干細胞衍生的視網膜色素上皮細胞的制作方法

專利名稱：：干細胞衍生的視網膜色素上皮細胞的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生產已分化的^L網膜色素上皮細胞(RPE)的方法和系統，并涉及由此獲得的RPE細胞的治療用途。相關技術的列表以下是被認為是對描述本發明領域的現有技術水平相關的參考文獻的列表。(1)StraussO.，Theretinalpigmentepitheliuminvisualfunction;Physiol.Rev.85:845-881，2005.(2)LundRD.etal.,Celltransplantationasatreatmentforretinaldisease;iVog￡>eM20:415-449,2001.(3)HarutaM.，Embryonicstemcells:potentialsourceforocularrepair;20(1):17-23,2005.(4)HarutaM.etal.，Invitroandinvivocharacterizationofpigmentepithelialcellsdifferentiatedfromprimateembryonicstemcells;/wveW(9p/^/m/mo/r&45:1020-1024,2004.(5)AokiH.etal.，EmbryonicstemcellsthatdifferentiateintoRPEcellprecursorsinvitrodevelopintoRPEcellmonolayersinvivo;~￡>eM82(2):265-274，2006.(6)KlimanskayaI.etal.,Derivationandcomparativeassessmentofretinalpigmentepitheliumfromhumanembryonicstemcellsusingtranscriptomics;C7om'wg5YemCe〃s6(3):217-245,2004.(7)LundRD.etal.,Humanembryonicstemcell-derivedcellsrescuevisualfunctionindystrophicRCSrats;CloningStemCells8(3):189-199,2006.(8)PCT申請公開No.WO06/070370。
背景技術：
：視網膜色素上皮細胞(RPE)的功能障礙、損傷和喪失是某些眼6部疾病和病癥的突出特征，例如年齡相關的黃斑變性(AMD)、遺傳性黃斑變性，包括Best病(卵黃樣黃斑營養不良的早期發作的形式)和色素性視網膜炎(RP)的亞型。這些疾病的可能的治療是RPE(和光受體)移植到受疾病影響的那些的視網膜中。相信的是，通過RPE細胞移植的RPE細胞補充可以延緩、停止或逆轉退化，改善視網膜功能和預防源自這些狀況的失明。斑(macula)，視網膜的中心部分，對于精細的可視細節和色彩感覺負責，并且對于我們許多日常的視覺工作例如面部識別和閱讀是關鍵的。在普遍的視網膜退化例如色素性視網膜炎(RP)中，以及在更特異性地耙向斑區域的不同疾病如年齡相關的黃斑變性(AMD)和Best病中，作為疾病過程的部分，斑常常受影響。在許多這些疾病中，原發的功能障礙和衰竭在視網膜色素上皮細胞(RPE)中發生，視網膜色素上皮細胞位于光受體的底部。高度專門化的RPE細胞在支持光受體功能方面起到重要作用它們從脈絡膜血管主動轉運營養物，參與維生素A的再循環，維生素A是光受體中發色團所必需的，以及作為這些細胞的正常更新過程的一部分攝取并再循環脫落的光受體外部片段、在RP的亞型Best病和AMD中，RPE的衰竭最終導致視覺喪失和失明。替換這些細胞是可能的治療介入2,但是從人類供體或胚胎獲得這樣的細胞是困難的。如果可以闡明使人類胚胎干細胞細胞定向分化成為功能性RPE細胞的方式，人類胚胎干細胞(hESC)可以充當RPE細胞潛在無限的供體來源3。早先已經描述了使hESC定向分化成為神經前體細胞(NP)高度富集的培養物的方法(ReubinoffBE.etal.，Neuralprogenitorsfromhumanembryonicstemcells;細&c/mo/19:1134-1140，2001;ItsyksonP.etal.，Derivationof腿mlprecursorsfromhumanembryonicstemcellsinthepresenceofnoggin;Mo/Ce〃A^w^wcZ.30(1):24-36，2005)。此外，已經體外和體內地顯示了hESC在嚙齒動物中移植到視網膜下間隙之后產生視網膜細胞的〉替力(BaninE.etal.,RetinalIncorporationandDifferentiationofNeuralPrecursorsDerivedfromHumanEmbryonicStemCells;5V柳(2):246-257,2006.)已經展現了小鼠和非人靈長類ESC分化成為RPE細胞，以及在7移植后存活和減慢視網膜退化的潛力4'5。顯示了hESC向RPE的自發的分化，然而，分化過程的效率是低的，需要相當的分化時間，在4-8周的分化后僅獲得僅很低百分比(<1%)的含RPE細胞的群集。此外，雖然在RCS大鼠中在這些RPE細胞的視網膜下移植之后觀察到改善的視網膜功能，移植的細胞作為真正的成熟RPE細胞的功能沒有展現，這種效應可能潛在地與非RPE特異性營養效應相關6'7'9'1Q。近來還顯示了，hESC可以被定向可再生地分化成為RPE細胞，其中hESC的定向的而非自發的分化成為RPE的結局在存在煙酰胺(NA)的情況下發生8。發明概述根據第一個方面，本發明提供了轉化生長因子-(3(TGF-P)超家族的成員用于制備培養系統的用途，所述培養系統用于促進人類干細胞(hSC)定向和增加分化為視網膜色素上皮(RPE)細胞。根據第二個方面，本發明提供了促進hSC定向分化為RPE結局的方法，所述方法包"l舌(a)提供包含hSC的細胞培養物；和(b)在培養系統中培養所述細胞培養物中的細胞，所述培養系統包含補充有TGF(3超家族的一種或更多種成員的基礎培養基，從而所述hSC被促使趨向定向分化為RPE結局。根據第三個方面，提供了細胞培養物，其包含通過在存在TGF卩超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細胞。優選的，所述RPE細胞是通過在此公開的方法獲得的終末分化的(成熟的)RPE細胞。如在此將顯示的，這樣的RPE細胞展現了幾種特征性性狀，其不同于當hSC自發地分化成RPE細胞時所獲得的性狀。優選的，所述RPE細胞能夠在它們的分化期間響應于TGF卩信號傳導。根據第四個方面，提供了將hSC衍生的RPE細胞移植到受試者的眼睛中的方法，所述RPE細胞通過所述hSC的定向分化獲得，所述方法包才舌(a)^是供包含hSC的細胞培養物；(b)在培養系統中培養所述細胞培養物，所述培養系統包含補充有TGFP超家族的一種或更多種成員的基礎培養基，從而所述hSC被誘導分化成RPE細胞；(c)從所述細胞培養物收獲RPE細胞；和(d)將所述RPE細胞移植到所述受試者的眼睛中。根據第五個方面，i是供了細胞培養系統，其包含通過所述hSC的定向分化所獲得的可移植的hSC衍生的RPE細胞。所述移植的RPE細胞展現了一種或更多種參數，所述參數表明所述移植的細胞在所述受試者眼睛內是功能性的。所述移植的RPE細胞的功能性通過它們攝取光受體的脫落的外部片段同時改善視網膜功能的能力來展現。在此公開的方法的培養系統中的hSC是分化中的hSC，即，基本上處于未分化的狀態的hSC的群體，或者其中至少部分所述細胞已經被誘導經歷了定向分化的初始階段，以及有的時候，大部分所述細胞已經被誘導經歷了定向分化的初始階段。根據一個實施方式，分化的初始階段通過先期將細胞暴露于NA來實現，而當未分化的細胞共同暴露于NA和TGFP超家族的一種或更多種成員時分化的初始階段也將發生。不受理論的限制，假定的是，對NA的先期暴露(在與TGF|3超家族的一種或更多種成員孵育之前)引起細胞趨向定向分化(與自發的分化相對)成為具有特定RPE形態的RPE細胞，這將在下文進一步討論。根據優選的實施方式，hSC是人類胚胎干細胞(hESC)。根據一個實施方式，在包含TGF(3超家族的一種或更多種成員的培養基中培養細胞是在hSC具有初始的分化、定向分化，優選的由NA導致定向分化之后至少兩天。根據第五個方面，提供了在受試者中治療或預防視網膜疾病或病癥(其包括視網膜色素上皮的功能障礙、損傷和/或喪失)的方法，所述方法包括向所述受試者眼內移植hSC衍生的RPE細胞，所述RPE細胞通過誘導hSC趨向定向分化來獲得。可移植的RPE細胞優選的通過在此公開的方法獲得。附圖的簡要描述為了理解本發明和顯示它如何實際上進行，現在將參考附圖通過僅非限制性的實例來描述優選的實施方式，在附圖中附圖1A-1E:實時PCR，分析存在NA的情況下RPE標志物的表達。hESC的分化通過將它們作為自由浮動的群集(cluster)來培養來誘導。在6周的分化時，RPE標志物MiTF-A(附圖1A)和RPE65(附圖IB)的表達水平在存在NA的情況下顯著增加。在連續時點的實時PCR分析展現了，在存在NA的情況下MiTF-A(附圖1C)和RPE65(附圖ID)的表達水平隨著時間逐漸^是高。包括斑萎蛋白(Bestrophin)、CRALBP和Mertk的RPE標志物的其他轉錄產物的表達通過平板接種的色素化的群集的RT-PCR分析來展現(附圖IE)。+/-分別表示逆轉錄酶的存在或缺乏。附圖2A-2F:NA的RPE分化誘導效應不取決于特定的培養基組成。在KO培養基中(附圖2A),或在補充有N2的Neurobasal培養基中、其1周后用補充有B27的DMEM/F12(NN培養基)替換(附圖2C)，分化12周的hESC群集的暗視野顯微照片。在兩種培養基中，NA增加了朝向色素化細胞的分化(附圖2B，D)，而已分化的hESC群集的大小和它們的總數在用NN培養基時較小(白色箭頭標出分化中的群集內的色素化區域)。在RNA水平上，在兩種培養基中，NA增添提高了MiTF-A和RPE65的表達水平(分別附圖2E和F)。附圖3A-3L:hESC的自由浮動群集內的黑色素表達細胞是推定的RPE細胞。具有高度富集色素化細胞的限定區域的分化中的hESC的自由浮動群集的暗視野顯微照片(附圖3A)。在解離和平板接種之后與抗Otx2和MiTF免疫反應性的色素化細胞的熒光(附圖3B)和相差(附圖3C)圖像。顯示了在表明限制的色素化區域的平板接種之后分化中的群集的暗視野顯微照片(附圖3D)。在色素化區域內具有RPE細胞典型的形態學特征的細胞的相差圖像(附圖3E)。間接的免疫熒光染色顯示了，這些細胞表達RPE細胞的標志物，包括MiTF(附圖3F)、ZO-1(附圖3G)、斑萎蛋白(附圖3H)、RPE65(附圖31)和CRALBP(附圖3J)。在解離之后，低密度平板接種并培養，色素化細胞失去了色素沉著并獲得了纖維樣的形態學(相差圖像)(附圖3K)。在進一步延長培養和增殖成高密度培養物之后，細胞再次獲得了表示RPE細胞特征的形態和色素沉著(附圖3L)。附圖4A-4E:激活蛋白A誘導RPE分化。人類ESC一皮容許作為自由浮動群集在存在或不存在激活蛋白A的情況下分化6周，激活蛋白A在分化第一周之后添加。群集的暗視野顯微照片顯示了，激活蛋白A顯著地提高包括色素化細胞的群集的百分比(附圖4A、B)(白色箭頭標出分化中的群集內的色素化區域，某些群集內色素化區域的邊界由虛線標出)。在存在激活蛋白A的情況下，色素化的區域的邊界更為清晰地與群集內圍繞的非色素化區域分開。此外，色素化的細胞在存在激活蛋白A的情況下是更暗色的(附圖4B)。在RNA水平上，實時PCR分析顯示了，RPE65(附圖4D)和斑萎蛋白(附圖4E)的表達在存在激活蛋白A的情況下顯著提高。MiTF-A的表達不被激活蛋白A處理改變(附圖4C)。附圖5A-5G:BMPs和TGF(33在RPE分化中起作用。人類ESC作為自由浮動群集被誘導分化6周。偶爾觀察到自發分化成色素化細胞(附圖5A),但是當培養基補充NA時顯著提高(附圖5B，最左側和左側暗視野圖像；白色箭頭標出分化中的群集內色素化的區域)。在不存在(附圖5D)和存在(附圖5C)NA的情況下，培養基補充頭發生素(noggin)阻斷了分化成為色素化細胞。在RNA水平上，實時PCR分析顯示了，在存在和不存在NA的情況下，頭發生素都降低了MiTF-A的表達水平(附圖5E)。當在存在NA的情況下在hESC群集的分化期間將TGFP3添加給培養基時，它顯著地增加了MiTF-A(附圖5F)而非RPE65(附圖5G)的表達水平。附圖6A-6J:在大鼠眼中移植的hESC衍生的RPE細胞的存活和整合。在hESC衍生的RPE細胞的眼內移植之后，色素化的細胞可以在白化大鼠的眼睛中容易地體內鑒定(附圖6A，6B)。在剜出眼睛(附圖6B)和除去角膜和晶狀體之后，可以看見主要的移植物和其他分散的色素化斑點(附圖6CK在組織切片中，包括也共表達GFP的暗色色素化細胞的移植物可以被鑒定(附圖6D-6G)，證明了細胞是hESC衍生的的事實。移植的細胞可以在玻璃體內區域中、視網膜和晶狀體之間(附圖6H)、視網膜中(偶爾地沿著注射的管道伸入玻璃體內)(附圖61)以及在視網膜下間隙(附圖61、60,6P)中找到。移植的hESC衍生的RPE細胞(用箭頭標出的色素化的細胞)整合到白化大鼠的RPE層中(附圖6J)。在對照的非移植的眼的RPE層中沒有觀察到色素化細胞。在移植物內，用ZO-l(附圖6K-6N)的免疫染色顯示了在移植的GFP+hESC衍生的細胞之間存在緊密連接。這種連接是RPE細胞的特征。在移植到患有RPE功能障礙和視網膜退化的RCS大鼠的視網膜下間隙中之后，與遠離移植物的區域相比(由箭頭標出)，光受體層的相對保存可以在靠近移植物處見到(附圖60;矩形內的區域由星號標記，在附圖6P中擴大)。注意到大量移植的hESC衍生的RPE細胞具有多邊形的形狀和鵝卵石樣外觀(附圖6P)(星號)。在此處顯示的所有情況中，RPE細胞來源于不存在激活蛋白A的情況下的hESC。附圖7:電子視網膜成像記錄顯示了，hESC衍生的RPE細胞的移植提供了在營養不良的RCS大鼠的眼睛中視網膜功能的拯救。與同伴的非移植的對照眼相比，在來自hESC的RPE細胞的移植之后在RCS大鼠眼中全視野ERG反應更高(n-ll只大鼠)。用于這些實驗的RPE細胞是沒有向培養基添加激活蛋白A來衍生的。顯示了對不斷提高強度的四次刺激的暗適應的混合的視錐4見桿反應的b-波幅。附圖8A-8I:顯示了在誘導來自hESC的色素化細胞發育中NA的效果的形態學和標志物表達的分析。暗視野顯微照片顯示了在存在(附圖8A、8C和8E)或不存在(附圖8B、8D或8F)NA(白色箭頭標出分化中的群集內的色素化區域)的情況下，在hESC衍生的群集培養4周(附圖8A、8B)、6周(附圖8C、8D)和8周(附圖8E、8F)期間色素化細胞的逐漸出現。在補充有NA的培養基中(粗線的柱)和在對照培養物(細線的柱)中在培養期間不同時點，含有色素化區域的群集的百分比的直方圖表示(附圖8G)。在具有NA補充的8周培養期間，色素化細胞(附圖8H)和對早期RPE標志物抗MiTF免疫反應性的細胞(附圖81)的百分比的直方圖表示。標尺柱(A)200mm;*p<0.05;**pO.001。附圖9A-9S:顯示了在hESC分化中的群集中隨著時間的RPE發育進展的實時PCR、免疫染色和流式細胞術分析。(附圖9A-9L)實時PCR，分析了在存在(粗線的柱)或不存在(細線的柱)NA的情況下培養的群集中RPE發育中關鍵基因的表達的時機。在hESC衍生的群集的8周分化期間在連續的時點分析了以下標志物的逐步表達hESC特異性標志物Oct4(附圖9A);早期神經標志物Otx2(附圖9B)、Musashi(附圖9C)和Pax6(附圖9D);視網膜祖代標志物Six3(附圖9E)、Rxl(附圖9F)和Chx10(附圖9G);RPE標志物MiTF-A(附圖9H)、RPE65(附圖91)和斑萎蛋白(附圖9J);光受體祖代標志物Crx(附圖9K);黑色素細胞發育標志物Soxl0(有橫條的柱，附圖9L)(M51黑素瘤細胞系被用作對照)。在具有(粗線)或缺乏(細線的柱)NA的情況下8周的群集分化中，展現了hESC特異性標志物TRA-l-60(附圖9M)和神經祖代標志物PSA-NCAM(附圖90)的逐步表達的FACS分析。在存在NA的情況下分化2周和4周的群集內，表達早期神經標志物PSA-NCAM(粗線的柱)、巢蛋白(有橫條的柱)、Musashi(細線的柱)、Pax6(縱條紋的柱)的細胞的百分比的間接免疫熒光分析(附圖9N)。免疫焚光圖像，表現了表達這些標志物的細胞，PSA-NCAM(附圖9P)、巢蛋白(附圖9Q)、musashi(附圖9R)、Pax6(附圖9S)。附圖10A-10J:形態學、標志物表達和功能的分析，顯示了hESC的自由漂浮的群集內色素表達細胞是推定的RPE細胞。鬼筆環肽染色顯示了表現RPE的特征的hESC衍生的色素化子代內F-肌動蛋白的分布(附圖10A);在解離、低密度平板接種并培養之后，色素化細胞失去色素沉著并獲得纖維樣形態(相差圖像，1周培養)(附圖IOB)。在進一步延長培養和增殖成高密度培養物之后，細胞再次獲得了表示RPE細胞特征的形態和色素沉著(1.5個月的培養)(附圖10C)。hESC衍生的RPE細胞的電子顯微鏡分析，顯示了作為RPE的特性的特征微絨毛(附圖10D)、基膜(附圖10E)、黑色素顆粒(附圖10D)、緊密連接(附圖10F)。相差(附圖10G)和熒光圖像(附圖10H-J)顯示了hESC衍生的色素細胞的綠色熒光膠乳珠子的吞噬作用(白色箭頭)；細胞膜用紅色熒光染料PKH染色(灰色)。三幅共焦熒光圖像表現了連續的Z軸切片(附圖10H-J)。附圖11A-11P:形態學和基因表達的分析，顯示了來自TGF卩家族的因子促進朝向RPE結局的分化。分化4周的hESC衍生的群集的暗視野顯微照片顯示了在存在激活蛋白的情況下在這個早期階段色素化細胞的出現(附圖11A)，以及與僅有NA(附圖11B)相反的，在存在激活蛋白A和NA的情況下(附圖11C)色素化群集分化的數量的提高。與激活蛋白A類似，補充TGF(31同樣提高了色素化群集的出現(附圖11D)。相比之下，激活蛋白信號傳導途徑的抑制物SB431542與激活蛋白A和NA—起的應用降低了激活蛋白A對色素13化群集出現的效力(附圖IIE)。色素化群集的發育還通過在存在FGF|3與NA的情況下培養細胞而被消除(附圖11F)。激活蛋白受體和激活蛋白A的轉錄產物的表達通過在存在或缺少NA的情況下培養的2周齡群集、以及未分化的hESCs作為對照的RT-PCR分析來展現(附圖11G)。在存在NA、NA+ActA、NA+SB431542、NA+ActA+SB431542、NA+TGF卩1的情況下在培養4周后含有色素化區域的群集的百分比的直方圖分析(附圖11H)。在NA(粗線的柱)或激活蛋白A和NA(對角條紋的柱)添加的4周培養之后色素化細胞的百分比的直方圖分析(附圖111)。在不同濃度的激活蛋白A下色素化細胞的百分比的直方圖分析(附圖11J),以及RPE標志物斑萎蛋白(附圖11K)和RPE65(附圖11L)的轉錄產物的表達水平，所述激活蛋白A濃度對于RPE誘導140ng/ml是最佳的。在有(對角條紋的柱)或沒有(粗線的柱)激活蛋白A添加、存在NA的情況下的hESC分化中，激活蛋白A對視網膜和RPE基因，斑萎蛋白(附圖11M)、MiTF-總(附圖11N)、Rxl(附圖110)和ChxlO(附圖IIP)的表達水平的作用的實時PCR時間-過程分析。**p<0.005.(白色箭頭標出分化中的群集內的色素化區域)。附圖12A-12E:來自用NA和激活蛋白A處理的hESC的RPE細胞在營養不良的RCS大鼠眼睛中的^L網膜下移才直之后存活。色素化細胞的群集可以使用眼底成像系統(附圖12A-12C);眼底照像(附圖12A)和無紅光照像(附圖12B)來容易地在RCS大鼠的眼睛中體內鑒定，其顯示了移植物的視網膜下的位置(注意到視網膜血管經過色素化區域)。hESC衍生的GFP表達細胞可以在熒光激發和使用發射濾波器時被看見發射熒光(附圖12C)。在熒光顯微鏡中離體(exvivo)成像的眼杯制品中(附圖12D-12E),可以看見視網膜下的GFP陽性細胞的大的群集(附圖12D)以及多個分散的較小的群集(附圖12E)。附圖13A-13F:在RCS大鼠眼睛中視網膜下hESC衍生的激活蛋白A處理的RPE細胞移植物的組織學外觀。蘇木素和曙紅(附圖13A和IB)染色的組織切片顯示了視網膜下的和偶爾地視網膜內位置的移植的hESC衍生的色素化細胞，其以群集或作為分離的纟田胞出現(箭頭)。使用GFP的免疫染色(附圖13C-13F)確認了這些細胞確實是hESC衍生的。移植物常常是十分大的和分散的(附圖13C,13E),14共同表達GFP的色素化細胞可以明顯地看出(附圖13D,13F)。注意到GFP陽性色素化細胞整合在宿主的RPE層之內(附圖13D，箭頭)。附圖14A-140:移植的hESC衍生的色素化細胞表達成熟RPE的標志物。免疫染色揭示了，移植物內大量的移植的細胞表達作為成熟RPE細胞的特征的蛋白質，包括RPE特異性標志物RPE65(附圖14A-14E)和斑萎蛋白(附圖14F-14J)以及緊密連接標志物Z0-1(附圖14K-140)。附圖14A、14F和14K顯示了共表達GFP和相關標志物的移植物的低放大率焚光圖像。在每一排的高放大率共焦圖像顯示了在單個細胞水平下色素(通過Nomarski光學器件)以及GFP和不同標志物的共表達。這些系列確認了這些細胞確實是hESC衍生的，以及它們在體內表達成熟RPE的標志物。在附圖14M中，注意到宿主RPE對ZO-l染色(虛線箭頭)，而它在附圖14N、140中是GFP陰性的(相應的區域是暗色的)，與ZO-l陽性hESC衍生的細胞相反(附圖14M中的完整箭頭)其確實共表達GFP(附圖14N，140)。附圖15A-15C:移植的hESC衍生的、激活蛋白A處理的RPE細胞提供了RCS大鼠視網膜退化模型中的功能拯救。與同類的非移植6勺對照眼相比，以及與單獨進行培養基的視網膜下注射的眼睛相比，在8周齡記錄的全—見野ERG反應在來自hESC的、激活蛋白處理的RPE細胞的移植之后的RCS大鼠眼晴中是更高的。在移植的眼(附圖15A)和它同類的對照眼(附圖15B)中顯示了在暗適應狀態下對一系列4是高強度的白色閃光的代表性的ERG反應。附圖15C顯示了在移植的眼和不同組的對照眼之間平均幅度方面的顯著的區別("-注射的眼(n=13);J-未注射的眼(n-13);--培養基的未注射的眼(n==5);j匿培養基注射的眼(n=5))。如所示，與在沒有激活蛋白A而衍生的RPE細胞的移植之后實現的拯救效果(附圖7)相比，在激活蛋白A處理的RPE細胞的移植之后(在此顯示)視網膜功能傾向于更好的保存。附圖16A-16D:移植的hESC衍生的、激活蛋白A處理的RPE細胞提供了RCS大鼠視網膜退化模型中的結構的拯救。利用蘇木素和曙紅染色的切片的高分辨率顯微鏡圖像檢查和定量移植的hESC衍生的激活蛋白處理的RPE細胞對退化的宿主視網膜的效果。與遠離移植物的區域相比，在接近視網膜下RPE移植物處，觀察到外核(光受體)層(ONL)以及內部和外部光受體片段(IS+OS)的相對保存(兩個實例在附圖16A、16B中顯示)。附圖16A中的插圖展現了這種差異(在接近移植物的右側插圖中顯示了拯救的視網膜具有相對厚的ONL;在遠離移植物的左側插圖中可見ONL的嚴重的變薄)。與遠離移植物的區域相比(灰色柱)，總體視網膜厚度(附圖16C)以及ONL和IS+OS厚度(附圖16D)在接近hESC衍生的RPE移植物處顯著地增加(黑色柱，平均土SEM，n=7)。這種類型的結構拯救僅在接近視網膜下和深部的視網膜內移植物處觀察到，而當移植物僅僅處于玻璃體內時沒有觀察到(未顯示)。對于定量技術的細節，請參見方法。附圖17A-17E:移植的hESC衍生的激活蛋白A處理的RPE細胞體內攝取視紫紅質。視網膜下移植的RPE細胞的共焦圖像顯示了色素、GFP、RPE65和視紫紅質在同一單個細胞內的共同定位。RCS大鼠的天然的RPE細胞表達RPE65(附圖17C,箭頭)，但是不表達GFP(附圖17D,箭頭)并含有最小數量的視紫紅質(附圖17B、17E)。發明的詳細說明當前的公開提供了轉化生長因子-|3(TGFP)超家族的一種或更多種成員用于制備培養系統的用途，所述培養系統用于促進人類干細胞(hSC)、優選的人類胚胎干細胞(hESC)分化成視網膜色素上皮(RPE)細胞。要注意的是，除了在此詳細地討論的特定用途之外，還包含在當前的公開之內的是通過在存在一種或更多種TGF(3超家族的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細胞；以及促進hSC的定向分化為RPE結局的方法，以及生長和維持這種hSC衍生的RPE細胞的方法，以及利用這種hSC衍生的RPE細胞的方法。根據某些優選的實施方式，根據在此的教導獲得的RPE細胞是成熟的(換句話說，終末分化的)和功能性的RPE細胞，以下將進一步討論和說明。當前的公開廣泛地涉及生長因子TGF卩超家族的一種或更多種成員在促進/誘導/增強hSC向RPE細胞、優選的成熟RPE細胞的定向分化方面的用途。在下面的說明書和權利要求書中，有時將使用各種術語，這些術語的含義應當根據在此的教導來解釋，如下"轉化生長因子-(3(TGFP)超家族生長因子"，如在此使用的，表示生長因子的TGFp超家族的任何成員，例如轉化生長因子-p蛋白，包括TGF卩1、TGF卩2和TGF卩3亞型，以及同源配體，包括激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B和激活蛋白AB)、nodal、抗mullerian激素(AMH)、某些骨骼形態發生蛋白(BMP)，例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7，以及生長和分化因子(GDF)。"人類干細胞，，或"hSC",如在此使用的，是指人類來源的細胞，其在適合的條件下能夠分化成為具有特定的專門化功能的其他細胞類型，而在其他適合的條件下能夠自我更新并保持在未分化的多能狀態，如下文詳述的。在此使用的"細胞"是指單細胞以及細胞的群體(即，超過一個細胞)。所述群體可以是包含一種細胞類型的純的群體。做為選擇，群體可以包含超過一種細胞類型。hSC細胞優選的是獲自任何年齡的個體的骨髓組織、或獲自新生個體的臍帶血或組織的造血或間質干細胞，獲自出生后任何年齡的胎兒或尸體腦部的神經干細胞、獲自受精后形成的胚胎組織(例如，卵裂球，胚泡)的胚胎干(ES)纟田胞、或獲自妊娠期間任何時間，優選的妊娠10周之前的胎兒的生殖組織的胚胎生殖(EG)細胞。術語細胞可以表示單細胞或細胞的群集。如在此使用的，"胚胎干細胞"和"多能胚胎干細胞，，是指可以子)4細k。'。、、如在此使用的，"細胞培養物"或"培養的細胞"是指在人工的體外環境中被培養、培育或生長的細胞或組織。如在此使用的，"未分化的多能hSC，，、"多能hSC"是指具有形成任何成年人細胞的能力的、人類來源的前體細胞。這樣的細胞是真實的細胞系，因為它們(i)能夠以未分化的狀態在體外大范圍的增殖；和(ii)甚至在延長的培養之后能夠分化成所有三種胚胎胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的衍生物。hESC來自低于一周齡的受精的胚胎(處于裂解或胚細胞階段)或通過具有等效特征的人工方式產生(例如，通過核轉移)。其他多能hSC包括，多能成年人祖細胞(MAP)、誘導的多能干細胞(iPS細胞)和羊水干細胞，但不限于此。如在此使用的，"未分化的"是指當群體中相當大比例(至少20%和可能超過50%或80%)的細胞和它們的衍生物顯示了未分化細胞的特征性標志物和形態學特征、將它們從胚胎或成年人來源的已分化的細胞區分開時所培養的細胞。當細胞在至少3周的培養時間期間經歷至少l次群體倍增，而在所述培養時間之后保持至少約50%，或相同比例的細胞帶有未分化細胞的特征性標志物或形態學特征，細胞被認為在未分化的狀態中增殖。如在此使用的，"細胞懸浮液"或"自由漂浮的細胞"是指細胞的培養物，其中大部分的細胞在基質中、一般在培養基(系統)中自由地漂浮，所述細胞作為單細胞、或作為細胞群集和/或作為細胞聚集體漂浮。換句話說，所述細胞不附著于基底地在培養基中存活并增殖。如在此使用的，"培養系統"是指適合于SC的增殖的培養系統。該術語表示了成分的組合，最少包括基礎培養基(通常包含規定的基礎溶液的細胞培養基，其包括鹽、糖類和氨基酸)以及生長因子的轉化生長因子-(3(TGFp)超家族的一種或更多種成員。根據本發明的培養系統可以進一步包含其他成分，例如而不限于此，血清或血清替代物，培養(營養物)基質和其他外源添加的因子，它們一起提供了支持SC生長的適合的條件，以及一般用于細胞培養系統的其他成分。，上述成分可以被共同地分類為可溶的成分。然而，在本發明的情境中，所述成分還可以與載體，即，不溶的成分締合。所述締合可以是通過化學的或物理的附著/結合。例如，所述成分可以固定在基質(例如，細胞外基質)上，通過添加到系統中或結合在生物可降解的材料上的細胞來呈遞。進一步，所述成分可以從載體上釋放，所述載體可以是細胞或者封裝或包埋了所述成分的泡嚢。因而，在以下的文字中，補充基礎培養基來形成培養系統的成分包括可溶的和不溶的成分。如在此使用的，"分化"是指從一種細胞類型到另一種細胞類型的細胞狀態的切換過程，更具體的在當前公開的上下文中是指人類干細胞獲得視網膜色素上皮(RPE)細胞的細胞類型的過程，所述細胞類型具有表明所述RPE細胞是成熟的(終末分化的)細胞的至少一種特征性特征。如在此使用的，術語"細胞類型"是指細胞的獨特形態學或功能形式。如在此使用的，"分化中的hSC"是指未分化的hSC,其在適合的條件下能夠以增加的、定向的方式分化為預定的結局；該術語還指hSC的群體，其中其至少部分已經被誘導經歷了至少初始的分化，即，疋向勿、1^冉^且勺、。"引起"、"增加"、"促進"或"使......定向"在此可互換地使用，除非上下文另外地指示了，是指啟動干細胞非自發的分化成為RPE纟田胞。"分化誘導物"或"分化啟動子"、"分化引發試劑"或"分化促進因子，，在此可互換地使用，表示能夠引發、增加、促進多能SC分化為體細胞或使多能SC定向分化為體細胞、優選的成為RPE細胞的任何試劑。"視網膜色素上皮細胞"、"RPE細胞"、"RPE"在上下文容許時可以可互換地使用，是指功能上類似于形成視網膜的色素化細胞層的天然RPE細胞的細胞類型的細胞(例如，在移才直到眼睛內時，它們展現了類似于天然RPE細胞的功能活性)。因而，術語"視網膜色素上皮細胞，，、"RPE纟田月包"或"RPE"可以用于指代視網膜的色素化層的天然RPE細胞和根據當前的公開直接分化自hSC的RPE纟田胞。術語"hSC衍生的RPE細胞，，在此使用是表示通過從hSC的定向分化所獲得的RPE細胞。根據優選的實施方式，hSC衍生的RPE細胞是成熟的(終末分化的)和功能性的RPE細胞，如下文定義的參數所展現的。術語"定向分化，，與術語"RPE誘導的分化"可互換地使用，被理解為是指在誘導/促進僅分化成RPE細胞類型的培養條件下操作hSC的過程。"功能性RPE纟田月包"在此使用是表示通過在存在TGFp超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的細胞，所述RPE細胞展現了至少一種以下的特征-在分化期間，培養的細胞響應TGFp信號傳導；-所述RPE細胞是成熟的、終末分化的細胞，如通過指示終末分化的標志物例如斑萎蛋白或RPE65的表達所展現的，同時地或作為選擇地，通過它們缺乏在體內增殖的潛力所展現的。-在移植之后(即，原位)，RPE細胞展現了支持鄰近于RPE細胞的光受體的營養效力；-進一步的，在原位，所述RPE細胞能夠具有作為這些光受體的正常更新過程的一部分的脫落的光受體外部片段的吞噬作用的功能。因而，根據本發明的RPE細胞特別適合于宿主RPE的再生，從而在將其移植到受試者的眼睛內之后提供改善的視力。"類似的"，當在分化中的RPE細胞的上下文中使用時，是指已分化的RPE細胞與天然RPE細胞共有一種或更多種獨特的形態學或功能特征。例如，足夠的相似性可以通過，例如確定所述已分化的細胞表達天然存在的RPE細胞的一種或更多種標志物，例如MiTF、ZO-l、斑萎蛋白、RPE65、Otx2、Mertk和CRALBP;或細胞顯示RPE細胞的一種或更多種物理的形態特征，例如細胞內典型的F-月幾動蛋白分布、色素化微粒的色素沉著、多邊形的(例如，六角形的)形狀、鵝卵石樣外觀和由電子顯微鏡檢查所展現的RPE的超微結構特征來指示。此外，可以包括任何一種上文列出的功能，例如，支持鄰近于RPE細胞的光受體的營養效果；具有攜帶視紫紅質或缺乏體內增殖的潛力的脫落的光受體外部片段的吞噬作用的功能性。如在此使用的"大規模，，對于細胞培養和擴增來說，是指RPE細胞在一定條件下的生產，所述條件允許在4周后在細胞培養物中細胞至少加倍，在4周后的細胞群體基本上由RPE細月包組成。如在此使用的，"細胞標志物"是指細胞的任何表型特征，其可白質(包括分泌的、細胞表面的或內部的蛋白質；被細胞合成的或攝取的)；核酸(例如mRNA,或酶活性核酸分子)或多糖。包括的是任何這些細胞成分的決定簇，其可以通過對感興趣的細胞類型的標志物特異的抗體、凝集素、探針或核酸擴增反應來檢測。所述標志物還可以取決于基因產物的功能通過生物化學的或酶學的分析或生物反應來鑒定。與每種標志物相關的是編碼轉錄產物的基因，以及導致標志物表達的事件。如果標志物的表達處于比可接受的對照物例如肌動蛋白或甘油醛3-磷酸脫氬酶(GAPDH)至少高50%(對于在抗體或PCR分析中測量的總基因產物)或更頻繁30%(對于群體中的陽性細胞而言)的水平，標志物被稱為在未分化的或已分化的細胞群體中優先地表達。表達更高或更頻繁2、10、100或10,000倍的標志物是遞20增地更為優選的。當前的公開利用了衍生RPE的hSC，是由于在存在著被應用于;l浮的hSC的獨特的培養系統的情況下hSC的誘導的和定向分化。hSC的非限制性的實例是獲自胎兒或出生后任何年齡或獲自尸體的神經干細胞，獲自任何年齡的人類個體的骨髓組織或獲自新生個體的臍帶血的造血干細胞，間質干細胞，羊水干細胞，獲自受精后形成的胚胎組織(例如，來自單個卵裂球，或來自胚泡)的胚胎干(ES)細胞，獲自妊娠期間任何時間，優選的妊娠10周之前的胎兒的生殖組織的胚胎生殖(EG)細胞，誘導的多能干細胞，或獲自任何年齡的人類個體的生殖腺的干細胞。根據本發明的優選的人類干細胞是人類胚胎干細胞(hESC)。hSC可以使用公知的細胞培養方法獲得。舉例來說，hESC可以分離自卯裂期或桑椹胚期人類胚胎的單個卵裂球，分離自卵裂期和桑椹胚人類胚胎和人類胚泡。人類胚胎可以獲自體內移植前胚胎，或更一般地獲自體外受精(IVF)的胚胎。做為選擇，未受精的人類卵細胞可以被單性生殖地活化來裂解并發育到胚泡階段。此外，單細胞人類胚胎可以被擴增到胚泡階段。對于從胚泡分離hESC，透明帶被除去，通過免疫外科手術來分離內細胞團(ICM),其中滋養外胚層細胞被裂解并通過柔和的吸移從完整的ICM中除去。ICM然后平板接種在含有允許它的生長的合適的培養基的組織培養燒瓶中。在9到15天后，ICM衍生的生長物通過機械解離或通過酶消化被分離成塊，然后細胞重新平板接種在新鮮的組織培養基上。展現了未分化的形態的菌落通過微量移液管單獨地挑選，機械地解離成塊，并重新平板接種。產生的ESC然后每l-2周常規地分裂。對于hESC的制備方法的進一步的細節，參見Thomsonetal.[U.S.Pat.No.5,843,780;Science282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995];Bongsoetal.[HumReprod4:706，1989]。商業上可獲得的hSC也可以根據本發明使用。HSC可以購自NIH人類胚胎干細胞登記所。商業上可獲得的胚胎干細胞系的非限制性實施例有BGOl、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03和TE32。hESC和衍生自它們的細胞的潛在的應用是廣泛的，包括藥物開發和測試，用于移植的細胞、組織和器官的產生，生物分子的生產，測試化合物的毒性和/或致畸性，高通量篩選分子的有毒，再生、保護或其他效力，以及促進發育和其他生物過程的研究。舉例來說，當前預期可通過hESC或hESC衍生的細胞的治療性移植來治療的疾病包括帕金森氏病、心臟梗塞、幼年發作型糖尿病和白血病[GearhartJ.Science282:1061-1062，1998;RossantandNagy,NatureBiotech.17:23-24,1999]。然而，對于hESC的實際開發存在著顯著的障礙。這樣的兩種障礙包括將hESC維持在未分化的、多能狀態而沒有自發的分化；以及使hESC定向分化成為特定類型的體細胞。對于維持和增殖干細胞，特別是hESC在未分化的狀態已經描述幾種培養系統8。由于衍生自干細胞的已分化細胞在無數的治療應用中的潛力，使a.體細胞結局是很令人感興趣的。在某些眼部疾病和病癥中，例如視網膜和斑(macula)的疾病和病癥，RPE細胞的衰竭最終導致視覺喪失和甚至失明。RPE細胞的移植來替換和支持衰竭的宿主RPE已經被暗示作為可能的治療性介入，但是從人類供體或胚胎獲得這樣的細胞是困難的。如果可以闡明使hSC細胞定向分化成為功能性RPE細胞的方式，hSC因此可以充當RPE細胞潛在無限的供體來源。現在已經令人驚訝地發現，用大量生長因子的TGF(3超家族的成員接觸hSC強烈地促進hSC朝向RPE結局的分化。換句話說，這些生長因子具有對hSC的誘導效果。因而，設想了轉化生長因子-(3(TGF-卩)超家族的成員用于制備培養系統的用途，所述培養系統用于誘導人類千細胞(hSC)分化為視網膜色素上皮(RPE)細胞。雖然生長因子的TGFp超家族的許多成員是已知的(上文列出了某些非限制性的實例)，根據優選的實施方式，TGF超家族的成員優選的是TGFpi、TGFP3生長因子或激活蛋白A或它們的組合。_外細胞具有抑制效應，以及進一步的，NA促進朝向神經、和進一步朝向RPE細胞樣結局的體細胞分化8。NA也稱為"煙酰胺"，是維生素B3(煙酸)的酰胺衍生形式，其被認為保存和改善卩細胞功能。NA具有化學式C6H6N20。NA對于生長和食物到能量的轉化是必不可少的，它已經用于關節炎治療和糖尿病治療和預防。NH2煙酰胺(NA)在當前的公開的上下文中，術語NA還表示NA的衍生物。在此使用的術語"煙酰胺(NA)的衍生物"代表作為天然NA的化學上修飾的4汙生物的化合物。化學修飾可以包括，例如，在基礎的NA結構的吡啶環上的替換(通過環的碳或氮成員)，通過酰胺部分的氮或氧原子，以及基團的刪除或替換，例如，來形成NA的硫代苯甲酰胺類似物，所有這些都是有機化學的熟練技術人員理解的。本發明的上下文中的衍生物還包括NA的核苷書f生物(例如，煙酰胺腺噪呤)。描述了NA的多種衍生物，某些還涉及PDE4酶的抑制活性(WO03/068233;WO02/060875;GB2327675A)或作為VEGF受體酪氨酸激酶抑制物(WO01/55114)。例如，制備4-芳基-煙酰胺衍生物的過程(WO05/014549)。與上述相關，現在令人驚訝地發現，當hSC在存在NA的情況下分化時，它們的性質被改變，因而它們獲得了響應TGF卩超家族的一種或更多種成員的誘導效應的能力，其使它們定向分化向RPE結局、優選的成熟和功能性RPE細胞。因此，當在之后將hSC暴露于生長因子的TGFj3超家族的一種或更多種成員時，結合在培養物中細胞對NA的預先暴露，NA的RPE分化誘導效應可以被顯著地提高。因而，根據一個實施方式，所述方法包括用生長因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員處理細胞，并與對NA的在先暴露組合使用、。組合用于包含TGFp和NA的培養系統的制備；以及用于僅包含TGF卩超家族的一種或更多種成員的培養系統的制備，用于誘導/促進已經暴露于NA的hSC的分化和/或進一步分化。不受理論的限制，相信的是NA充當了分化i秀導物/啟動物，以及類似地，TGFP超家族的一種或更多種成員充當了RPE分化促進因子。此外，不受到理論的限制，相信的是，hSC對NA的在先暴露為細胞提供了性質，所述性質允許它們對TGF卩超家族的一種或更多種成員的RPE分化促進效應的響應。因而，根據本發明的實施方式，hSC首先在包含補充有NA的基礎培養基的培養系統中培養至少幾個小時，優選的至少一天，更優選的至少2天，在將該細胞培養物中的細胞在補充有TGFp超家族的一種或更多種成員的基礎培養基(相同的或不同的)中培養之前。根據另一個實施方式，未分化的hSC在包含補充有NA和TGF(3超家族的一種或更多種成員的基礎培養基的培養系統中培養。注意的是，各種基礎培養基是本領域已知的，用于細胞培養物和優選的用于SC培養物。可以根據當前的公開使用的基礎培養基的非限制性列表包括NeurobasalTM(CAT#21103-049,Gibco1998/1999)、KO畫DMEM(CAT#10829-018,Gibco1998/1999)、DMEM(CAT#41965-039,Gibco2004)、DMEM/F12(CAT#21331-020,Gibco2004)、Cellgro干細胞生長培養基(CAT#2001，CellGenix2005)或X-Vivo(CAT弁04-380Q,LONZA2007)。當前的公開還提供了誘導hSC定向分化為RPE結局的方法，所述方法包括(a)提供包含hSC的細胞培養物；(b)在培養系統中培養所述細胞培養物中的細胞，所述培養系統包含補充有TGFP超家族的一種或更多種成員的基礎培養基，從而促進hSC定向分化為RPE結局。分化可以在hSC的自由浮動的群集或附著的培養物內發生。描述了在附著的培養物中的體細胞分化[美國專利No.7,112,437]。這樣的附著的培養物因而可以充當用于通過培養系統誘導RPE分化的基礎，所述培養系統補充有生長因子的TGFP超家族的至少一種或更多種成貝。細胞培養物中的細胞可以是未分化的hSC的群體，或是其中至少部分hSC已經開始分化的細胞的群體。所述起始的分化是定向分化。因而，在本公開的上下文中，所述方法中提供的細胞有時被稱為分化中的細月包。導入可溶的成分和不溶成分來補充。對于具有生長因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員的補充，所述成員可以以可溶的形式存在，或固定于或締合于添力口到培養系統的基質或纟田月包，或所述成》、可以結冶、或復合于其1'也物質。所述成員還可以從后者中存在的細胞分泌到培養系統中。hSC可以以未分化的狀態、以及在暴露于分化促進因子(分化引發試劑)例如NA之后提供。未分化的hSC可以從各種培養系統獲得，在所述培養系統中hSC可以被維持在未分化的多能狀態。例如，細胞可以被培養在無飼養物(feeder-free)的附著或懸浮系統(WO06/070370)中或飼養細胞上。通常使用的飼養細胞包括原代小鼠胚胎成纖維細胞(PMEF)、小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)、鼠胎兒成纖維細胞(MFF)、人類胚胎成纖維細胞(HEF)、獲自人類胚胎干細胞的分化的人類成纖維細胞、人類胎兒肌細胞(HFM)、人類胎兒皮膚細胞(HFS)、人類成年人皮膚細胞、人類包皮成纖維細胞(HFF)、獲自臍帶或胎盤的人類細胞、人類成年人輸卵管上皮細胞(HAFT)和人類骨髓基質細胞(hMSC)。hSC的群集可以通過從飼養層或細胞外基質解離細胞來從附著細胞培養物獲得來形成細胞的懸浮液。細胞的懸浮液可以包含自由浮動的群集或基本上單細胞的懸浮液，從其中細胞的群集可以生長形成細胞群集。根據優選的實施方式，所述細胞培養物包含細胞懸浮液，優選的處于懸浮培養物中的自由浮動的群集，即，來自人類胚胎干細胞(hESC)的細胞的聚集物。自由浮動的干細胞的來源早先在WO06/070370中描述了，通過引用將其全部合并在此。根據當前的公開的培養步驟可以包括用一種或更多種不同的培養系統培養細胞培養物中的細胞，至少一種所述培養系統包含TGF卩超家族的一種或更多種成員。根據當前的公開的一個實施方式，培養物中的細胞在培養系統中培養，所述培養系統包含除了所述生長因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員之外補充有NA的基礎培養基。根據另一個實施方式，細胞首先在包含基礎培養基和NA的培養系統中培養，所述細胞是未分化的hSC，優選的在hSC分化被誘導之后(即，在預定的時間之后，或通過本領域可用的技術確i人細胞分化之后)，細胞培養物中的細胞在包含生長因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員的培養系統中培養。第二培養系統還可以包含NA，即，可以是與初始的培養系統相同的，向其中添加了TGF|3超家族的成員。結果，定向分化為RPE細胞被誘導。根據這個實施方式，初始細胞培養物中的hSC在包含NA的培養系統中至少培養啟動hSCs分化所需的時間。根據一個特定的實施方式，所述細胞培養系統在包含NA的培養系統中培養幾天，優選的至少兩天，優選的至少一周，更優選的至少兩周。不受到理論的限制，本發明人規定，NA誘導定向分化過程，與自發的分化(即，在沒有NA暴露或暴露于NA與TGF(3成員時)相比其在它的發展中還被加速了。已經在此顯示了，在定向分化中，未分化的干細胞更為快速地從培養系統中消除。因此，NA在分化中的hSC的培養系統中使用，作為促進和加速定向分化過程的手段，用于未分化的干細胞的完全消除，據此預防潛在的并發癥，例如在移植后由于未分化細胞的存在的畸胎瘤腫瘤形成。在此已經顯示的是，與自發地分化中的細胞(即，不存在這些因子)相比，hSC對NA的暴露，跟隨著對TGF(3超家族的一種或更多種成員的暴露誘導了分化為具有不同表型的細胞。進一步的，不受到理論的限制，發明人假定的是，NA誘導了分化成為表達TGFJ3超家族的一種或更多種成員的受體(其不被自發地分化中的干細胞表達)的細胞，從而容許定向分化成為成熟的和功能性的RPE細胞。這樣的受體表達容許TGFp超家族成員對培養物中的分化中的細胞趨向RPE結局的定向分化的誘導效應，即，趨向成熟的和功能性的RPE細^<。如上文指出的，存在著生長因子的TGF卩超家族的多種成員。例如，根據本發明的生長因子可以是一種或更多種以下的，TGF卩1、TGF|32、TGF卩3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、nodal、抗mullerian激素(AMH)、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7或生長和分化因子(GDF)。然而，優選的，TGF卩超家族的生長因子是TGFP3或TGF卩1或激活蛋白A或它們的組合。根據本發明的基礎培養基是本領域已知用于支持體外細胞生長的任何已知的細胞培養基，一般地，是包含規定的基礎溶液的培養基，26其包含鹽、糖類、氨基酸和維持培養物中的細胞處于存活狀態所需的任何其他營養物。可以根據本發明使用的商業上可獲得的基礎培養基的非限制性實施例包括Neurobasal、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、CellgroTM干細胞生長培養基或X-VivoTM。基礎培養基可以補充有本領域已知的處理細胞培養物的多種試劑。以下是可以包括在培養系統中根據當前的公開使用的各種添加物的非限制性參考的實例匿含有血清或血清替代物的培養基，例如而不限于，knockout血清替代物(KOSR)、Nutridoma-CS、TCHTM、N2、N2衍生物或B27或組合；-細胞外基質(ECM)成分，例如而不限于，纖連蛋白、層粘連蛋白和明膠。ECM可以被用于攜帶生長因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員；-抗細菌試劑，例如但不限于，青霉素和鏈霉素；-非必需氨基酸(NEAA)，-已知在促進培養物中的SC的存活方面起作用的神經營養因子，例如而不限于BDNF、NT3、NT4。一旦細胞^皮促^f吏進入RPE結局，RPE細l包可以通過已知的方法從培養物中收回/收獲，用于各種應用。當前的公開還提供了通過在存在TGF(3超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細胞。根據一個實施方式，RPE細胞通過本發明的方法獲得。上文的進一步的，通過根據當前的公開的定向分化所產生的RPE細胞具有與在自發的分化期間發育的RPE細胞相比的特定性質。-分化中的細胞在它們的發育和分化中具有響應TGF(3信號傳導的潛力。-產生的RPE細胞是成熟的細胞(終末分化的)；-與在自發的分化期間形成的RPE細胞相比，成熟的RPE細胞顯示了更暗的色素沉著。-與通過自發分化產生的RPE細胞中它們的表達相比較，成熟的RPE細胞表達顯著更高水平的成熟RPE細胞的標志物的轉錄產物，例如斑萎蛋白和RPE65。在這一點上，例如，參考附圖9J、IIM和IIK，顯示了與存在NA(附圖9J)的情況下的分化相比在自發的分化(無NA)中斑萎蛋白的表達，以及激活蛋白A對定向分化的增加的效力(附圖IIK、IIM和4E)。進一步參考附圖1B和91,顯示了與存在NA的情況下的分化相比，進一步與附圖4D中激活蛋白A的增加效力相比較，在自發的分化(無NA)中RPE65的表達。-在電子顯微鏡(EM)分析中，RPE細胞展示了成熟的真正的RPE細胞的形態學特征，其在來自自發分化中的hSC的RPE樣細胞中沒有展現，例如頂端的絨毛、緊密連接和基膜。通過當前的公開的方法產生的RPE細胞可以用于這些細胞的大規模和/或長期培養。為此，本發明的方法在適合于細胞的大規模生產的生物反應器中進行，在其中未分化的hSC將根據本發明來培養。在生物反應器中培養細胞的一般需求是本領域技術人員公知的。做為選擇，當前的公開的方法產生的RPE細胞可以在它們的衍生之后被擴增。對于擴增，它們被離解、以低密度平板接種在胞外基質,優選的聚-D-賴氨酸和層粘連蛋白上，并在具有NA的無血清KOM中培養。在這些培養條件下，色素化細胞釋放色素沉著并獲得纖維樣形態。在進一步延長的培養和增殖為高密度培養物之后，細胞重新獲得RPE細胞的特征性的多邊形形狀形態學和色素沉著。RPE細胞可以在懸浮液中或以單層擴增。RPE細胞以單層培養的擴增可以通過本領域技術人員公知的方法被修飾為在生物反應器中的大規模擴增。本領域技術人員很好地理解的是，RPE細胞從hSC的衍生化具有很大效益。它們可以用作體外模型用于開發新的藥物來促進它們的存活、再生和功能。hSC彩f生的RPE細胞可以用于對RPE細胞具有毒性或再生效果的化合物的高通量篩選。它們可以用于揭示對于光受體細胞的發育、分化、維持、存活和功能重要的的機制、新的基因、可溶的或膜結合的因子。'RPE細胞還可以充當RPE細胞的無限的來源，用于移植、補充和支持視網膜退化中功能失常或退化的RPE細胞。此外，遺傳修飾的RPE細胞可以充當載體來在移植之后在眼睛和視網膜中攜帶并表達基因。因而，根據當前的公開的進一步的方面，提供了將RPE細胞移植到受試者的眼睛中的方法，所述方法包括(a)提供包含hSC的細胞培養物；(b)在包含補充有TGF(3超家族的一種或更多種成員的基礎培養基的培養系統中培養細胞，從而所述hSC被促使分化成RPE細胞；(c)從所述細胞培養物收獲RPE細胞；和(c)將所述已分化的RPE細胞移植到所述受試者的眼睛中。細胞的收獲可以通過本領域已知的各種方法來進行。非限制性的實施例包括機械解剖和用木瓜蛋白酶解離。還可以應用本領域已知的其他方法。hSC衍生的RPE細胞可以移植到受試者的眼睛中的各種目標位置。根據一個實施方式，RPE細胞的移植將到眼睛的視網膜下間隙，其是RPE的正常的解剖學位置(在光受體外部片段和脈絡膜之間)。此外，取決于細胞的遷移能力和/或主動旁泌效應，可以考慮移植到其他的眼睛區室，包括玻璃體間隙、外視網膜的內部、視網膜外周部和月永絡月莫之內。進一步的，移植可以通過本領域已知的各種技術進行。進行RPE移才直的方法在例如美國專利NO.5,962,027、6,045,791和5,941,250中，以及在EyeGraefesArchClinExpOpthalmolMarch1997;235(3):49-58;BiochemBiophysResCommimFeb.24,2000;268(3):842-6;OpthalmicSurgFebruary1991;22(2):102-8中描述了。進行角膜移植的方法在例如美國專利NO.5,755,785中和在Eye1995;9(Pt6Su):6-12;CurrOpinOpthalmolAugust1992;3(4):473-81;OphthalmicSurgLasersApril1998;29(4):305-8;OphthalmologyApril2000;107(4):719-24;andJpnJOphthalmolNovember-December1999;43(6):502-8中描述了。如果要主要利用旁泌效應，細胞還可以被遞送并維持在用半滲透容器密封的眼中，其將降低細胞對宿主免疫系統的暴露(NeurotechUSACNTFdeliverysystem;PNASMarch7，2006vol.103(10)3896-3901)。才艮據一個實施方式，移才直通過parspana玻璃體切除手術，隨后通過小的視網膜開口遞送細胞入視網膜下間隙，或通過直接注射來進行。做為選擇，細胞可以通過穿鞏膜的、穿脈絡膜的方法遞送到視網膜下間隙。此外，可以進行直接穿鞏膜注射到玻璃體間隙中，或遞送29到接近睫狀體的前視網膜外周部。RPE細胞可以以各種形式移植。例如，RPE細胞可以以細胞懸浮液的形式導入目標位點，或附著到基質、細胞外基質或基底如可生物降解的聚合物或其組合上。RPE細胞還可以與其他:枧網膜細胞，例如與光受體一起移才直(共移才直)。因而，本發明還涉及包含通過本發明的方法獲得的hSC衍生的RPE細胞的組合物。所述組合物優選的適合于移植到眼睛內。通過將本發明的方法獲得的RPE細胞導入受試者的眼睛內，可以治療或預防各種眼睛狀況。所述眼晴狀況可以包括一般地與視網膜功能障礙、視網膜損傷和/或視網膜色素上皮的喪失相關的視網膜疾病或病癥。可以根據本發明治療的狀況的非限制性列表包括色素性視網膜炎；先天性利伯氏黑矇、遺傳或獲得性黃斑變性、年齡相關的黃斑變性(AMD)、Best病、視網膜剝離、回旋形萎縮、無脈絡膜、模式營養不良(patterndystrophy)以及RPE的其他營養不良、Stargardt病、由于光、激光、炎癥、感染、放射、新血管或創傷性損傷的任一項所引起的損傷的RPE和視網膜損傷。不受到理論的限制，移植的RPE細胞可以通過多種機制發揮它們的治療效果。一種機制是促進退化的光受體或視網膜內的其他細胞的存活的營養支持性效應。通過本公開的方法、以及在存在TGFP超家族成員的情況下來自hSC的RPE細胞能夠潛在地通過營養效應保護鄰近于它們的光受體。，移植的RPE細胞還可以通過補充功能失常和/或退化的宿主RPE細胞的再生機制來發揮它們的效果。通過本公開的方法和在存在TGF卩超家族成員的情況下衍生于hSC的RPE細胞可以補充功能失常的宿主RPE。移植的細胞是成熟的，并具有吞噬包括視紫紅質的光受體的脫落的外部片段的功能能力。如上所述，通過本公開的方法和在存在TGFp超家族的成員的情況下衍生于hSC的RPE細胞是成熟的，并因而它們在移植后不在體內增殖。因此，通過本公開的方法衍生于hSC的RPE細胞對于移植療法是更安全的，帶有發育成畸胎瘤腫瘤或增殖性前體細胞的腫瘤的降低的風險。如在此寸吏用的，術i吾"治療(treating)，(treatment)"是指本發明的hSC衍生的RPE細胞對受試者的眼睛狀況的治療性以及預防性效果，所述效果一般包括，改善與所述狀況相關的癥狀、降低狀況的嚴重度或治愈狀況，更具體地，所述效果可以包括逆轉對治療的受試者的視網膜和RPE的損傷、改善受試者的視網膜的功能、重建受試者的視網膜和RPE，其通過替換和/或支持衰竭的宿主視網膜和RPE細胞，直接地或通過旁泌效果，以及通過減弱、抑制或停止作為所述狀況的結果對受試者的視網膜造成的損傷而展現的預防性效果。如在本說明書和權利要求中使用的，形式"一，，和"該"包括單數和復數的指代物，除非上下文明確地相反指示。例如，術語"一種生長因子"包括一種或更多種生長因子，術語"生長因子"包括一種生長因子和超過一種生長因子。如在此使用的，術語"或"是指兩種或更多種所列選擇的一種或組合。此外，使用隨后是由術語"和"分隔的一系列選項的用語"選自"包括兩種或更多種所列選項的一種或組合。進一步，如在此使用的，術語"包含"意圖指所述方法或組合物包括所述的元素，但不排除其他的。類似地，"基本上由……組成"被用于定義方法和系統，其包括所敘述的元素但是排除其他元素，所述其他元素可能對于本發明的培養系統的功能性具有本質的重要性。例如，基本上由基礎培養基、培養基添加物和飼養細胞組成的培養系統將不包括、或將僅包括無關緊要的數量(該數量將對培養系統中的細胞增殖和分化具有無關緊要的影響)的、對培養物中的細胞有影響的其他物質。并且，基本上由在此定義的元素組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的痕量染污物。"由……組成"將是指排除超過痕量的其他元素。這些過渡術語的每一個所定義的實施方式處在本發明的范圍之內。進一步的，所有的數值，例如濃度或劑量或其范圍，是近似值，其從聲明的值變化(+)或(-)最多達20%,有時最多達10%。要理解的是，即使不一定明確地聲明，所有的數字符號之前是術語"約"。還要理解的是，雖然不一定明確地聲明，在此描述的試劑僅僅是示范性的，它們的等同物是本領域已知的。某些示范性的實施方式材料和方法HES細胞培養物通過慢病毒載體來改造以持續表達eGFP的人類ESC(HES1細胞系)和hESC[GroppM，ItsyksonP，SingerO,Ben-HurT，ReinhartzE,GalunE，andReubinoffBE.Stablegeneticmodificationofhumanembryonicstemcellsbylentiviralvectors.MolecularTherapy7:281-7(2003)]在KO培養基(KOM)中在人類包皮成纖維細胞飼養層上培養，所述KO培養基由86%KO-DMEM(Gibco,Invitrogen，Gaithersburg,MD)、14%KOSR(Gibco)、lmM谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、50單位/ml青霉素(Gibco)、50jug/ml鏈霉素、(Gibco)和4ng/mlbFGF(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)組成。hES細胞每周用IV型膠原酶(1mg/ml;Gibco)傳代并平板接種在新鮮的飼養層上。分化的誘導前一周，通過用補充有0.05%EDTA(BiologicalIndustries,BeitHaemek，Israel)的無Ca/Mg++PBS解離成近乎單細胞懸浮液來傳代細胞，并在祠養物上重新平板接種。懸浮培養物中的EB形成在如上述將分離成單細^^的hES細l包平才反4妄種后六-八天；通過用IV型膠原酶處理將它們乂人飼養物上除下。在存在或缺少10mM煙酰胺(NA)(Sigma,St.Louis,MO,USA)的情況下，在用0.1%低熔點溫度瓊脂糖預先包被的細菌學平皿內，在KO培養基(KOM)中，團塊被懸浮培養各個時間最多到12周，所述KO培養基由86。/。KO-DMEM、14%KOSR、lmM谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、50單位/ml青霉素和50)ag/ml鏈霉素組成。在某些實驗中，使用的培養基是補充有N2添加物(1:100)(Gibco)的NeurobasalTM培養基(Gibco)(NN培養基)，其在1周后用補充有B27(1:50)(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)替換。在存在TGFP生長因子或抑制物的情況下hESC分化成為RPE細胞人類ESC被容許在存在煙酰胺(NA)10mM的情況下在如上述的KOM中作為自由漂浮的群集來分化最多到六周。在第一周或2周的分化之后，培養物補充激活蛋白A20-180ng/ml(PeproTechInc，RockyHill，NJ)、TGF(33(lng/ml;R&DSystemsInc,Minneapolis,MN)、TGF|31(lng/ml隱20ng/ml;R&DSystemsInc)或SB431542(5|aM-50|aM，Sigma)。對照培養基補充單獨的NA。在KOM中懸浮的人類ESC還在一周后存在或不存在NA的情況下補充骨骼形態發生蛋白(BMP)拮抗劑頭發生素(700ng/mlR&DSystemsInc，Minneapolis,MN)，或者在第3和第4周在存在NA的情況下補充FGF|3(20ng/mlPeproTechInc)，并容許作為懸浮的自由漂浮群集分化最多到6周齡。RPE細胞的擴增的描述為了擴增RPE細胞，色素化的群集被輕輕地機械解離為小塊，在聚-D-賴氨酸(30-70kDa，10jug/ml)和層粘連蛋白(4jug/ml)上低密度平板接種，并在具有NA的KOM中培養。在這些培養條件下，色素化細胞失去色素沉著并獲得纖維樣形態。在進一步培養1.5個月并增殖為高密度培養物之后，細胞重新獲得RPE細胞的特征性的多邊形狀形態和色素沉著。如下所述對所有培養物進行免疫染色和實時RT-PCR。群集內已分化的細胞的間接的免疫熒光染色為了表征聚集物內細胞的免疫表型，使用0.04%胰蛋白酶/0.04%EDTA，或用木瓜蛋白酶解離系統(WorthingtonBiochemical,Lakewood，NJ)將培養了2、4、6或8周的群集輕輕地離解，產生的小塊和單細胞平板接種在單獨補充有聚-D-賴氨酸(30-70kDa,10-20lag/ml)上的NA的KO培養基中，或補充有層粘連蛋白(4jag/ml)或纖連蛋白(10-20|ag/mL;全部來自Sigma,St.Louis,http:〃www.sigmaaldrich.com)的KO培養基中。在2小時后細胞用4%多聚曱醛固定，并檢查巢蛋白(1:200)、聚唾液酸NCAM(PSA-NCAM)(1:100)、Musashi(1:200;全部來自Chemicon，Temecula,來自CA)、Pax6(DSHB,1:100或Chemicon,1:250)、Otx2(Chemicon,1:200)、MiTF(LabVisionCorporation,Fremont,CA;小鼠IgG，1:50)的表達。對于色素化細胞的富集制品的免疫染色，分化8-10周的漂浮塊內的細胞的色素化(Brown)群集通過玻璃微量移液管或解剖刀片(No15;Swann-MortonSheffield,Eng)機械地解剖和分離。富集了色素化細胞的分離的群集通過有/沒有胰蛋白酶(0.025%，PBS中3mMEDTA)消化或木瓜蛋白酶解離(木瓜蛋白酶解離系統；WorthingtonBiochemicalCorporation,Lakewood，NewJersey)的壽乾助的研磨法來機械地解離成較小的塊。細胞的小的群集平板接種在聚-D-賴氨酸包被的(30-70kDa，10jug/ml;Sigma)和層粘連蛋白包被的(4Mg/ml;Sigma)玻璃蓋玻片上，并在用于hESC群集的懸浮培養的培養基中培養另外3-5周。生長物內已分化的細胞用4%多聚曱醛在室溫下固定30分鐘。對于用抗細胞內標志物抗體的免疫染色，細胞膜用補充有用于阻斷的正常山羊血清(5%，BiologicalIndustries)的PBS中的0.2%TritonX100(Sigma)滲透化30分鐘。細胞用以下初級抗體醉育抗MiTF(LabVisionCorporation,Fremont,CA;小鼠IgG!，1:50);抗RPE65(NovusBiologicals,Littleton,CO;小鼠IgG"1:300);抗斑萎蛋白(NovusBiologicals;小鼠IgG"1:150);抗ZO-1(ZymedLaboratoriesInc.,SanFrancisco，CA;兔多克隆，1:10);抗Ki67(DakoDenemarkA/S;，1:50)和抗CRALBP(由JohnC，Saari，UniversityofWashington,Seattle惠贈；兔多克隆，1:100)。細胞還用鬼筆環肽(1:200Sigma)孵育。初級抗體定位通過使用熒光素異硫氰酸(FITC)綴合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(DakoDenmarkA/S;1:20-1:50)、綴合到CyTH3的山羊抗小鼠IgG(1:500)(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc,WestGrove，PA)、綴合到Cy2的兔抗山羊IgG(1:200;JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc)和綴合到熒光素異硫氰酸(FITC)的豬抗兔Ig(Dako;1:50)來進行。通過RT-PCR和實時PCR分析hESC群集從在無血清條件(傳代后1周)下生長的、以及有或者沒有補充TGF(3超家族生長因子或拮抗劑、在存在或缺少lOmM煙酰胺的情況下培養hESC衍生的群集期間最多到8周的連續時點生長的hESC提耳又總RNA。4吏用TRIzol^式劑(Invitrogen,http:〃www.invitrogen.com)或TRI-試劑(Sigma)分離RNA。才艮據廠家的i兌明書(PromegaCorporation,Madison，WI，http:〃www.promega.com)<吏用Moloney鼠白血病毒逆轉錄酶(M-MLVRT)和隨機引物進行cDNA合成。聚合酶鏈式反應(PCR)使用TaqDNA聚合酶(GIBCO-BRL)用標準方案進行。擴增條件如下在94。C變性15秒，在55。C退火30秒，在72。C延伸45秒。取決于特定的mRNA豐度，循環數在18到40之間變動。用于鑒定人類基因轉錄產物(正向和反向5，-3，)的引物人類序列和擴增產物的長度如下(SEQIDNO:1-12):MiTF-A(GAGCCATGCAGTCCGAAT，GACATGGCAAGCTCAGGACT;486bp);RPE65(GCTGCTGGAAAGGATTTGAG,CAGGCTCCAGCCAGATAGTC;231bp);斑萎蛋白(GAATTTGCAGGTGTCCCTGT,ATCCTCCTCGTCCTCCTGAT;214bp);CRALBP(AGCTGCTGGAGAATGAGGAA，CAAGAAGGGCTTGACCACAT;218bp)MERTK(AAGTGATGTGTGGGCATTTG,TCTAAGGGATCGGTTCTCCA,189bp);ACTR1A(AATGTTGCCGTGAAGATCTTC,CTGAGAACCATCTGTTGGGTA;699bp);ACTRffi(CACGTGTGAGACAGATGGG,GGCGGTTGTGATAGACACG;346bp);ACTRIIA(AACCATGGCTAGAGGATTGGC,CTTTCACCTACACATCCAGCTG;551bp);ACTRUB(CACCATCGAGCTCGTGAAG,GAGCCCTTGTCATGGAAGG;611bp);激活蛋白A(CTTGAAGAAGAGACCCGAT;CTTCTGCACGCTCCACCAC;262bp);P-肌動蛋白(TTCACCACCACGGCCGAGC,TCTCCTTCTGCATCCTGTCG;351bp);GAPDH(AGCCACATCGCTCAGACACC;GTACTCAGCGCCAGCATCG;301bp).對于實時PCR，使用來自商業上可獲得的TaqManRAssays-on-Demand基因表達產品(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)的TaqMan引物和探針監視轉錄產物的水平Oct4,IDHs01895061;Musashi,IDHs01045894;Pax6，IDHs00240871;Six3，IDHs00193667;Rxl,IDHs00429459;ChxlO,IDHs01584048;MiTF-A,IDHsOl115553;MiTF-total,IDHsOl115557;Bestrophin,IDHs00188249;RPE65,IDHs00165642;SoxlO,IDHs00366918;Crx,IDHs00230899。使用ABIPrism7000HT和ABIPrism7900HT序列4企測系統和TaqMan⑧通用PCR主混合物(AppliedBiosystems)根據廠家的方案進行定量PCR分析。持家基因卩-葡糖醛酸酶(GusB，分析IDHs99999908)被選作實時RT-PCR定量分析中標準化的內部參考物，每種基因的相對表達水平顯示為當0天(或未處理的細胞)的表達水平被設為1時的相對值。擴增反應根據廠家的方案(AppliedBiosystems)—式兩份或三份地進行。透射電子顯微鏡術和膠乳珠子的吞噬作用人類ESC衍生的群集在KOM中懸浮培養。然后機械地分離色素化區域，并加工用于透射電子顯微鏡術。細胞用2%戊二醛和4%甲醛在0.1M二甲胂酸鹽緩沖液pH7.4中固定。在O.IM二甲胂酸鹽緩沖液中三次洗滌之后，組織用1%四氧化鋨和1.5%鐵氰化鉀后固定，用提高濃度的乙醇脫水，包埋在Agar100樹脂中。通過LKBultrotome3切割的超薄切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。用裝備有MegaviewIICCD攝像機和Analysis版本3.0軟件(SoftImagingSystem,http:〃www.soft-imaging.net)Tecnai12電子顯微鏡(Phillips,EindhoventheNetherlandshttp:〃www.philips.com)拍才聶顯孩吏照片。為了檢查吞噬能力，色素化群集與濃度l.Ox109個珠子/ml的1jum膠乳珠子(PolysciencesInc.,Warrington,PA)在37。C孵育18小時。色素化群集然后用PBS+洗滌，使用木瓜蛋白酶解離系統解離成單細胞或小塊并平板接種在聚-D-賴氨酸上。在固定之后，細胞膜用紅色焚光染料PKH(Sigma)染色。使用共焦顯微鏡(OlympusFluoviewFV1000)分析吞噬作用。流式細胞術進行流式細胞計分析來測定有或者沒有煙酰胺補充分化的hESC衍生的群集內不同時點的PSA-NCAM和TRA-1-60陽性細胞的數目。群集用0.04%胰蛋白酶/0.04%EDTA離解。單細胞然后用抗-PAS-NCAM或抗-Tra-l-60抗體(都來自Chemicon;1:100)染色，用綴合到FITC的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako;1:100)沖全測，然后用細胞生存力染泮牛石典化丙4定(propidiumiodide)(0.005mg/ml;Sigma)復染。對照細胞僅與第二抗體孵育。細胞相關的免疫反應性使用CellQuest4欠4牛用FACScalibur(BectonDickinsonImmunocytometrySystems)分析。hESC衍生的已分化的RPE細胞的玻璃體內和視網膜下的移植對于眼內移植，被工程化來表達eGFP的hESC[如早先在Groppetal.，Stablegeneticmodificationofhumanembryonicstemcellsbylentiviralvectors.MolecularTherapy2003;7:281匿7.中描述的]被用于產生如上所述的培養物中的RPE細胞。簡要地，在存在單獨的NA的情況下或存在補充有激活蛋白A的NA的情況下分化6-8周之后，富集了色素化細胞的群集通過解剖來機械地分離。為了容許通過小口徑玻璃毛細管的注射，團塊通過木瓜蛋白酶(PapainDissociationSystem;WorthingtonBiochemicalCorporation,Lakewood，NewJersey)在37°C消化30分鐘隨后研磨來進一步解離成細胞的較小的群集。十五只成年白化大鼠(體重230-250g)和超過100只1-3周遠系36雜交的營養不良的RCS大鼠被用于眼內的移植。在RCS大鼠中，Mertk基因中的突變引起RPE功能障礙，這導致在生命的前幾個月中的視網膜退化。所有動物試驗根據眼科和視覺研究中使用動物的ARVO聲明來進行，由Hebrew大學Hadassah醫科學校的動物研究機構委員會批準。對于移植(以及對于電視網膜圖像記錄)，動物用氯胺酮HC1(Ketalar,ParkeDavis，UK;100mg/kg)麻醉，與松弛試劑賽4立嗦、(2.0mg/kg)—起腹腔內地注射。施用局部麻醉滴劑(奧布卡因HC10.4%;FischerPharmaceuticals,Israel)。瞳孔用托吡卡胺0.5%(Mydramide，FisherPharmaceuticals,Israel)和去氧腎上l^素HC12.5%(FisherPharmaceuticals,Israel)擴大。在解剖顯樣么鏡(StemiSV11，Zeiss,Germany)的可視化之下，4mL培養基中大約100,000個細胞通過穿鞏膜的、或穿脈絡膜的方法通過連接到氣動Pico注射器(PLI-100;MedicalSystemCorp.,Greenvale,NY,http:〃www.medicalsystems.com)的玻璃毛細管注射到玻璃體中或一見網膜下間隙中，未注射的同類的眼睛充當一種類型的對照。作為另外的對照，眼睛用鹽水(氯化鈉注射液BP,0.9%，B.BraunMelsungenAG,Melsungen，Germany)注射。在注射期間和之后，沒有觀察到脈絡膜的出血。使用加熱燈在整個操作和操作之后使動物保持溫暖。在移植之后，所有動物在它們的飲用水中以210mg/l的濃度接受免疫抑制試劑環孢霉素A(Sandimmune,NovartisPharmaAG，Basel,Switzerland)。移植的細胞的體內和離體成像為了監視在體內移植的細胞的存活和位置，麻醉的動物使用彩色眼底照相機(Zeiss,Germany)成像，使用掃描激光沖企眼鏡(HeidelbergHRA,Germany)上的熒光素濾波器檢測GFP表達細胞的熒光。在某些眼睛中，GFP陽性移植物的位置還使用熒光顯微鏡(Canon，Japan)在眼杯制品中離體測定。在hESC衍生的RPE細胞的眼內移植之后宿主視網膜功能的評定移植后四到六周，通過視網膜電描記術(ERG)在移植的和對照的RCS大鼠眼睛中評定視網膜功能。在暗適應過夜之后記錄全視野ERG。動物在暗淡紅光中用氯胺酮和賽拉。秦麻痹，瞳孔用托吡卡胺和37苯腎上腺素擴大。單極的大鼠ERG晶狀體電極(lenselectrode)(MedicalWorkshop,Amsterdam,Netherlands)在另外的局部麻醉之后置于每只眼上，參考電極和接地電極分別置于舌頭和尾部。商售的計算機化ERG系統(LKC技術，UTAS3000)被用于記錄對使用置于Ganzfeld碗上氣光頻閃器閃光(photostrobeflash)(Grass,PS-22)產生的全視野刺激的視網膜反應。在暗視條件下暗淡的藍色閃光被用于SI發主要視桿驅動的反應。在暗適應狀態下藍色的更強刺激強度和白色閃光下，記錄混合的視錐-視桿反應。在燈光適應的(適應光的)條件下，使用對視桿抑制性34cd/n^白色背景的白色閃光，產生1Hz和16Hz視錐反應。信號在0.3-500Hz之間過濾，使用信號平均。移植的眼睛的組織學和免疫組織化學的評估在移植后4-8周處死動物，剜出眼睛用于組織學和免疫組織化學的檢驗。在Davidson溶液中固定之后，眼睛包埋入石蠟中，以4nm連續切片來切片。每五個切片用蘇木素和曙紅染色用于組織形態學評估和定量。對于間接免疫熒光法研究，為了表征移植的細胞的分化的狀態，樣本在二曱苯中去石蠟，并在梯度酒精中脫水，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH7.4)漂洗，在1l(TC用10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)孵育4分鐘。在用PBS洗滌之后，樣本用含有1。/o牛血清白蛋白(BSA)、0.1%TritonXI00(Sigma-Aldrich)和3%正常山羊或正常驢血清的PBS溶液在室溫下阻斷l小時。隨后，切片在濕潤的房間中與以下初級抗體的合適的組合孵育1小時抗綠色熒光蛋白質(抗-GFP)、其與熒光素(FITC)或羅丹明(TRITC)綴合(SantaCruzBiotechnology,Inc,SantaCruz,CA;小鼠單克隆的，1:100);抗RPE65(NovusBiologicals,Littleton,CO;小鼠IgG"1:100);抗斑萎蛋白(NovusBiologicals;小鼠IgG"1:100);抗ZO-1(ZymedLaboratoriesInc.，SanFrancisco,CA;兔多克隆的，1:100);和抗視紫紅質(SantaCruzBiotechnology,Inc，SantaCruz,CA;兔多克隆的，1:100)。在PBS中洗滌之后，通過使用CyTM2綴合的山羊抗兔IgG(1:200)、CyTM2綴合的山羊抗小鼠IgG(1:200)、CyTM3綴合的山羊抗兔IgG(1:200)、CyTM2綴合的驢抗小鼠IgG(1:200)、CyTM5綴合的驢抗兔IgG(1:200;全部來自JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc，WestGrove,PA)進行初級抗體定位。用含有4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的封固劑38(VectorLaboratories,Burlingame,CA)或用石典4匕丙《定1jug/ml(BioLegend，SanDiego，CA)復染核。為了測定抗原抗體反應的特有DP70數字照相機(Olympus,Japan)的OlympusBX41顯微鏡被用于熒光和光學顯微成像。共焦圖像在圍繞1X70倒置顯微鏡構造的OlympusFluoview300(FV300)共焦顯微鏡(Olympus，Japan)上采集。488-nmAr、543HeNe-綠色和633HeNe紅色激光器與Nomarski光學器件組合使用。在接近RPE移植物處光受體層拯救的定量為了定量hESC衍生的RPE移植對于退化的宿主視網膜的效力，獲得蘇木素和曙紅染色的切片的高分辨率顯微鏡圖像，使用Photoshop軟件(Adobe,USA)構建視網膜的全長的剪輯畫面。總視網膜厚度、外核(光受體)層的厚度以及內部和外部片段層的厚度使用J-圖像程序(NIH)在接近hESC衍生的RPE細胞的視網膜下移植物處測量。這些與遠離移植物的視網膜相應的對側中獲得的測量值相比。由于在RCS大鼠中的退化過程是位置依賴性的，在與睫狀體相等距離的區域中測量厚度。在每個區域中，至少三個等距離的測量值被平均。結果已分化的RPE的表征浮的群集來培養來誘導。在這些培養條件下，高度濃i色素化細胞的限定的區域在分化中的群集內發育，如附圖3A中所示。這些色素化區域在4周的分化后出現，在8周后72.9±2.5%的群集具有色素化區域。在沒有NA補充的情況下4周的分化后沒有觀察到色素化區域，'在這些條件下，僅13.1±4.8%在8周后發育為色素化區域(附圖8A和8B)。因而，與自發地分化中的hESC群集相比，NA處理增加/促進了hESC群集內向色素化細胞的分化。.在存在NIC的情況下分化了8周的群集內，5.7±1.0%的細胞是色素化的，5.4±1.1%表達早期RPE標志物MiTF,大多數情況下MiTF的表達與色素沉著相關(附圖8C)。已分化的hESC的部分離解和平板接種的群集，與其他類型的已分化的細胞一同，發育成為由色素化細胞的單層組成的菌落，如暗視野顯微照片(附圖3D)和相差圖像(附圖3E)所示。這些菌落內的細胞呈現了多邊形的形狀，形成了細胞的"鵝卵石"樣片層，在它們之間具有緊密連接(附圖3E)，具有天然RPE細胞的高度特征性的特征。細胞內的F-肌動蛋白分布接近它們的膜，與真正的RPE細胞相像，如通過用鬼筆環肽染色所展現的(附圖10A)。色素化的RPE細胞共表達RPE標志物Otx2(附圖3B)和MiTF-A(附圖3B和附圖3F)以及ZO-l(附圖3G)、斑萎蛋白(附圖3H)、RPE65(附圖31)和CRALBP(附圖3J)。在解離、低密度平板接種并培養之后，色素化細胞失去了色素沉著并獲得了纖維樣的形態，如通過相差成像所示的(附圖3K和IOB)。在進一步延長的培養和增殖為高密度培養物之后，細胞重新獲得RPE細胞的多邊形形狀形態和色素沉著(附圖3L和10C)。電子顯微鏡檢查(EM)分析展現了，hESC衍生的色素化細胞具有天然RPE細胞的形態學特征，包括它們的頂面上的微絨毛(附圖10D)和它們的基面上的基膜(附圖10E)。細胞含有黑色素微粒(附圖10D)并且通過緊密連接來附著(附圖10F)。RPE細胞的最重要的功能之一是光受體脫落的外部片段的吞噬作用。為了檢查hESC衍生的色素化細胞是否具有吞噬能力，它們與1ium熒光膠乳珠子孵育。三幅共焦熒光圖像表現了連續的Z軸切片(附圖10H-10J)。共焦顯微鏡分析顯示了，推定的RPE細胞能夠吞噬焚光珠子(附圖10G-10J)。煙酰胺的分化誘導效應hESC朝向RPE結局的分化通過將它們在有或者沒有NA的KOM中作為自由漂浮的群集培養來檢查(沒有提供自發地分化中的群集作為對照)。在6周的分化之后，RPE細J包的標志物MiTF-A和RPE65的表達水平在存在NA的情況下顯著沖是高，如通過實時RT-PCR所測定的(分別地，附圖1A和1B)。MiTF-A的表達在存在NA的情況下幾乎提高了兩倍，而RPE65的表達提高了幾乎30倍。由于大多數色素化細胞共表達MITF-A(附圖8C)，看來在存在NA的情況下，在每個色素化細胞的RPE65表達水平方面存在顯著的和突出的提高。因而，除了它朝向RPE結局的誘導效應之外，NA還促進RPE細胞的成熟，并對細胞的表型有影響。在2到6周之間連續的時點的Q-PCR分析顯示了在存在NA的情況下MiTF-A和RPE65表達水平(分別地，附圖1C和ID)方面的提高。標志物的表達在四周的分化之后被增量調節，在接下來的四周期間表達的水平繼續提高(最后兩周未顯示)。通過在平板接種的、色素化群集中細胞的RT-PCR,顯示了RPE標志物斑萎蛋白、CRALBP和Mertk的類似提高的表達(附圖1E)。為了發現RPE細胞的體外發育是否重演RPE在體內的關鍵發育步驟，進行了時程實驗，包括分析RPE發育期間hESC群集內關鍵標志物的表達。在存在或缺少NA的情況下的群集分化通過未分化的hESC的標志物的表達的實時PCR、早期神經分化、視網膜和RPE發育來分析(附圖9A-9L)。首先展現了未分化的hESC的標志物Oct4的表達(附圖9A)在存在NA的情況下的分化期間更快速地的下降。一致地，FACS分析展現了，未分化細胞的表面膜標志物TRA-1-60的表達在NA處理的樣品中也更快速地降低(附圖9M)。因而，在存在NA的情況下的分化可以用于從培養物中消除未分化的細胞，并且可以幫助避免移植后的畸胎瘤胂瘤形成。此外，NA處理增強了早期神經分化的過程。在存在NA的情況下，早期神經標志物Otx2(附圖9B)、Pax6(附圖9D)和Musashi(附圖9C)的轉錄產物的表達分別在2、2-6和4-6周的分化后顯著地提高。通過神經前體的標志物PSA-NCAM的表達的FACS分析，在蛋白水平上展現了類似的結果(附圖90)。在具有NA的4周分化之后，與對照群集中14.4±5.9%相比，81.4±6.3%的細胞表達PSA-NCAM，間接免疫熒光染色確認了，在4周，NA處理的群集內大部分細胞獲得了神經表型并表達PSA-NCAM(74.2±4.1%)、巢蛋白(55.9±10.1%)和Musashi(71.4%;附圖9N)。視網膜特定化和形態發生的關鍵調節基因Rxl和Six3(分別為附圖9F和9E)的轉錄產物的表達在分化后2周展現。NA處理提高了這些基因的表達。在存在NA的情況下，早期RPE標志物MiTFA的轉錄產物的表達在4周的分化后被誘導(附圖9H)。更為成熟的RPE的標志物斑萎蛋白和RPE65的表達分別在4周和8周之后被主要地增量調節(分別為附圖9J和91)。與作為對照的自發地分化中的hESC群集相比，在NA處理的培養物中，這些轉錄產物的表達也更高(附圖9I和9J)。RPE65的表達增加超過100倍，進一步確認了除了誘導效應之外，NA還對細胞的表型有影響。為了排除所獲得的色素化細胞不是神經脊衍生的黑色素細胞，展現了Soxl0的表達，其是這些細胞的發育標志物，與M51黑素瘤細胞系的對照細胞相比是低的，并且不取決于NA補充。因而所述培養物不由黑色素細胞組成。因而，斷定的是，NA促進了朝向RPE結局的分化的誘導。NA處理還提高了Chxl0的表達，其調節神經視網膜視網膜祖代和光受體祖代標志物Crx的增殖(附圖9K)。總之，發明人斷定的是，hESC群集內的RPE分化過程經歷了與真正的體內RPE發育相似的步驟，并且^皮NA增加。此外，NA對所獲得的RPE細胞的表型有影響。這些細胞不同于在自發的分化后獲得的RPE細胞，并且以顯著更高的水平表達成熟RPE細胞的標志物。NA顯示了與培養基無關的誘導效應在KO培養基和NN/DMEM培養基中培養12周的已分化的細胞中，NA補充提高了色素沉著，如分化中的hESC的群集的暗視野顯孩i照片所示(附圖2A-2D)。在一周后進一步^皮DMEM/F12-B27(NN/DMEM)替換的NN培養基中，與KO相比，在存在NA的情況下，群集總數中色素化hESC群集的百分比是更高的，而相對于KO培養基中培養的群集它們的大小和總群體數量是較小的。RT-PCR分析顯示了NA補充l是高了MiTF-A的表達，在KOM中大約3倍，在NN/DMEM培養基中大約2.5倍(附圖2E)。補充NA與沒有NA相比，RPE65的表達在KOM中是近似加倍的，在NN/DMEM培養基中提高幾乎6倍(附圖2F)。因而，NA的分化誘導效應在已分化的RPE細胞中顯示了，與在其中培養hESC并發生分化的培養基無關。TGFp超家族的成員對SC分化的效力首先分析的是在2周齡群集中激活蛋白受體以及激活蛋白A的表達。在這個時點進行分析，因為早期眼睛區域(eyefield)標志物的表達在這個時間出現，因而分化中的細胞可能處于與早期視泡平行的發育階段。展現的是，與細胞沒有NA的情況下分化時缺乏或較少的表達相比，受體ACTRIB和ACTRIIB的表達在存在NA的情況下是高的(附圖11G)。因而NA存在時對細胞分化的表型有影響。發現激活蛋白A增強朝向RPE結局的分化。分化4周的hESC衍生的群集的暗視野顯微照片顯示了在存在激活蛋白的情況下在這個42早期階段色素化細胞的出現(附圖11A)。進一步顯示了在存在NA的情況下，激活蛋白A顯著地增強hESC朝向RPE細胞的分化(附圖4A-4B和11B-11C)。包括色素化細胞的群集的百分比(50.7土6.5vs17.7±3.2),以及來自細胞總數的色素化細胞的百分比(9.9土1.4vs2.4±1.2)，與補充有NA而沒有激活蛋白A的對照培養物相比，在存在激活蛋白A的情況下誘導分化時顯著更高(附圖IIH和III)。這個結果用RT-PCR確認了，其顯示了激活蛋白A處理顯著地提高(分別超過五倍和超過四倍)對于成熟RPE細胞特異的標志物RPE65(附圖4D)和斑萎蛋白(附圖4E)的表達。此外，在存在激活蛋白A的情況下發育的色素化細胞的群集的形態學特征是不同的。它們的色素沉著是更暗色的，它們顯示了與圍繞的非色素化的細胞的非常清楚的界限(附圖4B)。在RPE發育期間較早出現的標志物MiTF-A的表達不受補充激活蛋白A的影響。因而，作為生長因子的TGF卩超家族的成員的激活蛋白A增強了hESC向RPE細胞的分化。激活蛋白抑制物SB431542的補充顯著地降低在這些條件下色素化群集的出現(附圖11E和11H)。在各種濃度下研究了激活蛋白A對RPE分化的影響。對于色素化細胞的百分比和RPE標志物斑萎蛋白(附圖11K)和RPE65(附圖11L)的表達，影響被發現是劑量依賴性的，最佳增強效果夸140ng/ml。在大多數實驗中，激活蛋白A在群集已經分化2周后添加持續兩周(第3-4周)，因為我們發現在這個時間應用對于增強RPE分化是最佳的。考慮到觀察結果，早期眼睛發育的標志物的表達也在分化的2周后開始(附圖9A-9L)，看起來激活蛋白增強了眼睛和RPE發育的過程。此外，由于在存在激活蛋白A的情況下色素化細胞的百分比提高5-6倍，而成熟RPE細胞的標志物例如斑萎蛋白的表達提高約10倍，看起來激活蛋白A除了它的誘導效應之外對細胞的成熟和表型有影響。這得到在存在激活蛋白A的情況下獲得的色素化細胞的形態學外觀的支持，它們是更暗色的，具有與周圍細胞的清晰的界線。2周激活蛋白A處理對于基因表達的影響的Q-PCR時程分析顯示，激活蛋白A顯著地提高視網膜祖代標志物Rxl和ChxlO以及RPE標志物斑萎蛋白的表達。在分化的4周，激活蛋白A處理還提高了總MiTF同種型的表達水平(附圖11M-11P)。激活蛋白A對視網膜和RPE分化的誘導效果還用TGF卩超家族的其他成員觀察到。使用TGFP3處理分化中的群集顯著地增強MiTF-A的轉錄產物的表達水平，MiTF-A在RPE體內發育中起到關鍵作用(附圖5F)。此外，用TGF|3超家族的另一個成員TGF卩1處理也顯著地提高帶有色素化細胞的群集的出現(附圖11D和11H)。相比之下，在存在NA和基礎的FGF(bFGF)、而非來自TGF卩超家族的因子的情況下的分化消除了色素化細胞的出現(附圖11F)。此外，顯示的是屬于TGFf3超家族的第二亞族的骨骼形態發生蛋白(BMP)在hESC的RPE分化中起到作用。如在暗視野顯微照片中所示，在存在BMP拮抗劑頭發生素的情況下，hESC群集向色素化RPE細胞的分化被阻斷(附圖5D)。即使當培養基也補充有NA時，向色素化細胞的分化也被頭發生素的添加所阻斷(附圖5C)。在RNA水平上，實時RT-PCR展現了，在培養基中存在和不存在NA的情況下，頭發生素都顯著地降低了MiTF-A的表達(附圖5E)。因而，BMP在誘導hESC向RPE細胞的分化中起到作用。衍生自hESC的已分化的RPE細胞可以用于眼內的移植被工程化來表達eGFP的hESC衍生的RPE細胞的富集群體首先移植到白化大鼠的玻璃體和視網膜下間隙中，來便于色素化細胞的定位。在眼內的移植之后，移植的色素化細胞可以在體內容易地鑒定(附圖6A和6B)。在附圖6B顯示的眼睛剜出術、除去角膜和晶狀體以及分離視網膜之后，視網膜顯示了主移植物和其他分散的色素化細胞(附圖6C)。在組織切片中，存在著包括也表達GFP的活的色素化的移植細胞的移植物(附圖6D-6G)。移植的細胞可以在玻璃體間隙中、在視網膜中、沿著注射的通道、以及在視網膜下間隙中找到(附圖6H、61、60和6P)。移植的RPE細胞還從視網膜下的移植物遷移，整合到宿主大鼠的RPE層內(附圖6J)。在移植物中，形成了作為RPE細胞的特征的緊密連接，如在移植的eGFP陽性細胞中緊密連接標志物ZO-l的表達所顯示的(附圖6K-6N)。移植物內的細胞還維持了RPE65、斑萎蛋白和Mi丁F-A的表達。在移植到RCS大鼠的視網膜下間隙內之后hESC衍生的RPE細胞存活、整合并維持已分化的RPE的特征移植實驗的主體在RCS大鼠中進行，其顯現了由于mertk基因中的突變引起的RPE和視網膜退化，以檢查hESC衍生的RPE細胞的遞送是否調節疾病的進程。移植的色素化細胞可以使用標準的眼底成像系統在RCS大鼠的眼睛中容易地體內鑒定(附圖12A-12C)。hESC書亍生的GFP表達細胞可以在焚光激發和使用發射濾波器時被看見發射熒光(附圖12C)。在熒光顯微鏡中離體成像的眼杯制品中(附圖12D-12E),可以看見視網膜下的GFP陽性細胞的大的群集(附圖12D)以及多個分散的較小的群集(附圖12E)。組織學和免疫組織化學的評估確認了體內和離體的宏觀觀察結果。移植的細胞存活并整合到視網膜下間隙中，維持了表征并對于成熟RPE常常是特異的蛋白質的表達(附圖13和14)。重要的是注意到不存在顯著的炎癥或免疫反應，并且在超過100個移植眼中沒有觀察到腫瘤或畸胎瘤。蘇木素和曙紅(附圖13A和13B)染色的切片顯示了視網膜下的和偶爾地視網膜內位置的移植的hESC衍生的色素化細胞，其以群集或作為分離的細胞出現(箭頭)。使用GFP的免疫染色(附圖13C-13F)確認了這些細胞實際上是hESC衍生的。移植物常常是十分大的和分散的(附圖13C和13E)，共同表達GFP的色素化細胞可以明顯地看出(附圖13D和13F)。免疫染色顯示了移植物內大量的移植的細胞表達蛋白質，所述蛋白質表征了成熟的、已分化的RPE細胞(附圖14)。這包括RPE特異性標志物RPE65(附圖14A-14E)和斑萎蛋白(附圖14F-14J)的表達。細胞還能夠形成緊密連接(附圖14K-140),其是RPE細胞的重要功能并且對于維持血液-視網膜屏障是關鍵的。每一行中最左側欄顯示了共表達GFP和相關標志物的移植物的低放大率熒光圖像。在每一排的高放大率共焦圖像顯示了在單個細胞水平下色素(通過Nomarski光學器件)以及GFP和不同標志物的共表達。hESC衍生的RPE細胞提供了營養不良的RCS大鼠中功能的和結構的視網膜拯救在視網膜退化的RCS大鼠模型中，視網膜功能到2-3月齡通常被嚴重損害。在結構上，發生視網膜外核層(ONL)的相應的喪失和變薄，它常常在這個年齡降低到低于1-2排光受體核。與對照的未處理的或培養基注射的眼睛相比，在用hESC衍生的RPE細胞移植的眼睛中，電視網膜圖像記錄顯示了視網膜功能的顯著的相對保存(附圖7和附圖15)。在移植的眼(附圖15A)和它同類的對照眼(附圖15B)中顯示了在暗適應(DA)狀態下對一系列提高強度的白色閃光的代表性的ERG反應。附圖15C顯示了在移植的眼和不同組的對照眼之間平均幅度方面的顯著的區別。在最高強度下，在RPE移植的眼睛中平均DAb波幅是283.3±37.5(平均值±SEM;n=13),對比同類的未處理的對照眼中的158.5±18.1(r產13,p<0.01)和培養基注射的眼中89.9±14.4(n=5,p<0.01)。重要的是注意到，與在沒有激活蛋白A時衍生的RPE細胞的移植后實現的拯救效果(附圖7)相比，在激活蛋白A處理的RPE細胞的移植之后存在著視網膜功能的更好的保存的傾向(附圖15)。視網膜結構的定性的和定量的評估證實了功能性的發現(附圖16)。與遠離移植物的區域相比，在接近視網膜下RPE移植物處，觀察到光受體(ONL)層以及內部和外部光受體片段(IS+OS)的相對保存(兩個實施例在附圖16A、16B中顯示)。與遠離移植物的區域相比(灰色柱)，在接近hESC衍生的RPE移植物處總體視網膜厚度(附圖16C)以及ONL和IS+OS厚度(附圖16D)顯著地提高(黑色柱，平均土SEM,n=7)。這種類型的結構拯救僅在接近視網膜下和深部的視網膜內移植物處觀察到，而當移植物僅<又處于玻璃體內時沒有觀察到(未顯示)。移植的hESC衍生的激活蛋白A處理的RPE細胞體內攝取視紫紅質健康的RPE的一個關鍵功能是攝取和再循環脫落的光受體外部片段，作為光受體的更新過程的一部分。視網膜下移植的RPE細胞的共焦圖像顯示了色素、GFP、RPE65和視紫紅質在同一單個細胞內的共同定位。這表明，移植的細胞具有成熟RPE的表型并且能夠進行脫落的外部片段(其含有視紫紅質)的攝取。注意到，RCS大鼠的天然的RPE細胞表達RPE65(附圖17C,箭頭)，但是不表達GFP(附圖17D，箭頭)并含有最小數量的視紫紅質(附圖17B、17E)。因而上述結果提供了證據，通過在包含TGF(3超家族的成員的培養系統中、和優選的在存在NA的情況下培養所獲得的hSC衍生的RPE細胞可以在體內用于移植，來提供眼睛中基本上完全功能性的RPE纟田月包。4權利要求1.一種促進hSC定向分化為RPE結局的方法，所述方法包括a.提供包含hSC的細胞培養物；b.在培養系統中培養細胞，所述培養系統包含補充有TGFβ超家族的一種或更多種成員的基礎培養基，從而所述hSC被誘導分化為RPE結局。2.權利要求1的方法，其中所述細胞培養物包含hSC的自由浮動的群集。3.權利要求1或2的方法，其中所迷hSC包含逸自未分化的hSC、分化中的hSC或其組合的SC群體。4.權利要求1到3的任一項的方法，其中所述培養包括使用包含煙酰胺(NA)的培養系統的第一培養階段，和使用包含所述TGFP超家族的一種或更多種成員的培養系統的第二培養階段。5.權利要求1到4的任一項的方法，包括在補充有所迷TGF(3超家族的一種或更多種成員的基礎培養基中培養所述細胞培養物之前，在包含補充有NA的基礎培養基的培養系統中培養所述hSC至少兩天。6.權利要求1到3的任一項的方法，其中所述培養系統包含所述TGFp的一種或更多種成員和NA。7.權利要求1到6的任一項的方法，其中所述TGF卩超家族的成員選自TGF(31、TGF(32、TGF(33、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、nodal、抗mullerian激素(AMH)、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、或生長和分化因子(GDF)。8.權利要求7的方法，其中所述TGFJ3超家族的成員是TGFIM、TGF卩3或激活蛋白A。9.權利要求1到8的任一項的方法，其中所述細胞在懸浮液中培養。10.權利要求1到9的任一項的方法，其包括在存在TGFp超家族的一種或更多種成員的情況下培養所述細胞至少一周。11.權利要求1到10的任一項的方法，其包括收獲RPE細胞。12.權利要求1到11的任一項的方法，其用于RPE細胞的大規應器中進行。13.權利要求12的方法，其中所述RPE細胞以單層擴增。14.權利要求12或13的方法，其中所述RPE細胞在培養系統中培養，所述培養系統包含補充有至少一種細胞外基質成分、血清替代物和NA的無血清基礎培養基。15.通過在存在TGF(3超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細胞。16.權利要求15的RPE細胞，其通過權利要求1到14的任一項的方法獲得。17.權利要求15或16的RPE細胞，其是終末分化的RPE纟田胞。18.權利要求15到17的任一項的RPE細胞，其表達選自斑萎蛋白和RPE65的一種或更多種標志物。19.權利要求18的RPE細胞，其中所述一種或更多種標志物的表達與通過SC的自發分化所獲得的RPE細胞中的標志物表達相比被提高。20.權利要求15到19的任一項的RPE細胞，其分化自人類胚胎干細月包。21.權利要求15到20的任一項的RPE細胞的培養物的用途，其用于治療組合物的制備。22.—種將RPE細胞移植到受試者的眼睛中的方法，所述方法包括a.提供包含hSC的細胞培養物；b.在培養系統中培養所述培養物中的細胞，所述培養系統包含補充有TGFP超家族的一種或更多種成員的基礎培養基，從而所述hSC^z漆導分化成為RPE細月包；c.從(b)的所述細胞培養物收獲RPE細胞；和d.將所述已分化的RPE細胞移植到所述受試者的眼睛中。23.權利要求22的方法，其中所述hSC是自由浮動的群集。-24.權利要求22或23的方法，其中所述培養包括使用包含NA的培養系統的第一培養階段，和使用包含所述TGFP超家族的一種或更多種成員的培養系統的第二培養階段。25.權利要求22到24的任一項的方法，其包括在補充有所述TGFP超家族的一種或更多種成員的基礎培養基中培養所述細胞培養物之前，在包含所述補充有NA的基礎培養基的培養系統中培養hSC至少兩天。26，權利要求22到25的任一項的方法，其中所述TGF(3超家族的成員選自TGF卩1、TGF(32、TGF卩3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、nodal、抗mullerian激素(AMH)、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、或生長和分化因子(GDF)。27.權利要求23的方法，其中所述TGFp超家族的成員是TGF卩3或激活蛋白A。28.權利要求22到27的任一項的方法，包括當在懸浮液中時培養所述細月包。29,權利要求22到28的任一項的方法，包括在所述眼睛的^L網膜下間隙處移植所述RPE細胞。30,權利要求22到29的任一項的方法，其中所述RPE細胞在懸浮液中、或作為固定在基質或基底上的細胞單層來移植。31，一種在受試者中治療或預防包括視網膜色素上皮的功能障礙、損傷和/或喪失的視網膜疾病或病癥的方法，所述方法包括向所舉受試者眼內移植權利要求15到20的任一項的、或通過權利要求1到14的任一項的方法所獲得的REP細胞。32.權利要求31的方法，包括將所述RPE細胞移植到所述眼睛的視網膜下間隙。33.權利要求31或32的方法，其中所述RPE細胞當在懸浮液中時、或作為固定在基質或基底上的細胞單層被移植。34.權利要求31到33的任一項的方法，其中所述-見網膜疾病或病癥是選自色素性視網膜炎、先天性利伯氏黑矇、遺傳或獲得性黃斑變性、年齡相關的黃斑變性(AMD)、Best病、視網膜剝離、回旋形萎縮、無脈絡膜、模式營養不良、RPE營養不良、Stargardt病、由于光、激光、炎癥、感染、放射、新血管或創傷性損傷的任一項所引起的損傷的RPE和視網膜損傷的至少一種。35，一種治療組合物，其包含適合于向受試者眼內移植的劑型的權利要求15到20的任一項的hSC衍生的RPE細胞。36.—種治療植入物，其包含權利要求15到20的任一項的hSC書f生的RPE細胞，或權利要求35的治療組合物，所述RPE細胞是在懸浮液中，或作為細胞單層固定在基質或基底上。37.權利要求35的治療組合物或權利要求36的治療植入物，其用于—見網膜病癥或疾病的治療或預防。38.權利要求35的治療組合物或權利要求36的治療植入物，其中所述視網膜疾病或病癥是選自色素性視網膜炎、先天性利伯氏黑矇、遺傳或獲得性黃斑變性、年齡相關的黃斑變性(AMD)、Best病、視網膜剝離、回旋形萎縮、無脈絡膜、模式營養不良、RPE營養不良、Stargardt病、由于光、激光、炎癥、感染、放射、新血管或創傷性損傷的任一項所引起的損傷的RPE和視網膜損傷的至少一種。39.權利要求1到14或31到34的任一項的方法，其中所述hSC是人類胚胎干細胞。全文摘要本發明涉及可通過從干細胞、特別是人類干細胞定向分化獲得的RPE細胞。已經特別發現的是，在存在TGF超家族的一種或更多種成員例如激活蛋白A的情況下培養干細胞誘導定向分化為成熟的和功能性的RPE細胞。這通過對成熟RPE細胞特異的標志物，包括MiTF-A、RPE65或斑萎蛋白的表達被證明。根據一個特定的實施方式，所述細胞是在先用煙酰胺(NA)培養的，發現了這增強細胞對TGF超家族的一種或更多種成員的誘導效應的反應。本發明還提供了進行定向分化的方法，以及利用產生的RPE細胞的方法。文檔編號C12N5/071GK101688178SQ200880020748公開日2010年3月31日申請日期2008年4月27日優先權日2007年4月18日發明者A·奧博倫斯基,B·魯比諾夫,E·巴寧,M·伊德爾森,R·阿爾珀-皮努斯申請人:哈達錫特醫學研究服務及發展有限公司