專利名稱：具有改進的經修飾的寡核苷酸的定向核苷酸交換的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過向細胞中引入寡核苷酸而特異地和選擇性地改變靶細胞中特定的DNA位點上的核苷酸序列的方法。結果是定向改變了一個或多個核苷酸，以致在其 不同的地方修改了靶DNA的序列。更特別地是，本發明涉及使用經修飾的寡核苷酸的定向 核苷酸交換。本發明進一步涉及寡核苷酸和試劑盒。本發明還涉及該方法的應用。
背景技術：
遺傳修飾是在活細胞的遺傳物質中故意產生變化的過程，其目的是修飾該細胞或 生物的一個或多個遺傳編碼的生物學特征，所述細胞形成所述生物的一部分或再生形成所 述生物。這些改變可以是下列形式刪除部分遺產物質、加入外源性遺傳物質或改變遺傳物 質的現有核苷酸序列。遺傳修飾真核生物的方法被人們知道已經超過20年，已經發現其廣 泛地在植物、人類和動物細胞和微生物中應用于農業、人類健康、食品質量和環境保護領域 中的改善。遺傳修飾的常見方法由以下組成向細胞的基因組中加入外源DNA片段，然后將 賦予細胞或其生物除了由已經存在的基因所編碼的性質之外的新性質(包括已經存在的 基因的表達將因此被抑制的應用)。雖然許多這樣的例子在獲得所需性質中有效，但是這些 方法不十分精確，因為對外源DNA片段插入的基因組位置沒有控制(因此無法控制最終的 表達水平)，并且因為所需的效果將需要證實其優于原始和均衡的基因組所編碼的天然性 質。相反，將引起預先確定的基因組位點中的核苷酸的加入、刪除或轉換的遺傳修飾的方法 將允許精確地修飾現有基因。寡核苷酸指引的定向核苷酸交換(TNE)是一種基于向真核細胞核中遞送合 成性寡核苷酸(由在Watson-Crick堿基配對性質上與DNA相似的短段核苷酸樣半體 (moiety)組成的分子，但是可以在化學上與DNA不同)的方法(Alexeev和Yoon，Nature Biotechnol. 16 1343,1998 ；Rice, Nature Biotechnol. 19 321,2001 ；Kmiec, J.Clin. Invest, m =632，2003)。通過故意在寡核苷酸的同源序列中設計錯配核苷酸，該錯配核苷 酸可以導致基因組DNA序列中的改變。該方法允許在靶標中轉換單個或最多幾個核苷酸， 但是可以應用于在現有基因中產生終止密碼子，導致其功能的破壞，或產生密碼子改變，導 致編碼具有改變的氨基酸組成(蛋白工程)的蛋白的基因。在植物、動物和酵母細胞中已經有定向核苷酸交換(TNE)的描述。第一次TNE報 道應用了被設計插入染色體靶標位點的所謂的DNA:RNA自我互補寡核苷酸。該嵌合體含 有在形成模板的DNA鏈上的錯配核苷酸，所述模板用于將突變引入染色體靶標。使用嵌合 體DNA:RNA寡核苷酸的第一個例子來自動物細胞(在Igoucheva等人.2001Gene Therapy 8, 391-399中有綜述)。許多實驗室的深入研究已經顯示使用這樣的寡核苷酸的TNE頻率 是可變的，并且平均非常低，并且取決于這樣的因素如靶標的轉錄狀態、細胞周期的影響和 轉化的細胞類型。在植物細胞中已經證明使用嵌合體DNA:RNA寡核苷酸的TNE(Beetham 等人 1999Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8774_8778 ；Zhu 等人 1999Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96,8768-8773 ；Zhu 等人 2000Nature Biotech. 18,555-558 ；Kochevenko 等人2003PlantPhys. 132 174-184 :Okuzaki 等人 2004Plant Cell Rep. 22 509-512) 通常，在 植物和動物研究中報道的頻率對于在非可選擇的染色體位點上實際應用TNE是太低了。還發現使用嵌合體寡核苷酸的TNE難以重復(Ruiter等人(2003)Plant Mol. Biol. 53,715-729)，這導致對另外的給出更可靠結果的寡核苷酸設計的尋找。幾個實驗室 已經集中精力于為TNE而使用單鏈(ss)寡核苷酸。已經發現這些在植物和動物細胞中給 出更可重復的結果(Liu 等人 2002Nuc. Acids Res. 30 :2742_2750 ；review, Parekh-Olmedo 等人 2005Gene Therapy 12 :639_646 ；Dong 等人 2006PlantCell Rep. 25 :457_65)。 幾個小組已經顯示可以在體外使用總細胞蛋白提取物模仿TNE過程。這樣的TNE 活性分析被稱為無細胞分析。該分析包括通過將載有這樣報告體的質粒與來自特定細胞類型的細胞蛋白和寡 核苷酸孵育而修復使細菌報告體基因(如LacZ或抗生素抗性基因)失活的突變。孵育后， 將質粒電穿孔至用作測定TNE效率的讀出系統的大腸桿菌(E.coli)中。無細胞系統已經 與嵌合體 DNA:RNA(Cole-Strauss 等人 1999NucleicAcids Res. 27 1323-1330 ；Gamper 等 人 2000Nucleic Acids Res.28,4332-4339 ；Kmiec 等人 2001Plant J. 27 267-274 ；Rice 等人 2001 迎857-868 ;Thorpe 等人 2002 J. GeneMedicine i，195-204)和單鏈寡核苷酸 (Igoucheva 等人 2001 Gene Therapy 8,391-399 ；Kren 等人 2003DNA Repair 2,531-546 ； Olsen 等人 2005 J. Gene Medicine[，1534-1544)聯合使用。在這樣的實驗中，寡核苷酸通常通過將終止密碼子(TAG)改變為指定氨基酸的密 碼子而影響置換。另外，無細胞系統還可以用于研究使用寡核苷酸產生單核苷酸插入的可 能性。可以產生具有從細菌報告體基因中刪除單個核苷酸而產生移框突變的質粒。在無細 胞分析中，通過加入由寡核苷酸介導的核苷酸的刪除而修復該刪除。相似地，含有原本不存 在于靶標的一個或多個額外的核苷酸的寡核苷酸還可以用于向靶序列中引入一個或多個 核苷酸。TNE在高等生物中如植物的細胞中應用所面臨的最大問題是迄今已經報道的低效 率。在玉米中Zhu等人(2000Nature Biotech. 18 555-558)報道IxliT4的轉換頻率。隨后 在煙草(Kochevenko 等人 2003Plant Phys. 132 174-184)和水稻(Okuzaki 等人 2004Plant Cell Rep. 22 :509_512)中的研究分別報道1χ1(Γ6和IxlO"4的頻率。這些頻率對于TNE的 實際應用仍然太低。使用嵌合體DNA =RNA寡核苷酸的TNE已經在Kmiec的各種專利申請中有描述，特 別是 W00173002、W003/027265、W001/87914、W099/58702、W097/48714、W002/10364。在 WO 01/73002考慮到，使用未經修飾的DNA寡核苷酸獲得的基因改變的低效率相信大多是由存 在于靶細胞的反應混合物中的核酸酶降解供體寡核苷酸的結果。為了校正這一問題，建議 的是引入給予獲得的寡核苷酸核酸酶抗性的經修飾的核苷酸。通常的例子包括具有磷硫酰 連接或2’-0-甲基類似物的核苷酸。這些修飾優選位于寡核苷酸的末端，令中心DNA結構域 包圍錯配的核苷酸。另外，公開物規定轉換寡核苷酸和參與轉換的蛋白之間包括特異性化 學相互作用。不能預測使用除了磷硫酰連接或2’-0_甲基類似物引入寡核苷酸以外的修飾 而產生核酸酶抗性末端的這樣的化學相互作用的效果，因為還不知道，并且根據W00173002 的發明人，不能預測參與改變過程的蛋白及其與寡核苷酸取代物的化學相互作用。使用經修飾的單鏈寡核苷酸的TNE已經在專利申請WO 02/26967中有描述。該申請證明給予寡核苷酸增加的核酸酶抗性的經修飾的核苷酸對于使用無細胞系統的TNE效 率的作用。然后該申請繼續顯示使用無細胞系統鑒定的經修飾的核苷酸(當引入單鏈寡核 苷酸中時)還增強哺乳動物染色體靶標上的TNE。這證實在體外無細胞分析中獲得的信息 可應用于體內染色體位點。該申請還要要求保護幾個經修飾的核苷酸，例如C5-丙炔嘧 啶，而不是被鎖定的核酸，還可以用于增加TNE的效率。作者陳述(第16頁)“引入寡核 苷酸的修飾將不改變對生物活性負責的細胞功能，在這個情況下是指重組和修復活性”。相 反，我們在本申請中證明WO 02/26967所述的顯示增加的結合活性的幾個經修飾的核苷酸 在TNE過程中無生物學活性，因此預測經修飾的核苷酸在TNE過程中的有用性不能只基于 增加結合親和力而做出。
由于現在的TNE方法效率相對低(如前面說明的在10_6至10_4之間，盡管報道的 寡核苷酸的90%的高遞送率)，本領域中有必要得到更有效的TNE的方法。因此，本發明人 開始改進現有的TNE技術。
發明內容
現在本發明人已經發現通過向用于TNE的供體寡核苷酸引入經修飾的核苷酸組 合(其能夠比相應的未經修飾的核苷酸如A、C、T或G更強結合受體DNA，可以顯著增加TNE 的速率。不限于理論，本發明人相信，通過向供體寡核苷酸引入經修飾的核苷酸，供體寡核 苷酸更強地結合受體DNA，因此增加TNE的比率。另外，本發明人已經發現，經修飾的核苷酸增加TNE的能力依賴兩個重要性質 (1)與正常未經修飾的DNA相比其對其靶標增加的結合親和力，⑵其對于TNE過程的生物 學活性。反義技術也應用寡核苷酸在細胞中誘導效應。在這種情況下，將寡核苷酸設計成 與互補靶標mRNA結合。這個DNA:RNA雜合體由切割雜合體的RNA鏈的RNaseH識別，抑制 基因表達。增加的結合親和力和增強的核酸酶抗性，獲得有效反義反應所需的寡核苷酸特 征也是已經發現對于增加TNE頻率重要的特征。已經在文獻中報道了許多顯示增加的結合 親和力和/或核酸酶抗性的經修飾的核苷酸，但是關鍵步驟是證明含有這樣經修飾的核苷 酸的寡核苷酸對于TNE過程仍然保持生物學活性。本發明人已經使用無細胞系統為了其增強TNE能力而篩選了許多經修飾的核苷 酸并且已經發現這不能通過研究經修飾的核苷酸的物理性質而預測。另外，本發明人發現， 許多用于增加反義寡核苷酸性質的經修飾的核苷酸實際上抑制無細胞系統中的TNE。因此， 本發明人鑒定了對增加TNE本身效率特異的經修飾的核苷酸。另外相信，本寡核苷酸顯示 出有利的立體化學和空間構型。本發明人已經發現含有接近但不(直接)毗鄰錯配，即位于距離錯配至少一個核 苷酸的位置上的一個或多個LNA的寡核苷酸，與C7-丙炔修飾的嘌呤和/或C5-丙炔修飾 的嘧啶一起(一起被稱為丙炔化的核苷酸)增加TNE的效率至迄今未預料的程度，特別地 增加體內即不在無細胞系統中，但是例如在原生質體系統中的TNE的效率。為此，已經研究了使用在寡核苷酸中不同位置上引入一個或多個LNA和一個或多 個丙炔化核苷酸的寡核苷酸對于無細胞系統中TNE頻率的效果。這樣的寡核苷酸的TNE活 性與由正常DNA構成的或由只用LNA或丙炔化核苷酸修飾的寡核苷酸構成的寡核苷酸的 TNE活性比較。發現含有在距離錯配至少一個核苷酸的位置上的一個或多個LNA并聯合增加量的丙炔化核苷酸的寡核苷酸增加無細胞分析中置換和插入的TNE效率至迄今未觀察 到的水平。特別地，通過插入核苷酸，即在給定的位置插入一個或多個核苷酸而獲得了有利 的效果，并且特別是在體內系統，如原生質體系統中，效率顯著增加。進一步發現當經修飾的寡核苷酸用于西紅柿葉子原生質體中的TNE時(其給出 寡核苷酸的未有先例的增加)這種增強也可以通過改變LNA的數目和位置而被增加。例如 其中將LAN位于至少間隔2個核苷酸，優選至少3個核苷酸，更優選至少4個核苷酸。另外發現引入西紅柿基因組的核苷酸改變。這證明觀察到的增加為位點非依賴性的，表明具有在與錯配相比特定位置上的經修飾的核苷酸的本發明的寡核苷酸能夠以物種 不相關的方式，如在植物和動物細胞中，提供增加的TNE頻率。因此本發明基于如下的發明考慮可以通過使用部分(即最多50%，優選最多 40% )LNA修飾的進一步含有丙炔化寡核苷酸的寡核苷酸而實現所需的定向核苷酸交換。 寡核苷酸修飾的位置、類型和數量可以在限定內變化，如將在下面本文所討論的那樣。因此本發明在一個方面提供經LNA修飾的和丙炔化寡核苷酸。因此修飾的單鏈寡 核苷酸可以用于在植物和動物或人類細胞中引入特異的遺傳改變。本發明適用于生物醫學 研究、農業領域并且構建特異突變的植物和動物，包括人類。本發明還適用于醫學和基因治 療領域。除了含有將堿基變化引入靶鏈的錯配堿基的部分之外，本發明的寡核苷酸的序列 與靶鏈同源。錯配堿基被引入靶序列。通過操作核苷酸的修飾(與常規的A、C、T或G相 比)，更特別地，通過操作引入錯配的寡核苷酸修飾的位置和數量，可以增加效率(或DNA雙 鏈中所需位置的核苷酸改變的成功程度)。本發明的另一個方面在于一種通過將親代DNA雙鏈與寡核苷酸接觸而定向改變 親代DNA鏈(第一鏈、第二鏈)的方法，所述寡核苷酸含有與親代鏈相比至少一個錯配的核 苷酸，其中供體寡核苷酸含有特定位置上以LNA修飾的區段從而當能夠進行定向核苷酸交 換的蛋白存在時，具有比親代(受體)鏈更高的結合能力。因此，本發明的發明要點在于以相對于未經修飾的寡核苷酸來說，具有經修飾的 核苷酸的寡核苷酸(有時稱作供體)的結合能力的增加，其中LNA修飾位于與錯配不相鄰 的一個或多個位置并且通常在未經LNA修飾的位置和不在錯配的位置上將丙炔化核苷酸 引入寡核苷酸。還通過使用根據本發明的具有組合的LNA和丙炔修飾物的寡核苷酸以插入DNA片 段中的插入物達到了有利的結果。特別令人驚訝值得注意的是其它經修飾的已知本身增加 結合效率的寡核苷酸，在TNE中不如LNA和丙炔修飾的寡核苷酸的本組合有效。
具體實施例方式在一個方面，本發明涉及用于定向改變雙鏈DNA序列的寡核苷酸，該雙鏈DNA序列 含有第一 DNA序列和與第一 DNA序列互補的第二 DNA序列，所述寡核苷酸含有能夠與第一 DNA序列雜交的結構域，該結構域相對于第一 DNA序列來說含有至少一個錯配，并且其中該 寡核苷酸包含至少一個區段，該區段含有至少兩個經修飾的核苷酸，所述核苷酸與天然存 在的A、C、T或G核苷酸相比具有更高的結合親和力，其中-至少一個經修飾的核苷酸是位于與至少一個錯配相距至少一個核苷酸的位置上的LNA，其中可選地，寡核苷酸含有最多約50%的LNA修飾的核苷酸；并且-至少一個經修飾的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。在一個方面，本發明涉及用于定向改變雙鏈DNA序列的經修飾的寡核苷酸。該雙鏈DNA序列含有第一 DNA序列和第二 DNA序列。該第二 DNA序列與第一 DNA序列互補并且 與之配對而形成雙鏈。該寡核苷酸包括結構域，該結構域含有相對于需要改變的雙鏈DNA 序列的至少一個錯配。優選，該結構域是與第一鏈互補的包括至少一個錯配的寡核苷酸的 一部分。優選地，結構域中的錯配是相對于第一 DNA序列的錯配。該寡核苷酸包含以至少 一個LNA修飾的區段和以至少一個丙炔化核苷酸修飾的區段，從而具有比第二 DNA序列 (對應的部分)更高的結合親和力，同時保留了生物學活性。優選地，至少一個經修飾的LNA 核苷酸位于與至少一個錯配相距至少一個核苷酸的位置，更優選寡核苷酸含有最多約50% 的LNA修飾的核苷酸以及至少一個丙炔化核苷酸。含有錯配的結構域和含有經修飾的核苷酸的區段，無論分別是LNA或是丙炔化 的，可以重疊。因此，在某些具體實施方式
中，相對于所考慮修飾的區段，含有錯配的結構域 位于寡核苷酸上的不同位置上。在某些具體實施方式
中，結構域整合一個或多個區段。在 某些具體實施方式
中，區段可以整合結構域。在某些具體實施方式
中，結構域和區段可以位 于寡核苷酸的相同位置上并且具有相同的長度，即區段在長度和位置上是一致的。在某些具體實施方式
中，結構域中可以有一個以上的區段。對于本發明，這意味含有為了改變DNA雙鏈的錯配的寡核苷酸部分可以位于與修 飾的寡核苷酸部分不同的或移位的位置上。特別地，在某些具體實施方式
中，其中細胞的修 復系統(或至少參與該系統的蛋白，或至少參與TNE的蛋白)決定哪條鏈含有錯配以及哪 條鏈將用作改正該錯配的模板。LNA 變化鎖定的核酸(LNA)是具有非常有趣性質的用于反義基因治療的DNA類似物。LNA 是二環和三環核苷和核苷酸類似物和含有這樣類似物的寡核苷酸。在各種出版物和專利 中，包括 WO 99/14226,WO 00/56748,W000/66604,WO 98/39352、美國專利 No. 6，043，060 和 美國專利No. 6，268，490中公開了 LNA的基本結構和功能性特征以及相關的類似物，所有這 些全部通過參考全文并入本文。特別地，其結合了區分正確和非正確靶標(高特異性)的能力，非常高的生物穩定 性(低周轉)和未有先例的親和力(非常高的對靶標的結合強度)。事實上，以LNA記錄的 親和力的增加使得所有以前報道的類似物的親和力在低至中等的氛圍內。LNA是RNA類似物，其中核糖在結構上被2'-氧和4'-碳原子之間的亞甲基橋 所限制。該橋限制了呋喃核糖環的靈活性并且將結構鎖至剛性的二環結構。這個所謂的 N-型(或3'-內)構象造成含有雙鏈的LNA的Tm增加，以及隨后的更高的結合親和力和 更高的特異性。NMR光譜研究實際上已經證明LNA糖的鎖定的N-型構象，但是還揭示LNA 單體能夠將其非修飾的相鄰核苷酸扭至N-型構象。重要的是LNA的有利特征是不以其它 重要性質為代價的，而核酸類似物則經常觀察到是以其它重要性質為代價。可以將LNA與所有其它組成DNA類似物總體的化學物自由地混合。可以將LNA堿 基引入寡核苷酸作為短的全LNA序列或作為較長的LNA/DNA嵌合體。可以將LNA置于內部3'或5'位置。但是由于其剛性的二環構象，LNA殘基有時妨礙核酸鏈的螺旋扭轉。因此 較不優選的是設計具有兩個或兩個以上相鄰LNA殘基的寡核苷酸。優選，LNA殘基由至少 一個(經修飾的)不干擾螺旋扭轉的核苷酸(如常規的核苷酸A、C、T或G)分開。最初開發的和優選的LNA單體⑶-D-氧-LNA單體)已經被修飾成新的LNA單體。 新型a -L-氧-LNA對3’ -外切核酸酶活性顯示超穩定性，并且還比0 _D_氧-LNA在設計 有力的反義寡核苷酸方面更有力和更萬能。另外可以使用木-LNA(xylo-LNA)和L-核糖 LNA，如在W09914226、W000/56748、W000/66604中公開的。本發明中，任何上面類型的LNA 可以在實現本發明的目標(即增加TNE效率)中有效，優選是0-D-LNA類似物。TNE領域中，LNA修飾被列在作為TNE中的嵌合體分子的替代物的可能寡核苷酸修 飾的名單中。但是，迄今本領域中沒有顯示建議當LNA位于距離錯配至少一個核苷酸遠時 和/或當寡核苷酸不含約50%以上(四舍五入至最接近核苷酸整數)的LNA時，LNA修飾 的單鏈DNA寡核苷酸顯著增加TNE效率至現在已經發現的程度。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸包括含有至少一個，優選至少2個，更優選2個 LNA修飾的核苷酸的區段。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸上的區段可以含有2、3、4、5、 6、7、8、9或10個以上的LNA修飾的核苷酸。 在某些具體實施方式
中，至少一個LNA位于距離錯配最多10個核苷酸，優選最多8 個核苷酸，更優選最多6個核苷酸，甚至更優選最多4、3或2個核苷酸的距離。在更優選的具體實施方式
中，至少一個LNA位于距離錯配一個核苷酸的距離，即錯配和LNA之間有一個 核苷酸。在某些涉及含有一個以上的LNA的寡核苷酸的具體實施方式
中，至少兩個LNA位 于距離錯配至少一個核苷酸的距離。在優選的具體實施方式
中，LNA彼此不相鄰并且由至少 一個核苷酸，優選由兩個或三個核苷酸所分開。在某些具體實施方式
中，在兩個或兩個以上 (偶數)LNA修飾寡核苷酸的情況下，修飾位于距離錯配(約)相等的距離。換句話說，優 選LNA修飾對稱地位于錯配的周圍。例如，在優選的具體實施方式
中，兩個LNA對稱地位于 錯配周圍距離錯配1個核苷酸的距離(且彼此間隔3個核苷酸)，即...(LNA)-N-(錯配) N-(LNA) 。在某些具體實施方式
中，最多40 %，優選最多30 %，更優選最多25 %，甚至更優選 最多20%，和最優選最多10%的寡核苷酸的經修飾的核苷酸是LNA衍生物，即常規的A、C、 T或G被其LNA的對應物所替代。在某些具體實施方式
中，可以引入一個以上的錯配，或同時或相繼引入。寡核苷酸 可以在寡核苷酸相鄰或遠離的位置上容納一個以上的錯配。為此，寡核苷酸可以根據本文 所示的原則適應為容納第二套LNA，只要它們不會由于寡核苷酸中的LNA的特定構象(即 優選位于錯配周圍距離錯配一個核苷酸的距離)而干擾彼此的增加的結合能力或保留的 生物學活性。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸可以包含可以是相鄰的或遠距離的(即非 相鄰的)兩個、三個、四個或更多錯配核苷酸。寡核苷酸可以進一步含有結構域和區段以容 納這些，并且特別地可以含有幾個區段。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸可以整合一個潛 在的插入物以插入受體鏈。這樣的插入物的長度可以從5個以上至100個核苷酸變化。以 相似的方式，在某些具體實施方式
中，可以引入相似長度變化(從1至100個核苷酸)的刪 除。可以通過電穿孔或其它能夠遞送至核或細胞質的常規技術而完成寡核苷酸的遞送。可以使用如W001/87914、W003/027265、W099/58702、W001/92512中所述的無細胞系統 而實現本發明的方法的體外測試。丙炔修飾在某些具體實施方式
中，寡核苷酸包括含有至少一個，優選至少兩個，更優選至少 三個丙炔修飾的核苷酸的區段，所述修飾的核苷酸獨立地選自C7嘌呤和/或C5嘧啶。在某 些具體實施方式
中，寡核苷酸上的區段可以含有4、5、6、7、8、9或10個以上丙炔修飾的核苷 酸。在某些具體實施方式
中，區段是完全修飾的，即所有寡核苷酸中的嘧啶都載有C5-丙炔 取代物和/或所有嘌呤都載有C7-丙炔取代物，然后LNA修飾可以位于區段的旁側。在某些具體實施方式
中，有經LNA修飾的區段和經丙炔修飾的區段。在某些具體實施方式
中，區段 同時含有LNA修飾的核苷酸和丙炔修飾的核苷酸。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸包括 含有至少一個，優選至少2個，更優選至少3個丙炔修飾的核苷酸的區段。在某些具體實施 方式中，寡核苷酸上的區段可以含有4、5、6、7、8、9或10個以上丙炔修飾的核苷酸。在某些具體實施方式
中，區段是完全修飾的，即所有寡核苷酸中的嘧啶都載有C5-丙炔取代物和/ 或所有嘌呤都載有C7-丙炔取代物。在某些具體實施方式
中，所有的嘌呤都可以被丙炔化 并且嘧啶可以被LNA所置換或反之亦然。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸中至少10%的 核苷酸被其丙炔化對應物所替代。在某些具體實施方式
中，至少25，更優選至少50%，更優 選至少75%和在某些情況下優選至少90%的核苷酸被其丙炔化對應物所替代。包含在C5-位置上帶有丙炔基團的嘧啶核苷酸的寡核苷酸形成相對于其對應的 嘧啶衍生物而言更穩定的雙鏈和三鏈。在7-位置上帶有相同丙炔取代物的嘌呤形成甚至 更穩定的雙鏈并且因此是優選的。因此，在某些具體實施方式
中，通過使用比C5-丙炔嘧啶 核苷酸增強結合親和力至甚至更大程度的7-丙炔嘌呤核苷酸(8-氮-7-脫氮-2，-脫氧鳥 苷和8-氮-7-脫氮-2’ -脫氧腺嘌呤的7-丙炔衍生物)進一步增加了效率。這樣的核苷 酸特別在 He 和 Seela，2002 Nucleic Acids Res.迎5485_5496 中被公開。在某些具體實施方式
中，可以引入一個以上的錯配，或同時或相繼引入。寡核苷酸 可以在寡核苷酸相鄰或遠離的位置上容納一個以上的錯配。在某些具體實施方式
中，寡核 苷酸可以包含可以是相鄰的或遠距離的(即非相鄰的)兩個、三個、四個或更多錯配核苷 酸。寡核苷酸可以進一步包含結構域和區段以適應這一狀況，并且特別可以包含幾個區段。 在某些具體實施方式
中，寡核苷酸可以整合潛在的需要插入受體鏈的插入物。這樣的插入 物的長度可以從5個以上至100個核苷酸變化。以相似的方式在某些具體實施方式
中，可 以引入相似長度變化(從1至100個核苷酸)的刪除。在本發明的某些有利的具體實施方式
中，使用本發明的寡核苷酸已經實現核苷酸 的插入。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸可以整合潛在的需要插入受體鏈的插入物。這 樣的插入物的長度可以從1、2、3、4、5至100個核苷酸變化。以相似的方式在某些具體實施 方式中，可以引入相似長度變化(從1至100個核苷酸)的刪除。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸中至少10%的核苷酸被其丙炔化對應物所替 換。在某些具體實施方式
中，至少25，更優選至少50 %，更優選至少75 %和在某些情況下優 選至少90%的核苷酸被其丙炔化對應物所替代。丙炔基團是具有三鍵的三碳鏈。三鍵與位于嘧啶的C5位置和嘌呤核苷酸的7-位 上的核苷酸基本結構共價結合(圖2)。胞嘧啶和尿嘧啶(替代寡核苷酸上的胸腺嘧啶)
11都可以裝備C5-丙炔基團，分別形成C5-丙炔-胞嘧啶和C5-丙炔-尿嘧啶。單個C5-丙 炔-胞嘧啶殘基增加Tm 2.8°C，單個C5-丙炔-尿嘧啶增加1.7°C (Froehler等人1993 Tetrahedron Letters M1003-6 ；Lacroix 等人 1999 Biochemistry 38 1893-1901 ； Ahmadian等人 1998 Nucleic Acids Res 巡3127_3135 ;Colocci 等人 1994J. Am. Chem. Soc 116 785-786)。這是由于C5-位上的1_丙炔基團的疏水性并且其還允許更好地堆積堿基， 因為丙炔基團相對于雜環堿基而言是平面的。已經研究了含有C5-丙炔取代的嘧啶基團的寡核苷酸的增加的結合性質以改變 細胞過程。含有C5-丙炔基團的反義寡核苷酸與其靶標mRNA形成更穩定的雙鏈，引起基因 表達抑制的增加(Wagner 等人 1993 Science 260 1510~1513 :Flanagan 等人 1996 Nature Biotech. 14 1139-1145 ；Meunier 等人 2001 Antisense&NucleicAcid Drug Dev. H 117-123)。另外，這些實驗證明這樣的寡核苷酸有生物學活性并且可被細胞耐受。在TNE 的領域中，C5-丙炔嘧啶修飾被列在作為TNE中的嵌合體分子的替代物的可能寡核苷酸修 飾的名單中。但是，迄今本領域中沒有顯示建議與LNA修飾聯合的C5和/或C7修飾的單 鏈DNA寡核苷酸顯著增加TNE效率至現在已經發現的程度。寡核苷酸設計在本發明的進一步方面，可以通過下列方法實現寡核苷酸的設計-確定受體鏈的序列，或需要交換的核苷酸周圍序列的至少一個區段。這可以通常 是約與錯配或所需插入位置相鄰的至少10個，優選15、20、25或30個核苷酸，優選在錯配 的每一側，(例如GGGGGGXGGGGGG，其中X是錯配或插入位置)；-設計與錯配相鄰的一個或兩個區段互補的并且含有需要交換的核苷酸的供體寡 核苷酸(例如 CCCCCCYCCCCCC)；-給供體寡核苷酸提供(例如通過合成)所需位置上的LNA和丙炔修飾。修飾 可以根據環境廣泛變化。例子是 CCCmCCmCYCCmCCCmC、CCCmCCCYCCCmCCC、CCCCCCYCCCmCmCmCm、 CmCmCmCmCmCYCCCCCC、CCCCCmCYCCCmCCCCC等等，其中Cm代表LNA或丙炔修飾的核苷酸殘基。 對于不同的受體序列，例如ATGCGTACXGTCCATGAT，可以設計對應的供體寡核苷酸，例如具有 如上文概括的可變修飾的TACGCALGYCLGGTACTA(L = LNA或丙炔)。-當存在能夠靶向核苷酸交換的蛋白(例如，并且特別地是在細胞的錯配修復機 制中有功能的蛋白)時以供體寡核苷酸修飾DNA。不被理論所限制，增加的結合親和力被認為增加寡核苷酸發現并且保持結合其靶 標的可能性，因此增加了 TNE的效率。對糖骨架或堿基的許多不同化學修飾給予增加的結 合親和力。但是本發明人選擇集中于LNA修飾的寡核苷酸并且發現其在TNE中的活性依賴 寡核苷酸中的位置。如本文中使用的，供體寡核苷酸影響TNE的能力取決于引入供體寡核苷酸中經修 飾的核苷酸的類型、位置和數目或相對數量。該能力被定量可以通過例如將常規核苷酸之 間的結合親和力(或結合能量(Gibbs自由能))標準化至1，即對于AT和GC，結合親和力 均標準化至1。對于本發明的寡核苷酸，每個修飾的核苷酸的相對結合親和力(RBA)為> 1。這在下面的公式中舉例說明RBA = E RBA(經修飾的)-1 RBA(未修飾的)> 0 nm其中RBA是總相對結合親和力，RBA (經修飾的)是具有n個核苷酸長度的經修飾 的寡核苷酸的相對結合親和力的和，RBA(未修飾的)是具有m個核苷酸長度的未修飾的寡 核苷酸的相對結合親和力的和。例如，對于含有10個修飾的lOObp寡核苷酸，每個具有1. 1 的相當結合親和力。然后總 RBA 等于RBA = [(10*1. 1) +(90*1.0)]-(100*1.0) = 1。注意RBA的定義原則上不依賴需要比較的核苷酸鏈的長度。但是，當比較不同鏈 的RBA時，優選的是鏈具有約相同的長度或采用可比長度的區段。注意RBA不考慮可以在鏈 上集合在一起的修飾。因此以鏈B相比，某些鏈A的較高程度修飾意味著RBA (A) > RBA (B)。 對于上游和下游區段，可以確定和使用對應的(局部的)RBA值。為了容納經修飾的核苷酸 的位置效應，可以將重量因素引入RBA值。例如，經修飾的核苷酸對于與錯配相鄰的供體寡 核苷酸的效應可以比位于距離錯配5個核苷酸距離的經修飾的核苷酸的效應大。在本發明 的上下文中，RBA (供體)> RBA (受體)。在某些具體實施方式
中，供體的RBA值可以比受體的RBA至少大0. 1。在某些具 體實施方式中，供體的RBA值可以比受體的RBA值至少大0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8、 0. 9,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5。RBA值可以源自核苷酸的經修飾的結合親和力的常規分析，例如通 過分子模擬法、熱力學測定等。或者，可以通過測定修飾鏈和未修飾鏈之間的Tm差別而確 定它們。或者，可以以未修飾和修飾鏈之間Tm的差別表示RBA，或者是通過測量，或者是通 過使用用于計算一組核苷酸的Tm的常規公式，或者是計算和測量組合。根據本發明的供體寡核苷酸可以含有進一步修飾以增加雜交特征，以致供體顯示 對靶標DNA鏈增加的親和力，因此促進了供體的插入。也可以進一步修飾供體寡核苷酸以 使其對核酸酶更具抗性，以穩定三鏈或四鏈結構。對本發明的LNA修飾的供體寡核苷酸的 修飾可以包括硫磷酰修飾、2-OMe置換、在寡核苷酸的3和/或5’末端使用其它類型的LNA、 PNA(肽核酸)，核糖核苷酸和其它堿基，所述這些調節優選為增加寡核苷酸和受體鏈之間 雜交體的穩定性。這些修飾中特別有用的是PNA，其是寡核苷酸類似物，其中寡核苷酸的脫氧核糖骨 架被肽骨架所替代。一個這樣的肽骨架是由通過酰胺鍵連接的N-(2-氨乙基)甘氨酸重復 單位構成。每個單位的肽骨架連接至核苷堿基(也稱為“堿基”)，其可以是天然存在的，非 天然存在的或經修飾的堿基。PNA寡聚物結合具有比DNA或RNA更高的親和力的與DNA或 RNA特異性互補的序列。因此，獲得的PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈具有更高的熔解溫度(Tm)。 此外，PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈的Tm比DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈對鹽濃度較為不敏感。PNA 的聚酰胺骨架還對酶的降解更有抗性。PNA合成在例如W0 92/20702和W092/20703中有 描述，其內容通過參考全文并入本文。其它PNA在例如W093/12129和1996年7月23日出 版的美國專利No. 5，539，082中有示例，其內容通過參考全文并入本文。另外，許多科學出 版物描述了 PNA的合成以及其性質和用途。見例如Patel，Nature，1993, 365,490,Nielsen 等人，Science, 1991，254，1497 ；Egholm, J.Am. Chem. Soc.，1992，114，1895、Knudson 等人， NucleicAcids Research, 1996，24，494、Nielsen 等人，J. Am. Chem. Soc.，1996，118，2287、 Egholm 等人，Science，1991,254，1497、Egholm 等人，J.Am. Chem. Soc.，1992，114，1895 和
13Egholm 等人，J Am. Chem. Soc.，1992，114，9677。本發明的寡核苷酸的進一步有用的修飾還有從德國Epoch Biosciences獲得的 SuperA和Super T。這些經修飾的核苷酸含有插入DNA大溝的另外的取代物，其中被認為 增加DNA雙鏈的堿基堆積。在另外的具體實施方式
中，當將根據本發明的經修飾的寡核苷酸以外的進一步的 修飾(其可以甚至更增加寡核苷酸對于受體鏈的親和力)引入寡核苷酸時，可以獲得有利 的結果。因此，已經發現，進一步包含C5-丙炔修飾的嘧啶和/或C7-丙炔修飾的嘌呤的根 據本發明的LNA修飾的寡核苷酸顯著增加TNE的效率。本發明的供體寡核苷酸還可以制成嵌合體，即含有DNA、RNA、LNA、PNA或其組合物 的區段。因此，在某些具體實施方式
中，本發明的寡核苷酸進一步含有其它的可選的非甲 基化的經修飾的核苷酸。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸對核酸酶有抗性。這對于防止寡核苷酸被核酸 酶降解有利，并且增大供體寡核苷酸發現其靶標(受體分子)的機會。在本發明的某些具體實施方式
中，可以修飾在寡核苷酸的錯配位置上的核苷酸。 錯配是否可以被修飾將很大程度上取決于定向核苷酸交換的確切機制或利用供體和受體 鏈間親和力的差別的細胞DNA修復機制。對于與錯配相鄰或附近的其它修飾位置確切位置 也是這樣。但是，基于本文中顯示的公開，考慮到對于如本文其它地方所述的合適的測試過 程，可以容易地設計和測試這樣的寡核苷酸。在某些具體實施方式
中，未修飾錯配位置上的 核苷酸。在某些具體實施方式
中，修飾在距離錯配1個核苷酸遠的位置上，優選距離錯配2、 3、4、5、6或7個核苷酸遠。在某些具體實施方式
中，修飾位于錯配下游的位置。在某些具體 實施方式中，修飾位于錯配上游的位置。在某些具體實施方式
中，修飾位于距離錯配10bp 至10kb，優選50至5000bp，更優選距離錯配100至500bp。用作供體的寡核苷酸的長度可變化但是通常在10-500個核苷酸的長度變化，優 選為11-100個核苷酸，優選為15-90個核苷酸，更優選為20-70個核苷酸，最優選為30-60 個核苷酸。在一個方面，本發明涉及一種定向改變雙鏈受體DNA序列的方法，其包括將雙鏈 受體DNA序列與供體寡核苷酸結合，其中雙鏈受體DNA序列含有第一 DNA序列和與第一 DNA 序列互補的第二 DNA序列，并且其中供體寡核苷酸包括含有相對于需要改變的雙鏈受體 DNA序列(優選相對于第一DNA序列)而言至少一個錯配的結構域，并且其中供體寡核苷酸 的區段以至少一個LNA和至少一個丙炔化核苷酸修飾，從而當存在能夠靶向核苷酸交換的 蛋白時，表達與寡核苷酸中該位置上的未經修飾的核苷酸比，較高程度的對第一 DNA序列 的親和力，其中LNA位于距離錯配至少一個核苷酸的距離。本發明以其最廣泛的形式，通常適用于所有種類的生物如人類、動物、植物、魚、爬 行動物、昆蟲、真菌、細菌等等。本發明適用于任何類型的DNA的修飾，如源于基因組DNA的 DNA、線性DNA、人工染色體、核染色體DNA、細胞器染色體DNA、BAC、YAC的修飾。本發明可以 在體內以及在體外進行。本發明以其最廣泛的形式，適用于改變細胞、通過恢復至野生型而改正突變、誘導 突變、通過破壞編碼區而滅活酶、通過改變編碼區而修飾酶的生物活性、通過破壞編碼區而修飾蛋白的許多目的。本發明還涉及實質上如以上所述的寡核苷酸的用途，其用于改變細胞、通過恢復 至野生型而改正突變、誘導突變、通過破壞編碼區而失酶、通過改變編碼區而修飾生物活 性、通過破壞編碼區而修飾蛋白、錯配修復、定向改變(植物)遺傳物質，包括基因突變、定 向基因修復和基因敲除。本發明進一步涉及一種試劑盒，其含有如本文其它地方所述的一個或多個寡核苷 酸，可選地與能夠誘導定向突變和特別地能夠進行TNE的蛋白聯合。本發明進一步涉及通過本發明的方法獲得的修飾的遺傳物質，涉及含有修飾的遺 傳物質的細胞和生物，涉及如此獲得的植物或植物部分。可以通過電穿孔或其他能夠遞送至核或細胞質的常規技術實現寡核苷酸的遞送。 可以使用如W001/87914、W003/027265、W099/58702、W001/92512中所述的無細胞系統實現 本發明方法的體外測試。本發明以其最廣泛的形式，適用于改變細胞、通過恢復至野生型而改正突變、誘導 突變、通過破壞編碼區而滅活酶、通過改變編碼區而修飾生物活性、通過破壞編碼區而修飾 蛋白的許多目的。本發明還涉及實質上如以上所述的寡核苷酸的用途，其用于改變細胞、通過恢復 至野生型而改正突變、誘導突變、通過破壞編碼區而滅活酶、通過改變編碼區而修飾生物活 性、通過破壞編碼區而修飾蛋白、錯配修復、定向改變(植物)遺傳物質，包括基因突變、定 向基因修復和基因敲除。本發明進一步涉及一種試劑盒，其含有如本文其它地方所述的一個或多個寡核苷 酸，可選地，與能夠誘導定向突變和特別地能夠進行TNE的蛋白聯合。本發明進一步涉及通過本發明的方法獲得的修飾的遺傳物質，涉及含有修飾的遺 傳物質的細胞和生物，涉及如此獲得的植物或植物部分。本發明特別涉及使用本發明的LNA和丙炔修飾的寡核苷酸的TNE方法用于提供植 物中的除草劑抗性的用途。特別地，本發明涉及提供了抗除草劑抗性的植物，特別是磺酰脲 除草劑(例如氯磺隆(chlorsulfuron)和草甘膦。本發明進一步涉及一種增加雙鏈DNA的定向核苷酸交換效率的方法，該方法包括 下列步驟(a)獲得含有能夠與所述雙鏈的第一 DNA序列雜交的結構域的寡核苷酸，其中所 述結構域含有(i)至少一個相對于第一 DNA序列的錯配；和(ii)至少一個具有增加的結 合親和力的經修飾的核苷酸；和(b)將所述修飾的核苷酸和所述錯配間的距離減小至約8 個或更少的核苷酸；(c)回收用于定向核苷酸交換的寡核苷酸。該方法基于寡核苷酸的現 有技術中給出的限制的觀察，即錯配和寡核苷酸之間的距離必須是至少8個核苷酸的要求 不是本發明的寡核苷酸的要求。如從附屬的實施例中可見的，含有一個或多個經修飾的核 苷酸比未經修飾的寡核苷酸在TNE中更有效。本發明進一步涉及用于定向改變雙鏈DNA的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含能 夠與所述雙鏈的第一 DNA序列雜交的結構域并且所述結構域含有(a)至少一個相對于第 一 DNA序列的錯配；(b)含有至少一個經修飾的具有增加的結合親和力的核苷酸的至少一 個區段，其中所述經修飾的核苷酸是LNA或丙炔修飾的核苷酸，如本文其它地方所述，其中 所述經修飾的核苷酸位于距離所述錯配至少8個核苷酸。在某些具體實施方式
中，區段含
15有兩個或兩個以上經修飾的核苷酸，獨立選自如本文其它地方所述的LNA或丙炔修飾的核 苷酸。在某些具體實施方式
中，LNA位于距離錯配至少一個但是不超過8個核苷酸。在某 些具體實施方式
中，經修飾的核苷酸位于距離所述錯配至多8個核苷酸。在某些具體實施 方式中，經修飾的核苷酸位于距離所述錯配至多6個核苷酸。在某些具體實施方式
中，經修 飾的核苷酸位于距離所述錯配至多4個核苷酸。在某些具體實施方式
中，經修飾的核苷酸 位于距離所述錯配至多2個核苷酸。在某些具體實施方式
中，寡核苷酸含有能夠與雙鏈的 第一 DNA序列雜交的結構域，其中所述結構域含有2個LNA。另外，用于雙鏈DNA的定向核 苷酸交換的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有(a)經修飾的核苷酸；和(b)相對于所述雙鏈 DNA鏈的錯配，其中所述經修飾的核苷酸位于距離所述錯配約1個核苷酸遠。
圖1 圖解說明定向核苷酸交換。將含有需要交換的核苷酸⑴的受體雙鏈 DNA鏈與LNA和C5-丙炔嘧啶修飾的含有需要插入的核苷酸(Y)的供體寡核苷酸(以 NNNmNNNmYNNmNNm圖解給出)接觸。將受體/供體結構置于或者與能夠進行TNE的環境接 觸或至少與能夠進行TNE的蛋白接觸，如與已知的無細胞酶混合物或無細胞提取物(見 W099/58702, W001/73002)接觸。圖2 5-丙炔脫氧尿嘧啶、5-丙炔脫氧胞嘧啶、2 ‘-脫氧_7_丙炔_7_脫氮-腺 苷和2’脫氧-7-丙炔-7-脫氮鳥苷和鎖定的核酸的化學結構。圖3 自除草劑抗性的番茄愈傷組織擴增的ALS P186/184密碼子的序列分析。在 這個情況下將單獨的PCR產物克隆并測序。
實施例實施例1 無細胞系統中的TNE含有C5-丙炔嘧啶的寡核苷酸、LNA核苷酸或其組合購自Trilink Biotech, GeneLink或Ribotask。含有其它修飾的核苷酸的寡核苷酸購自Eurogentec。使用的寡核苷酸的序列在表1中顯示。用于實驗的質粒是含有提供卡那霉素和羧 芐青霉素的抗性基因的PCR2. ldnvitrogen)的衍生物。質粒KmY22st0p具有卡那霉素0RF 中密碼子Y22上的TAT至TAG突變。在質粒KmY22 A中，將Y22密碼子(TAI)的第三個核 苷酸去除以產生框架移動。在兩個質粒中，將卡那霉素0RF在相同的位置突變。因此，可以 通過分別以KmY22st0p或KmY22 A孵育測試單個核苷酸產生核苷酸取代或插入的效率。Km WT GAG AGG CTA TTC GGC TAT GAC TGG GCA CAA CAGERLFGYDWAQQKmY22stop GAG AGG CTA TTC GGC TAG GAC TGG GCA CAA CAGE R L F G 女KmY22A GAG AGG CTA TTC GGC TA_ GAC TGG GCA CAA CAGE R L F G 女顯示了卡那霉素0RF的相對序列和編碼的氨基酸。如前所述(Sawano等人2000 Nucleic Acids Res.28 :e78)引入單個核苷取代和刪除從而產生終止密碼子(TAG，*)。顯 示了用于實驗的寡核苷酸的序列。在卡那霉素0RF中寡核苷酸結合區以下劃線標示。
無細胞分析無細胞分析如下進行。從擬南芥(Arabidopsis thaliana)(生態型Col_0)收集 花蕾并在液氮下研磨。加入200 ill蛋白分離緩沖液(20mM HEPES pH7. 5,5mM KC1，1. 5mM MgCl2, lOmM DTT, 10% (v/v)甘油，(w/v)PVP)。通過 14k RPM 離心 30 分鐘將植物碎片 沉淀并且將上清液儲存于-80°C。使用NanoOrange試劑盒(Molecular Probes, Inc)測定 蛋白濃度。通常分離形成約3-4i!g/ia的蛋白濃度。無細胞反應物含有下列成分lyg 質粒DNA (KmY22stop或KmY22 A )，100ng寡核苷酸，30 y g總植物蛋白，4 yl剪切的鮭精 DNA(3ug/u l),2u 1蛋白酶抑制劑混合物(50x濃度完全的無EDTA的蛋白酶抑制劑混合 物片，Roche Diagnostics) ,50 u 1 2x無細胞反應緩沖液(400mM Tris pH7. 5,200mM MgCl2, 2mM DTT, 0. 4mM 亞精胺，50mM ATP, 2mM 每種 CTP，GTP，UTP，0. ImM 每種 dNTP 和 lOmM NAD)，以 水制成總體積100 yl。將混合物于37°C孵育1小時。然后將質粒DNA按照如下分離向每 個反應物中加入100 u 1 H20以增加體積，然后加入200 u 1堿緩沖的酚(pH8-10)。將其短時 振蕩，然后于13k rpm離心3分鐘。將上層水相轉移至新管然后加入200 yl氯仿。將其短時 振蕩，于13k rpm離心3分鐘并將水相轉移至新管中。通過加入0. 7倍體積的2-異丙醇沉淀 DNA，將沉淀重懸于TE。為了去除任何共純化的寡核苷酸，將DNA通過Qiagen PCR純化柱并 將質粒DNA洗脫于最終體積30 ill。將2 ill質粒DNA電穿孔至18 u 1 DH10B (Invitrogen) 電感受態細胞。電穿孔后，令細胞在S0C培養基中于37°C恢復1小時。這期間后，加入卡那 霉素至lOOy g/ml的濃度并將細胞繼續孵育3小時。通過計數獲自涂在含有培養基的羧芐 青霉素上的10-4至10_5電穿孔稀釋液的克隆數而計算電穿孔的效率。通過用卡那霉素抗 性克隆數除以從羧芐青霉素抗性克隆數計算來的總轉化細胞數而計算TNE的效率。結果使用KmY22stop的無細胞實驗顯示在表1中的引入寡核苷酸的經修飾的核苷酸如下甲基磷酸酯(MP)是含有核酸酶抗性甲基磷酸酯連接而不是天然存在的帶負電的 磷酸二脂鍵的非離子核酸類似物。它們廣泛用于哺乳動物細胞中的反義方法。已知C-5甲基化嘧啶脫氧核苷酸(5Me_dC)比其對應的嘧啶衍生物形成更穩定的 雙鏈。例如，已經顯示5-甲基-2’-脫氧胞苷(5-Me-dC)的取代增加Tm 1. 3°C /取代。合 成5-(1_丙炔)-2’ -脫氧尿苷(pdU)和5-(l-丙炔)-2’ -脫氧胞苷(pdC)已經證明兩個 取代均增加雙鏈的穩定性。在嘧啶C5的位置用1-丙炔取代甲基使得更好地堆積堿基，因 為與雜環堿基相比丙炔基團是平的。同時，丙炔比甲基更疏水，這一性質進一步提供結合的 增加。雙鏈結合增加1. 7°C /pdU和1. 5°C /pdC殘基。嗎啉代寡核苷酸是DNA類似物，其中核糖被嗎啉半體替代，使用磷酸酰胺 (phosphoroamidate)亞基間連接替代磷酸二酯鍵。其廣泛用于斑馬魚中的基因敲除研究 (Genesis, Vol 30，2001)。其還用于改正突變3 _球蛋白前體mRNA的異常剪接(Lacerra 等人 2000，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97，9591-9596)。首先由Wengel 和同事描述(Koshkin 等人 1998，Tetrahedron 54，3607-3630 ； Singh 等人，1998，Chem. Commun. 455-456)的和由 Imanishi 和同事(Okiba 等人 1998， Tetrahedron Lett. 39，5401-5404)描述的鎖定的核酸(0-D-LNA)是構象限定的核苷酸 衍生物。其含有減少構象靈活性并給核苷酸的糖半體提供RNA樣C3’ -內構象的亞甲基2，-0，4，-C 連接(Petersen 等人 2002，J.Am. Chem. Soc. 124,5974-5982)。與未經修飾的 雙鏈比，這極大地增加了對于DNA靶標的親和力，每個引入的LNA單體增加寡核苷酸的Tm 4-9°C (ffengel, J. 2001, In Crooke, S. T. (ed), Antisense DrugTechnology Principles, Strategies and Applications. Marcel Dekker, Inc. ,New York,Basle,pp. 339-357)。還石if 究了 0-D-LNA的立體異構體a-L-LNA的性質。熟知0-D-LNA用互補的DNA鎖至A-形式， 但是 a -L-LNA和 DNA 間的雙鏈采用 B 形式(Nielsen 等人 2002，Chem. Eur. J. 8,3001-3009)， 其是雙鏈DNA的天然形式。由于其增加的結合親和力，這些LNA形式都顯示增加寡核苷酸 的反義性質(Kurreck 等人 2002，Nuc. Acids. Res. 30，1911-1918 ；Frieden 等人 2003，Nuc. AcidsRes. 31,6365—6372)。在兩個末端任一個或在序列內帶有6-氯-2-甲氧吖啶分子的寡核苷酸具有有效 插入雙螺旋的能力。因此這樣的插入通過提供額外的結合能量而增加雜合體穩定性。吖啶 標記的寡核苷酸已經用于那些寡核苷酸雜合體穩定性的增加為重要的應用。向寡核苷酸3’ 末端加入染料還保護寡核苷酸免受外切核酸酶的降解。由于形成額外的氫鍵，結合胸腺嘧啶的2-氨基腺嘌呤的穩定性位于A: T和G: C堿 基對穩定性的中間。2’ -0-甲基核苷酸，例如2’ -0-甲基肌苷對各種核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶有 抗性，也與互補序列形成更穩定的雜合體。
18表1.無細胞分析中含有經修飾的寡核苷酸的寡核苷酸的TNE效率。
DNA而大寫字母代表經修飾的核苷酸(堿基，糖或磷酸鹽骨架修飾或其組合)和其在寡核苷 酸中的位置。說明了每個寡核苷酸中包括的經修飾的核苷酸。每個寡核苷酸的TNE效率表 示為與只有DNA的寡核苷酸(寡核苷酸1)的TNE效率相比TNE增加(或減少)的倍數。每 個寡核苷酸至少進行了 4次重復，每個系列的實驗還包括作為參考的寡核苷酸1的多次重 復。為了區分不同種類的位于相同寡核苷酸上的經修飾的核苷酸，以粗體顯示一種類型的 經修飾的寡核苷酸(例如寡核苷酸9、10、21和22)。pdC，5- (1-丙炔)-2’-脫氧胞苷；pdU, 5-(1_丙炔)_2’_脫氧尿苷；LNA，鎖定的核酸；MP，甲基磷酸酯連接；5Me-dC，5-甲基-脫氧 胞苷。對照實驗中，當從反應中省略寡核苷酸或蛋白時，未獲得卡那霉素抗性克隆。將寡核苷酸設計為分別在KmY22st0p或KmY22A質粒中產生單個核苷酸取代或插 入，恢復0RF功能。實驗證明單鏈寡核苷酸中的0-D-LNA核苷酸的數量和位置是相關的。 其中3-D-LNA核苷酸被置于錯配核苷酸旁邊的寡核苷酸(寡核苷酸2)與未經修飾的寡核 苷酸相比顯示出較小的TNE活性。增加0-D-LNA核苷酸的數量(寡核苷酸3和4)產生生 物非活性寡核苷酸。但是，當以3或4個包括錯配核苷酸的正常DNA核苷酸(寡核苷酸5和 6)分開0 -D-LNA時，觀察到TNE效率的增加。考慮到a -L-LNA核苷酸采用更多DNA構象， 可以預期其還將增加TNE至與0 -D-LNA比相同的程度或也許甚至更好。但是顯示寡核苷酸 7和8在我們的分析中幾乎無活性，證明0 -D-LNA立體異構體優選用于增加TNE。2’ -氨 基-LNA與其他LNA形式比顯示較優的DNA結合，由于向LNA核苷酸加入可以提供額外的DNA 相互作用的額外的基團(Singh等人(1998) J. Org. Chem. 63,10035) 0但是，再次，雖然寡核 苷酸9和10的結合親和性假設是增加了，測試的2’ -氨基-LNA衍生物去除了這些寡核苷 酸的TNE活性并且因此是較不優選的。與其提供給反義寡核苷酸的強烈增強相反，寡核苷 酸11、12、13和16在TNE中無活性。在每一端含有2個2’ -0-甲基肌苷的寡核苷酸14與 未經修飾的寡核苷酸的活性一樣，但是當2’ -0-甲基肌苷核苷酸在錯配核苷酸的側面(寡 核苷酸15)時，該寡核苷酸變得無活性。插入劑6-氯-2-甲氧吖啶還使得寡核苷酸無活性 (寡核苷酸17和18)。我們的數據顯示含有C5-丙炔嘧啶的寡核苷酸顯示TNE的增強，其 至少部分依賴于寡核苷酸中經修飾的嘧啶的數量。當我們考慮含有C5-甲基胞嘧啶的等同 寡核苷酸(寡核苷酸13)是無活性時，這個結果令人驚訝。因此，我們觀察到的效果完全依 賴于連接至嘧啶C5-位置的基團。最后，將具有優化間距的0-D-LNA核苷酸與C5-丙炔嘧 啶組合于單個寡核苷酸上顯示出比未經修飾的寡核苷酸增加平均13倍的TNE頻率。使用KmY22A的無細胞實驗還測試了優化的寡核苷酸設計在質粒KmY22A中插入單個核苷酸和恢復卡那霉 素0RF功能性的能力(見表2)。使用未經修飾的DNA寡核苷酸，我們發現其通過TNE引入 插入的能力比其產生取代的能力低約5倍。當我們測試含有LNA和/或C5-丙炔嘧啶核苷 酸的寡核苷酸5、19和20的引入插入的能力時，與我們的取代的數據相反，這些經修飾的寡 核苷酸沒有將效率增加至以未經修飾的寡核苷酸(寡核苷酸1)獲得的效率以上。但是，當 使用寡核苷酸21或22時，獲得核苷酸插入效率的協同性增加。這證明LNA和C5-丙炔嘧 啶優選存在于相同的寡核苷酸上以增加TNE的效率，其中核苷酸被插入靶標。另外，寡核苷 酸20和寡核苷酸21間見到的效率的差別指示可以最大化寡核苷酸中C5-丙炔嘧啶核苷酸 的數量以獲得優化的核苷酸插入效率。
序列分析無細胞TNE事件 將所有本研究中的寡核苷酸設計為將KmY22stop中的終止密碼子(TAG)轉換為TAC，恢復卡那霉素ORF的功能性。為了確定含有經修飾的核苷酸的寡核苷酸修復的忠實 性，從以寡核苷酸1(未修飾的DNA)或寡核苷酸18 (其中所有嘧啶核苷酸由C5-丙炔嘧啶 所替代)修復后獲得的卡那霉素抗性克隆中純化質粒。當以寡核苷酸1進行TNE反應時， 所有40個測序的質粒顯示在Y22上預期的TAC修復事件。但是，當使用寡核苷酸20時， 28/38顯示在Y22上的TAC而其余10個質粒在該位置含有TAT。因此，雖然C5-丙炔嘧啶 增加TNE頻率，其還影響修復反應的結果，使其更傾向于錯誤。證明使用體外TNE分析、無細胞系統，含有C5-丙炔嘧啶核苷酸的寡核苷酸和錯配 周圍的LNA的特異性間隔確實顯示與使用正常DNA寡核苷酸獲得的TNE效率比顯著高水平 的TNE。這種增加可以高至14倍。可以通過靶向嘧啶豐富序列以便使C5-丙炔嘧啶核苷酸的 百分比最大化而進一步提高這種增加。還可以通過使用增加結合親和力至比C5-丙炔嘧啶 核苷酸甚至更大程度的7-丙炔 嘌呤核苷酸而進一步增加效率(He & Seela，2002 Nucleic Acids Res. 30 =5485-5496) 0將丙炔嘌呤和嘧啶組合允許產生其中所有核苷酸載有堿基上 的丙炔基團的寡核苷酸。實施例2 煙草中的TNE煙草嫩芽培養這個實施例的材料來源是煙草體外嫩芽培養物，其無菌生長于25/20°C (白天/夜 晚)溫度和光子流密度為80 μ Ε. πΓ2. S—1 (光周期為16/24h)的玻璃杯(750ml)中的MS20培 養基中。MS20培養基是基礎Murashige和Skoog氏培養基(Murashige，Τ.和Skoog，F.， Physiologia Plantarum，！^ :473_497，1962)，其含有 2 % (w/v)蔗糖，沒有加入荷爾蒙和 0. 8% Difco瓊脂。將嫩芽每3周亞培養至新鮮的培養基。原生質體分離為了分離葉肉原生質體，收集3-6周齡的嫩芽培養物的完全展開的葉子。將葉子 切成Imm的薄條，然后將其轉移至大(lOOmmxlOOmm)的含有45ml MDE基本培養基的培養 皿以進行前質壁分離處理30分鐘的。MDE基本培養基含有0. 25g KClU.Og MgSO4. 7H20、 0. 136g KH2P04、2. 5g聚乙烯吡咯酮(MW 10，000)、6mg萘乙酸和2mg 6-芐氨基嘌呤，總體積 為900ml。將溶液的重量克分子滲透壓濃度用山梨醇調整至600m0sm. kg—1，將pH調整至5. 7。前質壁分離后，向每個培養皿加入5ml的酶儲存液。每100ml酶儲存液含有750mg 纖維素酶Onozuka R10、500mg崩潰酶和250mg浸解酶R10，以Whatman紙過濾并過濾消毒。 將培養皿密封并在黑暗中25°C靜止孵育過夜以消化細胞壁。次日早晨，將原生質體懸浮液通過500 μ m和100 μ m篩進入250ml的Erlenmeyer 瓶中，與等體積的KCl洗滌培養基混合，并于50ml管中于85xg離心10分鐘。KCl洗滌100培 養基由2. Og的CaCl2. 2H20/L和足夠量的KCl組成以使重量克分子滲透壓濃度至540m0sm.
kg-1。將離心步驟重復兩次，首先以重懸于MLm洗滌培養基(其是一半的正常濃度的MS 培養基的宏量營養素(Murashige, T. and Skoog,F. ,Physiologia Plantarum, 15 473~497, 1962)，2. 2g的CaCl2. 2H20/L和一定量的甘露醇以使重量克分子滲透壓濃度至540m0sm. kg"1)中的原生質體進行，最后以重懸于MLs培養基(其是甘露醇被蔗糖替代的MLm培養基) 中的原生質體進行。將原生質體從蔗糖培養基中的漂浮帶回收并重懸于等體積的KCl洗滌培養基。用血細胞計數器計數其密度。隨后，將原生質體在IOml玻璃管中于85xg再次離心5分鐘，將沉淀以IxlO5原生質體/ml的密度重懸于電穿孔培養基中。使所有的溶液保持無菌，所有 操作在無菌條件下進行。ALS靶標基因和寡核苷酸的設計在煙草乙酰乳酸合成酶(ALS) SurA基因(Gene Bank登錄號X07644)中，氨基酸轉 換P194Q和W571L使得ALS蛋白對磺酰脲除草劑氯磺隆不敏感。將兩個寡核苷酸設計為 引入在編碼這些氨基酸的SurA密碼子中的堿基對突變。SEQ IDNO 23將產生P194Q突變， SEQ ID NO 24產生W571L突變。兩個寡核苷酸中所有的C和T殘基都被丙炔化(這樣的寡 核苷酸中，脫氧胸苷被5-(1_丙炔)-2’_脫氧尿苷替代)，除了寡核苷酸SEQ ID NO 231中 的脫氧胸苷錯配核苷酸，其對應于所要的點突變的位置。丙炔化胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸在 SEQ ID NO 23和SEQ ID N024中標示為Cp或Up。另外，在距離錯配核苷酸任一側兩個核 苷酸遠的位置上引入了 LNA殘基(在SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24中標示為A"、T"、C" 或G~)。對照單鏈寡核苷酸只由具有相同核苷酸序列的正常DNA殘基(無C5-丙炔嘧啶也 無LNA殘基)組成。5，UpCpAGUpACpCpUpAUpCpAUpCpCpUpACpG"UpTGC"ACpUpUpGACpCpUpGUpUpAUpAG3， [SEQ ID NO 23]5，CpCpUpUpAUpAGAACpCpGAUpCpCpUpC“CpAAT"UpGAACpCpACpCpAUpUpCpCpCpAA3'[ SEQID NO 24]CodA靶標基因和寡核苷酸的設計對于用于堿基對轉換的TNE，ALS基因是有用的選擇性標記基因，因為在特異位置 上的單個堿基變化導致單個氨基酸轉換，這轉而提供對磺酰脲除草劑的抗性。對于用于產 生單個堿基插入或刪除(indel)的TNE，ALS不是有用的選擇性標記基因，因為單個堿基 indel將導致基因的開放閱讀框的框架移動，因此產生無功能性蛋白。因此對于磺酰脲除草 劑的篩選是不可能的。CodA是細菌的編碼胞嘧啶脫氨基酶的基因，可以用作負篩選標記(Stougaard， Plant Journal755_761，1993)。表達該基因并暴露于5-氟胞嘧啶(5-FC)的植物將死 于由5-氟尿嘧啶(5-FU)的胸苷酸合成酶的不可逆抑制途徑，所述5-氟尿嘧啶是通過被 CodA的基因產物催化的5-FC的脫氨形成的。通過寡核苷酸的作用引入CodA序列的框架移 動突變將使基因無功能，并且這樣的植物細胞對5-FC有抗性。在本實施例中，利用CodA負篩選系統來選擇由于寡核苷酸的作用進行indel突變 的煙草細胞。為此,通過如 Stougaard (Plant Jlant Journal 3 755-761,1993)中所述的 土壤桿菌_介導的轉化已經產生從CaMV 35S啟動子表達細菌CodA基因的煙草SRl植物。 已經測試轉化植物對5-FC的正確反應，并以如上所述的體外嫩芽培養物保持所述植物。本 實施例中，使用了 CodA基因的優化用于植物密碼子的特異版本以便增加其在植物細胞中 的翻譯效率。密碼子優化的CodA基因的序列是ATGTCTAACAACGCTCTTCAGACTATCATCAACGCTAGACTTCCTGGAGAAGAGGGACTTTGGCAGATTCATCTTCAGGATGGAAAGATCTCTGCTATCGATGCTCAGTCTGGAGTGATGCCTATCACTGAGAACTCTCTTGATGCTGAGCAGGGACTTGTTATTCCTCCTTTCGTGGAGCCTCACATCCATCTTGATACAACTCAGACTGCTGGACAACCTAATTGGAACCAGTCTGGAACTCTTT
TCGAGGGAATCGAAAGATGGGCTGAGAGAAAGGCTCTTCTTACTCACGATGATGTGAAGCAAAGGGCTTGGCAAACTCTTAAGTGGCAGATCGCTAACGGAATTCAGCATGTGAGGACTCATGTGGATGTGTCTGATGCTACTCTTACTGCTCTTAAGGCTATGCTGGAAGTGAAGCAGGAAGTCGCGCCGTGGATTGATCTTCAGATCGTGGCTTTCCCTCAAGAGGGAATCCTTTCTTACCCTAACGGAGAGGCTCTTCTTGAAGAGGCTCTTAGGCTTGGAGCTGATGTTGTTGGAGCTATCCCTCACTTCGAGTTCACTAGGGAATACGGAGTTGAGTCTCTTCACAAGACTTTCGCTCTTGCTCAGAAGTACGATAGGCTTATCGATGTTCACTGCGATGAGATCGATGATGAGCAGTCAAGATTCGTTGAGACTGTGGCTGCTCTTGCTCATCATGAAGGAATGGGAGCTAGAGTTACTGCTTCTCACACTACTGCTATGCACTCTTACAACGGAGCTTACACTTCTAGGCTTTTCGGCTTCTTAAGATGTCTGGTATCAACTTCGTGGCTAACCCTCTTGTGAACATCCATCTTCAGGGAAGATTCGATACTTACCCTAAGAGGAGGGGAATTACTAGGGTGAAGGAGATGCTTGAGTCAGGTATCAATGTGTGCTTCGGACACGATGATGTTTTCGATCCTTGGTATCCTCTTGGAACTGCTAACATGCTTCAGGTGTTGCATATGGGACTTCATGTGTGCCAACTTATGGGATACGGACAGATCAACGATGGACTTAACCTTATCACTCACCACTCTGCTAGGACTCTTAACCTTCAGGATTACGGAATTGCTGCTGGAAACTCTGCTAACCTTATCATCCTTCCTGCTGAGAATGGATTCGATGCTCTTAGGAGGCAAGTTCCTGTTAGGTACTCTGTTAGGGGAGGAAAGGTGATCGCTTCTACTCAACCTGCTCAGACTACTGTTTACCTTGAGCAGCCTGA[SEQ ID NO :25]。設計寡核苷酸用于在CodA基因5'末端的位置上引入單個堿基對插入。丙炔化胞 嘧啶或尿嘧啶核苷酸標示為Cp或Up。自對應于要插入(插入核苷酸，下劃線的)的核苷酸 任一端兩個核苷酸遠的位置上，引入LNA殘基(標示為A~，T~，C~或G~)。對照單鏈寡核苷 酸只由具有相同核苷酸序列的正常DNA殘基(無C5-丙炔嘧啶也無LNA殘基)組成。5' GAAGUpCpUpAGCpGUpUpGAUpGA~Up￡AG~UpCpUpGAAGAGCpGUpUp⑶pUpAGA3' [SEQ ID NO 26]。原生質體電穿孔使用PHBS 作為電穿孔培養基(10mM Hepes,pH 7. 2 ；0. 2M 甘露醇，150mMNaCl ；5mM CaCl2)，原生質體在電穿孔化合物中的密度為約lX106/ml，電穿孔設置為250V(625V cnT1) 電荷和800 u F電容，脈沖和培養間恢復時間為10分鐘。對于每個電穿孔使用約每800微 升1-2 iiF寡核苷酸。電穿孔=25iig/ml。原生質體再生和選擇電穿孔處理后，將原生質體置于冰上恢復30分鐘，然后重懸于I；培養基，密度 為 lxlO5 原生質體/ml。TQ 培養基含有(每升，pH5. 7)950mg KN03、825mgNH4N03、220mg CaCl2. 2H20、185mg MgS04. 7H20、85mg KH2P04、27. 85mgFeS04. 7H20、37. 25mg Na2EDTA. 2H20、根 據 Heller 氏培養基的微量營養素(Heller，R.，Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14 :l-223, 1953)，根據 Morel 和 Wetmore 氏培養基的維生素(Morel，G. and R. H. ffetmore, Amer. J. Bot.38 138-40,1951),2% (w/v)蔗糖、3mg萘乙酸、lmg 6-芐氨基嘌呤和一定量的使重 量克分子滲透壓濃度至540m0sm. kg—1的甘露醇。然后將重懸于T。培養基的原生質體與等體積的I；培養基中的1. 6% SeaPlaque低 熔點瓊脂糖溶液混合，滅菌后于30°C水浴中保持液態。混合后，將懸浮液以2. 5ml等份輕柔 移至5cm培養皿中。將皿密封并在黑暗中于25/20°C (16/24h光周期)孵育。
在黑暗中孵育8-10天后，將瓊脂糖培養基切成餅狀的6等份，將其轉移至含有 22. 5ml液體MAPA0培養基的10cm培養皿中。該培養基由下列成分組成(每升，pH5. 7) 950mg KN03、825mg NH4N03、220mg CaCl2. 2H20、185mgMgS04. 7H20、85mg KH2P04、27. 85mg FeS04. 7H20、37. 25mg Na2EDTA. 2H20、根據 Murashige 和 Skoog 氏培養基的十分之一原濃度 的微量營養素(Murashige，T.和 Skoog，F.，Physiologia Plantarum,15 :473_497，1962)， 根據 Morel 和 Wetmore 氏培養基的維生素(Morel，G. and R. H. ffetmore, Amer. J. Bot. 38 138-40，1951)、6mg丙酮酸鹽、12mg蘋果酸、12mg反丁烯二酸和12mg檸檬酸、3% (w/v)蔗 糖、6% (w/v)甘露醇、0. 03mg萘乙酸和0. lmg 6-芐氨基嘌呤。為了選擇有成功TNE事件 的克隆，還向培養基中加入41nM氯磺隆或250iig/ml 5-FC。將培養皿于25/20°C光周期 為16/24h的弱光中(光子流密度為ZOyE.nT2. s—1)孵育。兩周后，將培養皿轉移至全光中 (SOiiE.n^.s—1)。在這個選擇期間內，大多數原生質體死亡。只有其中通過寡核苷酸的作 用，靶基因中發生堿基變化以致產生對除草劑或5-FC的抗性的原生質體，分裂并繁殖成原 生質體衍生的微克隆。分離后六至八周，將原生質體衍生的克隆轉移至MAPi培養基。此時瓊脂糖珠子分 開至足以用廣口無菌移液管轉移微克隆，或者將它們單獨用鑷子轉移。MAPi培養基具有與 MAPiAO培養基相同的組成，但是以3% (w/v)甘露醇代替6%的甘露醇，并具有46. 2mg. F1 組氨酸(pH 5. 7)。其用0. 8% (w/v)Difco瓊脂固化。在該固體培養基上生長2-3周后，將克隆轉移至再生培養基RP，每10cm培養皿有 50個克隆。RP培養基由下列成分組成(每升，pH5. 7) :273mg KN03、416mg Ca(N03)2. 4H20、 392mg Mg(N03)2. 6H20、57mg MgS04. 7H20、233mg(NH4)2S04、271mg KH2P04、27. 85mg FeS04. 7H20、 37. 25mg Na2EDTA. 2H20、根據Murashige和Skoog氏培養基的五分之一發表濃度的微量營養 素(Murashige, T. and Skoog, F. , Physiologia Plantarum，！^ :473_497，1962)、根據 Morel 和 Wetmore 氏培養基的維生素(Morel，G.和 R. H. ffetmore, Amer. J. Bot. 38 138-40,1951)、 0. 05% (w/v)蔗糖、1.8% (w/v)甘露醇、0. 25mg 玉米素和 41nM 氯磺隆或 250ii g.mH-FC， 并用0. 8% (w/v)Difco瓊脂固化。靶基因的PCR擴增使用DNeasy試劑盒(Qiagen)從氯磺隆或5-FC抗性煙草微克隆分離DNA， 并用作PCR反應的模板。使用下列引物檢測煙草ALS基因中定向密碼子的轉換 5，GGTCAAGTGCCACGTAGGAT[SEQ ID NO 27]和 5’ GGGTGCTTCACTTTCTGCTC[SEQ ID NO: 28]，其擴增該基因的776bp片段，包括密碼子194。引物5’ CCCGTGGCAAGTACTTTGAT[SEQ ID NO: 29]和 5，GGATTCCCCAGGTATGTGTG[SEQ ID NO 30]同樣用于擴增煙草 ALS 基因 的794bp的片段，包括密碼子571。為了 PCR擴增5-FC抗性煙草愈傷組織中的經修飾 的 CodA 基因，設計下列引物組5 ‘ GTGGAAAAAGAAGACGTTCCAAC3 ‘ [SEQID N0 31]和 5' AGCATCGATAGCAGAGATCTTTC3‘ [SEQ ID N0 :32]。測序以證明核苷酸轉換通過測序獲自這樣愈傷組織中的DNA的PCR產物以證實除草劑抗性煙草愈傷組織 中的核苷酸轉換。煙草ALS P194密碼子(CCA至CAA)的轉換導致密碼子第二位置上的雙 峰(C/A)。最后，煙草ALS W571密碼子(TGG至TTG)的轉換導致第二密碼子位置上的雙峰 (G/T)。
26
實施例3 小鼠胚胎干細胞中的TNE為了具有選擇性系統以證明小鼠細胞中的TNE，使用了表達提供培養物中G418抗 性的選擇性標記基因(neo)的小鼠胚胎干(ES)細胞系，但是通過故意的突變使其無功能。 該TNE實驗的目的是修復該突變并恢復neo基因的功能性，形成G418中這樣的細胞的選 擇。小鼠ES細胞系通過引入由MC1啟動子驅動的缺陷性neo基因而衍生自E14系(Te Riele 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :5128_5132，1992)。該缺陷性 neo 基因含有 neo 的ATG起始密碼子的緊接下游的兩個額外的核苷酸GT，引起框架移動(Dekker等人，Nucl. Acids Res. 31，No. 6e27，2003)。該細胞生長于BRL條件化培養基中。為了 TNE實驗，將細胞以7X 105/孔的密度分配于6孔培養板24小時。然后向 每孔加入1.4ml無血清培養基、10 iig寡核苷酸和63 ill TransFast lipofection試劑 (Promega)。1小時后，加入4ml含有血清的培養基，將細胞孵育過夜。無選擇孵育24小時 后，令細胞生長于含有100mg. 1^418的選擇性培養基中。10天后，計數G418抗性克隆。用于修復框架移動突變的寡核苷酸由對應于ATG起始密碼子周圍的neo基因區域 的編碼鏈的序列的36聚體組成，但是不具有被引入neo中為了產生框架移動突變的GT核 苷酸。另外，所有的胞嘧啶或胸腺嘧啶核苷酸被丙炔化，下面通過Cp或Tp標示。自距離框 架移動插入任一端兩個核苷酸遠的位置，引入LNA殘基(標示為A~，T~，C~或G~)。對照單 鏈寡核苷酸只由正常DNA殘基(無C5丙炔嘧啶也無LNA殘基)組成，并含有GT框架移動 突變。寡核苷酸序列如下5 ‘ TpCpTpAGAGCpCpGCpCpACpCpAT“GAT“CpACpCpGATpGCpATpCpGAG3 ‘ [SEQ ID NO 33]。從G418抗性克隆中抽提DNA，并進行PCR以便擴增neo起始密碼子周圍的區域。 隨后測序該PCR片段以便證實正確修復框架移動突變。實施例4使用C5-丙炔和LNA修飾的寡核苷酸在番茄(Solanum lycopersicum)中的定向 核苷酸交換乙酰乳酸合成酶(ALS，也稱為乙酰羥酸合成酶；AHAS)是第一個在生物合成途徑 中合成支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的共同的酶。該途徑存在于植物和微生物， 如細菌、真菌和藻類中。ALS是至少4種結構上不同類的除草劑，包括磺脲(SU)、咪唑啉酮 (IMI)、三唑并嘧啶磺酰胺(triazolopyrimidinesulfonamides) (TP)和嘧啶水楊酸(PS) 的首要作用靶點。在番茄中，ALS是多拷貝基因，因為兩個全長EST存在于植物轉錄數據 庫(http://planta.tiRr. org)中。在我們的研究中，我們將轉錄物TA3727_44081定義為 ALS1，將轉錄物TA37275_4081定義為ALS2。ALS1編碼659AA的蛋白而ALS2編碼657AA的 蛋白。ALS1和ALS2分別在DNA和蛋白水平上顯示93%和96%的同一性。兩個蛋白主要的 差別在于負責葉綠體定向的蛋白的信號肽區。雖然有這些差別，ALS1和ALS2蛋白都被預 測為靶向葉綠體。以前的研究已經顯示保守殘基上的幾個氨基酸變化足以給予植物對除草 劑的抗性，如水稻ALS中的P171Q、W548L和S627I突變。生物間的ALS的保守是高度的并 且許多生物中相同的突變造成相似的除草劑抗性表型。在本研究中，我們向設計用于改變 ALS2中的P184密碼子(或ALS1中的P184)的番茄葉子原生質體中引入正常DNA寡核苷酸
27或C5-丙炔和LNA修飾的寡核苷酸以便產生對磺酰脲類除草劑氯磺隆的抗性。由于經修飾 的和未經修飾的寡核苷酸的序列相同，因此當使用無細胞系統時我們觀察到的任何TNE效 率的差別一定是由于C5-丙炔和LNA修飾造成的。材料和方法寡核苷酸含有P184/186密碼子(大寫字母)的ALS1和ALS2區的序列顯示如下。ALS1和 ALS2之間的單核苷酸多態性以粗體顯示。ALS1 gattgttgctattac a ggtcaagtgCC A aggaggatgattggtactgatgcgt P186 [SEQ ID N034]ALS2 gattgttgctattac c ggtcaagtgCC G aggaggatgattggtactgatgcgt P184 [SEQ IDNO 35]設計表3中的寡核苷酸44和95用于產生ALS2中的P184Q改變。兩個都是“反 義”寡核苷酸，與ALS基因的非轉錄鏈互補。寡核苷酸80由C5-丙炔和LNA修飾的核苷酸 的GATC重復組成并作為對照。該設計包括末端4個核苷酸間的磷硫酰連接因為這樣的修 飾已知部分保護寡核苷酸免受核酸酶的降解。表3 y = 5-丙炔-2'-脫氧胞苷；z = 5-丙炔-2'-脫氧尿嘧啶；s = LNA A ;v = LNA T ;w = LNAC ；x = LNA G ;U =脫氧尿嘧啶；* =磷硫酰連接。所有的寡核苷酸通過 Eurogentec合成和HPLC純化。與靶標形成錯配的核苷酸加下劃線。番茄葉子原牛質體的分離和轉化以前已經描述了番茄葉子原生質體的分離和再生(Shahin，1985Theor. Appl. Genet. M :235_240 ；Tan 等人 1987 Theor. Appl. Genet. 75 105-108 ；Tan 等人 1987 Plant Cell R印.5:172-175)，可以在這些發表物中找到所需溶液。簡單地說，將番茄(Solanum Lycopersicum)的種子以0. 1 %的次氯酸鹽滅菌，體外在16/8小時光周期于20001ux于 25°C和50-70%相對濕度生長于無菌MS20培養基中。將lg新鮮收集的葉子置于含有5ml CPW9M的皿中，使用解剖刀片每毫米垂直于主干切割。將其轉移至25ml酶溶液(CPW9M， 其含有 2%纖維素 onozuka RS、0. 4%浸解酶 onozuka R10、2. 4_D (2mg/ml)，NAA(2mg/ml)、 BAP(2mg/ml), pH5. 8)的新鮮板中并在黑暗中于25°C進行消化過夜。然后通過將其置于軌 道振蕩器上(40-50rpm) 1小時而釋放原生質體。通過將其通過50 y m的篩子而將原生質體
28從細胞碎片中分離，并以CPW9M洗滌篩子2次。以85g離心原生質體，棄去上清液，然后吸 收于一半體積的CPW9M。最后將原生質體吸收于3ml CPW9M，然后小心加入3ml CPW18S以 避免兩種溶液混合。將原生質體以85g離心10分鐘，并使用長巴斯德移液管收集漂浮于相 間層的活原生質體。通過加入CPW9M增加原生質體的體積至10ml并在血細胞計數器中測 定回收的原生質體的數目。使用Gene Pulser (BioRad)用電穿孔將寡核苷酸引入番茄原生質體。將原生質體 以lX106/ml的密度重懸于0. 4cm電穿孔杯中的作為電穿孔培養基(10mM HEPES，pH 7. 2 ； 0. 2M甘露醇，150mM NaCl,5mM CaCl2)的PHBS中。將5 y g寡核苷酸加入到1ml原生質體懸 浮液中，電穿孔在250V(625C cnT1)和800 y F電容下進行。然后小心地從杯中移出原生質 體并轉移至新管，加入8ml 9M培養基。然后將其于85g離心5分鐘，去除上清液，加入2ml 新鮮的9M培養基。將原生質體植入藻酸鹽溶液以再生。加入2ml藻酸鹽溶液(甘露醇90g/l， CaCl2. 2H20 140mg/l，藻酸鈉20g/l (Sigma A0602))并通過倒置重復混合。將其lml平均地 鋪在Ca-瓊脂板(72. 5g/l甘露醇，7. 35g/l CaCl2. 2H20，8g/l瓊脂)上并令其聚合。然后 將藻酸鹽盤轉移至含有4ml K8p培養基的4cm培養皿中并在黑暗中于30°C孵育7天。然后 將盤切成5mm寬的條并鋪在含有20nM氯磺隆的TM-DB愈傷組織誘導培養基上。30°C孵育 4-5周后，除草劑抗性愈傷組織出現，然后將個體轉移至GM-ZG培養基進一步生長。在該培 養基上2-3周后，將部分愈傷組織用于DNA分離。分析番茄愈傷組織使用植物DNAeasy試劑盒(Qiagen，#69104)從5周齡的愈傷組織中分離基因組 DNA。將引物設計為特異性擴增ALS1或ALS2。對于ALS1我們使用引物08Z769 (5，GAAAGG GAAGGTGTTACGGATGTA SEQ ID NO 39)和 08Z770(5，CTTGATTGCGAACACCCACC SEQ ID NO 40)；對于 ALS2 使用引物 08Z773(5，GAAAGGGAAGGGGTTAAGGATGTG SEQ ID NO 41)禾口 08Z774(5，CTCGACTGTGAACACCCACC SEQ ID NO 42)。使用校正性酶 rTth DNA 聚合酶 XL (Roche)進行PCR擴增，并直接測序獲得的PCR片段。為了證實核苷酸改變，使用Taq DNA 聚合酶向用校正性酶產生的平端PCR片段加A-尾(lOOng產物(5 ill)+1 ill PCR緩沖液 +1 u 1 dNTP's (20mM) +1U Taq DNA 聚合酶 +2. 8 ii 1 H20 ；72°C 10 分鐘)。然后使用 PCR 純化 試劑盒(Qiagen)純化PCR片段，并將10ng克隆至T0P0 TA克隆試劑盒(Invitrogen)。轉 化至大腸桿菌(E. coli)后，使用rTth DNA聚合酶XL (Roche)使用退火至載體中的位點和 插入點旁側的M13引物在白色、卡那霉素抗性克隆上進行PCR反應。然后使用M13引物直 接測序這些PCR產物。MM進行兩個獨立的實驗以測試使用含有C5-丙炔和LNA修飾的寡核苷酸是否增加了 番茄中TNE的效率。結果在表4中顯示。表 4 含有C5-丙基和LNA修飾的核苷酸的寡核苷酸44給出比由未經修飾的DNA組成 的寡核苷酸95多約8倍的愈傷組織。這些寡核苷酸的序列是相同的。寡核苷酸80是也含 有經修飾的核苷酸的“亂序的”寡核苷酸。該寡核苷酸對于ALS1或ALS2都不特異并作為 對照以證明寡核苷酸單獨存在于植物細胞中不足以產生除草劑抗性愈傷組織。另外，當將 寡核苷酸從原生質體轉化混合物中去除時，未觀察到除草劑抗性愈傷組織，表明番茄原生 質體中的自發除草劑抗性低于可檢測水平。為了證明氯磺隆抗性愈傷組織在期望的位點確實含有突變，將3個愈傷組織(1個 來自寡核苷酸95(D)，2個來自寡核苷酸44 (E和F))測序。對來自ALS1或ALS2的PCR產 物的序列分析顯示在所有3個愈傷組織中混合峰存在于靶標密碼子。這證明除草劑抗性表 型確實是由于由寡核苷酸產生的核苷酸改變并且愈傷組織對于核苷酸改變是半合的。然后 我們進行了克隆并對源自ALS1或ALS2的單個PCR產物測序。序列分析的結果在圖5中顯 示。愈傷組織D和E分別顯示ALS2和ALS1上的CCA至TCA改變(P186S)，而愈傷組織G顯 示ALS1上的CCA至TTA的改變(P186L)。煙草中的研究已經顯示在煙草ALS直系同源物 (SurA或SurB)中保守脯氨酸殘基上的任何氨基酸改變給予氯磺隆抗性(Kochevenko等人 2003PlantPhys. 132 174-184)。因此ALS1或ALS2的P186/184密碼子用于檢測未預期的 核苷酸改變是理想的，因為這樣的事件也將引起除草劑抗性表型。我們的結果證明通常C5-丙炔和LNA修飾不抑制基因組中，特別是番茄的基因組 中的核苷酸改變的產生。另外，這種類型的修飾通常顯著增加植物細胞中定向核苷酸交換 的效率，在番茄的情況下約增加8倍。這種類型的組合修飾(如本文所述的LNA和丙炔) 提供在體外的相對于以前描述的那些只使用LNA修飾的寡核苷酸或只使用丙炔修飾的核 苷酸的無細胞分析(即體外)的顯著增加。這里特別值得注意的是從無細胞分析至體外分 析的步驟。令人驚訝的是我們沒有發現預期的核苷酸改變(ALS2上的CCG至CAG，P184Q)。相 反在愈傷組織D和E中，我們觀察到對靶標核苷酸密碼子的核苷酸5’上的改變(C至T)。 另外，我們來自愈傷組織G的數據顯示與靶序列共享單個錯配的寡核苷酸能夠誘導2個核 苷酸的改變。將完全PCR產物(500bp)的序列與ALS1或ALS2的相比，除了靶標脯氨酸密 碼子上的改變，未觀察到其它核苷酸的變化。因此，寡核苷酸能夠誘導植物基因的特異密碼 子上的突變。使用無細胞系統和DNA寡核苷酸產生的TNE事件的分析確實給出預期的核苷 酸改變。在我們對愈傷組織D的分析中，使用未經修飾的DNA寡核苷酸，我們觀察到未預期的核苷酸改變。這顯示細胞中可能有其它因素，其影響在無細胞系統中不起作用的修復過 程，使得從無細胞分析至體外分析的步驟不簡單。但是，我們顯示含有C5-丙炔修飾的寡核 苷酸確實產生無細胞系統中未預期的核苷酸變化，揭示經修飾的核苷酸本身引起更“傾向 于錯誤的”修復。因此值得注意的是使用經修飾的寡核苷酸產生了顯示CCA至TTA改變的 愈傷組織G。 幾個研究提示用寡核苷酸處理后在人類細胞中產生的核苷酸變化是由于在靶位 點整合了寡核苷酸(Radecke等人2006 J. Gene Med. 8 217-218) 0但是寡核苷酸整合不能 解釋我們在番茄中獲得的結果。首先寡核苷酸整合將引起預期的核苷酸改變(P184Q)，這我 們未觀察到。第二，我們使用靶向ALS2的寡核苷酸還發現ALS1中的核苷酸改變。在ALS1 上整合該寡核苷酸還將改變存在于P 186/184密碼子的第三個核苷酸的單核苷酸多態性。 因為未觀察到此，我們得出結論，寡核苷酸整合不能解釋我們的結果。這可以反映動物和植 物細胞間的TNE機制的差別。我們傾向于下列機制寡核苷酸結合其基因組靶標并誘導靶 密碼子上的突變過程，隨之寡核苷酸隨后被降解。
權利要求
一種用于定向改變雙鏈DNA序列的寡核苷酸，該雙鏈DNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補的第二DNA序列，該寡核苷酸含有能夠與第一DNA序列雜交的結構域，該結構域含有相對于第一DNA序列的至少一個錯配，并且該寡核苷酸包括至少一個區段，該區段含有與天然存在的A、C、T或G核苷酸相比具有較高的結合親和力的至少兩個經修飾的核苷酸，其中-至少一個經修飾的核苷酸是位于距離至少一個錯配至少一個核苷酸距離的LNA，并且其中，可選地，該寡核苷酸含有最多約50％的LNA修飾的核苷酸；并且-至少一個經修飾的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。
2.根據權利要求1所述的寡核苷酸，其中至少2個，優選至少3個，更優選至少4個，甚 至更優選至少5個和最優選至少6個核苷酸是LNA。
3.根據權利要求1或2所述的寡核苷酸，其中LNA在距離錯配兩端最多10個核苷酸， 優選最多8個核苷酸，更優選最多6個核苷酸，甚至更優選最多4、3或2個核苷酸的距離獨 立地分布。
4.根據權利要求1-3所述的寡核苷酸，其中2個，優選3個，更優選4個，甚至更優選5 個和最優選6個核苷酸是LNA。
5.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸的最多40%，優選最多 30 %，更優選最多25 %，甚至更優選最多20 %，和最優選最多10 %的經修飾的核苷酸是LNA 衍生物。
6.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中經修飾的核苷酸獨立位于錯配的 5’側和/或3’側。
7.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中位于錯配5’或3’側的兩個LNA修 飾的核苷酸被至少1個，優選至少2個堿基對(核苷酸)彼此分開。
8.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中嘌呤是腺嘌呤或鳥嘌呤和/或嘧啶 是胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶脫氧核苷。
9.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中，獨立地至少10%，優選至少50%， 更優選至少75%和最優選至少90%的嘧啶和/或嘌呤被其各自的丙炔化衍生物替代。
10.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中經修飾的核苷酸是嘧啶。
11.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中經修飾的核苷酸是嘌呤。
12.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中至少兩個經修飾的核苷酸是丙炔 化核苷酸，獨立地選自丙炔化嘌呤或丙炔化嘧啶。
13.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含至少2個區段，優選 至少3個區段，所述區段獨立地含有至少2個，更優選至少3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾 的核苷酸。
14.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中區段位于或接近3’末端、5’末端 和/或包括錯配位置或在錯配位置旁側。
15.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸，其中位于錯配位置的核苷酸不經修飾。
16.根據前述權利要求任一項的寡核苷酸，其中至少一個丙炔修飾的核苷酸位于錯配 的附近，優選在錯配的2、3、4、6、7、8、9或10個核苷酸以內。
17.根據前述權利要求任一項的寡核苷酸，其具有10至500個核苷酸的長度。
18.根據前述權利要求任一項的寡核苷酸，其中(經修飾的)區段是結構域。
19.根據前述權利要求任一項所述的寡核苷酸。
20.一種定向改變雙鏈受體DNA序列的方法，其包括將雙鏈受體DNA序列與供體寡核 苷酸結合，其中雙鏈受體DNA序列含有第一 DNA序列和與第一 DNA序列互補的第二 DNA序 列，并且其中供體寡核苷酸包括結構域，該結構域含有相對于需要改變的雙鏈受體DNA序 列，優選相對于第一 DNA序列的至少一個錯配，并且其中寡核苷酸包括區段，該區段含有與 天然存在的A、C、T或G相比具有較高的結合親和力的至少一個經修飾的核苷酸，并且其中 當存在能夠定向核苷酸交換的蛋白時，與天然存在的與第一 DNA序列中相反位置上的核苷 酸互補的核苷酸相比經修飾的核苷酸與第一 DNA序列中相反位置上的核苷酸的結合更強， 并且其中經修飾的寡核苷酸如權利要求1-19中所定義。
21.根據權利要求20所述的方法，其中改變是在細胞內，所述細胞優選選自植物細胞、 真菌細胞、嚙齒動物細胞、靈長類細胞、人類細胞或酵母細胞。
22.根據前述方法權利要求任一項所述的方法，其中蛋白來自細胞提取物。
23.根據前述方法權利要求任一項所述的方法，其中細胞提取物選自植物細胞提取物、 真菌細胞提取物、嚙齒動物細胞提取物、靈長類細胞提取物、人類細胞提取物或酵母細胞提 取物。
24.根據前述方法權利要求任一項所述的方法，其中改變是刪除、取代或插入至少一個 核苷酸。24.根據前述方法權利要求任一項所述的方法，其中細胞是真核細胞、植物細胞、非人 類哺乳動物細胞或人類細胞。
25.根據前述方法權利要求任一項所述的方法，其中靶DNA來自真菌、細菌、植物、哺乳 動物或人類。
26.根據前述方法權利要求任一項所述的方法，其中雙鏈DNA來自基因組DNA、線性 DNA、哺乳動物人工染色體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、植物人工染色體、核染色體 DNA、細胞器染色體DNA、游離DNA。
27.根據前述方法權利要求任一項的方法，其用于改變細胞、通過恢復至野生型而改正 突變、誘導突變、通過破壞編碼區而使酶失活，通過改變編碼區而修飾酶的生物學活性、通 過破壞編碼區而修飾蛋白。
28.如權利要求1-19中所定義的寡核苷酸的用途，其用于改變細胞、通過恢復至野生 型而改正突變、誘導突變、通過破壞編碼區而使酶失活、通過改變編碼區而修飾酶的生物學 活性、通過破壞編碼區而修飾蛋白、錯配修復、定向改變(植物)遺傳物質包括基因突變、定 向基因修復和基因敲除。
29.如權利要求1-19所定義的寡核苷酸的用途，其用于增加雙鏈DNA序列的定向改變， 該雙鏈DNA序列含有第一 DNA序列和與第一 DNA序列互補的第二 DNA序列，寡核苷酸含有 能夠與第一 DNA序列雜交的結構域，該結構域含有相對于第一 DNA序列的至少一個錯配，并 且其中寡核苷酸包括區段，該區段含有與天然存在的A、C、T或G核苷酸相比具有較高結合 親和力的至少兩個經修飾的核苷酸，其中-至少一個經修飾的核苷酸是位于距離至少一個錯配為至少一個核苷酸的LNA，并且 其中，可選地，寡核苷酸含有最多約50%的LNA修飾的核苷酸；并且-至少一個經修飾的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。
30.如權利要求1-19所定義的寡核苷酸在用于為植物提供除草劑抗性的方法中的用途。
31.含有如權利要求1-19所定義的寡核苷酸的試劑盒。
32.通過權利要求13-27所述的方法產生的經修飾的遺傳物質。
33.含有權利要求32所述的經修飾的遺傳物質的細胞。
34.一種增加雙鏈DNA定向核苷酸交換效率的方法，其包括(a)獲得含有能夠與所述雙鏈的第一DNA序列雜交的結構域的寡核苷酸，其中所述結 構域含有(i)相對于第一DNA序列的至少一個錯配；和(ii)具有增加的結合親和力的至少一個經修飾的核苷酸，和(b)減少所述經修飾的核苷酸和所述錯配之間的距離至約8個或更少的核苷酸；和(c)回收用于定向核苷酸交換的寡核苷酸。
35.一種用于定向改變雙鏈DNA的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有能夠與所述雙鏈 的第一 DNA序列雜交的結構域并且所述結構域含有(a)相對于第一DNA序列的至少一個錯配；(b)至少一個區段，該區段含有具有增加的結合親和力的至少一個經修飾的核苷酸，其 中所述經修飾的核苷酸是LNA，其中所述經修飾的核苷酸位于距離所述錯配最多8個核苷酸。
36.根據權利要求35所述的寡核苷酸，其中經修飾的核苷酸位于距離所述錯配最多8 個核苷酸。
37.根據權利要求35所述的寡核苷酸，其中經修飾的核苷酸位于距離所述錯配最多6 個核苷酸。
38.根據權利要求35所述的寡核苷酸，其中經修飾的核苷酸位于距離所述錯配最多4 個核苷酸。
39.根據權利要求35所述的寡核苷酸，其中經修飾的核苷酸位于距離所述錯配最多2 個核苷酸。
40.根據權利要求35所述的寡核苷酸，其中所述結構域含有兩個LAN。
41.一種用于雙鏈DNA的定向核苷酸交換的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有(a)經修飾的核苷酸；和(b)相對于所述雙鏈DNA鏈的錯配；其中所述經修飾的核苷酸位于距離所述錯配約1個核苷酸遠。
全文摘要
一種用于雙鏈DNA序列的定向核苷酸交換的方法和寡核苷酸，其中供體寡核苷酸含有至少兩個經修飾的核苷酸，至少其中一個是丙炔化嘌呤和/或嘧啶并且至少其中一個是LNA，所述經修飾的核苷酸與天然存在的A、C、T或G相比具有較高的結合親和力和/或與天然存在的與第一DNA序列中相反位置上的核苷酸互補的核苷酸相比更強地結合至第一DNA序列中相反位置上的核苷酸。
文檔編號C12N15/10GK101868542SQ200880020319
公開日2010年10月20日 申請日期2008年6月19日 優先權日2007年6月22日
發明者P·邦道克 申請人:凱津公司