專利名稱：：用于預測結腸直腸腺癌細胞的存在的方法和工具的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于腫瘤診斷，更具體而言用于檢測結腸直腸腺癌的存在的方法。本發明進一步提供了用于執行這些方法的引物和探針。
背景技術：
：胃腸道的結腸直腸部分的癌癥是頻繁發生的病癥。在第一個階段，良性腫瘤(腺瘤)發生，這可以變成惡性癌癥(腺癌)。并非所有腺瘤都進展至癌。事實上這種進展至癌僅在小部分腫瘤中發生。基因組不穩定性的起始是關鍵步驟，并且在結腸直腸癌中以兩種方式發生(Lengauer等人(1998)Nature,396，643-649)。導致微衛星不穩定性(縮寫為MSI或MIN)的DNA錯配修復缺陷已得到最廣泛的研究(diPietro等人(2005)Gastroenterology,129，1047-1059)，但僅解釋了約15%的腺瘤進展至癌。在結腸直腸腺瘤進展至癌的其他85%的病例中，基因組不穩定性在染色體水平(CIN)上發生，產生非整倍性。盡管長期以來這些染色體異常已視為繼發于癌癥發展的隨機噪聲，但目前已充分確定這些DNA拷貝數變化以特定模式發生，并且與不同臨床行為相關(Hermsen等人(2002).Gastroenterology123,1109-1119)。在結腸直腸癌中經常報告的染色體異常是7pq、8q、13q、20q獲得和4pq、5q、8p、15q、17p、18q缺失。顯示8q、13q和20q獲得以及8p、15q、17p和18q缺失與結腸直腸腺瘤進展至癌相關(上文引用的Hermsen等人(2002)。染色體臂20q的獲得是在結腸直腸癌中觀察到的最常見的獲得，在超過65%的病例中改變(Meijer等人(1998)J.Clin.Pathol.51,901-909)。在20q特別是區域20ql2_ql3上的獲得在其他類型的實體腫瘤中也常常得到描述，并且已與胃和結腸直腸癌的不良結局相關。檢測這些染色體異常的方法一般基于比較基因組雜交(CGH)。Rooney等人(2004J.Pathol.204，282-288)描述了定性PCR的使用，以檢測結腸癌中的基因ZNF217的基因復制。在盡可能早的階段中鑒定上述腺瘤至腺癌的進展具有最大限度的臨床重要性，以允許癌的早期治療，同時避免不需要的手術干預。理想地，可以在惡性細胞的存在通過活組織檢查物或切除材料的原位光學分析或顯微鏡分析無法檢測的階段時鑒定腺癌。發明概述本發明涉及用于癌癥診斷，更具體而言用于鑒定結腸和/或直腸中的腺癌的存在的方法和工具。更具體而言，本發明提供了具有增加的靈敏度和可靠性、允許差異檢測癌的方法和工具。腺瘤可能發展或不發展成腺癌。然而，本發明的優點是基于這些細胞的差異遺傳構成，在非常早的階段時檢測例如腺瘤內的惡性結腸直腸腺癌細胞。這種篩選可以使用非常靈敏的技術來進行，從而使得可以檢測僅少量癌細胞的存在。這允許在癌細胞可以通過回波描記術、射線照相術或MRI(磁共振成像)檢測的階段前鑒定癌細胞的存在，并且允許檢測無需活組織檢查或切除術就可以獲自結腸的材料(例如糞便)中的腺癌細胞。本發明基于結腸直腸腺瘤至腺癌的進展與腺瘤細胞染色體內至少一個染色體獲得或缺失區域的出現相關的發現。因此，本發明的目的在于通過直接或間接分析方法通過檢測這些獲得或缺失而精確地檢測癌細胞的存在。在本發明的一個方面，提供了基于檢測包含與從結腸直腸腺瘤進展到腺癌相關的染色體獲得或缺失的遺傳物質的存在，檢測患者中的結腸直腸腺癌細胞的存在的方法。更具體而言，提供了用于檢測患者中的結腸直腸腺癌細胞的存在的體外方法，所述方法包括檢測患者的測試樣品的基因組DNA中一個或多個最小重疊區域(SRO)的獲得或缺失的存在的步驟，其中包含一個或多個SRO的獲得或缺失的遺傳物質的存在指示患者中結腸直腸腺癌細胞的存在。更具體而言，在本發明的方法中，一個或多個SRO選自-染色體8上的SR0_8p_l、SR0_8p_2、SR0_8p_3和SR0_8p_4，和/或-染色體8上的SR0_8q_l、SR0_8q_2、SR0_8q_3、SR0_8q_4、SR0_8q_5和SR0_8q_6，和/或-染色體13q上的SR0_13q_l、SR0_13q_2、SR0_13q_3、SR0_13q_4、SR0_13q_5和SR0j3q—6，和/或-染色體15上的SR0_15q_l、SR0_15q_2和SR0j5q—3，和/或-染色體17上的SR0_17p_l和SR0j7p—2，和/或-染色體18上的SR0_18q_l和SR0_18q_2，禾P/或-染色體20上的SR0_20q_l、SR0_20q_2和SR0_20q_3。在具體實施方案中，本發明的方法包括與結腸直腸腺癌相關的每個染色體獲得或缺失區域的至少一個SRO的獲得或缺失的檢測，更具體而言在8q、13q和20q處的染色體獲得，以及在8p、15q、17p和18q處的染色體缺失。在進一步的實施方案中，本發明的方法包括至少一個染色體區域的所有所述SROs的獲得或缺失的檢測。在進一步的實施方案中，本發明的方法包括每個列出的染色體區域的所有所述SROs的獲得或缺失的檢測。在具體實施方案中，本發明的方法包括使用比較基因組雜交(CGH)，特別是陣列CGH檢測染色體獲得或缺失。在進一步的具體實施方案中，本發明的方法包括使用諸如熒光原位雜交、DNA印跡或雜合性缺失分析的技術檢測染色體獲得或缺失。在進一步的具體實施方案中，本發明的方法包括通過采用SRO特異性引物對的PCR反應檢測染色體獲得或缺失。在具體實施方案中，所使用的SRO特異性引物對定位接近于SRO的邊界，并且允許如本發明所公開的檢測SRO的缺失或獲得。考慮了定量和定性PCR方法。更具體而言，用于檢測染色體缺失區域的SRO的SRO特異性引物對包含位于所述SR05'的正向引物和位于所述SRO3'的反向引物。在具體實施方案中，用于檢測染色體獲得區域內的SRO的SRO特異性引物對包含所述SRO的3'區域內的正向引物和SRO的5'區域內的反向引物。在進一步的具體實施方案中，本發明的方法包括通過定量PCR檢測位于一個或多個SR0s內的序列而檢測染色體獲得或缺失。在進一步的具體實施方案中，本發明的方法包括使用MPLA(多重連接(multiplexligation)依賴性探針擴增)檢測染色體獲得或缺失。在具體實施方案中，對患者的測試樣品執行用于檢測患者中的結腸直腸腺癌細胞的存在的本發明方法，所述測試樣品是包含來自結腸直腸癌活組織檢查或切除術的材料的樣品。可替代地，測試樣品包含來自糞便樣品的材料。進一步可替代考慮的是對測試樣品執行的方法，所述測試樣品包含來自組織或液體的材料，所述液體選自血液、尿、唾液和結腸液。本發明的方法特別適合于診斷結腸直腸腺瘤進展至腺癌。本發明的另一個方面提供了用于檢測染色體缺失或復制的試劑盒，對于表1中所示的每個染色體區域的一個或多個SROs，所述試劑盒包括在嚴格條件下與所述SR0內的序列或者與位于所述SR0邊界3'或5'最多約lMb的基因組序列內的序列特異性雜交的一種或多種寡核苷酸。在具體實施方案中，一種或多種寡核苷酸是SRO特異性PCR引物對。在進一步的實施方案中，一種或多種寡核苷酸是SRO特異性探針。在進一步的特別實施方案中，SRO特異性引物檢測表2的一種或多種標記基因。因此，本發明的進一步方面涉及本文提供的試劑盒用于體外測定患者樣品中的結腸直腸腺瘤細胞的存在的用途。更具體而言，試劑盒在用于測定結腸直腸病變的細胞中的染色體異常的方法中使用。當已鑒定腺瘤細胞的存在時，本發明的方法和試劑盒可以用于體外測定結腸直腸腺瘤進展至腺癌。根據下述詳述，結合舉例說明例如本發明原理的附圖，本發明的上述和其他特性、特征和優點將是顯而易見的。這個說明僅為了舉例而給出，而不限制本發明的范圍。下文引用的參考圖指附圖。附圖簡述圖1示意性舉例說明使用定性PCR反應檢測多核苷酸序列中的染色體缺失(A)或獲得(B)的原理。該圖顯示了在染色體異常前和后的部分基因組DNA。箭頭代表PCR引物。PCR片段(如果產生)的長度顯示在基因組DNA下。實施方案的詳述本發明將根據具體實施方案且參考某些附圖進行描述，但本發明并不限于此，而僅由權利要求限制。權利要求中的任何參考標記不應解釋為限制范圍。所描述的附圖僅是示意性和非限制性的。在附圖中，為了舉例說明的用途，某些元件的尺寸可以是擴大且不是按比例描繪的。當術語"包含"在本說明書和權利要求中使用時，它不排除其他元件或步驟。當使用不限定或限定項目的情況下提及單數名詞例如"一個"或"一種"、"該"時，這包括該名詞的復數，除非具體闡述另外的意思。此外，說明書和權利要求中的術語第一、第二和第三等用于區分相似元件，并且不一定用于描述順序或年代次序。應當理解如此使用的術語在合適的環境下可互換，并且本文描述的本發明的實施方案能夠以除本文描述或舉例說明外的其他序列操作。下述術語或定義僅為了幫助理解本發明而提供。這些定義不應解釋為具有小于本領域普通技術人員理解的范圍。定義如本文所使用的，"腫瘤"或"贅生物"指這樣的異常組織，其通過比正常更快速的細胞增殖而生長，并且在起始新生長的剌激停止后繼續生長。術語"病變"一般是指涉及由于任何疾病或任何損傷導致的任何組織或器官的異常，在本文中也用于指贅生物。腫瘤、贅生物或病變可以是良性或惡性的。"癌癥"是提及任何類型的惡性贅生物的通用術語。如本文所使用的，"腺瘤"指良性上皮贅生物。腺瘤通常是良好分界的，它們可以是扁平或息肉樣的，并且贅生細胞不浸潤或侵入鄰接組織。如本文所使用的，"腺癌"指上皮細胞的惡性贅生物。最通常地，癌形成腺體或腺樣模式。同義詞是"腺癌(glandularcancers)，，禾口"腺癌(glandularcarcinomas)，，。惡性細胞通常特征在于進行性和不受控制的生長。它們可以局部或通過血流和淋巴系統傳播到身體的其他部分。結腸直腸腺瘤在年長群體中是常見的，但僅這些惡變前腫瘤的小部分(估計約5%)進展至惡性腫瘤(即結腸直腸腺癌)。"進展的腺瘤"是已具有癌癥病灶的腺瘤并且也稱為"惡性息肉"。"結腸直腸"指結腸和/或直腸，即完整的大腸。如本文所使用的，"染色體異常"指染色體缺失或獲得，即在染色體中已缺失或復制的區域。如本文所使用的，"標記基因"指其表達在腺瘤和腺癌細胞之間有差別(減少或增加)的基因。"表達概況"指細胞或樣品中的許多標記基因的表達水平。關于結腸癌預防居第二位的事情是早期診斷。存在結腸癌的5個階段(0-4)。這個分期系統反映癌癥的浸潤階段。一般而言，階段越早，癌癥就越容易治療。本發明提供了用于區分惡性和惡變前的結腸直腸病變以及用于診斷受試者中的結腸直腸癌的存在的方法和工具。例如，本發明的診斷方法可以可靠地檢測非常早期的結腸直腸癌。雖然結腸鏡檢查和乙狀結腸鏡檢查是用于早期檢測結腸直腸癌的最常用檢查，但它們不僅對于患者非常不舒適，而且它們僅允許檢測可見病變。此外，它們的靈敏度由執行測試的醫生的經驗決定。當通過組織學分析鑒定息肉以證實息肉性質時，通常執行在結腸鏡檢查過程中切除物或活組織檢查物的獲取。最近，基于DNA微陣列的腫瘤基因表達概況已用于癌癥診斷。然而，研究已局限于少數癌癥類型，并且具有使不同數據庫中的比較復雜化的擴展多重技術平臺。在RNA或蛋白質水平上執行的表達分析具有許多缺點，首先與樣品的來源相關，即侵入性結腸鏡檢查的需要。此外，RNA或蛋白質樣品容易被結腸或直腸的內容物污染，這使后續分析復雜，或導致待分析的材料降解。此外，特別對于早期診斷，當與周圍腺瘤組織的細胞群比較，樣品可能僅包含少量腺癌細胞時，通過此種少量腺癌細胞的異常基因表達的貢獻可能不會被注意到。因此，表達分析的靈敏度被限制。本發明基于因為以下觀察結果超過85%的結腸直腸癌與染色體異常的存在相關的觀察，應當可以在基因水平上檢查這些癌癥，避免蛋白質或RNA表達分析的缺點。在一個方面，本發明涉及體外方法，其中通過直接分析樣品的遺傳物質中染色體異常的存在或不存在，將基因組DNA用于檢測患者中的結腸直腸腺癌細胞。已發現結腸直腸腺癌細胞顯示在8q、13q和20q處的染色體獲得，而染色體缺失在8p15q、17p或18q處遇到。患者樣品中包含一種或多種所述染色體異常的遺傳物質的存在指示該患者中的結腸直腸腺癌細胞的存在。因為這些染色體異常的存在是腺癌細胞相對于非惡性腺瘤細胞的特征，所以本發明的方法因此允許檢測良性結腸直腸腺瘤進展至惡性癌。在本發明方法中使用的患者樣品是包含基因組DNA，更具體而言潛在包含源于患者中存在的癌細胞的基因組DNA的樣品。在一個實施方案中，樣品包含患者的結腸直腸組織，更具體而言，樣品是或包含來自結腸直腸病變的活組織檢查物或切除物的遺傳物質。然而，考慮到本發明方法的靈敏度，還可以使用包含極少量遺傳物質的樣品。在具體實施方案7中，對來自機體的材料執行本發明方法的基因組分析，所述材料包含來自結腸直腸病變的完整細胞或裂解細胞，例如糞便樣品。腺癌細胞可以侵襲其他組織。因此，本發明的方法也考慮了分析除來自結腸直腸活組織檢查物或切除物和糞便樣品外的測試樣品。還考慮了可以包含腺癌細胞或這些細胞的至少部分基因組DNA的樣品例如血液、尿、唾液的分析。在某些實施方案中，本發明的方法包括比較獲自患者的樣品的基因組分析與對照。在本發明上下文中的合適對照包括不包含來自腺癌細胞的遺傳物質的基因組DNA。一般地，合適的對照是來自未受影響的組織或來自不包含腺癌細胞的腺瘤組織的、來自相同患者的遺傳物質。對照材料也可以是源于另一個患者或對照患者的集合(不包含來自腺癌細胞的遺傳物質)的遺傳物質。由于包含8q、13q和20q處的染色體獲得和/或8p、15q、17p或18q處的染色體缺失的DNA材料的存在，基因組DNA可以通過任何遺傳分析技術進行分析。雜合性缺失(LOH)可以使用多態性標記來執行。可替代地，使用雜交方法例如CGH(比較基因組雜交)。根據一個實施方案，使用CGH執行本發明方法中染色體缺失和插入的檢測。在本文中測試樣品的基因組DNA與代表人基因組的基因組克隆陣列進行雜交。CGH是確立的方法，這個操作的例子在本申請的實施例部分中詳細描述。CGH基于樣品DNA與矩陣上的DNA的雜交。基因組異常的存在基于與對照DNA相比雜交模式的差異進行檢測。為了具有可靠結果，避免非特異性雜交。這例如通過使用升高的溫度、高鹽濃度和離液劑例如甲酰胺去除非特異性結合的DNA來執行。這些參數中每一個的值依賴序列相似性程度和雜交配偶體的長度。合適的值在CGH陣列制造商的說明書以及參考書中存在，例如Sambrook等人(2000)inMolecularCloning,ALaboratoryManual,第3片反，ColdSpringHarborPress。例子是包含約50X甲酰胺、2xSSC，pH7或0.1M磷酸鈉、0.1%NonidetP40，pH8的溶液，其中SSC濃度為0.2-0.OlxSSC。通過在從腺瘤到癌的轉變后缺失或復制的染色體區域的精細作圖，已鑒定了先前與結腸直腸腺癌相關的染色體缺失和獲得區域的最小區域。因此，本發明的具體實施方案涉及用于檢測患者樣品中結腸直腸腺癌細胞的存在的方法，其包括檢測至少一個最小重疊區域(SR0)的獲得或缺失的存在。已對于與結腸直腸腺癌相關的每個染色體獲得區域，更具體而言8q、13q和20q處的染色體獲得區域，以及每個染色體缺失區域，更具體而言8p、15q、17p或18q處的染色體缺失區域鑒定了最小重疊區域(SR0)。事實上，某些變化存在于發現與結腸直腸腺癌相關的染色體異常的確切大小和位置。SR0s對應于以下這些區域當染色體獲得或缺失在分別的染色體區域上存在時，其總是獲得或缺失，并且因此代表其對應的染色體缺失或獲得。對于每個染色體缺失或獲得區域鑒定的SR0s在表1中提供。表1:在結腸直腸腺癌細胞中的染色體異常的最小重疊區域。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>#:SRO區域在各自染色體上的定位，依照UCSC2003年7月的HumanGoldenPath的限定。因此，本發明檢測方法的具體實施方案包括用于與結腸直腸腺癌相關的一個或多個染色體缺失/獲得區域的表1的一個或多個SR0s的檢測。染色體異常區域縮小到SROs內，允許檢測界限清楚的DNA區域。這種SRO特異性檢測可以例如通過(定量或定性)PCR來進行。PCR的特異性和靈敏度使得可以檢測僅包含微量細胞或DNA或者僅包含來自結腸直腸病變的微量基因組物質的樣品中的SROs。例如，糞便樣品可以包含從結腸直腸病變例如腺瘤性息肉中釋放的僅微量的細胞材料。根據一個具體實施方案，本發明的方法包括檢測由MLPA描述的一個或多個SROs。在這種技術中，使用在樣品DNA上彼此鄰近雜交的2種探針。其后使探針連接，并且連接的探針代替樣品通過PCR進行擴增。在具體實施方案中，選擇探針，使得鄰近探針的靶序列是在SRO內的序列。擴增產物的量反映靶序列的相對拷貝數。可替代地，可以選擇探針，使得擴增子的大小或存在/不存在指示染色體異常。MLPA允許使用同時與染色體的不同部分雜交的不同探針對(每個產生特定長度的擴增子)。因此，可以同時檢測不同SROs(Schouten等人2002，Nucl.AcidsRes.30(12)，e57)。可替代地，界限清楚的目的基因組區域的鑒定允許CGH技術的進一步改善，由此僅使用針對特定目的區域的探針。因此，在一個實施方案中，通過測定8p上命名為SR0_8p_l、SR0_8p_2、SR0_8p_3和SR0—8p—4的一個或多個或所有區域的染色體缺失來測定樣品中結腸直腸腺瘤細胞的存在。另外或可替代地，通過測定8q上命名為SR0_8q_l、SR0_8q_2、SR0_8q_3、SR0_8q_4、SR0_8q_5和SR0_8q_6的一個或多個或所有區域的染色體獲得來測定樣品中結腸直腸腺瘤細胞的存在。另外或可替代地，通過測定13q上命名為SR0_13q_lSR0_13q_2、SR0_13q_3SR0_13q_4、SR0_13q_5和SR0_13q_6的一個或多個或所有區域的染色體獲得來測定樣品中結腸直腸腺瘤細胞的存在。另外或可替代地，通過測定15q上命名為SR0_15q_l、SR0_15q_2和SR0_15q_3的一個或多個或所有區域的染色體缺失來測定樣品中結腸直腸腺瘤細胞的存在。另外或可替代地，通過測定17p上命名為SR0_17p_l和SR0_17p_2的一個或兩個區域的染色體缺失來測定樣品中結腸直腸腺瘤細胞的存在。另外或可替代地，通過測定18q上命名為SR0_18q_l和SR0_18q_2的一個或兩個區域的染色體缺失來測定樣品中結腸直腸腺瘤細胞的存在。另外或可替代地，通過測定20q上命名為SR0_20q_l、SR0_20q_2和SR0_20q_3的一個或多個或所有3個區域的染色體獲得來測定樣品中結腸直腸腺瘤細胞的存在。最特別地，本發明提供了基于檢測與結腸直腸癌的發生相關的任何染色體缺失或獲得區域是否可以在患者的基因組物質中檢測到，由此可以容易地檢測患者中的結腸直腸癌細胞的存在的方法。因此，本發明的一個具體實施方案是指用于檢測腺癌細胞的方法，其包括測定表1中提及的染色體異常8p缺失、8q獲得、13q獲得、15q缺失、17p缺失、18q缺失和20q獲得中每一種的至少一個SRO的染色體獲得或缺失。在一個非常具體的實施方案中，通過測定表1中提及的染色體異常8p缺失、8q獲得、13q獲得、15q缺失、17p缺失、18q缺失和20q獲得中每一種的所有SRO的染色體獲得或缺失來執行這種檢測。本發明的方法允許可靠檢測患者中的結腸直腸腺瘤細胞進展至腺癌細胞。10根據一個實施方案，本發明的方法包括在PCR擴增技術中通過SRO特異性引物對檢測上文描述的一個或多個SRO。SRO特異性引物對是這樣的引物對，當用于擴增基因組物質時，其將依賴是否存在涉及SRO的染色體異常(獲得/缺失)而產生不同的擴增子。當使用SRO特異性引物對時，無需使用定量PCR方法就可以鑒定一個或多個染色體獲得和/或缺失。因此，在一個進一步的方面，本發明提供了這樣的引物對，其檢測與結腸直腸腺癌相關的染色體獲得和缺失區域的一個或多個SROs的復制或缺失。更具體而言，本發明提供了表1中所示的SR0s的SRO特異性引物對。此外，本發明提供了適合于檢測根據本發明的SR0s組合，更具體而言用于檢測與結腸直腸腺癌相關的每個染色體缺失或獲得區域的一個SRO的引物對的集合。進一步的實施方案涉及包含用于檢測本發明的每一SROs的引物的引物對的集合。缺失可以定性地檢測，例如通過位于染色體缺失區域的SRO5'的正向引物和位于染色體缺失區域的SRO3'的反向引物。當該SRO的缺失(或染色體缺失)發生時，引物之間的基因組DNA的一部分不存在，并且導致比野生型(無染色體缺失)中小得多的PCR產物的產生。由具有缺失的區域擴增的PCR片段小于完整染色體的片段。此種更小的片段將優先擴增，允許非常靈敏的檢測。此外或可替代地，可以縮短PCR反應中的延伸時間，以阻止更長PCR產物的擴增。復制或染色體獲得的發生可以例如通過如表1中命名的SRO的3'區域中的正向引物和5'區域中的反向引物進行檢測。因為這些引物彼此"遠離(pointaway)"，所以在沒有復制的情況下，染色體上將不存在PCR產物。檢測缺失或復制的概念在圖1中舉例說明。通過計算長度、GC組成和引物和模板之間的序列同一性程度來測定關于與PCR引物一起使用的嚴格條件。基于預測的引物解鏈溫度，修改PCR擴增的條件。PCR反應中的嚴格性參數在很大程度上通過選擇PCR循環中的退火溫度來決定。不同軟件程序可用于在給定DNA序列中選擇具有所需解鏈溫度的PCR引物對，其是特異的且不彼此雜交，或形成發夾。任選地，通過執行所謂的嵌套式PCR增加PCR反應的特異性。用于擴增基因組DNA的試劑盒可從例如Roche或Stratagene獲得。根據另一個實施方案，本發明的方法包括通過定量PCR檢測上文描述的一個或多個SRO。使用與位于目的SRO內的序列退火的引物，樣品中這種序列的定量表達可以與對照(對照樣品中的相同區域或其他區域)進行比較。類似地，使用MLPA，可以使用靶向染色體缺失或獲得區域內的序列的引物對(MLPA)，導致反映靶序列的相對拷貝數的相對量的擴增子的產生。在本發明的上下文中鑒定的位于SR0s內的特異性靶序列，更具體而言，表1中鑒定的SROs，可以由技術人員容易地測定。盡管基本上基因組DNA的任何部分都適合于作為用于擴增的靶，但在具體實施方案中，基因的一部分，更具體而言至少一個外顯子的至少一部分用作用于擴增的靶。因此，本發明方法的具體實施方案涉及檢測樣品中的結腸直腸腺癌細胞的存在，所述方法包括定量檢測位于與結腸直腸腺癌相關的SRO內的DNA序列，更具體而言位于表1的SRO內的序列的存在。根據另一個實施方案，本發明的方法包括使用對于SR0內的序列特異的探針(SRO特異性探針)，通過基因組篩選而檢測上文描述的一個或多個SRO。類似于CGH技術，與對照基因組物質比較，包含染色體異常的基因組物質與對于SRO內的序列特異的探針集合的雜交將產生不同信號。在本發明上下文中鑒定的位于SROs，更具體而言，表l中鑒定的SROs內的基因可以由技術人員容易地測定。因此，在一個進一步的方面，本發明提供了允許在包含基因組DNA的樣品內檢測基因組物質的存在的探針，所述基因組物質包含與結腸直腸腺癌相關的染色體獲得和缺失區域的一個或多個SROs的復制或缺失。更具體而言，本發明提供了用于表1中所示的SROs的SRO特異性探針。此外，本發明提供了包含適合于檢測根據本發明的SROs組合，更具體而言適合于檢測與結腸直腸腺癌相關的每個染色體缺失或獲得區域，即在8q、13q和20q處的染色體獲得區域和在8p、15q、17p或18q處的染色體缺失區域的一個SR0的探針。進一步的實施方案涉及包含用于檢測每一個本發明的SROs的探針。因此，一般地，本發明提供了包含一種或多種寡核苷酸的試劑盒，所述寡核苷酸在嚴格條件下與SRO內的序列或與位于所述SRO邊界的3'或5'最多約1Mb的基因組序列內的序列特異性雜交，其允許特異性檢測SRO。本發明的一個進一步方面提供了針對與結腸直腸腺癌相關的染色體獲得和缺失而鑒定的SROs的標記基因。本發明的標記基因是位于與結腸直腸癌相關的染色體獲得和缺失區域內的SRO內的基因。更具體而言，本發明的標記基因是位于表l中公開的SR0s內，并且已顯示在腺瘤細胞和腺癌細胞之間具有差異表達的基因。本發明的標記基因列表在下表2中提供。這些基因是特別感興趣的，因為它們允許基因組篩選和平行表達分析。因此，本發明的一個進一步實施方案涉及用于檢測患者中的結腸直腸腺癌細胞的方法，其包括檢測表2中所示的一種或多種基因之一的基因組DNA的缺失或獲得。表2中的登記號指Genbank中的mRNA條目。基因的標識符在描述后的括號中指出。基因名或cDNA的條目得到具有不同外顯子指示的基因組序列。表2:人標記基因及其在特定SRO內的定位。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>SRO-8q-4BC030520類似于假定蛋白質F33H2.2-秀麗新桿線蟲，克隆MGC:40403IMAGE:5180533，m飄，完全cds。SRO-8q-6亂0326U翻_024035NM—032862蘭—017767NM一002346AF289596NM—012162AB051475SRO—13q_l翻—001260細胞周期蛋白依賴性激酶8(CDK8),mRM。麗—006646WAS蛋白質家族，成員3(WASF3)，mRNA。SRO-13q_2U50531NM-145293U50524NM-033111SRO—13q一3NM一024808麗-014832麗-006002畫-005358麗_012158麗-015057ML024546BC026126IVA型蛋白質酪氨酸磷酸酶，成員3(PTP4A3),轉錄變體1,mRNA。假定蛋白質MGC3113(MGC3113),mRNA。tigger轉座元件衍生的5(TIGD5)，mRNA。溶質載體家族39(鋅轉運蛋白)，成員4(SLC39A4)，m濕。淋巴細胞抗原6復合物，基因座E(LY6E)，m濕。克隆pp7882未知的mRNA。F-框和富含亮氨酸的重復蛋白質6(FBXL6),轉錄變體1,mRNA。KIAA1688蛋白質的mRNA,部分cds。BRCA2區域，mRNA序列CG030。類似于假定蛋白質FLJ20897(LOC196549)，m隨。BRCA2區域，mRNA序歹iJCG017。CG016(LOC88523),mRNA。假定蛋白質FLJ22624(FIJ22624)，m飄。TBC1結構域家族，成員4(TBC1D4),mRNA。遍在蛋白羧基末端酯酶L3(遍在蛋白巰基酯酶)(UCHL3),mRNA。4又LIM結構域7(LM07),轉錄變體l,mRNA。F-框和富含亮氨酸的重復蛋白質3A(FBXL3A)，mRNA。KUA0916蛋白質UIAA0916),mRNA。假定蛋白質FLJ13449(FLJ13449)，mRNA。4艮定蛋白質KIAA1165，克隆MGC:3415IMAGE:3027907，mRM,完整cds。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>NNL004738VAMP(液泡相關膜蛋白質)-相關蛋白質B和C(VAPB)，m飄。NNL153360假定蛋白質FU90166(FLJ90166),mRM。腿_080425GMS復合基因座(GNAS),轉錄變體3，mRM。NM—016397TH1-樣(果蠅)(TH1L),mRNA。■—006886ATP合酶，H+轉運，線粒體Fl復合物，s亞基(ATP5E)，編碼線粒體蛋白質的核基因，mRM。NM一016045染色體20可讀框45(C20orf45)，mRNA。NM一000114內皮素3(EDN3),mRNA。■-020673RAB22A，成員RAS癌基因家族(RAB22A),m飄。SRO-20q-3麗_003185TAF4RNA聚合酶II,TATA框結合蛋白質(TBP)-相關因子，135kDa(TAF4),mRM。測—014054染色體20可讀框40(C20orf40)，mRNA。測_152255蛋白酶體(前體，macropain)亞基，a型，7(PSMA7)，轉錄變體2,riRIU。■—007002粘附調節分子l(ADRM1),mRNA。BC003122克隆IMAGE:3357127，oiRNA,部分cds。■-016354溶質栽體家族21(有機陰離子轉運蛋白)，成員12(SLC21A12)，m飄。NM—018270染色體20可讀框20(C20orf20)，niRNA。NM一001853膠原，IX型，a3(COL9A3),mRNA。NM—006602轉錄因子樣5(基本螺旋-環-螺旋)(TCFL5)，mRNA。■_022105死亡相關的轉錄因子l(MTFl),轉錄變體l,mRM。■—017896染色體20可讀框11(C20orfl1),mRNA。NM—022082染色體20可讀框59(C20orf59)，mRNA。■—015666GTP結合蛋白質5(推定的)(GTPBP5),mRM。NM-144498氧基固醇結合蛋白質樣2(OSBPL2),轉錄變體2,m醒。麗一017798染色體20可讀框21(C20orf21)，mRNA。■—012384糖皮質激素調節元件結合蛋白質2(GMEB2)，mRM。■-032527^i定蛋白質FLJ14972(KIAA1847),mRNA。BC025345類似于LOC149651,克隆MGC:39393IMAGE:4862156，m飄,完整cds。翻_033405過氧化物酶體增殖活化受體A相互作用復合物285(PRIC285)，m飄。在具體實施方案中，對基因的一部分執行檢測(包含基因的至少部分內含子或外顯子的檢測)。在進一步具體的實施方案中，基因是癌基因。癌基因是在由于這種獲得而超量表達的獲得區域內的，并且其功能暗示在癌癥中的作用的基因(例如轉錄因子、細胞周期基因等)。位于染色體20q中的此種基因的例子是C20orf24、AURKA、RNPCl、THlL、ADRMl、C20orf20和TCFL5。17因此，在一個進一步的方面，本發明提供了用于特異性檢測本發明的標記基因，更具體而言表2的標記基因的引物對或探針。本發明進一步提供了包含用于特異性檢測一種或多種標記基因的引物或探針組合的引物或探針的集合，它們例如針對包含與結腸直腸腺癌相關的每個染色體異常的一種基因的標記基因的集合。進一步的實施方案涉及位于表1中鑒定的每個SRO內的標記基因的引物或探針組合。進一步的具體實施方案涉及用于檢測一種或多種標記基因的引物/探針或引物/探針集合，與腺瘤細胞比較，所述標記基因在腺癌細胞中超量表達。進一步的具體實施方案涉及用于檢測選自表2的一種或多種癌基因的引物/探針或引物/探針的集合。根據一個實施方案，根據本發明的這個方面的引物特別適合于定量PCR。根據一個進一步的實施方案，本發明的特異性探針特別適合于篩選陣列中的基因組物質。本發明的具體和優選方面在所附的獨立和從屬權利要求中闡述。適當地并且并非僅僅如權利要求中明確闡述的，來自從屬權利要求的特征可以與獨立權利要求的特征組合，并且與其他從屬權利要求的特征組合。體現本發明的系統和方法的其他安排對于本領域技術人員將是顯而易見的。應當理解盡管優選實施方案、特定構建體和構型以及材料已在本文中針對本發明的裝置進行討論，但無需背離本發明的范圍和精神即可進行形式和細節的各種變化或修飾。實施例實施例1:20q的染色體獲得區域內的最小重疊區域的測定腫瘤樣品的選擇和制備在荷蘭阿姆斯特丹的VU-大學醫學中心(VUmc)前瞻性收集41個福爾馬林固定且石蠟包埋的進展腺瘤(其中已存在癌的病灶，也稱為惡性息肉)和73個快速冷凍的結腸直腸腫瘤(37個未進展的腺瘤和36個癌癥)。所有樣品順應機構的倫理條例使用。41個惡性息肉(檔案材料)對應于38個患者(19個女性和19個男性)，因為3個患者呈現超過一個惡性息肉。患者的平均年齡是67歲(范圍45-86歲)。從這些息肉，分開分析腺瘤和癌組分，加入總共分析的82個檔案樣品(41x2)。73個冷凍樣品對應于65個患者(31個女性和34個男性)。其中，6個患者具有多發性腫瘤4個患者，多發性腺瘤和2個患者，接近于癌的1個或多個腺瘤。患者的平均年齡是69歲(范圍47-89歲)。在兩組樣品中執行陣列-CGH，并且僅對冷凍組進行表達微陣列。DNA的分離來自檔案樣品的DNA如先前詳細描述而獲得(Hermsen等人(2002)Gastroenterology,123，1109-1119)。根據供應商的說明書用TRIzol試劑(Invitrogen，Breda，NL)分離來自快速冷凍組織的DNA。在NanodropND-1000分光光度計(Isogen，IJsselstein，NL)中測量DNA濃度和純度，并且在1%瓊脂糖凝膠中評估完整性，用溴化乙錠染色。陣列CGHa)用于比較基因組雜交(CGH)的陣列的產生使用包含約5000個DNA克隆的內部印刷的全基因組BAC陣列。陣列包含具有沿1.OMb的完整基因組的平均分辨率的Sanger1Mb克隆集合、包含對應于200種癌癥相關基因的約600個克隆的OncoBac集合(Caltech)，以及選擇的獲自Children'sHospitalOaklandResearchlnstitute(CHORI)和/或獲自Sanger的til印ath克隆集合的目的克隆，以填充染色體6上大于1Mb的任何缺口，并且具有在染色體8q22-q23、11q23、13q2l_q31和20ql2_ql3上的完全覆蓋的重疊群區域。根據Snijders等人(Snijders等人(2001)NatGenet，29，263-264，通過連接介導的聚合酶鏈反應(PCR)來完成BAC克隆DNA的擴增。所有克隆在CodelinkTM載玻片(AmershamBiosciences,Roosendaal，NL)上以150mM磷酸鈉，pH8.5中1iig/iil的濃度上一式三份地印刷，該印刷使用配備SMP3針(TeleChemInternational,Sunnyvale,CA，USA)的OmniGrid100微陣列儀(GenomicSolutions,AnnArbor，MI，USA)。印刷后，載玻片根據制造商的方案(Codelink載玻片;AmershamBiosciences,Roosendaal,NL)進行力口工。b)標記和雜交300ng腫瘤和參照(從來自10個健康女性或男性個體的外周血中分離的DNA合并物)DNAs通過隨機弓l物法(BioprimeDNALabelingSystem，Invitrogen，Breda，NL)進行標記。用s印hadex柱(ProbeQuantG-50MicroColumns-AmershamBiosciences,Roosendaal,NL)完成未摻入的核苷酸的去除。Cy3標記的測試基因組DNA和Cy5標記的參照DNA進行組合，并且通過添加0.1體積的3M乙酸鈉(pH5.2)和2.5體積冰冷的100%乙醇與100iig人Cot-IDNA(Invitrogen,Breda，NL)—起共沉淀。通過在4。C下在14，000rpm下離心30分鐘來收集沉淀物。風干后，將團塊溶解于13ml酵母tRNA(100mg/ml，Invitrogen)和26ml20%SDS中，小心防止形成泡沫。在室溫下溫育15分鐘后，加入91ii1主混合物[14.3%(w/v)硫酸葡聚糖(USB)、50%(v/v)甲酰胺(Invitrogen)、2.9xSSCpH7.0(Sigma)-]，并且輕輕混合。在73。C下使DNA樣品變性10分鐘，隨后在37t:下溫育60分鐘，以允許Cot-IDNA阻斷重復序列。在雜交站(HybArrayl2TM-PerkinElmerLifeSciences,Zaventem，BE)中，使陣列在37。C下與變性且阻斷的雜交混合物溫育38小時。雜交后，在45t:在包含50X甲酰胺、2xSSC，pH7的溶液中將載玻片洗滌3分鐘，隨后為在室溫下用PN緩沖液(PN:0.1M磷酸鈉、0.l%nOnidetP40，pH8)、0.2xSSC、0.lxSSC和0.OlxSSC的1分鐘洗滌步驟。通過在室溫下在1000rpm下離心3分鐘使載玻片干燥。c)檢領lj陣列的圖像通過掃描(AgilentDNAMicroarray掃描儀G2505B-Agilenttechnologies,PaloAlto，USA)而獲得，并且Imagene5.6軟件(BiodiscoveryLtd,MarinadelRey，California)用于自動特征提取(2個通道Cy3和Cy5的每個點的點分段以及信號和背景強度的定量)。使用不良質量點的減弱的缺省設置。MicrosoftExcel圖表用于從測試和參照DNA的信號中值強度中扣除局部背景。對于每個BAC克隆計算一式三份點的中值，并且通過扣除染色體1-22上的BAC克隆的模式值來標準化21og比值(腫瘤/正常參考信號)。如果3個點的強度的標準差大于0.2，那么克隆從進一步的分析中排除。此外，在所有腫瘤中具有超過20%漏失值的克隆也從進一步的分析中排除。考慮來自UCSC2003年7月的HumanGoldenPath的限定的克隆位置，完成所有19后續分析。d)數據分析拷貝數分段為了對DNA拷貝數變化(獲得和/或缺失)分段，應用平滑算法"aCGH-Smooth"(Jong等人(2004)Bioinformatics,20，3636-3637)。平滑的21og比值-O.15和0.15用作閾值，基于對于15個正常與正常雜交獲得的99%置信區間(99%CIs)。僅包括覆蓋至少3個鄰接BAC克隆的獲得和缺失。當21og比值超過1.0時，調用擴增。在修飾版本的ArrayCGHbase(Menten等人(2005)BMCBioinformatics，6，124)中對DNA拷貝數數據評分。測定每個病例的中值絕對偏差(MAD)，作為評估陣列CGH質量的參數。簡言之，計算來自所有常染色體的所有log2比值的中值，然后對于每個比值計算與中值的距離，并且最后所有距離的中值得到MAD值(deWiel，未公開的數據)。進一步分析僅具有MAD<0.2的病例。陣列-CGH概況在ArraCGHbase中得到顯現，并且輸出不同輸出文件用于下游應用。鄉充i備斤使用TIGR多實驗觀察器(TMev)完成非監督聚類分析，其中應用完全連鎖且使用Euclidian距離作為量度。對于監督分析，使用CGHMultiArray(vandeWiel等人(2005)Bioinformatics,21，3193-3194)比較兩個組。對于相同腫瘤(腺瘤和來自相同進展的腺瘤內的癌組分)內的病變之間的配對分析，并且基于對于平局進行校正的Wilcoxon符號秩檢驗使用修改版本的CGHMultiArray。為了測定染色體20上的獲得的最頻繁最小重疊區域(SRO)，在所有病例中，使用STAC-異常拷貝數的顯著性檢驗(Diskin等人(2006).GenomeRes.16，1149-1158.)。結果如本發明中公開的SR0s的測定在本文中針對在20q處的染色體獲得區域詳細舉例說明。先前通過CGH分析的(上文引用的Hermsen等人(2002)前41個進展的腺瘤(惡性息肉)通過陣列-CGH進行分析，以便使20q上的獲得區域變窄。如其中所述，我們分開分析惡性息肉的腺瘤和癌組分的DNA拷貝數變化。在>20%的病例中觀察到lp、4、8p、14q、15q、17p和18的缺失以及lq、6p、7、8q、13q、17q、19p、20q和22q的獲得，其中8p和18缺失以及13q和20q獲得是最頻繁的，在超過35X的病例中發生。單獨的染色體20獲得在超過60%的病例中發生。在基因組范圍，拷貝數變化模式在進展的腺瘤中的腺瘤和癌組分之間并無不同，即在癌組分中發現的異常已存在于腺瘤組分上，盡管具有較低頻率或幅度。接下來，分析37個非進展的腺瘤和36個癌癥的拷貝數變化。在73個腫瘤中，67個(34個腺瘤和33個癌癥)顯示高質量基因組概況(對應于8%的中途退出)，由此顯示結果。在腺瘤中，異常的頻率明顯極低。相比之下，癌顯示頻繁的(>20%的病例)^、4、8p、14q、15q、17p和18缺失以及lq、6p、7、8q、13q、17q、19p、20q和22q獲得，其中8p和18缺失以及13q和20q獲得在超過35%的病例中存在(如在進展的腺瘤中)。染色體20獲得在小于15%的腺瘤但超過60%的癌中發生，主要影響整個染色體或長臂，如在進展的腺瘤中。這67個腫瘤(非進展的腺瘤和癌)在DNA拷貝數概況上的等級聚類顯示癌和腺瘤明顯分成2個不同聚類，分別為聚類1和2，其中)^檢驗p〈0.001。在搜索非進展的腺瘤和癌之間顯著不同(P<0.05)的那些DNA拷貝數變化中，觀察到4q、8p、8q、13q、15q、18和20是相關區域，其中在20q上的基因座最顯著不同(p<0.00001)。為了測定具有在結腸直腸癌進展中具有作用的假定癌基因的20q內的最相關區域，將STAC應用于石蠟包埋的惡性息肉(n=41)和冷凍癌(n=33)的組合集合。這些樣品的分析揭示在20q上的異常拷貝獲得的3個相關區域，1個跨4Mb(32-36Mb)，1個跨3Mb(56-59Mb)，并且第3個跨2Mb(61_64Mb)。這3個區域(最小重疊區域-SRO's)仍分別包含80、35和94種基因。這對應于表1中對于20q列出的SR0s。對于與腺癌相關的其他染色體異常區域執行類似分析，并且對于這些區域中的每一個所鑒定的SR0s也在表1中提供。實施例2:微陣列表達分析為了研究染色體不穩定性對結腸直腸腺瘤至癌進展中基因表達的影響，對一系列68個結腸直腸腫瘤(37個非進展的腺瘤和31個癌)，通過陣列-CGH，分析整個基因組拷貝數變化，并且通過微陣列分析，分析表達水平。對于最頻繁發生類型的染色體異常即20q獲得，鑒定了在結腸直腸癌的進展中發揮作用的假定癌基因。在表2中，提供了位于表1的SROs內的基因的概述，當比較結腸直腸腺瘤和腺癌組織時，如通過來自活組織檢查物或切除物樣品的mRNA的微陣列分析測定的，發現其具有顯著不同的表達(FDR<0，1(假測定率))。2權利要求用于檢測患者中結腸直腸腺癌細胞的存在的體外方法，所述方法包括下述步驟檢測所述患者的測試樣品的基因組DNA中至少一個最小重疊區域(SRO)的獲得或缺失的存在，其中所述SRO選自-染色體8p上的SRO_8p_1、SRO_8p_2、SRO_8p_3和SRO_8p_4，和/或-染色體8q上的SRO_8q_1、SRO_8q_2、SRO_8q_3、SRO_8q_4、SRO_8q_5和SRO_8q_6，和/或-染色體13q上的SRO_13q_1、SRO_13q_2、SRO_13q_3、SRO_13q_4、SRO_13q_5和SRO_13q_6，和/或-染色體15q上的SRO_15q_1、SRO_15q_2和SRO_15q_3，和/或-染色體17p上的SRO_17p_1和SRO_17p_2，和/或-染色體18上的SRO_18q_1和SRO_18q_2，和/或-染色體20q上的SRO_20q_1、SRO_20q_2和SRO_20q_3，其中一個或多個所述SROs的獲得或缺失的存在指示所述患者中結腸直腸腺癌細胞的存在。2.根據權利要求l的方法，其中所述檢測包括每個染色體缺失或獲得區域的至少一個SRO的獲得或缺失，即在8q、13q和20q處的染色體獲得以及在8p、15q、17p和18q處的染色體缺失的檢測。3.根據權利要求l的方法，其中所述檢測包括至少一個染色體區域的所有所述SROs的獲得或缺失的檢測。4.根據權利要求l的方法，其中所述檢測包括每個列出的染色體區域的所有所述SROs的獲得或缺失的檢測。5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述染色體獲得或缺失的檢測使用比較基因組雜交來執行。6.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述染色體獲得或缺失的檢測通過位于所述一個或多個SROs中的至少部分基因的定量PCR檢測來執行。7.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述SRO的染色體缺失的檢測通過PCR反應來執行，所述PCR反應使用包含位于所述SRO5'的正向引物和位于所述SRO3'的反向引物的SRO特異性引物對。8.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述SRO的染色體獲得的檢測通過PCR反應來執行，所述PCR反應使用所述SR0的3'區域中的正向引物和所述SR0的5'區域中的反向引物。9.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述SRO的染色體獲得或缺失的檢測使用多重連接依賴性探針擴增(MPLA)來執行。10.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述測試樣品是結腸直腸腫瘤切除物或活組織檢查物。11.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述測試樣品是糞便樣品。12.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述測試樣品是組織或液體的樣品，所述液體選自血液、尿、唾液和結腸液。13.根據權利要求1-12中任一項的方法用于診斷結腸直腸腺瘤進展至腺癌的用途。14.用于檢測染色體缺失或復制的試劑盒，對于表l中所示的每個染色體區域的一個或多個SROs，所述試劑盒包含在嚴格條件下與所述SRO內的序列或者與位于所述SRO邊界3'或5'最多約lMb的基因組序列內的序列特異性雜交的一種或多種寡核苷酸。15.根據權利要求14的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸是SRO特異性PCR引物對。16.根據權利要求14的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸是一種或多種SRO特異性探針。17.根據權利要求14的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸是特異性擴增SRO內的核苷酸序列的引物對。18.根據權利要求17的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸是各自特異性擴增表2的標記基因序列的引物對。19.根據權利要求14-18中任一項的試劑盒用于體外測定結腸直腸病變的遺傳物質中的染色體異常的用途。20.根據權利要求14-18中任一項的試劑盒用于體外測定結腸直腸腺瘤進展至腺癌的用途。全文摘要本發明公開了用于在基因水平上可靠檢測患者中的腺癌細胞的存在的方法和工具。本發明對與腺瘤進展至腺癌細胞相關的染色體異常區域精細作圖，并且提供基于其的檢測方法和工具。文檔編號C12Q1/68GK101711285SQ200880011087公開日2010年5月19日申請日期2008年3月31日優先權日2007年4月5日發明者B·平托莫賴斯德卡瓦爾霍,G·A·梅杰申請人:基督教高等教育科學研究及病人護理協會