2天6只小鼠10, 000 SPI0-STASIX/1血液體積第0天3只小鼠和第2天6只小鼠30，000 SPI0-STASIX/1血液體積第0天3只小鼠和第2天6只小鼠在閹割前的第0天，給每個處理組三只小鼠灌輸每個濃度的SPI0-STASIX顆粒，在 閹割后第2天，六只小鼠灌輸每個濃度的SPI0-STASIX顆粒。給動物灌輸顆粒，使血小板循 環(huán)四十五分鐘，并使動物成像。成像后，將動物安樂死，收集移植物，并準備用于組織學分析 和異種移植物/濕重組織內鐵含量的定量。用B-模式的超聲波和聲輻射力脈沖(ARFI)脈沖序列監(jiān)控動物。然后將小鼠接受 MR成像，兩個已登記的成像序列設計用來提供登記的解剖學標志和對鐵納米顆粒存在改善 的敏感性。使用51h51h64的各向異性成像矩陣獲取3D擴散加重投影編碼的圖像。設計 來提供對局部場異質性改善的敏感性的相同序列的變化(T2*敏感性)可以用來檢測納米 顆粒。體內研究結束時，進行異種移植物的MR組織學來提供更高空間分辨率3D圖像組，用 于腫瘤幾何學程度的更完整量化和納米顆粒的定位。使用之前已經描述并且是本領域已知 的上述3D編碼方法，在9. 4T進行對灌注固定樣本(原位固定)的工作。MR組織學后，將宿 主動物處死；收集異種移植物，固定，包埋和切片；進行熒光和透射電子顯微鏡檢查。(C)定向能量傳遞將動物置于紅外攝像機和電磁近場源之間，將超聲波轉換器直接接觸動物的皮 膚。在SPI0-STASIX顆粒灌輸之前和灌輸后45分鐘，應用無線電頻率，用于通過洛倫茲力 介導的機制產生熱和/或聲響應。還應用了用于誘導鐵磁共振的微波場來進行了該實驗。 監(jiān)控動物誘導的熱和聲音信號。如下，在低、中等和高SPI0-STASIX顆粒濃度下評價六個動 物組。
權利要求
1.含有微米或納米大小顆粒的血小板，所述微米或納米大小的顆粒含有活性劑。
2.權利要求1的血小板，其中所述血小板含有哺乳動物血小板。
3.權利要求1的血小板，其中所述血小板含有人血小板。
4.權利要求1的血小板，其中所述微米或納米大小顆粒由選自天然和合成聚合物、樹 枝狀骨架、小分子聚集物、鐵磁物質、磷脂泡囊、膠束及其組合的材料制得。
5.權利要求1的血小板，其中所述活性劑是選自蛋白質、RNA、DNA、螯合劑、放射性化合 物、鐵磁化合物、超順磁復合物及其組合的物質。
6.權利要求1的血小板，其中所述活性劑包含抗病毒劑。
7.權利要求1的血小板，其中所述活性劑包含凝血蛋白。
8.權利要求1的血小板，其中所述活性劑包含抗凝血蛋白。
9.權利要求1的血小板，其中所述活性劑包含核酸。
10.權利要求1的血小板，其中所述活性劑是超-順磁氧化鐵納米顆粒。
11.一種藥物組合物，其含有藥物學上可接受的載體和含有微米或納米大小顆粒的血 小板，所述微米或納米大小的顆粒含有活性劑和藥物學上可接受的載體。
12.權利要求11的藥物組合物，其中所述血小板含有哺乳動物血小板。
13.權利要求11的藥物組合物，其中所述血小板含有人血小板。
14.權利要求11的藥物組合物，其中所述微米或納米大小顆粒由選自天然和合成聚合 物、樹枝狀骨架、小分子聚集物、鐵磁物質、磷脂泡囊、膠束及其組合的材料制得。
15.權利要求11的藥物組合物，其中所述活性劑是選自蛋白質、RNA、DNA、螯合劑、放射 性化合物、鐵磁化合物、超順磁復合物及其組合的物質。
16.權利要求11的藥物組合物，其中所述活性劑包含抗病毒劑。
17.權利要求11的藥物組合物，其中所述活性劑包含凝血蛋白。
18.權利要求11的藥物組合物，其中所述活性劑包含抗凝血蛋白。
19.權利要求11的藥物組合物，其中所述活性劑包含核酸。
20.權利要求11的藥物組合物，其中所述活性劑是超-順磁氧化鐵納米顆粒。
21.權利要求11的藥物組合物，其中所述載體是無菌載體。
22.權利要求11的藥物組合物，其中所述載體是固體載體。
23.權利要求11的藥物組合物，其中所述載體是液體載體。
24.權利要求11的藥物組合物，其中所述載體是含水載體。
25.將血小板遞送至患者體內的目標部位的方法，所述血小板含有微米或納米大小顆 粒，該顆粒含有活性劑，該方法包括下列步驟提供權利要求1的血小板；和 將所述血小板給予患者。
26.權利要求25的方法，其中所述血小板含有哺乳動物血小板。
27.權利要求25的方法，其中所述血小板含有人血小板。
28.權利要求25的方法，其中所述微米或納米大小顆粒由選自天然和合成聚合物、樹 枝狀骨架、小分子聚集物、鐵磁物質、磷脂泡囊、膠束及其組合的材料制得。
29.權利要求25的方法，其中所述活性劑是選自蛋白質、RNA、DNA、螯合劑、放射性化合 物、鐵磁化合物、超順磁復合物及其組合的物質。
30.權利要求25的方法，其中所述活性劑包含抗病毒劑。
31.權利要求25的方法，其中所述活性劑包含凝血蛋白。
32.權利要求25的方法，其中所述活性劑包含抗凝血蛋白。
33.權利要求25的方法，其中所述活性劑包含核酸。
34.權利要求25的方法，其中所述活性劑是超-順磁氧化鐵納米顆粒。
全文摘要
公開了含有微米或納米大小顆粒的血小板，其中微米或納米大小的顆粒含有活性劑，用于治療醫(yī)學病癥中。還公開了含有藥物學上可接受的載體和裝載顆粒的血小板的藥物組合物，以及將含有活性劑的微米或納米大小顆粒遞送至患者體內的目標部位的方法。
文檔編號C12N5/078GK102083447SQ200880021137
公開日2011年6月1日 申請日期2008年5月2日 優(yōu)先權日2007年5月16日
發(fā)明者小E·斯坦·埃斯克里奇, 托馬斯·H·費希爾 申請人:恩特格利昂公司