專利名稱：：利用重組微生物生產生物燃料的制作方法
技術領域：
：本發明提供代謝修飾微生物以及生產這種微生物的方法。還提供通過利用合適的底物與代謝修飾微生物及其酶制劑接觸生產生物燃料的方法。
背景技術：
：由于經濟和環境問題，用生物燃料代替石油的需求日益增長。常見的生物燃料如乙醇并不是一種理想的燃料，因為它的能量密度比汽油低，并且必須在限定的濃度范圍內與汽油混合，才能作為運輸用燃料。乙醇還具有吸濕性和腐蝕性，這就造成了貯存和配送系統方面的問題。
發明內容本發明提供一種能夠產生選自下組的醇類的重組微生物(a)正丙醇；(b)異丁醇，其產率為每克葡萄糖產生約0.12至0.41g異丁醇；(c)正丁醇;(d)2-曱基-l-丁醇；(e)3-曱基-l-丁醇;和(f)2-苯基乙醇，這種醇類從包含2-酮酸的代謝物中產生。在一實施方案中，該微生物經過112小時左右的培養，產生的乙醇不到240mg/L。在另一實施方案中，在相似條件下培養時，該微生物的乙醇生產曲線與被命名為SA237或CRS-BuOH23的微生物的生產曲線基本相同。在另一實施方案中，經過大約16至64小時的培養，異丁醇的產率約為每克葡萄糖產生約0.33至0.36g異丁醇，或每克葡萄糖產生約0.36至0.40g異丁醇。還有一實施方案中，每克葡萄糖的乙醇產率不足0.0037g/g左右。在一實施方案中，與親本微生物相比，該微生物的乙醇生產能力較低。在另一實施方案中，該微生物將乙酰輔酶A轉化為乙醇的能力降低或受到抑制。在另一實施方案中，重組微生物的乙醇脫氳酶含量減少，因此，其乙醇生產能力降低。在一實施方案中，該微生物能夠表達將丙酮酸轉化為a-酮異戊酸的酶或增加此酶的表達。在另一實施方案中，此酶是2-酮酸脫羧酶(例如，Pdc、Pdcl、Pdc5、Pdc6、ArolO、Thi3、Kivd、KdcA和前迷各種酶的同源體或變體，以及與前迷任何一種酶有至少6()0/0同一性且具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽)。在另一實施方案中，2-酮酸脫羧酶由一種多聚核苷酸編碼，這種多聚核苷酸與選自下組的一種核酸有60%的同一性；x/c、、/&5、、ara7^A/'3、h'v丄fe/d和前述各種基因的同源基因或變體，或它們的片段，其中這種多聚核苷酸編碼具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。在一個具體實施方案中，2-酮酸脫羧酶由一個源自A:/W基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。在一實施方案中，與其親本微生物相比，此微生物能夠增加2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性。在一實施方案中，醇脫氫酶選自下組Adhl、Adh2、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、Sfal和前述各種酶的同源體或變體，以及與前述任何一種酶有至少60%同一性并具有醇脫氬酶活性的多肽。在另一實施方案中，醇脫氫酶由一種多聚核苷酸編碼，這種多聚核苷酸與選自下組的一種核酸有至少60%同一性、^/2、oW3、"W4、aW5、^//6、s/a7基因和前述各種基因的同源基因或變體，其中這種多聚核苷酸編碼具有2-醇脫氫酶活性的多肽。在一實施方案中，此重組微生物的一個基因發生一處或多處缺失或敲除，這個基因編碼的酶能夠催化乙酰輔酶A轉化為乙醇；催化丙酮酸酯轉化為乳酸酯；催化延胡索酸酯轉化為琥珀酸酯；催化乙酰輔酶A和磷酸酯轉化為輔酶A和乙酰磷酸；催化乙酰輔酶A和曱酸酯轉化為輔酶A和丙酮酸酯，乙酰輔酶A的乙酰基和3-曱基-2-氧代丁酸酯(2-氧代異戊酸酯)的縮合反應，2-異丙基蘋果酸酯和3-異丙基蘋果酸酯的異構化反應；催化a-酮酸轉化為支鏈氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；催化丙酮酸酯轉化為乙酰輔酶A;催化生成支鏈氨基酸；催化蘇氨酸生成a-酮丁酸酯的反應；催化蛋氨酸生物合成的第一步反應；以及催化蘇氨酸的代謝。例如，這種微生物可能包15/7to、z^/JS、/ew丄/ew5、/ewC、/ew/XWvii"、，6pox8,,7vB,z'/v/>//vj.meL4、礎、前述各種基因的同源基因及自然產生的突變。在一個具體實施方案中，此微生物的基因型選自下組(a)選自下組基因的一種缺失或敲除，選自一組基因，這組基因包括AadhE、AldhA、Apta、AleuA、AleuB、AleuC、AleuD、ApoxB、AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生正丙醇；(b)選自下組基因的一種缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AleuA、AilvE、ApoxB、AilvA及其任4可組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生異丁醇；(c)選自下組基因的一種缺失或敲除AadhE、AldhA、Apta、ApoxB、AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生正丁醇；(d)選自下組基因的一種缺失或敲除AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生2-甲基-l-丁醇；(e)選自下組基因的一種缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afor、Apta、ApflB、AilvE、AtyrB及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生3-曱基l-丁醇；和(f)選自下組基因的一種缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AleuA、厶ilvE、ApoxB、AilvA及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生2-苯基乙醇。在另一實施方案中，ThrABC包含抗反饋抑制的ThrA*。在一實施方案中，此重組微生物含有被命名為SA237或CRS-BuOH23的微生物的表型。本文提供的是代謝修飾微生物，其包括生化重組途徑，該途徑利用合適的底物，通過代謝工程微生物生產生物燃料，包括異丁醇、2-曱基-1-丁醇、3-曱基-l-丁醇、2-苯基乙醇、正丙醇或正丁醇等。本發明還提供利用本文描述的微生物生產生物燃料的方法。在一實施方案中，提供了產生一種醇類的重組微生物。該醇類可以是正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-曱基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。通常情況下，可利用含有2-酮酸的代謝物并以發酵或非發酵方式(即在有氧或無氧條件下)生產醇類。在某些方面，2-酮酸包含2-酮丁酸、2-酮異戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸、2-酮基-4-甲基戊酸或苯丙酮酸。在其他方面，與其親本微生物相比，此重組微生物增加2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性。2-酮酸脫羧酶可能是來自釀酒酵母(Sacc/wrawycescereWw'ae)的Pdc6、或ArolO、或Thi3;來自H酸吝'U求菌(丄actococow/(3c"力的Kivd;來自丙酮丁醇才發菌(C7o^/-,'<i/Mmaceto/M(y/〖'cw/w)的Pdc,或它們的同源體。2-酮酸脫羧酶可以由源自以下一種基因的多聚核苷酸編碼來自釀酒酵母的尸DC6、來自釀酒酵母的y4WO/0、來自釀酒酵母的來自乳酸乳球菌的hV丄來自丙酮丁醇梭菌的，或它們的同源基因。在某些方面，醇脫氫酶可能是來自釀酒酵母的Adh2或其同源基因，由源自釀酒酵母y4D//2基因的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，提供了一種產生異丁醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含增加乙酰鞋酸合成酶、乙酰羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶以及醇脫氬酶的表達或活性。在某些方面，此微生物能夠包含增加乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶以及醇脫氫酶的表達。在某些方面，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的丙酮酸酯。因此，此重組微生物還可以含有at/Z五、/J/k/W、>r、/^8、ac/bl或/to基因或它們的任何組合的基因缺失或表達抑制。特別是，此重組微生物能夠含有單獨的ad/KW/2、/W基因缺失或與/"r、/m"和；to、pto和組合的基因缺失。在某些方面，此重組微生物還可以含有其基因組的部分缺失，例如缺失大腸桿菌(Eco/,)基因組中約1,397,551個到約1,439,877個的核苷酸。一方面，乙酰羥酸合成酶可由源自以下基因的多聚核苷酸編碼//v/i/操縱子、,7vfflV操縱子、大腸桿菌的,7vGM、來自枯草芽孢桿菌的a/'"基因，或它們的同源基因。z7v///操縱子的/:/v/基因編碼乙酰羥酸合成酶的大亞基多肽，,/v///操縱子的/:/v/f基因編碼乙酰羥酸合成酶的小亞基多肽。另一方面，乙酰鞋酸還原異構酶可由源自大腸桿菌,7vC基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另夕卜，二羥酸脫水酶可由源自z7vD基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，2-酮酸脫羧酶可由源自以下基因的多聚核苷酸編碼乳酸乳球菌的A:m/基因或其同源基因，或釀酒酵母的JW(9^基因或其同源基因。另一方面，醇脫氬酶可由源自釀酒酵母的基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。通常，大腸桿菌的//v///操縱子編碼乙酰羥酸合成酶，這是異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸生物合成途徑中的第一個酶。乙酰羥酸合成酶III同功酶由兩個亞基組成，即,7v/基因產物(乙酰羥酸合成酶III的大亞基)和z/v//基因產物(乙酰羥酸合成酶的小亞基)，能夠催化大腸桿菌K-12中異亮氨酸、亮氨酸及纈氨酸生物合成的共同第一步反應。大腸桿菌的,/vC基因編碼乙酰幾酸還原異構酶，這是平行進行的異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑中的第二個酶。大腸桿菌的z/vD基因編碼二輕酸脫水酶，這是異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑中的第三個酶。在某些方面，此重組微生物包含乙酰乳酸合成酶的表達增加。乙酰乳酸合成酶可來自枯草芽孢桿菌(^7C/〃WA'wtoto)的AlsS。在一實施方案中，提供了一種產生正丁醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含2-異丙基蘋果酸合成酶、P-異丙基蘋果酸脫氫酶、異丙基蘋果酸異構酶和蘇氨酸脫水酶的表達或活性增加。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的2-酮基戊酸。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有較低水平的2-酮異戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸或2-酮基-4-甲基戊酸或它們的任何組合。因此，與其親本微生物相比，此微生物還可含有,7vD基因缺失或表達受抑制。一方面，2-異丙基蘋果酸合成酶可由源自/e^4基因的多聚核苷酸或其同源體編碼。另一方面，P-異丙基蘋果酸脫氫酶可由源自基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，異丙基蘋果酸異構酶可由源自/ewCD凍效f4真^源凍效f的多聚核苷酸編碼。通常，/^0)操縱子的/^C基因編碼異丙基蘋果酸異構酶的大亞基多肽，/wCZ)操縱子的/wD基因編碼異丙基蘋果酸異構酶的小亞基多肽。另一方面，蘇氨酸脫水酶可由源自z/"基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，蘇氨酸脫水酶可由源自基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還可含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶、蘇氨酸脫水酶或它們的任何組合的表達或活性的增加。在某些方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氬酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶或蘇氨酸脫水酶分別由源自以下基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼；/7c,;^c、<35pC、^wv4、asd、^rB、欲rC、</<x45和f<io8基因。在一實施方案中，提供了一種產生正丙醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含a-異丙基蘋果酸合成酶、問號鉤端螺旋體(Ze/to^ra/"fewg""》的LeuB、異丙基蘋果酸異構酶和蘇氨酸脫水酶的表達或活性的增加。一方面，a-異丙基蘋果酸合成酶可由源自基因或其同源基因的多聚核香酸編碼。cz7w^基因可能是問號鉤端螺旋體的c/mX基因或詹氏甲烷暖球菌(Mw/zawoca/tfococci^_y'aw/twc/'/)的cz'w^4基因。另一方面，P-異丙基蘋果酸脫氫酶可由源自/ew萬基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，異丙基蘋果酸異構酶可由源自/^Q)桊教f戚岸河源模z欲f的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還可含有以下酶的表達或活性的增加磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氬酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶或蘇氨酸脫水酶，或它們的任何組合。在某些方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氬酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶或蘇氨酸脫水酶分別由源自以下基因的多聚核苷酸編碼ppc、；少c、aspC、AM、as'd、ArC、■/a4B和基因，或其同源基因。在另一實施方案中，提供了一種產生2-甲基-l-丁醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含蘇氨酸脫水酶、乙酰鞋酸合成酶、乙酰羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性的增加，并產生2-曱基l-丁醇。在某些方面，蘇氨酸脫水酶可由源自z/v^f基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，蘇氨酸脫水酶可由源自^fe5基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的2-酮基-3-甲基戊酸。另一方面，2-酮酸脫羧酶可由源自以下基因的多聚核苷酸編碼A:zW基因或其同源基因；尸DC6基因或其同源基因；基因或其同源基因。在另一實施方案中，提供了一種產生3-甲基-l-丁醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含乙酰羥酸合成酶或乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶，2-異丙基蘋果酸合成酶、異丙19基蘋果酸異構酶、(3-異丙基蘋果酸脫氬酶、2-酮酸脫羧酶以及醇脫氫酶的表達或活性的增加。在某些方面，乙酰羥酸合成酶可由源自//V///模效子或其同源操縱子的多聚核苷酸編碼。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自"/"基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自//vMG操縱子或其同源操縱子的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的2-酮異己酸。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自z/vAW操縱子或其同源操縱子的多聚核苷酸編碼。在另一個實施方案中，提供了一種生產苯基乙醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶、分支酸變位酶T/預苯酸脫氬酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性的增力口。另一方面，分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶可由源自p力"基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，分支酸變位酶T/預苯酸脫水酶可由源自(y^基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的苯丙酮酸。在一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為正丁醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物的方法2-異丙基蘋果酸合成酶活性、j3-異丙基蘋果酸脫氫酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性和蘇氨酸脫水酶活性。在另一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為異丁醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物乙酰羥酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二輕酸脫水酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。在另一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為正丙醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物a-異丙基蘋果酸合成酶活性、P-異丙基蘋果酸脫氫酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性和蘇氨酸脫水酶活性。在一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為2-曱基-l-丁醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物蘇氨酸脫水酶活性、乙酰羥酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二鞋酸脫水酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。在另一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為3-甲基-l-丁醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物乙酰鞋酸合成酶活性或乙酰乳酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-異丙基蘋果酸合成酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性、(3-異丙基蘋果酸脫氫酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。圖1A-C描述了有助于了解本發明的反應途徑。(A)描述了利用2-酮酸代謝生產醇類的一條代表性非發酵合成途徑。(B)描述了基因工程大腸桿菌中醇類化合物的代表性生成途徑。灰色箭頭代表2-酮酸降解途徑。酶、LeuABCD、IlvA和IlvIHCD代表氨基酸生物合成途徑。雙線代表氬基酸生物合成途徑的副反應。(C)描述了微生物的一般反應途徑，并標出了這個生物體內可被破壞或敲除的酶，以增加所需反應方向的通量(例如增加合成丙酮酸的通量，減少流向其他竟爭性途徑的丙酮酸通量)。圖2A-C描述了經修飾的氨基酸生物合成途徑，以改進異丁醇和正丁醇的生產。A圖顯示了經改造的,7v///G9途徑存在或不存在的情況下異丁醇的產量。左邊區域異丁醇產量；右邊區域每克葡萄糖的異丁醇產率。異丁醇的最高產率的理論值為0.41g/g。B圖顯示了經改造的//vv4-/eW6CD途徑存在或不存在的情況下由葡萄糖獲得正丁醇的產量。左邊區域正丁醇產量；右邊區域相同菌抹的正丙醇產量。圖C顯示了加入L-蘇氨酸時的正丁醇產量。左邊區域正丁醇產量；右邊區域相同菌抹的正丙醇產量。圖3描述了異丁醇對細胞生長的影響。上面顯示含有或不含有2%異丁醇時，野生型菌林和高耐受性突變菌抹的細胞生長時間過程。兩種菌林在LB培養基中都生長到指數期。在OD,為3.5時，向培養基加入2%異丁醇。三角形未加異丁醇的野生型菌林；菱形添加異丁醇的野生型菌林；方形未添加異丁醇的高耐受性突變菌抹；圓形添加異丁醇的高耐受性突變菌林。圖4描述了大腸桿菌中異丁醇的代表性生產途徑。圖5描述了異丁醇產量的質譜分析檢測結果。圖6描迷了質鐠分析數據。圖7描述了由丙酮酸生成2-酮基異戊酸的代表性途徑。圖8描述了亮氨酸的代表性生物合成途徑。圖9描述了異亮氨酸的代表性生物合成途徑。圖10描述了以2-酮基丁酸為中間產物的丁醇代表性生物合成途徑。圖11描述了由丙酮酸生成丁醇的代表性生物合成途徑。圖12描述了以蘇氨酸為中間產物的丁醇代表性生物合成途徑。圖13描述了生產異丁醇類化合物(例如，2-曱基丙基醇)、3-甲基-l-丁醇、正丁醇、乙醇、2-甲基-l-丁醇和正丙醇的代表性生物合成途徑。圖14描述了生產苯基乙醇、乙醇、3-甲基-l-丁醇和異丁醇類化合物(例如2-甲基丙基醇)的代表性生物合成途徑。圖15描述了源自A:,vc/基因的核酸序列(序列ID號27)，此基因編碼具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。圖16描述了源自尸DQ5基因的核酸序列(序列1D號29),此基因編碼一段具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。圖17描述了源自爿i^M基因的核酸序列(序列ID號31)，此基因編碼一段具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。圖18描述了源自基因的核酸序列(序列ID號33)，此基因編碼一段具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。圖19描述了源自基因的核酸序列(序列ID號35)，此基因編碼一段具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。圖20描述了源自v4D//2基因的核酸序列(序列ID號37)，此基因編碼一段具有醇脫氬酶活性的多肽。圖21描述了源自,7v/基因的核酸序列(序列ID號39),此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶大亞基活性的多肽。圖22描述了源自Z/v7/基因的核酸序列(序歹'JID號41),此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶小亞基活性的多肽。圖23描述了源自,7vC基因的核酸序列(序列ID號43)，此基因編碼一段具有乙酰羥酸還原異構酶活性的多肽。圖24描述了源自z7vZ)基因的核酸序列(序列ID號45),此基因編碼一段具有二羥酸脫水酶活性的多肽。圖25描述了源自,7"基因的核酸序列(序列ID號47)，此基因編碼一段具有蘇氨酸脫水酶活性的多肽。圖26描述了源自/e"基因的核酸序列(序列ID號49)，此基因編碼一段具有2-異丙基蘋果酸合成酶活性的多肽。圖27描述了源自基因的核酸序列(序列ID號51)，此基因編碼一段具有P-異丙基蘋果酸脫氫酶活性的多肽。圖28描述了源自/cC基因的核酸序列(序列ID號53)，此基因編碼一段具有異丙基蘋果酸異構酶大亞基活性的多肽。圖29描述了源自/o/Z)基因的核酸序列(序列ID號55),此基因編碼一段具有異丙基蘋果酸異構酶小亞基活性的多肽。圖30描述了源自基因的核酸序列(序列ID號57)，此基因編碼一段具有a-異丙基蘋果酸合成酶活性的多肽。圖31描述了源自//vM基因的核酸序列(序列ID號59)，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶大亞基活性的多肽。圖32描述了源自,7W基因的核酸序列(序列ID號61)，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶小亞基活性的多肽。圖33描述了源自z7wV基因的核酸序列(序歹'JID號63),此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶大亞基活性的多肽。圖34描述了源自//v8基因的核酸序列(序列ID號65)，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶小亞基活性的多肽。圖35描述了源自at//2/^基因的核酸序列(序列ID號67)，此基因編碼一段具有醇脫氮酶活性的多肽。圖36描述了源自基因的核酸序列(序列ID號69),此基因編碼一段具有a-異丙基蘋果酸合成酶活性的多肽。圖37描述了源自丄"raC基因的核酸序列(序列ID號71)，此基因編碼一段具有異丙基蘋果酸異構酶大亞基活性的多肽。圖38描述了源自基因的核酸序列(序列ID號:73)，此基因編碼一段具有異丙基蘋果酸異構酶小亞基活性的多肽。圖39描述了源自基因的核酸序列(序歹'JID號:75),此基因編碼一段具有P-異丙基蘋果酸脫氫酶活性的多肽。圖40描述了源自p/ev4基因的核酸序列(序列ID號77),此基因編碼一段具有分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶活性的多肽。圖41描述了源自7>M基因的核酸序列(序列ID號79)，此基因編碼一段具有分支酸變位酶T/預苯酸脫水酶活性的多肽。圖42描述了源自"/aS基因的核酸序列(序列ID號81),此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶活性的多肽。圖43描述了不同微生物的敲除突變與異丙酸產量間的相關性。圖44描述了對普通搖瓶與帶螺旋蓋燒瓶內異丁醇產量的比較。圖45描迷了超過200小時的分批補料過程中，添加不同的復合培養基組分對異丁醇產量的影響。圖46顯示了從葡萄糖轉化為3-甲基-l-丁醇的代謝途徑。除另有注明外，所有基因均來自大腸桿菌。BS二枯草芽孢桿菌；LL二乳酸乳球菌；SC=釀酒酵母。圖47A-B顯示了3-甲基-l-丁醇的初期產量。方格柱形代表異丁醇；實心柱形代表3-甲基-l-丁醇。(A)JCL16中3-甲基-l-丁醇的產量。對攜帶ilvffl(EC)或alsS(BS)基因并具有leuABCD基因染色體或質粒表達的菌林進行了醇產量測定。(B)JCL260中3-曱基-l-丁醇的產量。對攜帶ilvIH(IAA92)或alsS(IAA85)基因的菌林進行了醇產量測定。圖48A-B是描述a-酮酸產量的圖表。方格柱形代表2-酮異戊酸；實心柱形代表2-酮基異己酸。(A)JCL260背景下a-酮酸的產量。對菌抹的2-酮異戊酸(異丁醇)和2-酮基異己酸(3-甲基-l-丁醇)的產量進行了測定。改變RBS僅用于leuA基因產物(IPMS)。(B)L-亮氨酸合成敲除背景中a-酮酸的產量。'△，表示缺失。圖49A-B顯示了消除反饋抑制后3-甲基-l-丁醇的產量。(A)對含有WTIPMS(IAA88)和IPMS(G462D)(IAA89)的JCL260宿主的生長和醇產量進行了比較。(B)對JCL260AilvEAtyrB(IAA69)背景中含有WTIPMS(IAA90)菌林的生長和醇產量進行了定量檢測。圖50是基因工程大腸桿菌內由蘇氨酸生成丙醇和丁醇的生物合成途徑示意圖。圖中描述了特定途徑的中斷；空心矩形框表示醇產物的前體。圖中還描述了非正常的正纈氨酸途徑，以及纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和蛋氨酸(這些氨基酸分別以縮寫形式寫在灰色框中)的生物合成途徑。圖51顯示了thrA*BC的過度表達對BWWT中醇和主要代謝產物的影響，并顯示了CRS-BuOH12(實心菱形)和CRS-BuOH31(空心菱形)中丙醇、丁醇、主要副產物、微生物生長及葡萄糖消耗的時間過程。CRS-BuOH12和CRS-BuOH31均為BWWT菌林。CRS-BuOH31含有pSA62和pSA55T，CRS-BuOH12還含有另外的質粒pCS49,此質25粒攜帶的thrA*BC位于PLlacOl后。按照本發明所迷的材料和方法培養細胞。圖52A-B對各種敲除菌林的醇產量進行了比較。A.菌才朱被從左到右依次編號為CRS-BuOH12、32、2、11、23。所有菌林均包含pCS49、pSA62和pSA551質粒。如本文所述，將細胞培養72小時。圖中所示為第72個小時時間點的數據。B.A圖中顯示的各菌林生長時間過程。圖53對采用替代性抗反饋蘇氨酸脫水酶和2-異丙基蘋果酸合成酶生產的丙醇和丁醇的產量進行了比較。比較時采用BWAmetA、Atdh、AilvB、Ailvl作為背景菌抹。各菌抹被編號為CRS-BuOHll、18、19、20，除圖中所示的質粒外，所有菌林還含有pSA62和pSA551質粒。質粒編號下方為表達特定的蘇氨酸脫水酶和2-異丙基蘋果酶的基因名稱。如本文所述，將細胞培養72小時。圖中所示為第72個小時時間點的數據。圖54A-E顯示了CRS-BuOH23中丙醇、丁醇和代謝副產物的時間過程。A.正丙醇和正丁醇的產量。實心菱形代表丁醇，空心菱形代表丙醇。B.主要副產物醋酸的產量。C次要副產物丙酮酸、乳酸和乙醇的產量。實心菱形代表丙酮酸，空心方塊代表乳酸，交叉符號代表乙醇。D.葡萄糖的消耗過程。E.CRS-BuOH23在100小時內的生長過程。每張圖里類似的參考符號代表類似的要素。具體實施例方式除非文中另有明確說明，否則，本文及隨后所附的權利要求中使用的表示單數含義的"一種"、"和"及"此"等詞語也包含復數指代。因此，例如提到"一種多聚核苷酸"時，也包含多種這樣的多聚核香酸；當提到"此微生物"時，也指一種或多種微生物等等。除非另有說明，本文中使用的所有技術術語與科學術語均與本發明所屬
技術領域：
的技術人員通常理解的意思相同。雖然與本文所述的方法和材料相似或相當的方法和材料也能用于本發明公開的方法和成分中，但是本文描述的是代表性方法、裝置和材料。的內容。本文不得^皮視為發明人無權憑借先有公開內容而先于這樣的公開。丁醇是疏水性化合物，其揮發性比乙醇差。正丁醇的能量密度與汽油接近。濃度為85%的丁醇可用于汽車，并且不需對發動機做任何改動(與乙醇不同)，它產生的動力比乙醇大，幾乎與汽油相同。丁醇也被作為溶劑用于化學和紡織工藝、有機合成以及用作化學中間體。丁醇還被作為液壓制動液中的一種成分使用，以及作為基礎成分用于香水中。與乙醇相比，異丁醇具有優點且和正丁醇相同。此外，由于異丁醇帶有分支碳鏈，所以其辛烷值比正丁醇高，正丁醇作為發酵產物生產，并用作發動機燃料。雖然異丁醇已被用作發動機添加劑，但是還不能以高產率由可再生資源生產出異丁醇。異丁醇尚未被考慮作為汽油的替代品。能夠生產正丁醇的天然菌種如丙酮丁醇梭菌，還能生產出作為發酵產物的諸如丙酮、乙醇及丁酸等副產物。但是，這些微生物較難操控，其基因操控工具不如大腸桿菌等易操控的宿主的基因操控工具有效，而且對它們的生理學和代謝調節的了解也較少，因此阻礙了其高效生產的步伐。此外，雖然已在微生物代謝副產物中發現少量的其他高級醇，例如異丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和2-苯基乙醇，但是尚未發現可以由葡萄糖生成并能夠達到工業利用量的高級醇的天然菌種。通過各種酵母菌(包括釀酒酵母)生產異丁醇和其他雜醇，這對酒精飲料制造商頗具吸引力。對酒精飲料而言，雜醇通常屬于不期望的異常成分。用野生型酵母菌生產異丁醇已經在各種培養基上證實過，這些培養基包括制酒過程中的葡萄汁(Romano等，MetabolicdiversityofSaccharomycescerevisiaestrainsfromspontaneouslyfermentedgrapemusts(來自自然發酵葡萄汁的各種釀酒酵母菌抹的代謝多樣性)，19:311-315,2003)到基本補充培養基(Oliviera等，(2005)WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology21:1569-1576)，前者可產生12-219mg/L異丁醇，后者可產生16-34mg/L異丁醇。Dickinson等人的研究(JBiolChem.272(43):26871-8,1997)已確定支鏈氨基酸(例如，纈氨酸和亮氨酸)轉化為異丁醇的反應途徑中的酶反應步驟。本發明提供了代謝工程微生物，其包含利用合適底物生產高級醇(包括異丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和2-苯基乙醇)的生物化學途徑。本發明的一種代謝工程微生物包含該生物體基因組內的或該生物體基因組以外的一種或多種重組多聚核香酸。此微生物能夠包含在野生型微生物內發現的基因的減少、破壞或敲除，和/或導入外源多聚核苷酸。本發明還包括利用生物體的天然氨基酸途徑的代謝工程生物合成途徑。利用天然氨基酸途徑生產生物燃料有多種好處。它不僅避免了表達一大組的外源基因的困難，還將積累有毒中間產物的可能性降到最低。與在多種梭狀芽孢桿菌(aas卞/^"朋)中發現的丁醇產生途徑相反，用于生物燃料生產的經改造氨基酸生物合成路徑避免了涉及氧氣敏感酶和對輔酶A依賴的中間產物。本發明提供了一種宿主友好型生物燃料生產系統，其利用微生物氨基酸生物合成途徑中的自然代謝產物生產生物燃料。—方面，本發明提供了一種重組微生物，與其親本微生物相比，此重組微生物包含至少一種目標酶的表達增加，或編碼在其親本微生物中未發現的酶。另一方面，此微生物包含至少一種基因的減少、破壞或敲除，此基因編碼的酶與生產期望的高級醇產物所需的代謝產物有竟爭作用。重組微生物產生至少一種與異丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇的生物合成途徑相關的代謝產物。一般情況下，重組微生物包含至少一種重組代謝途徑，此途徑包含一種目標酶，并且還可包含竟爭性生物合成途徑中一種酶的活性或表達降低。此途徑的作用是修飾異丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇生產過程中的底物或代謝中間產物。目標酶通過源自合適的生物來源的多聚核苷酸進行編碼和表達。在某些實施方案中，此多聚核苷酸包含源自一種細菌或酵母的一種基因，其經重組改造引入本發明的^[敬生物中。正如本文中所使用的，"代謝工程"或"代謝改造，，這一術語涉及生物合成基因、與操縱子有關的基因以及此類多聚核苷酸的調控元件的合理途徑改造與組裝，其目的是在一種微生物里產生期望的代謝產物，例如2-酮酸或高級醇。"代謝工程"還包含利用基因工程和合適的培養基條件(包括與導向所需路徑的中間產物相竟爭的一種竟爭性代謝途徑的減少、破壞或敲除)對轉錄、翻譯、蛋白質穩定性和蛋白質功能進行調節和優化，以優化代謝通量。一種生物合成基因可能與宿主微生物異源，可利用宿主異源的基因，或通過致突變作用、重組進行修飾，并且/或與存在于內源性宿主細胞的異源表達控制序列有關。一方面，如果此多聚核香酸對宿主生物體是異源基因，則能對此多聚核香酸進行密碼子優化。術語"生物合成途徑"，也稱"代謝途徑"，指將一種化合物轉化(改變)為另一種化合物的一組合成代謝或分解代謝生化反應。如果基因產物平行或連續地作用于相同的底物，產生相同的產物或作用于或產生一種在該相同底物與代謝終產物之間的代謝中間物(例如代謝產物)，則這些基因產物屬于相同的"代謝途徑"。例如，通過L-亮氨酸固有的生物合成途徑合成亮氨酸，此途徑偏離L-纈氨酸生物合成系統的中間產物(2-酮異戊酸)。在大腸桿菌中，L-纈氨酸的生物合成和L-亮氨酸固有的生物合成是通過一組分別由ilvGMEDA操縱子和leuABCD操縱子編碼的酶進行。leuABCD操縱子包括leuA、leuB、leuC和leuD基因。其中，IeuA編碼a-異丙基蘋果酸合成酶，leuB編碼|3-異丙基蘋果酸脫氫酶，leuC和leuD編碼a-異丙基蘋果酸異構酶。其中，a-異丙基蘋果酸合成酶催化由a-酮異戊酸生成a-異丙基蘋果酸的合成反應，a-異丙基蘋果酸異構酶催化由a-異丙基蘋果酸生成P-異丙基蘋果酸的異構化反應，P-異丙基蘋果酸脫氫酶催化由(3-異丙基蘋果酸生成a-酮基異己酸的脫氫反應，a-酮基異己酸是L-亮氨酸生物合成的最終中間產物。大腸桿菌具有四種轉氨酶，即由aspC基因編碼的轉氨酶A(天冬氨酸-谷氨酸轉氨酶)、由ilvGMEDA操縱子含有的ilvE基因編碼的轉氨酶B(BCAA轉氨酶)、由avtA基因編碼的轉氨酶C(丙氨酸-纈氨酸轉氨酶)和由tyrB基因編碼的轉氨酶D(酪氨酸轉氨酶)。這些酶參與各種胺化反應。其中，轉氨酶B和轉氨酶D催化上述由a-酮基異己酸生成L-亮氨酸的胺化反應。轉氨酶C和轉氨酶D催化L-纈氨酸生物合成途徑的最后一步反應，這一步是L-纈氨酸生物合成和L-亮氨酸生物合成的共有反應。另外，leuABCD操縱子的表達也受到L-亮氨酸的抑制。編碼乙酰鞋酸合成酶I的ilvBN基因的表達受到L-纈氨酸和L-亮氨酸的協同抑制，編碼乙酰羥酸合成酶II的ilvGM基因的表達受到L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸的協同抑制，編碼乙酰羥酸合成酶III的ilvIH基因的表達受到L-亮氨酸的抑制。術語"底物"或"合適的底物"指在酶的作用下轉化為或要轉化為另一種化合物的物質或化合物。此術語不僅包含一種化合物，也包含化合物組合，例如溶液、混合物或至少包含一種底物或其衍生物的其他物質。并且，術語"底物"不僅包括適合作為起始物質的提供碳源的化合物，例如源自任何生物質的糖類，還包括本文所述的用于與代謝工程微生物相關途徑的中間代謝產物和最終代謝產物，"源自生物質的糖類"包括但不限于例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的分子。術語"源自生物質的糖類"包括通常被微生物利用的合適的碳底物，諸如6碳糖，包括但不限于葡萄糖、乳糖、山梨糖、杲糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖，所有糖的構型均為D型或L型，或6碳糖組合如葡萄糖和果糖和/或6碳糖酸類，包括但不限于2-酮基-L-古洛糖酸、艾杜糖酸(1A)、葡萄糖酸(GA)、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸(2KDG)、5-酮基-D葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸磷酸、2,5-二酮基-L-古洛糖酸、2,3-L-二酮基古洛糖酸、脫氫抗壞血酸、異抗壞血酸(EA)和D-甘露糖酸。術語"醇類"包括正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。術語"l-丁醇，，或"正丁醇"一般指末端碳原子帶有醇官能團的直鏈異構體。內部碳原子帶有醇官能團的直鏈異構體是仲丁醇或2-丁醇。末端碳原子帶有醇官能團的支鏈異構體是異丁醇，內部碳原子帶有醇官能團的支鏈異構體是叔丁醇。本文提供的重組微生物能夠表達多種目標酶，這些酶與由合適碳底物生成正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇的合成途徑相關。因此，通過將基因物質引入選擇的某個宿主或親本微生物，從而產生經代謝"改造"或"修飾"的微生物，以修改或改變此微生物的細胞生理學或生物化學特性。通過引入基因物質，親本微生物獲得了新性狀，例如，能夠產生新的或更多數量的胞內代謝產物。在一示例實施方案中，將基因物質51入親本微生物中導致其獲得新的能力或經改進的能力，能夠生產一種醇，例如正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。引入親本微生物的基因物質包括基因或部分基因，其編碼一種或多種與醇類生產的生物合成途徑相關的酶，并且還包含參與這些基因的表達和/或表達調控的其他要素，例如啟動子序列。除了將基因物質引入宿主或親本微生物外，在可選的方法中，一種經改造或修飾的微生物還能包括基因或多聚核苷酸的破壞、缺失或敲除，以改變微生物的細胞生理學和生物化學特性。通過基因或多聚核香酸的減30少、破壞或敲除，微生物獲得了新的或經改進的性狀(例如能夠產生一種新的或更多數量的胞內代謝產物，改進所需途徑的代謝通量，并且/或降低不需要的副產物的產量)。本發明證實了在具有以下酶活性的多肽存在時編碼具有酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的多肽的一種或多種異源多聚核苦酸的表達或過度表達a-異丙基蘋果酸合成酶、p-異丙基蘋果酸脫氫酶、a-異丙基蘋果酸異構酶、蘇氨酸脫水酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶活性以及蘇氨酸合成酶。例如，本發明證實了通過異源hw/和aW2;大腸桿菌的,7v丄/ewX、/ez/B、/et/D(或Lew操縱子，例如/ra^SCD);以及f/M、AM、或77^操縱子(例如AM5C，thrA可能是抗反饋抑制多肽，例如thrA*)的過表達可以生產出正丁醇和正丙醇。利用2-酮戊酸生產正丁醇涉及到中間產物2-酮基丁酸和非自然的正纈氨酸生物合成途徑。由于Kivd與兩種2-酮酸的親和力相近，且2-酮基丁酸是LeuA的第二底物，因此，正丙醇與正丁醇一同被生產出來，且數量相近。本文提供的微生物經修飾能夠大量產生親本微生物中不能產生的代謝產物。"代謝產物"指微生物產生的任何物質或某代謝過程所需的或參與此過程的物質。一種代謝產物可以是作為起始物質的一種有機物(例如，葡萄糖或丙酮酸)；代謝過程中的一種中間產物(例如，2-酮酸)；或一種最終產物(例如，正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇)。代謝產物可用來構建更復雜的分子，或被分解成更簡單的分子。中間代謝產物可由其他代謝產物合成，可用來構建更復雜的物質，或被分解成更簡單的化合物，通常伴隨著化學能的釋放。代表性代謝產物包括葡萄糖、丙酮酸、正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基l-丁醇、3-甲基l-丁醇或2-苯基乙醇，以及2-酮酸。如圖1A所示，代表性的2-酮酸中間產物包括2-酮基丁酸、2-酮異戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基3-曱基戊酸、2-酮基4-甲基-戊酸、和苯丙酮酸。圖1A所示的代表性2-酮酸可被用作正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇生產過程中的代謝中間產物。例如，如圖1B所示，一種重組微生物經代謝改造，可以提供表達水平增加的如由Leu操縱子(例如LeuABCD)編碼的2-異丙基蘋果酸合成酶、P-異丙基蘋果酸脫氫酶和異丙基蘋果酸異構酶，其催化2-酮基丁酸生成2-酮基戊酸。2-酮戊酸代謝物可用于生產正丁醇，此過程由代謝修飾微生物產生的其他酶產生。此外，可通過重組微生物由2-酮丁酸和2-酮基-3-甲基戊酸生產1-丙醇和2-甲基-l-丁醇，此微生物經過代謝改造，可表達或過度表達乙酰羥酸合成酶、a-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶，這些酶由例如^////^、/Wc和cw^基因編碼。此外，代謝產物2-酮酸異戊酸可由經過代謝改造的重組微生物生成，此微生物能夠表達或過度表達由例如〃v///CD基因編碼的乙酰羥酸合成酶。此代謝產物可繼續用于異丁醇或3-甲基-l-丁醇的生產。代謝產物丙酮酸和笨丙酮酸可用于由經過代謝改造的重組微生物生產2-苯基乙醇，此微生物能夠表達或過度表達a-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶，這些酶由例如/Wc和oW基因編碼。其他代謝產物和基因見圖1B。此外，本文提供的是生產異丁醇的重組微生物，在某些方面，可能包含目標酶的增加表達，例如乙酰羥酸合成酶(例如z7v/Z/操縱子)、乙酰羥酸還原異構酶(例如z/vC)、二羥酸脫水酶(例如//vZ))、2-酮酸脫羧斷例如/<^、^4^9/0、77//丄/1,^/4'/^c)及醇脫氳斷例如爿/>/^)。此微生物還可含有乙醇脫氫酶(例如，"W五)、W/(例如Ml4)、/n/(例如./hi8>/raC或/礎C)、/肌/ew丄//v五、pox8、/Avl、、聲基因或它們的任何組合的表達缺失或受抑制，以增加丙酮酸的可利用性或減少會爭奪所需的生物合成途徑里的代謝物的酶。在某些方面，此重組微生物可以含有乙酰乳酸合成酶("例如a/W人乙酰羥酸還原異構酶f，如//vCV、二羥酸脫水酶("辨>//vD、2-酮酸脫羧酶f辨如尸DC6、^(9M、77/7丄Ar/vJ減/Jc乂以及醇脫氫酶卩辨如vlD//2J的增加表達。關于醇脫氫酶方面，雖然乙醇脫氫酶屬于醇脫氫酶，但是在此生物合成途徑中，乙醇的合成是不需要的副反應。因此，當提到微生物里醇脫氫酶活性或表達增強時，明確不包括乙醇脫氫酶活性。本發明還提供產生正丁醇的重組微生物，可包括目標酶的增加表達，例如2-異丙基蘋果酸合成酶(#/如/e")、P-異丙基蘋果酸脫氫酶(辨如/eW),異丙基蘋果酸異構酶(翔:知/ewC、/ewD減/ewCD模教子)、絲氨酸脫水酶(辦如。與親本微生物相比，此微生物還可以含有2-酮異戊酸、2-酮基-3-甲基-戊酸、2-酮基-4-甲基戊酸或他們的任何組合的含量減少。此外，與親本微生物相比，此微生物可含有二羥酸脫水酶(辨如"vD差茵)表達破壞、缺失或敲除。產生正丁醇的重組微生物還可以含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶和/或蘇氨酸脫水酶的表達或活性增加，這些酶分別由源自//C、/^C、as/7C、f/iM、a/、AW、^rC、WiL4仏fcfc6基因或其同源基因的核酸序列編碼。本發明還提供產生正丙醇的重組微生物，可包括目標酶的增加表達，例如a-異丙基蘋果酸合成酶(斧/如czm乂)、P-異丙基蘋果酸脫氳酶(辨如/ewiO、異丙基蘋果酸異構酶(辨如/wCD橫教f)和絲氨酸脫水酶。本發明還提供產生2-甲基-l-丁醇的重組微生物，可包含目標酶的增加表達，例如蘇氨酸脫水酶(#/如z7v乂成^:'8)、乙酰羥酸合成酶(辨如//v///凍效子)、乙酰羥酸還原異構酶(辨如WvC)、二羥酸脫水酶(辨如；7vD),2-酮酸脫羧酶(辦如PD05、AR(9川、777/3>hWf口/4')及醇脫氬酶(。4D招)。本發明還提供產生3-甲基-l-丁醇的重組微生物，可以含有目標酶的增加表達，例如乙酰乳酸合成酶(鄉如a/W)、乙酰羥酸合成酶(辨如z/v/H)、乙酰乳酸合成酶(#/如,7vMG)或(辨如z7v7VB)、乙酰鞋酸還原異構酶(鄉如//vC),二羥酸脫水酶(辨如,2-異丙基蘋果酸酶合成酶(/e")、異丙基蘋果酸異構酶(辨如/ewC、D或/ewCD操縱子)、卩-異丙基蘋果酸脫氫酶(鄉如/ei^)、2-酮酸脫羧酶(辨余hvJ、戶D05或)及醇脫氮酶(#/如4DH2)。本發明還提供產生苯基乙醇的重組微生物，可以含有目標酶的增加表達，例如分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶(#/如p/2^4)、分支酸變位酶T/預苯酸脫氬酶(辦如(y^4)、2-酮酸脫羧斷辨如hVt/、PDC6、或)和醇脫氫酶(#/如y4D/^)。如前所迷，本發明描述的目標酶一^:都會生成代謝產物。例如，2-異丙基蘋果酸合成酶(/e^)、P-異丙基蘋果酸脫氫酶(/et^)和異丙基蘋果酸異構酶(/ewC、/ewD或/ewCD操縱子)可由含有2-酮基丁酸的底物生成2-酮基戊酸。此外，本文所述的目標酶都由多聚核苦酸編碼。例如，蘇氨酸脫水酶由源自,7v^基因的多聚核苷酸編碼。乙酰羥酸合成酶由源自//v///操縱子的多聚核苷酸編碼。乙酰羥酸還原異構酶由源自//vC基因的多聚核苷酸編碼。二羥酸脫水酶由源自z7vZ)基因的多聚核苷酸編碼。2-33酮酸脫羧酶由源自尸DC(5、y4W(970、777/3、A:/w/和或/wfc基因的多聚核苷酸編碼。醇脫氳酶由源自^D//2基因的多聚核苷酸編碼。其他酶和代表性基因詳見本文。各種多肽與多聚核苷酸的同源體可以來自提供由合適多聚核苷酸編碼的合適酶的任何生物來源。例如，可以通過參考各種數據庫來確定同源體。本發明確定了對本發明的方法、組成成分和生物體有用的特定基因；但是，應當認識到，沒必要完全識別這些基因。例如，為了改變活性，可以對含有編碼某多肽或酶的序列的某種基因或多聚核苷酸進行改變或篩選。通常，此類改變包含保守突變和沉默突變。可以利用所屬領域中的方法對這類修飾或突變多聚核苷酸和多肽進行功能酶活性表達篩選。由于此遺傳密碼固有的簡并性，其他編碼基本相同或功能等同的多肽的多聚核苷酸也可用于復制，并表達編碼此類酶的多聚核苷酸。正如本發明所屬領域的技術人員所理解的，修飾編碼序列有利于增強在特定宿主中的表達。此遺傳密碼具有64個可能的密碼子是冗余的，但是大多數生物體通常只利用其中的部分密碼子。一個物種中最頻繁利用的密碼子稱為最佳密碼子，那些不經常被利用的稱為稀有或低利用率密碼子。密碼子的取代反應了宿主對偏愛密碼子的利用，此過程通常稱為"密碼子優化"或"物種密碼子偏愛控制"。可以制備含有特定的原核宿主或真核宿主偏愛的密碼子的優化編碼序列(見Murray等，(1989)《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)17:477-508)，例如，以增加翻i奪率或生成具有所需的特性的重組RNA轉衰期。也可根據宿主偏好修飾翻譯終止密碼子。例如，顏潘,母和哺乳動物的典型終止密碼子分別為UAA和UGA。單子葉植物的典型終止密碼子是UGA，昆蟲和大腸桿菌共同利用的終止密碼子是UAA(Dalphin等，(1996)《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)24:216-218)。第6,015,891號美國專利以及本文引用的文獻提供了用于植物中表達的優化核苷酸序列的方法。本發明所屬領域的技術人員公認的，由于遺傳密碼的簡并性，許多具有不同核苷酸序列的DNA化合物可用于編碼本發明中的某種酶。本文對編碼上述生物合成酶的天然DNA序列的引用僅為了說明本發明的一個實施方案，公開的內容包括對本發明提供的方法中利用的酶和多肽的氨基酸序列進行編碼的任何序列的DNA化合物。以類似的方式，通常可以允許多肽的氨基酸序列中發生一個或多個氨基酸的置換、缺失和插入，而不對其所需的活性造成損害或嚴重損害。本發明包含與本文所述的特定蛋白質具有不同氨基酸序列的多肽，這些經過修飾的多肽變體具有參照多肽的酶的合成代謝或催化代謝活性。此外，本文所示的DNA序列編碼的氨基酸序列僅用于說明本發明的實施方案。此外，本文提供的方法和微生物包含可用于產生代謝物(例如，酮石克解酶、乙酰CoA、乙酰基轉移酶、羥丁酰CoA脫氬酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA還原酶、丁酰-CoA-脫氫酶、醇脫氫酶(ADH))的醉的同源體。針對第一個家族或物種的原始的酶或基因而言的所用術語"同源體"指第二個家族或物種的不同酶或基因，這些不同酶或基因通過進行功能、結構或基因組分析確定，對應于第一個家族或物種的原始酶或基因。同源體往往具有相似的功能、結構或基因組。通過基因探針和PCR能夠易于克隆酶或基因的同源體的技術是已知的。通過功能分析或基因的基因組作圖可確認復制的同源體序列的身份。如果編碼一個蛋白質的核酸序列與編碼第二個蛋白質的核酸序列相似，則該蛋白質與第二個蛋白質具有"同源性"或是"同源的"。或者，如果這兩種蛋白質具有"相似"的氨基酸序列，則這兩種蛋白質具有同源性(因此，術語"同源蛋白質"是指具有相似氨基酸序列的兩種蛋白質)。如本文所使用的，當兩種蛋白質(或蛋白質區域)的氨基酸序列具有至少30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性時，它們就基本同源。為了確定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的百分比同一性，將這兩種序列進行比對以達到最優的比較目的(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸之一或兩者中插入空位以便于最優比對，并且通過比對能夠忽略非同源序列)。在一實施方案中，進行比較目的時比對用的參考序列長度至少為該序列長度的30%，通常為40%以上，較典型的長度為50%以上，更加典型的長度為60%以上，最典型的長度至少為70%、80%、90%、100%。然后，比較相應位置的氨基酸殘基或核苷酸。如果第一個序列某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二個序列相應位置的相同，則這兩個分子在此位置上相同(如本文所使用的，氨基酸或核酸"相同"等同于氨基酸或核酸"同源")。兩種序列間的百分比同一性是這兩種序列的相同位置數目的函數，同時要考慮空位數以及每段空位的長度，空位是為了便于最優比對兩種序列而插入的。例如，^W/基因包含來自其他生物體的編碼具有基本相似酶活性的酶的同源基因(例如p<ic6,"ra/6>、仇G、；t/c、ybb4,p6W、/76fc5),以及與該參考基因的同一性至少為30、40、50、60、70、80、85、90、95、98、或99%并且它們編碼的酶與參考基因編碼的酶具有基本相似酶活性的基因。例如，乳酸克魯維酵母(X/w少verawyc^/acto)中的丙酮酸脫羧酶在氨基酸水平上與Kivd同一性為37。/。；kivd和thl3在核酸水平上的同一性為32%;粟酒裂殖酵母(&;/zas'a(x/wTOw，w/ww&)中的醇脫氬酶與釀酒酵母中的ADH2在氨基酸序列水平上的同一性為52%;釀酒酵母與乳酸乳球菌"W的同一性為49%;KIVD(乳酸乳球菌)與PDC6(釀酒酵母)間的同一性為36%(相似殘基=322/562(57%),空位=24/562(4%));KIVD(乳酸乳5求菌)和THI3(間的同一性為32%(相似殘基=307/571(53%)，空位=35/571(6%));kivd(乳酸乳球菌)和ARO10(被灑脊母)間的同一性為30%(相似殘基=296/598(49%),空位=65/598(10%));ARO10(與PDC6(被潘#母)間的同一性為34%(相似殘基=320/616(51%)，空位=61/616(9%));ARO10(被源摔母)與THI3(釀酒酵母)間的同一性為30%(相似殘基=304/599(50%)，空位=48/599(8%));ARO10(與丙酮酸脫羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)間的同一性為30%(相似殘基=291/613(47%),空位=73/613(11%));PDC6(顏游,母)與THI3(孩7麥,爭)間的同一性為50%(相似殘基=402/561(71%),空位=17/561(3%));PDC6(凝潘發母)與丙酮酸脫羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)間的同一性為38%(相似殘基=328/570(57%)，空位=30/570(5%));THI3(與丙酮酸脫羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)間的同一性為35%(相似殘基=284/521(54%)，空位=25/521(4%))。本文所列的每個基因和多肽/酶的序列可通過互聯網上的數據庫輕易獲得(例如http:(〃)eecoli.kaist.ac.kr/main.html)。此外，可利用本發明所屬領域的常用算法對氨基酸序列和核酸序列進行比對，以確定其同一性。通常其保守氨基酸置換不同。"保守氨基酸置換"指一個氨基酸殘基被另一個具有側鏈(R基團)的氨基酸殘基置換，此另一個氨基酸殘基具有相似的化學性質(例如電荷、疏水性)。一般情況下，保守氨基酸置換不會顯著改變蛋白質的功能特性。如果兩個或多個氨基酸序列由于保守置換互不相同，則可以要向上調整序列同一性或同源度，以修正置換的保守性。本發明所屬領域的技術人員很了解這種調整方法(見Pearson等，1994，以引用的方式并入本文)。以下六組中，每組的氨基酸都可以相互進行保守置換。l)絲氨酸(S),蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷胺酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。多肽的序列同源也稱為序列百分比同一性，通常利用序列分析軟件對其進行測量。例如威斯康辛大學生物技術中心遺傳學計算機集團(GeneticsComputerGroup)(GCG)的序列分析4欠件包(SequenceAnalysisSoftwarePackage)，該公司位于威斯康星州麥迪遜大學街910號，郵編53705。蛋白質分析軟件通過測定各種置換、缺失及其他修飾(包括保守氨基酸置換)的同源性配對相似序列。例如，GCG包含諸如"Gap(空位)"和"Bestfit(最佳配合)"之類的程序，他們能夠結合使用默認參數來確定緊密相關的多肽例如來自不同種類生物體的同源多肽間的序列同源度或序列同一性，或野生型蛋白質與其突變體之間的序列同源度或序列同一性。見GCG6.1版。計算機程序BLAST(Altschul，1990;Gish1993;Madden,1996;Altschul1997;Zhang,1997)特別是blastp或tblastn(Altschul，1997)是一種典型算法，它可以將一個分子序列與包含大量源自不同生物體的序列的數據庫進行比較。BLASTp的典型參數是期望值10(默認值)；過濾器seg(默認值)；開放空位罰分11(默認值)；擴展空位罰分1(默認值)；最大比對100(默認值)；字長11(默認值)；描述量100(默認值)；矩陣罰分BLOWSUM62。在搜索包含來自大量不同生物體序列的數據庫時，通常要比對氨基酸序列。可以利用本發明所屬領域內除blastp以外的算法分析氨基酸序列搜索數據庫。例如，可以利用FASTA,GCG6.1版中的一個程序，來比對多肽序列。FASTA提供查詢和搜索序列間最佳重疊區域的比對和序列百分比同一性(Pearson,1990,以引用的方式并入本文)。例如，可以利用FASTA及GCG6.1版中提供的默認參數(字長為2，以及PAM250得分矩陣)，確定氨基酸序列間的序列百分比同一性，此參數以引用的方式特此并入本文。下表及公開內容提供了基因以及每種基因的同源基因的非限定性例子，這些基因的多聚核苷酸和多肽序列是本發明所屬領域的技術人員可以得到的。表1:描述了生產各種高級醇的重組途徑("+，，=表達、表達或活性增強/"-"=表達或活性降低或敲除*)。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表2-9闡明了本發明各種重組微生物的反應途徑，并列出了代表性基因和同源基因及其生物來源。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表3由L-蘇氨酸生成正丁醇的反應途徑<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表6由丙酮酸生成正丙醇的反應途徑第一步反應丙酮酸+乙酰CoA》(R)-檸蘋酸c/wj(0^/e^鍵M'霧乂，czhjf/^子錄^攀《謬乂或其同源J^第二步反應(R)-檸蘋酸->檸康酸/ewCZ)f/^7子錄潘銀凌謬？、/ewCDf義廯許麥J或其同源基因第三步反應檸康酸-〉(3-甲基-D-蘋果酸/ewO)f何爭《夕端4羅凌^U、/wCZ)產義應并^V或其同源基因第四步反應(3-曱基—D-蘋果酸->2-酮基-丁酸/raB0子錄^銀凌^U,f乂應并^V或其同源基因第五步反應2-酮基丁酸->丁醛￥ihvc/廣#乙^/乙承謬，，W"T^^逸諒^V、尸DC7f麟渴發母J、PDC5(^座湯雜母J.尸i)C6，f顏源舉母J.Ji0^產顏潘摔母J或其同源基因第七步反應丁醛->正丁醇爿DW/f顏潘脊母J、/4D//2f^潘發母J、^D/Z3f^潘發母J,f顏潘,母J,^Z)//5、^DH6f麟潘雜爭j.^SK47廣顏潘##^或其同源基因表7由L-蘇氨酸生成2-曱基-l-丁醇的反應途徑<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表8<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表9由分支酸生成苯基乙醇的反應途徑第一步反應分支酸->預苯酸f義^^y產霧,、//;df義應V產^V或其同源基因第二步反應預苯酸->苯丙酮酸p/d產義J^產^V或其同源基因第三步反應苯丙酮酸->笨甲醛"M/t,'w/(^乙S其歡^V、Mdf^凝/乙承謬,，尸ZX7f,尸Z)C5,尸DC6廣凝灑發#,、f被澇,孝J,AR0川("顏潘發孕,或其同源基因第四步反應笨甲醛->2-笨基乙環"S/4D///f^潘雜母J,v4/)//2f顏灑酵孕？、^D//3f被潘發母，，/4D/Wf顏潘脊母J，ADH5f被潘酵母J、ADi/6<"顏游##,,SfM/f被游脊母J或其同源基因本發明提供了可用于本文所述的重組微生物構建的各種基因、同源體及突變體的登記號。應當了解，本文所述的同源體和突變體為代表性的而非限制性的。本發明所屬領域的技術人員可利用各種數據庫獲得其他同源體、突變體和序列，這些數據庫包括例如，可通過互聯網訪問的美國國家生物技術信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation)。乙醇脫氫酶(又稱為醛醇脫氫酶)由大腸桿菌中的ac//^編碼。adhE含有三種酶的活性醇脫氫酶(ADH);乙醛/乙酰-CoA脫氬酶(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶)；PFL失活酶的活性能夠催化4失、NAD和CoA依賴性反應中丙酮酸-甲酸-裂解酶催化劑的滅活。此項技術中的同源體為已知(見醛/醇脫氫酶(Polytomella種Pringsheim198.80)gi|40644910|emb|CAD42653.2|(40644910);醛/醇脫氳酶(A型ATCC3502)gi|148378348|reflYP_001252889,1|(148378348);醛/醇脫氬酶(篇瘦，々^A許^"C092)gi|16122410|reflNP—405723.1|(16122410);醛/醇脫氫酶(/度潛^"#^^褒《蘿IP32953)gi|51596429|ref1YP—070620.1|(51596429);醛/醇脫氫酶(厲瘦,次^突沃奸臠C092)gi|1153478891emb|CAL20810.1|(115347889);醛/醇脫氫酶(/皮潛核#農森/^勞IP32953)gi|51589711|emb|CAH21341.11(51589711)醛/醇脫氫酶(大腸桿菌CFT073)gi|26107972)gb|AAN80172.1|AE016760—31(26107972);醛/醇脫氪酶(田鼠型鼠疫耶爾森氏桿菌生物變種91001)gi|45441777|reflNP—993316.11(45441777);醛/醇脫氫酶(田鼠型鼠疫耶爾森氏桿菌生物變種91001)gi|45436639|gb|AAS62193.1|(45436639);醛/醇脫氫酶(產氣莢膜梭菌ATCC13124)gi|110798574|reflYP—697219.1|(110798574)(匿-1)gi|24373696|reflNP_717739.11(24373696);醛/醇脫氬酶(A型ATCC19397)gi|153932445jreflYP—001382747.1|(153932445);醛/醇脫氬酶(并E1979001)gi|165991833|gb|EDR44134.1|(165991833);醛/醇脫氫酶(A型《辜鍵^"Hall抹)gi卩53937530lref!YP—001386298.1|(153937530);醛/醇脫氫酶(ATCC13124)gi|110673221|gb|ABG82208.1|(110673221);醛/醇脫氫酶(A型力善凝,HalH朱)gi|1529334441gb|ABS38943.11(152933444);醛/醇脫氫酶(《才^篇瘦，次4《并^^參f神F1991016)gi|165920640|gb|EDR37888.1|(165920640);醛/醇脫氫酶(《才型扃瘦，^^突/t^,4參^神IP275)gi|165913933|gb|EDR32551.1|(165913933);醛/醇脫氫酶(安爭在虞瘦，次^/t奸霧)giil624191161ref]YP—001606617.1|(162419116);醛/醇脫氫酶(F型溝毒^蘿Langeland)gi|153940830|reflYP—001389712.1|(153940830);醛/醇脫氫酶(義應并霧HS)gi|157160746|reflYP—001458064.1|(157160746);醛/醇脫氫酶(E24377A)gi|157155679|reflYP—001462491.1|(157155679);醛/醇脫氬酶(V、應潛應^，泉殺^并霧小應潛應^:亞并8081)gill23442494|reflYP_001006472.1|(123442494);醛/醇脫氫酶(聚球藻#JA-3-3Ab)gi|866051911reflYP_473954.1|(86605191);醛/醇脫氫酶(卓^"勿/6增4bF2365)gi|46907864|reflYP_014253.1|(46907864);醛/醇脫氬酶(V583)gi|293754841reflNP_814638.1|(29375484);醛/醇脫氫酶(尤/乙遂球霧2603V/R)gi|22536238|ref!NP—687089.1|(22536238);醛/醇脫氫酶(A型49ATCC19397)gi|152928489|gb|ABS33989.1|(152928489);醛/醇脫氫酶(義應yf^"E24377A)gi|157077709|gb|ABV17417.11(157077709);醛/醇脫氬酶(義應并豚HS)gi|157066426|gb|ABV05681.11(157066426);醛/醇脫氫酶(F型Langeland)gi|152936726|gb|ABS42224.1|(l52936726》；醛/醇脫氬酶(^瘦f^^《^1^CA88-4125)gi|149292312|gb|EDM42386.1|(149292312);醛/醇脫氫酶(V、應潛應^,泉疾《并^V、應潛靡^亞神8081)gi|122089455|emb|CAL12303.1|(122089455);醒/醇脫氫酶(襲,》漠)gi|92084840|emb|CAF04128.1|(92084840);醛/醇脫氪酶(聚球藻種JA-3-3Ab)gi|86553733|gb|ABC98691.1|(86553733);醛/醇脫氳酶(MR-1)gi|24348056|gb|AAN55183.1|AE015655—9(24348056);醛/醇脫氫酶(V583)gi|29342944|gb|AAO80708.1|(29342944);醛/醇脫氫酶(卓^"勿羞潛i李身掙/t^"4bF2365)gi|46881133|gb|AAT04430.1|(46881133);醛/醇脫氫酶(#裙勿/^^^，^f掙;t齊l/2aF6854)gi|47097587|reflZP—00235115.11(47097587);醛/醇脫氫酶(#裙勿應乂#^#身#/^^"4bH7858)gi|47094265|ref]ZP—00231973.1|(47094265);醛/醇脫氫酶(##勿羞潛1#身掙A蘿4bH7858)gi|4707355|gb|EAL0880.11(47017355);醛/醇脫氫酶(##勿/^^i湊身^^t霧1/2aF6854)gi|47014034|gb|EAL05039.11(47014034);醛/醇脫氫酶(尤^鏈嫌^"2603V/R)gi|22533058|gb|AAM98961.1|AE014194—6(22533058)p;醛/醇脫氳酶(古典型歲瘦##/^射參身并E1979001)gi|166009278|reflZP_02230176.1|(166009278);醛/醇脫氬酶(東方型厲^,次^A并漭^:參f#IP275)gi|165938272|ref!ZP—02226831.1|(165938272);醛/醇脫氫酶(東方型篇^，々,秉《并蘿i^^r神F1991016)gi|165927374|reflZP—02223206.1|(165927374);醛/醇脫氫酶(安哥拉,^#次#囊/t^^")gi|162351931|gb|ABX85879.11(162351931);醛/醇脫氬酶(/發茲##々^囊《麥IP31758)gi|153949366|reflYP_001400938.1|(153949366);醛/醇脫氫酶(/度潛裙#農^《^"IP31758)gi|152960861|gb|ABS48322.1|(152960861);趁/醇脫氫酶(處^，次4^A^f^"CA88-4125)gi|149365899|reflZP—01887934.1|(149365899);乙醛脫氫酶(乙酰化)(CFT073)gi|26247570|reflNP—753610.1|(26247570);醛/醇脫氪酶(包括醇脫氫酶；乙醛脫氫酶(乙酰化)(EC1.2丄10)(acdh);丙酮酸-曱酸-裂解酶失活酶(pfl失活酶))(A型溝善凝^"ATCC3502)gi|148287832|emb|CAL81898.1|(148287832);醛/醇脫氫酶(包括醇脫氮酶(ADH);乙醛脫氬酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))gi|71152980|sp|P0A9Q7.2|ADHE_ECOLI(71152980);醛/醇脫氬酶(包括醇脫氫酶、乙醛脫氫酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(教,/、炎,厥^t;并霧^#/、炎,亞并SCRI1043)gi|50121254|reflYP—050421.11(50121254);醛/醇脫氫酶(包括醇脫氫酶、乙醛脫氬酶和丙酮酸-曱酸-裂解酶失活酶(辨#7、炎,欽4^f,辨,/、炎/C^并SCRI1043)gi|49611780|emb|CAG75229.1|(49611780);醛/醇脫氫酶(包括醇脫氫酶(ADH);乙醛脫氳酶(乙酰化)(ACDH))gi|19858620|sp|P33744.3|ADHE—CLOAB(19858620);醛/醇脫氬酶(包括醇脫氫酶(ADH);乙醛脫氫酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))gi|71152683|sp|P0A9Q8,2|ADHE—ECO57(71152683);醛/醇脫氫酶(包括醇脫氫酶；乙醛脫氫酶(乙酰化)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(艱，凝,630)gi|126697906|reflYP_001086803.1|(126697906);醛/醇脫氫酶(包括醇脫氫酶；乙醛脫氫酶(乙酰化)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(艱;-凝630)gi|115249343|emb|CAJ67156.1|(115249343);醛/醇脫氫酶(包括醇脫氫酶(ADH);乙醛脫氫酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))(laumondii亞種TTOl)gi|37526388|reflNP—929732.1|(37526388);醛/醇脫氫酶2(包括醇脫氫酶；乙醛脫氬酶)(必應遂卓'霧Manfredo)gi|134271169|emb|CAM29381.1|(134271169);醛/醇脫氫酶(包括醇脫氫酶(ADH);乙醛脫氫酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-曱酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))(發'^許霧laumondii亞種TTOl)gi|36785819|emb|CAE1487(U|(36785819);酪/醇脫氬酶(包括醇脫氬酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(艱舉凝^"630)gi|126700586|reflYPJ)01089483.1|(126700586);醛/醇脫氬酶(包括醇脫氬酶和丙酮酸-曱酸-裂解酶失活酶(艱;^鍵麥630)gi|115252023|emb|CAJ69859.1|(115252023);搭/醇脫氫酶2(必應鏈承^"Manfredo)gi|139472923|reflYP—001127638.1|(139472923);醛/醇脫氬酶E(,氣D差凝^"13)gi|18311513|reflNP—563447.1|(18311513);醛/醇脫氬酶E(,氣,/^凝^"13)gi|18146197|dbj|BAB82237.1|(18146197);醛/醇脫氬酶ADHE1(丙酮丁醇梭菌ATCC824)gi|15004739|reflNP—149199.1|(15004739);醛/醇脫氫酶ADHE1(丙酮丁醇梭菌ATCC824)gi|14994351|gb|AAK76781.11AE001438—34(14994351);醛/醇脫氬酶2(包括醇脫氬酶(ADH);乙醛/乙酰CoA脫氫酶(ACDH))gi|2492737|sp|Q24803.1|ADH2_ENTHI(2492737);醇脫氪酶(腐道，/7代#腸道傷寒桿菌亞種CT18)gi|16760134|reflNP—455751.1|(16760134);以及醇脫氬酶(應道^7'7^離腸道傷寒桿菌亞種)gi|16502428|emb|CAD08384.1|(16502428))，每個帶有登記號的序列全部以引用的方式并入本文。乳酸脫氫酶(又稱為D-乳酸脫氫酶和發酵脫氫酶)由大腸桿菌中的IdhA編碼，它能催化丙酮酸到乳酸的NADH依賴型的轉化。ldhA的同源基因和突變基因已知。事實上，目前通過NCBI可以查到1664種細菌乳酸脫氫酶。例如，這些同源基因和突變基因包括D-乳酸脫氫酶(D-LDH)(發酵乳酸脫氫酶)gi|1730102|sp|P52643.1|LDHD—ECOLI(1730102);D-乳酸脫氫酶gi|1049265|gb|AAB51772.1|(1049265);D-乳酸脫氬酶(義廯許霧APECOl)gi|l〗7623655|ref!YP—852568.|(117623655);D-乳酸脫氫酶(7t^Vf巖CFT073)gi|262476891ref!NP—753729.1|(26247689);D-乳酸脫氬酶(0157:H7EDL933)gi|15801748|reflNP—287766.1|(15801748);D-乳酸脫氬酶(義應VfAPECOl)gi|115512779|gb|ABJ00854.1|(115512779));D-乳酸脫氫酶(義應并麥CFT073)gi|26108091|gb|AAN80291.1|AE016760—150(26108091);NAD依賴性發酵D-乳酸脫氫酶(K12)gi|16129341|reflNP—415898.1|(16129341);NAD依賴性發酵D-乳酸脫氬酶(義應許謬UTI89)gi|91210646|reflYP—540632.1|(91210646);NAD依賴性發酵D-乳酸脫氫酶(義應Vf霧K12)gi|1787645|gb|AAC74462.1|(1787645);NAD依賴性發酵D-乳酸脫氫酶(義應7f蘿W310)gi|89108227|rei!AP—002007.1|(89108227);NAD依賴性發酵D-乳酸脫氬酶(義應Yf#W3110)gi|1742259|dbj|BAA14990.1|(1742259);NAD依賴性發酵D-乳酸脫氪酶(義應并霧UTI89)gi|91072220|gblABE07101.11(91072220);NAD依賴性發酵D-乳酸脫氫酶(義應#齊0157:H7EDL933)gi|12515320|gb|AAG56380.1|AE0053666(12515320);NAD依賴性發酵D-乳酸脫氬酶(義應許霧0157:H7str.Sakai)gi|13361468|dbj|BAB35425.1|(13361468);COG1052:乳酸脫氪酶及相關脫氬酶(101-1)gi|83588593|reflZP—00927217.11(83588593);COG1052:乳酸脫氬酶及相關脫氫酶(義*53638)gi|75515985|reflZP—00738103.1|(75515985);COG1052:乳酸脫氪酶及相關脫氫酶(義廯Vf霧E22)gi|75260157|reflZP_00731425.1|(75260157);COG1052:乳酸脫氬酶及相關脫氫酶(義濕yf蘿Fll)gi|75242656|re^ZP—00726400.1|(75242656);COG1052:乳酸脫氬酶及相關脫氬酶(義應并^"El10019)gi|75237491|reflZP—00721524.1|(75237491);COG1052:乳酸脫氬酶及相關脫氫酶(義^^V/1^B7A)gi|7523160l|reflZP_00717959.1|(75231601);和COG1052:乳酸脫氫酶及相關脫氮酶(義應Vf^"B171)gi|75211308|reflZP—0O711407.11(75211308)，每個帶有登記號的序列全部以引用的方式并入本文。兩種含有FAD的膜結合酶負責催化延胡索酸和琥珀酸的相互轉化；延胡索酸還原酶用于厭氧生長，琥珀酸脫氫酶用于好氧生長。延胡索酸還原酶包含多個亞基(例如義^^^蘿中的frdA、B、C)。對任一亞基進行修飾都會得到本文所需的活性。例如，本發明的方法可使用frdB、frdC或frdBC的敲除。Frd同源體和突變體已知。例如，同源體和突變體包括如延胡索酸還原酶亞基D(延胡索酸還原酶13kDa疏水蛋白)gi|67463543|sp|P0A8Q3.1|FRDD—ECOLI(67463543);延胡索酸還原酶亞基C(延胡索酸還原酶15kDa疏水蛋白)gi|1346037|sp|P20923.2|FRDC—PROVU(1346037);延胡索酸還原酶亞基D(延胡索酸還原酶13kDa疏水蛋白)gi|1204991sp|P20924.1|FRDD_PROVU(120499);延胡索酸還原酶亞基C(延胡索酸還原酶15kDa疏水蛋白)gi|67463538|sp|P0A8Q0.1|FRDC—ECOLI(67463538);延胡索酸還原酶鐵-硫亞基(義應許霧乂gi(14526屮gbiAAA23438.1((145264》延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基(大腸桿菌)gi|145263|gb|AAA23437.1|(145263);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基gi|37538290|sp|P17412.3|FRDA_WOLSU(37538290);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基gi|120489|sp|P00363.3|FRDA—ECOLI(120489);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基gi|120490|sp|P20922.1|FRDA_PROVU(120490);黃素細胞色素c)(黃素細胞色素c3)(Fcc3)gi|119370087|sp|Q07WU7.2|FRDA—SHEFN(ll9370087);延胡索酸還原酶鐵-硫亞基gi|81175308|sp|P0AC47.2|FRDB—ECOLI(81175308)延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基(黃素細胞色素c)(黃素細胞色素c3)(Fcc3);gilll93700881sp|P0C278.1|FRDA—SHEFR(119370088);Frd操縱子非典型蛋白質Cgi|140663|splP20927.1|YFRC—PROVU(140663);Frd操縱子可能的鐵-硫亞基Agil140661|sp|P20925.11YFRA—PROVU(l40661);延胡索酸還原酶鐵-硫亞基gi|1204931sp|P20921.2|FRDB—PROVU(120493);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基；gi|2494617|sp|O06913.2|FRDA—HELPY(2494617);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基前體(三價鐵離子誘發的黃素細胞色素c3)(Ifc3)gi|13878499|sp|Q9Z4P0.1|FRD2SHEFN(13878499);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基gi|54041009|sp|P64174.11FRDA—MYCTU(54041009);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基gi|54037132|sp|P64175.1|FRDA—MYCBO(54037132);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基gi|12230114|sp|Q9ZMP0.11FRDA—HELPJ(12230114);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基；延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基gi|1169737|sp|P44894.1|FRDA—HAEIN(l169737);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基(Z磁磁^^,霧)gi|13160058|emb|CAA04214.2|(13160058);延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基前體(黃素細胞色素c)(FLcyt)gi|25452947|sp|P83223.2|FRDA—SHEON(25452947);延胡索酸還原酶鐵-硫亞基gi|2282000|emb|CAA04215.1|(2282000);以及延胡索酸還原酶細胞色素b亞基(,裙磁^妖羞霧)gi|2281998|emb|CAA04213.1|(2281998),每個帶有登記號的序列全部以引用的方式并入本文。乙酸激酶由大腸桿菌中的ackA編碼。AckA參與到乙酰-coA轉化為乙酸的反應。具體講，即ackA催化乙酰磷酸轉化為乙酸。AckA的同源體和突變體已知。NCBI數據庫列出了約1450種用作細菌乙酸激酶的多肽。例如，此類同源體和突變體包括乙酸激酶(乂產^遂#霧A3(2))gi|21223784|reflNP—629563.1|(21223784);乙酸激酶(乂產《鏈,^"A3(2))gi|680847|emblCAB70654.1|(6808417);乙酸激酶(化應鏈諒^"MlGAS)gi|15674332|reflNP—268506.1|(15674332));乙酸激酶(至，應,必Yf#空腸彎曲亞種NCTC11168)gi|157920381reflNP—281861.11(15792038);乙酸激酶(化#^承霧MlGAS)gi|13621416|gb|AAK33227.1|(13621416);乙酸激酶(^羅好凈irV、染多蘿SH1)gi|32476009|reflNP_869003.1|(32476009);乙酸激酶(波羅的漆ir'/、染多齊SHI)gil32472045|reflNP—865039.1|(32472045);乙酸激酶(重應,必Yf蘿空腸彎曲亞種NCTC11168)gi|112360034|emb|CAL34826.1|(112360034);乙酸激酶(《,^^夢ir'/、染多^"SH1)gi|32446553|emb|CAD76388.1|(32446553));乙酸激酶(《TW滲ir'/、染多,SH1)gi|32397417|emblCAD72723,1|(32397417);AckA(A凝霧DSM555)gi|153954016|reflYP—001394781.1|(153954016));乙酸激酶(雙^/f麥NCC2705)gi|23465540|ref]NP—696143.1|(23465540);AckA(iA^霧DSM555)gi|146346897|gb|EDK33433.1|(146346897);乙酸激酶(^鏡并^")gi|38200875|emb|CAE50580.1|(38200875);乙酸激酶(雙友^f蘿NCC2705)gi|23326203|gb|AAN24779.1|(23326203);乙酸激酶(乙酰激酶)gi|67462089|sp|P0A6A3.1|ACKA—ECOLI(67462089);和AckA(她衣f^7f麥DSM13)gi|52349315|gb|AAU41949.1|(52349315)，每個帶有登記號的序列全部以引用的方式并入本文。石粦酸乙酰基轉移酶由大腸桿菌中的pto編碼。PTA參與到乙酸轉化為乙酰CoA的反應。具體講，即PTA催化乙酰coA轉化為乙酰磷酸。PTA的同源體和突變體已知。通過NCBI可以查到約1075種細菌磷酸乙酰基轉移酶。例如，此類同源體和突變體包括磷酸乙酰基轉移酶Pta(貓立克次氏體URRWXCa12)gi|67004021|gblAAY60947.1|(67004021);磷酸乙酰基轉移酶(印Mftco/aCc(雪松長足大奸))gi|1162569101gb|ABJ90592.1|(l16256910);pta(a/7/7/^co/a^V/勁A^"Cc(雪松長足大蟲牙))gi|116515056|reflYP—802685.1|(116515056);pta(/)rev,)w/p"'舌蠅的魏格沃菌共生體)gi|251661351dbj|BAC24326.1|(25166135);Pta(多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70)gi|127209931gblAAK02789.1|(12720993);Pta(尿'irir4f謬)gi|25989720|gblAAN75024.1|(25989720);pta(6b型^《，身#沃巖史并SLCC5334)gi|116742418|emb|CAK21542.1|(116742418);Pta(4為、乂Vf蘿副結核亞種K-10)gil41398816|gb|AAS06435.1|(41398816);磷酸乙酰基轉移酶(pta)(/專X蔬銀凌沐B31)gi卩55949341reflNP一212723.11(15594934);磷酸乙酰基轉移酶(pta)(摔X^4f凌謬B31)gi|2688508|gb|AAB91518.1|(2688508);磷酸乙酰基轉移酶(pta)(^4'替j^7f#RdKW20)gi|1574131|gb|AAC22857.11(1574131);磷酸乙酰基轉移酶PtaUe〃"ji乂/義《謬RML369-C)gi|91206026|reSYP—538381.1|(91206026);磷酸乙酰基轉移酶Pta(&〃/,ji乂z義《傳RML369-C)gi|91206025|reflYP—538380.1|(91206025);磷酸乙酰基轉移酶pta(潛#為、乂并^"Fll)gi|148720131|gb|ABR04756.1|(148720131);磷酸乙酰基轉移酶pta(/"粉^奸,Haarlem型)gill34148886|gb|EBA40931.1|(134148886);磷酸乙酰基轉移酶pta(潛/粉i并霹C)gi|124599819|gb|EAY58829.1|(124599819);磷酸乙酰基轉移酶PtaUe〃//ji乂^《伴RML369-C)gi|91069570|gb|ABE05292.1|(91069570);磷酸乙酰基轉移酶Pta(&〃//ji!/義/t謬RML369-C)gi|91069569|gb|ABE05291.1|(91069569);磷酸乙酰基轉移酶(pta)(梅毒螺旋體梅毒亞種，Nichols型)gi|15639088|ref]NP_218534.1|(15639088);和磷酸乙酰基轉移酶(pta)(梅毒螺旋體梅毒亞種，Nichols型)gi|3322356|gb|AAC65090.i|(3322356)，每個帶有登記號的序列全部以引用的方式并入本文。丙酮酸-甲酸裂解酶(甲酸乙酰基轉移酶)能夠催化丙酮酸轉化為乙酰CoA和甲酸。此酶通過在厭氧條件下由plf-活化酶誘導，產生有機自由基，在磷酸限制條件下此酶顯著減少。曱酸乙酰基轉移酶由大腸桿菌中的編碼。PFLB的同源體和突變體已知。例如，此同源體和突變體包含甲酸乙酰基轉移酶1(丙酸-甲酸-裂解酶)gi|129879|sp|P09373.2|PFLB—ECOLT(129879);甲酸乙酰基轉移酶1(歲^#農殺^并#C092)gi|16121663|reflNP—404976.1|(16121663);曱酸乙酰基轉移酶1(/度/^##^^囊《麥IP32953)gil51595748網YP—069939.1|(51595748);甲酸乙酰基轉移酶1(田鼠型鼠疫耶爾森氏桿菌生物變種91001)gi|45441037|reflNP—992576.1|(45441037);甲酸乙酰基轉移酶1(篇瘦#次諫《^勞C092)gilll5347142|emb|CAL20035.1|(115347142);甲酸乙酰基轉移酶1(田鼠型篇瘦,次,突A力:離生物變種91001)gi|45435896|gb|AAS61453.1|(45435896);甲酸乙酰基轉移酶1(爽潛^"#農殺《TP32953)gi|51589030|emblCAH20648.1|(51589030);曱酸乙酰基轉移酶H應道，/7A豚應if侈裝亞神Typhif#CT18)gi|16759843|reflNP—455460.1|(16759843);甲酸乙酰基轉移酶1(廯道，/7《巋腸道亞種傷寒A變種ATCC9150)gil56413977|reflYP—151052.1|(56413977);曱酸乙酰基轉移酶1(應道,/7A漭腸道亞種傷寒變種)gi|16502136|emb|CAD05373.1|(16502136);甲酸乙酰基轉移酶1(厲道"77A,腸道亞種傷寒A變種ATCC9150)gi(56128234(gbiAAV77740.1|(56128234);甲56酸乙酰基轉移酶1(痢疾志賀氏菌Sdl97)gi|82777577|re0YP—403926.11(82777577);甲酸乙酰基轉移酶1(2a型福氏志賀氏菌2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2-異丙基蘋果酸合成酶(Po(ywMc/eotoc^erSTIR1)gi|164506789|gb|EDQ94990.1|(164506789);2-異丙基蘋果酸合成酶(4^,孫^f麥KBAB4)gi|163939313|ref]YPJ)01644197.1|(163939313),任何帶有登記號的序列全部以引用的方式并入本文。BCCA轉氨酶催化支鏈氨基酸(BCAA)的形成。一些已知的這類轉氨酶由大腸桿菌中的z/vA'編碼。典型同源體和突變體包含下列登記號所指的序列ilvE(銅綠微囊藻PCC7806)gill59026756|emb|CAO86637.1|(159026756);IlvE(義應并霧)gi|87117962|gb|ABD20288.1|(87117962);IlvE(義應并霧)gi|87117960|gb|ABD20287.1|(87117960)gi|87117958|gbiABD20286.11(87117958)gi|8717956|gb|ABD20285.11(87117956)gi!87117954|gb|ABD20284.11(87117954)gi|87117952!gb|ABD20283.11(87117952)gi|87117950|gb|ABD20282,1|(87117950)gi|87117948|gb|ABD2028U|(87117948)gi|87117946|gb|ABD20280.1|(87117946;)IlvE義應并蘿)IlvE福-《)IlvE(插《士'"、貪蘿)IlvEc插霧)IlvE福沃士貪沃麥)IlvE福士貪沃)IlvE(福女貪)IlvE(福沃士'"、貪沃蘿)gi|87117944|gb|ABD20279.11(87117944)IlvE(福A,悉貪處gil87117942|gb|ABD20278.11(87117942);IlvE(^^A^^7t霹)gi|87117940|gb|ABD20277.11(87117940)IlvE(福《，《豚)gi|87117938|gb|ABD20276.11(87117938)IlvE(身^,S貪沃蘿gi|871179361gb|ABD20275.11(87117936)IlvE(,悉沃麥gi|87117934|gb|ABD20274.11(87117934)IlvE(^疾，悉貪臠gi|87117932|gb|ABD20273.11(87117932)IlvE(H《貴gi|87117930|gb|ABD20272.11(87117930);和IlvE(對,S貴戌#Jgi|87117928|gb|ABD20271.11(87117928)，每個帶有登記號的序列全部以引用的方式并入本文。酪氨酸轉氨酶催化二羧酸和芳香族氨基酸底物的轉氨基作用。大腸桿菌中的酪氨酸轉氨酶由tyrB基因編碼。TyrB的同源體和突變體已知。例如，此類同源體和突變體包括tyrB(滲磁#^處)gi|163857093|reflYP_001631391.1|(163857093);tyrB(辨潛掙代,)gi|16326082l|emb|CAP43123.1|(163260821);轉氨酶gi|551844|gb|AAA24704.11(551844);轉氨酶(慢生根瘤菌BTAil)gi|146404387|gb|ABQ32893.1|(146404387);酪氨酸轉氨酶TyrB(腸道沙門氏菌)gi|4775574|emb|CAB40973.2|(4775574);酪氨酸轉氨酶(鼠傷寒沙門氏菌LT2)gi|16422806|gb|AAL23072.11(16422806);和酪氨酸轉氨酶gi|148085|gb|AAA24703.1|(148085)，其所有序列均以引用的方式并入本文。丙酮酸氧化酶催化丙酮酸轉化為乙酸和C02的反應。在大腸桿菌中，丙酮酸氧化酶由pa^編碼。PoxB及其同源體和突變體包括如丙酮酸氧化酶；PoxB(大腸桿菌)gi|685128|gb|AAB31180.1|lbbml348451|bbs|154716(685128);PoxB(,^臠,/S^")gi|32815820|gb|AAP88293.1|(32815820);PoxB(大腸桿菌)gi|25269169|emb|CAD57486.1|(25269169);丙酮酸脫氳酶(應道"77A蘿腸道亞種傷寒變異型)gill65021011emblCAD05337.1|(16502101);丙酮酸氧化酶(植物乳桿菌)gi|41691702|gb|AAS10156.1i(41691702);丙酮酸脫氳酶(慢生型大豆根瘤菌)gi|20257167|gb|AAM12352.1|(20257167);丙酮酸脫氬酶(鼠疫耶爾森氏桿菌KIM)gi|22126698|reflNP—670121.1|(22126698);丙酮酸脫氛酶(細胞色素)(古典型鼠疫耶爾森氏桿菌生物變異體B42003004)gi|166211240|reflZP_02237275.1|(166211240);丙酮酸脫氫酶(細胞色素)(古典型鼠疫耶爾森氏桿菌生物變異型B42003004)gi|166207011|gb|EDR51491.1|(166207011);丙酮酸脫氮酶(番茄細菌性葉斑病菌DC3000)gi|288697031reflNP—792322.1|(28869703);丙酮酸脫氫酶(篇資泉^7'7/e^LT2)gi|16764297|reflNP—459912.1|(16764297);丙酮酸脫氫酶(腸道沙門氏菌腸道亞種傷寒變異型CT18)gi|167598081reflNP—455425.1|(16759808);丙酮酸脫氬酶(細胞色素)(々韻-伊/^ji^/義謬Dugway5J108-111)gi|154706110|ref!YP—001424132.11(154706110);丙酮酸脫氫酶(4麥NCPPB382)gi|148273312|reflYP_001222873.1|(148273312);丙酮酸脫氫酶(嗜凝/^^麥NCFM)gi|58338213|reflYP_194798.1|(58338213);和丙酮酸脫氳酶(鼠疫耶爾森氏桿菌C092)gi|16121638|reSNP—404951.11(16121638),帶有登記號的序列以引用方式并入本文。L-蘇氨酸-3-脫氫酶(ECU.U03)催化L-蘇氨酸轉化成L-2-氨基-3-氧代丁酸的反應。tdh基因編碼L-蘇氨酸-3-脫氫酶。NCBI中認可的來自細菌的L-蘇氨酸-3-脫氫酶約有700種。tdh的各種同源體和突變體包括如L-蘇氨酸-3-脫氫酶gill35560|sp|P07913.1|TDH—ECOLI(135560);L-蘇氨酸-3-脫氫酶gi|166227854|sp|A4TSC6.1|TDH—YERPP(66227854);L-蘇氨酸-3-脫氫酶gi|166227853|sp|AlJHX8.1|TDH—YERE8(166227853);L-蘇氨酸-3-脫氬酶gi|166227852|sp|A6UBM6.1|TDH—SINMW(166227852);L-蘇氨酸-3--脫氬酶gi|16622785l|sp|AlRE07.1|TDH—SHESW(166227851);L-蘇氨酸-3-脫氬酶gi|166227850|sp|A0L2Q3.1|TDH_SHESA(166227850);L陽蘇氨酸-3-脫氫酶gil1662278491splA4YCC5.1|TDH—SHEPC(166227849);L誦蘇氨酸-3-脫氬酶gil166227848|splA3QJC8.1|TDH—SHELP(166227848);L畫蘇氨酸-3-脫氬酶gi|1662278471sp|A6衡G6,11TDH一SHEB8(166227847);L-蘇氨酸-3-脫氫酶gi|166227846|sp|A3CYN0.1|TDH—SHEB5(166227846);L層蘇氨酸-3-脫氫酶gi|166227845|sp|AlSlQ3.1|TDH—SHEAM(l66227845);蘇氨酸-3-脫氫酶gil166227844|sp|A4FND4.1|TDH_SACEN(166227844);蘇氨酸-3-脫氬酶gi|166227843|sp|AlSVW5.1|TDH—PSYIN(166227843);L-蘇氨酸-3-脫氫酶gi|166227842|sp|A5IGK7.1|TDH—LEGPC(166227842);L-蘇氨酸-3-脫氫酶gil166227841|sp|A6TFL2.1|TDH—KLEP7(166227841);L-蘇氨酸-3-脫氬酶g(l166227840|sp|A4IZ92.1|TDH—FRATW(166227840);L-蘇氨酸-3-脫氬酶gil166227839|sp|A0Q5K3.1|TDH—FRATN(166227839);L-蘇氨酸-3-脫氪酶gi|166227838|sp|A7NDM9.1|TDH_FRATF(166227838);L-蘇氨酸-3-脫氬酶gi|166227837|sp|A7MID0.1|TDH_ENTS8(166227837);和L-蘇氨酸-3-脫氫酶gi|166227836|sp|AlAHF3.1|TDH—ECOK1(166227836)，帶有登記號的序列以引用方式并入本文。乙酰羥酸合成酶(例如ilvH)和乙酰乳酸合成酶(例如alsS、ilvB、ilvl)催化支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)的合成反應。義應Yf麥中的IlvH編碼乙酰羥酸合成酶(見乙酰幾酸合成酶AHASIII(IlvH)(義應并麥)gi|40846|emb|CAA38855.1|(40846)，以引用的方式并入本文)。ilvH的同源體、突變體以及構成ilvH的操縱子已知，其包含如ilvH(銅綠微嚢藻PCC7806)gi|159026908|emb|CAO89159.1|(159026908);IlvH(龍為、濕化f源并^"FZB42)gi|154686966|reflYP_001422127.1|(154686966);IlvH(淀粉液化芽孢桿菌FZB42)gi|154352817|gb|ABS74896.1|(154352817);IlvH(嗜線蟲致病桿菌)gi|131054140|gb|ABO32787.1|(131054140);IlvH(^絲^77A,)gi|7631124|gb|AAF65177.1|AF117227_2(7631124);ilvN(無害李斯特氏菌)gi|16414606|emb|CAC97322.1|(16414606);ilvN(#凝勿羞乂#jgi|64ll438|emb|CAD00063.11(16411438);乙酰羥酸合成酶(者刀為7f,Jgi|408939|gb|AAA23048.1|(408939);乙酰羥酸合成酶I,小亞基(^道^、/7A霧腸道亞種傷寒變異型)gi|16504830|emb|CAD03199.11(16504830);乙酰羥酸合成酶，小亞基(rra//7eo^aTW08/27)gil28572714|reflNP—789494.1|(28572714);乙酰羥酸合成酶，小亞基(rra-eowaTW08/27)gi|28410846|emb|CAD67232.1|(28410846);乙酰幾酸合成酶I，小亞基(i道^、/7A霧腸道亞種傷寒A變異型)ATCC9150)gi|56129933|gb|AAV79439.1|(56129933);乙酰羥酸合成酶小亞基；乙酰羥酸合成酶，小亞基gi|551779|gb|AAA62430.1|(551779);乙酰羥酸合成酶I，小亞基(濕道/，/7A霧腸道亞種傷寒變異型Ty2)gi|29139650|gb|AAO7〗216.1|(29139650);乙酰鞋酸合成酶小亞基(肉桂地鏈霉菌)gi|5733116|gb|AAD49432.1|AF175526J(5733116);乙酰羥酸合成酶大亞基；和乙酰羥酸合成酶，大亞基gi|400334|gb|AAA62429.1|(400334)，帶有登記號的序列以引用方式并入本文。乙酰乳酸合成酶基因包括alsS和ilvl。ilvl和alsS的同源體已知，例如，乙酰乳酸合成酶小亞基(長雙歧桿菌NCC2705)gi|233254891gb|AAN24137.1|(23325489);乙酰乳酸合成酶小亞基(泉趟腐嚴穿孫7f霧)gi|19918933|gb|AAL99357.1|(19918933);乙酰乳酸合成酶(固氮弧菌BH72)gi|119671178|emb|CAL95091.1|(11%71178);乙酰乳酸合成酶小亞基(冷裙一f^")gi|38199954|emb|CAE49622.1|(38199954);乙酰乳酸合成酶(固氮弧菌BH72)gi|119669739|emb|CAL93652.1|(l19669739);乙酰乳酸合成酶小亞基A捧炎Vf,K411)gi|68263981|emb|CAB7469.1|(68263981);乙酰乳酸合成酶小亞基(祐^"f逸7f^")gi|1770067|emb|CAA99562.1|(1770067);乙酰乳酸合成酶同工酶1小亞基(AHAS-I)(乙酰羥酸合成酶同工酶1小亞基)(ALS-I)gi|83309006|sp|P0ADF8.1|ILVN_ECOLI(83309006);乙酰乳酸合成酶大亞基；(;^y^^f孫^1,)gi|19918932|gb|AAL99356.1|(19918932);和乙酰乳酸合成酶，小亞基(應^嗜;^Mf^"MB4)gi|20806556|reflNP—621727,1|(20806556),帶有登記號的序列以引用方式并入本文。NCBI中所列ilvB同源體和突變體約為1120種。乙酰羥酸還原異構酶是異亮氨酸和纈氨酸生物合成平行途徑中的第二個酶。大腸桿菌中的//vC編碼乙酰羥酸還原異構酶。ilvC的同源體和突變體已知，包括如乙酰羥酸還原異構酶(粟酒裂殖酵母972h-)gi|l62312317|rei!NP_00l018845.2|(l623l23]7);乙酰羥酸還原異構酶(粟酒裂殖酵母)gi|3116142|emb|CAA18891.1|(3116142);乙酰羥酸還原異構酶(被潘脊母YJM789)gi|151940879|gb|EDN59261.1|(151940879);11v5p:乙酰羥酸還原異構酶(凍潘,母)gi|609403|gb|AAB67753.1|(609403);ACL198Wp(棉病囊菌ATCC10895)gi|45185490|ref]NP—983206.11(45185490);ACL198Wp(棉病嚢菌ATCC10895)gi|44981208|gb|AAS51030.1|(44981208);乙酰幾酸還原異構酶；Uv5x(釀酒酵母)gi|957238|gb|AAB33579.1||bbm|369068|bbsll65406(957238);乙酰羥酸還原異構酶；11v5g(釀酒酵母)gi|957236|gb|AAB33578.1||bbm|369064|bbs|165405(957236);和乙酰幾酸還原異構酶(粟酒裂殖酵母)gi|2696654|dbj|BAA24000.11(2696654),每個帶有登記號的序列均以引用方式并入本文。二羥酸脫水酶催化異亮氨酸和纈氨酸生化合成途徑中的第四步反應，即2,3-二羥基-異戊酸脫水生成a-酮異戊酸。//vD和//v3編碼二羥酸脫水酶。二羥酸脫水酶的同源體和突變體已知，包含如IlvD(^U^為V乂并麥Jgi|2104594|emb|CAB08798.1|(2104594);二羥酸脫水酶(TropherymawhippleiTW08/27)gi|28410848|emb|CAD67234.1|(28410848);二羥酸脫水酶(虐^為V乂并#7gill3093837|emb|CAC32140.1|(13093837);二羥酸脫水酶(^羅W滲irV、染多#SH1)gi|32447871|emb|CAD77389.1|(32447871);和推定的二羥酸脫水酶(金黃色葡萄球菌金黃色亞種MRSA252)gi|49242408|emb|CAG41121.1|(49242408),每個帶有登記號的序列均以引用方式并入本文。2-酮酸脫羧酶催化2-酮酸轉化為相應醛的反應。例如，2-酮異戊酸脫羧酶催化2-酮異戊酸轉化為異丁醛的反應。已知一些2-酮酸脫羧酶,例如由pdc、pdcl、pdc5、pdc6、aro10、thl3、kdcA和kivd基因編碼的2-酮酸脫羧酶。對2-酮酸轉化為相應醛的反應起催化作用的典型同源體和突變體包含下列登記號所指的序列及已鑒定的酶活性gi|44921617|gb|AAS49166.1|支鏈oc-酮酸脫羧酶(乳酸乳球菌)；gi|15004729|ref1NP_149189.1|丙酮酸脫羧酶(/^^7"舉凝蘿ATCC824);gi|82749898|reflYP—415639.11可能的丙酮酸脫羧酶(金黃色葡萄糖球菌RF122);gi|77961217|reflZP_00825060,l|COG3961:丙酮酸脫羧酶及相關的硫胺素焦磷酸所需的酶(:#沃#^4沃^"ATCC43969);gi|71065418|reflYP—264145.11推定的丙酮酸脫羧酶(北極嗜冷桿菌273-4);gi|16761331|rei!NP—456948.|推定的脫羧酶(腸道沙門氏菌腸道亞種傷寒變異型)CT18);gi|930057921reflYP_580229.11丙酮酸脫羧酶(cryohalolentis嗜冷桿菌K5)gi|23129016|reflZP_00110850.1|COG3961:及相關的硫胺素焦磷酸所需的酶(點形念珠藻PCC73102);gi|16417060|gb|AAL18557.1|AF354297J丙酮酸脫羧酶(眾乂V^難巖)；gill5607993lreflNP—215368.1l可能的丙酮酸或巧l味-3誦丙酮酸脫羧酶PDC(潛核為V乂奸麥H37Rv);gil41406881|reflNP—959717.11Pdc(^》Vi許^"^潛i亞神K-10);gi|91779968|ref]YP—555176.11推定的丙酮酸脫羧酶(xe"ovora似伯克氏菌LB400);gi|15828161|reflNP—302424.1|丙酮酸(或p引咮丙酮酸)脫羧酶(y^乂為V乂并巖TN);gi|118616174|ref]YP—904506.11丙酮酸或吲哚-3-丙酮酸脫羧酶Pdc(潰瘍分枝桿菌Agy99);gil67989660|reflNP_001018185.1|推定蛋白SPAC3H8.01(,潘*磁##972h畫)；gi|21666011|gb|AAM73540.1|AF282847—1丙酮酸脫羧酶PdcB(^橫躇J，'gi|69291130|reflZPJ)0619161.1|丙酮酸脫羧酶丙酮酸脫羧酶(耐輻射f,力eococcwsSRS30216);gil66363022|reflXP—628477.1|丙酮酸脫羧酶(愛荷華凝V、潛孩f^II);gi|70981398|reflXP—731481.11丙酮酸脫羧酶(乂欲必,Af293);gi|121704274|ref]XP—001270401.11丙酮酸脫羧酶，推定(舉必#NRRL1);gi|119467089|re^XPJ)01257351.1|丙酮酸脫羧酶，推定(資^齊,托,181);gi|26554143|reflNP_758077.11丙酮酸脫羧酶(,遞乂^謬HF-2);gi|21666009|gb|AAM73539.11AF282846—1丙酮酸脫羧酶PdcA(米根酶入醇脫氫酶(adh)催化氨基酸分解代謝的最后一步反應，即醛轉化為長鏈或復雜醇。在此項技術中，各種"W基因已知。如本文所指出的，adhql同源體和突變體包括如adh2、adh3、adh4、adh5、adh6和sfal(見SFA(顏灑脊母)gil288591|emb|CAA48161.1|(288591);帶有登記號的序列以引用方式并入本文中)。檸蘋酸合成酶催化丙酮酸和乙酸的縮合反應。C,""編碼檸蘋酸合成酶。同源體和突變體已知，包括如檸蘋酸合成酶(雙必錄端舉凌#Patoc變異型)gi|116664687|gblABK13757.1|(116664687);檸蘋酸合成酶(雙命錄4:螺，炎糸Monteralerio變異型)gi|116664685|gb|ABK13756.1|(l16664685);檸蘋酸合成酶(河#鉤端螺《#Hebdomadis變異型)gi|1166646831gb|ABK13755,l|(116664683);檸蘋酸合成酶(河子鉤端螺凌雄Pomona變異型)gi|116664681|gb|ABK13754.1|(116664681);檸蘋酸合成酶(河Australis變異型)gi卩16664679|gb|ABKl3753.11(116664679);檸蘋酸合成酶(河#錄_#4#凌傳Autumnalis變異型)gi|116664677|gb|ABK13752.1|(l16664677);檸蘋酸合成酶(河子錄屏舉凌傳Pyrogenes變異型)gi|116664675|gb|ABK13751.1|(l16664675);梓蘋酸合成酶(/7#錄屏謬凌雄Canicola變異型)gi|116664673|gb|ABK13750.1|(l16664673);檸蘋酸合成酶(河子錄端^^謬Lai變異型)gi|l16664671igbjABK13749.1((H6664671);CimASemaranga變異型)gilll9720987lgblABL98031.1|(119720987);(R)-檸蘋酸合成酶gi|2492795|sp|Q58787.1|CIMA—METJA(2492795);(R)-檸蘋酸合成酶gi|22095547|sp|P58%6.1ICIMA一METMA(22095547);(R)-檸蘋酸合成酶gi|220015541sp|Q8TJJl.l|CIMA—METAC(22001554);(R)-檸蘋酸合成酶gi|22001553|sp|O26819.1|CIMA—METTH(22001553);(R)-檸蘋酸合成酶gi|22001555|sp|Q8TYBl,l|CIMA—METKA(22001555);(R)-檸蘋酸合成酶(海沼甲烷球菌S2)gi|45358581|reflNP—988138.1|(45358581);(R)-檸蘋酸合成酶(海沼甲烷球菌S2)gi|44921339|emb|CAF30574.1|(44921339);以及與(R)-檸蘋酸合成醉相似的醉(C"wd/(iafM5:ATwewew/astuttgartiensis)gi|91203541|emb|CAJ71194.1|(91203541)，每個帶有上述登記號的序列以引用的方式并入本文。在一實施方案中，本發明提供的微生物可表征為含有miBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78(F轉導自XL-1BLUE，以提供laclq)、AadhE、AldhA、AfrdBC、Afnr、Apta和ApflB，及pSA55和pSA69的大腸桿菌，其中pSA55是一種從ColEl原點構建的質粒，其含有受PLlacOl調控的(#乙凝/乙^齊)和(麟灑##)基因和一氨卡西林抗性基因，/7&4M是一種源自pl5A起點的質粒，其舍有受PLlacOl調控的akS(祐，^"孩許霧)、,/vC(義應許^")和(義應^f,)基因和一卡那霉素抗性基因。在另一實施方案中，本發明提供的微生物可表征為含有rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78(F轉導自XL-1BLUE,以提供laclq)、AmetA、Atdh、AilvB、Ailvl和AadhE,及pCS49、pSA62和pSA55I的大腸桿菌，其中pSA551為從ColEl原點構建的質粒，其含有受PLlacOl調控的hvd(乳酸乳球菌)和(釀游脊學)基因和一種氨千西林抗性基因，lacl位于氨千西林抗性基因之后，pSA62是一種源自pl5A起點的質粒，其含有受PLlacOl調控的,7vj(義凝7f^")和/a^4SCD(義廯Yf霧)基因和一卡那霉素抗性基因，pCS49是一種源自pSC10P起點的質粒，其含有受PLlacOl調控的AM(/^)萬Cf義應并霧J基因和一種壯觀霉素抗性基因。本發明還提供了被保存的微生物。被保存的微生物只是代表性的，根據本發明，本發明所屬領域的技術人員能夠修飾其他不同種或不同基因型的親本微生物，以獲得本發明提供的能夠產生異丁醇和正丁醇的微生物。本發明提供了一種被命名為SA237的重組微生物，其ATCC登記號為no._,于2008年2月7日由ATCC保存。本發明包含微生物的培養物，此培養物含有ATCC登記號為no._的一種微生物群體，其包括混合培養物。本發明還提供源自ATCC登記號為no._的多聚核苷酸片段，其用于制備一種生產異丁醇的微生物，產率為每克葡萄糖產出0.12至0.41克異丁醇。例如，此多聚核苷酸片段的堿基對數量可以從1000個左右到數百萬個。本發明還包含異丁醇或苯基乙醇生產過程中的生物反應器，此反應器含有一定數量的微生物，這些微生物的ATCC登記號為_。使用被保67存微生物時，本領域技術人員能夠很容易確定被保存微生物或其任何基因片段以及本文所述的多聚核苷酸片段的序列，包括定位敲除或破壞的基因。本發明還提供了一種被命名為CRS-BuOH23的重組微生物，其ATCC登記號為no._，于2008年2月7日由ATCC保存。本發明包含微生物的培養物，此培養物含有一定數量的ATCC登記號為no.的微生物，包括混合培養物。本發明還提供源自ATCC登記號為no._的多聚核苷酸片段，它將用于制備一種生產正丁醇的微生物。例如，此多聚核苷酸片段的堿基對數量可以從1000個左右到數百萬個。本發明還包含正丁醇生產過程中的生物反應器，此反應器含有一定數量的微生物，這些微生物的ATCC登記號為_。使用被保存微生物時，本領域技術人員能夠很容易確定被保存微生物或其任何基因片段以及本文所述的多聚核苷酸片段的序列，包括定位基因敲除或基因破壞。應當了解，可以對一系列微生物進行修飾，使它們含有適合于生產正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-曱基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇的重組代謝途徑。應當了解，有多種微生物都能作為編碼合適目標酶的遺傳物質的"來源"，這些目標酶適用于本發明提供的重組微生物。術語"微生物，，包括古細菌域、細菌域和真核生物域內的原核和真核微生物物種，后者包括酵母菌和絲狀真菌、原生動物、藻類或高級原生生物。術語"微生物細胞"和"微生物(microbe)"可以與"微生物(microorganism)"互換^f吏用。術語"原核生物"指本發明所屬領域公認的并且指不含細胞核或其他細胞器的細胞。"原核細胞"通常被歸為細菌域和古細菌域這兩個域中的一個。古細菌域和細菌域的明顯區別在于16S核糖體RNA的核普酸序列間的根本不同。術語"古細菌域"指疵壁菌門中的一類微生物，它們通常存在于特殊環境中，并且在許多方面不同于其他原核生物，包括核糖體蛋白的數量以及細胞壁中胞壁酸的缺乏。通過ssrRNA分析，古細菌包含兩種在系統進化上截然不同的種群泉古菌門和廣古菌門。根據它們的生理學特征，古細菌可被分為三種類型產曱烷菌(能產生曱烷的原核生物)；極端嗜鹽菌(能在含有極高濃度的鹽(Nacl)環境中生存的原核生物)；和極端(超)嗜熱菌(能在極高溫度環境中生存的原核生物)。這些原核生物除了具有與細菌不同的統一的古細菌特性(例如細胞壁中無胞壁質、細胞膜脂之間由酯質相連，等)外，它們還展現出獨特的結構或生化特性，這使它們能夠適應特殊的生境。泉古菌門主要包括超嗜熱硫依賴原核生物，廣古菌門則包含產甲烷菌和極端嗜鹽菌。"細菌，，或"真細菌"指原核生物域。細菌至少包括以下11個不同種群(1)革蘭氏陽性(gram+)細菌，其中主要有兩個分支(1)高G+C組(放線菌、分枝桿菌、微球菌等)(2)低G+C組(桿菌、梭菌、乳桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、支原體)；(2)變形菌門，例如，紫色光合菌+非光合革蘭氏陰性細菌(包括大多數"常見"的革蘭氏陰性細菌)；(3)藍細菌，例如生氧光能菌；(4)螺旋體及相關菌種；(5)浮霉狀菌；(6)類桿菌、黃桿菌；(7)衣原體；(8)綠色硫細菌；(9)綠色無硫細菌(也稱為厭氧光能菌)；(10)耐輻射微球菌及相關菌種；(11)熱袍菌和嗜熱棲熱腔菌屬。"革蘭氏陰性細菌，，包括球菌、非腸道桿菌和腸道桿菌。革蘭氏陰性細菌屬包括如奈瑟菌、螺旋菌、巴氏桿菌、布魯氏菌、耶爾森氏菌、弗朗西斯氏菌、嗜血桿菌、博德特氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌，志賀氏菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、弧菌、假單胞菌、類桿菌、醋酸桿菌、產氣桿菌、土壤桿菌、固氮菌、螺旋菌、沙雷氏菌、弧菌、根瘤菌、衣原體、立克次氏體、密螺旋體和梭桿菌。"革蘭氏陽性細菌，，包括球菌、無孢桿菌和有孢桿菌。革蘭氏陽性細菌屬包括如放線菌、桿菌、梭菌、棒狀桿菌、丹毒絲菌、乳桿菌、李斯特氏菌、分枝桿菌、粘球菌、諾卡氏菌、葡萄球菌、鏈球菌和鏈霉菌。術語"重組微生物"和"重組宿主細胞"在本文中互換使用，指微生物經過基因修飾，用于表達或過度表達內源性多聚核苷酸，或表達非內源性序列如存在于栽體的序列或減少表達內源性基因。此多聚核苷酸通常編碼與參與產生上述所需的代謝產物的代謝途徑的目標酶。因此，本文中描述的重組微生物已經過基因改造，能夠表達或過度表達目標酶，此目標酶未被親本微生物表達或過度表達過。應當了解，術語"重組微生物"和"重組宿主細胞"不僅指特定的重組微生物，還指此微生物的子代或潛在子代。"親本微生物"指用來制造重組微生物的細胞。術語"親本微生物"描述了一種自然產生的細胞，即未經過基因修飾的"野生型"細胞。術語"親本微生物"還描述了一種經過基因修飾的細胞，但是此細胞不能表達或過度表達目標酶，例如參與生物合成途徑以能夠產生所需的例如以下代謝產物的酶正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-曱基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。例如，一種野生型微生物通過基因修飾，能夠表達或過度表達硫解酶等第一目標酶。此微生物能作為親本微生物制造修飾微生物，以表達或過度表達第二目標酶，例如幾丁酰CoA脫氫酶。反過來，表達或過度表達如硫解酶和羥丁酰CoA脫氫酶的修飾微生物可經過再修飾，以表達巴豆酸酶等第三目標酶。因此，親本微生物可作為連續基因修飾的參考細胞。每次修飾通過向參考細胞里引入核酸分子來實現。引入核酸分子有利于表達或過度表達目標酶。應當了解，術語"有利于"包含通過對親本微生物體內啟動子序列的基因修飾來激活編碼目標酶的內源性多聚核苷酸。還應了解，術語"有利于"也包含將編碼目標酶的外源性多聚核苷酸引入親本微生物。在另一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能將合適的碳底物轉化為正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。此方法包括用編碼包括以下多肽的一種或多種重組多聚核苷酸轉化一種微生物例如乙酰羥酸合成酶(如//v///操縱子)、乙酰輕酸還原異構酶(如,7vC)、二羥酸脫水酶(如//vD)、2-酮酸脫羧酶(如尸DC6、JK(9川、77//3、或；^c)、2-異丙基蘋果酸合成酶(如)、|3-異丙基蘋果酸脫氫酶(如/6^)、異丙基蘋果酸異構酶(如/^CZ)操縱子)、蘇氨酸脫水酶(如z7v/1)、a-異丙基蘋果酸合成酶(如cwl4)、P-異丙基蘋果酸脫氫酶(如/eW)、異丙基蘋果酸異構酶(如leuCD操縱子)、蘇氨酸脫水酶(如z/vt4)、乙酰乳酸合成酶(如//vA/G或//vtVS)、乙酰鞋酸還原異構酶(如,7vC)、二鞋酸脫水酶(如,7vD)、p-異丙基蘋果酸脫氫酶(如leuB)、分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶(如;/j")、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶(如(y^)、2-酮酸脫羧酶(如hvfl、尸DC6或和醇脫氫酶活性。編碼用于生成代謝物的酶的多聚核苷酸用于重組核酸分子，這些酶包括其同源體、突變體、片段、相關融合蛋白或具有相同功能的物質，所述重組核酸分子引導此類多肽在合適的宿主細胞如細菌或酵母菌細胞內表達。應當了解，如果增加序列不會改變多聚核苷酸的編碼活性，例如加入非功能性或非編碼序列，則構成對基本核酸的保守性改變。酶的"活性"是測定其催化生成代謝物反應的能力，即"起作用"，可表示為反應生成代謝物的速率。例如，酶活性可用單位時間或單位酶產生的代謝物的量(例如濃度或質量)表示，或用親和性或電離常數表示。"蛋白質"或"多肽"在本文中互換使用，它們包含一條或多條化學結構單元，即通過化學鍵即肽鍵聯結在一起的氨基酸。"酶"指任何全部或大部分由蛋白質構成的任何物質，它能在一定程度上特異性地催化或促進一個或多個化學或生化反應。術語"酶"也可指具有催化能力的多聚核苷酸(例如RNA或DNA)。"天然"或"野生型"蛋白質、酶、多聚核苷酸、基因或細胞指自然界中存在的蛋白質、酶、多聚核苷酸、基因或細胞。應當了解，上述多聚核苷酸包括"基因"，上述核酸分子包括"載體"或"質粒"。例如，編碼酮基硫解酶的多聚核苷酸可由"/ofi基因或其同源基因編碼，或由/a6M或其同源基因編碼。因此，術語"基因"又稱為"結構基因"，指編碼特定氨基酸序列的多聚核苷酸，此氨基酸序列構成全部或部分蛋白質或酶，并且可能包含調控的(非轉錄的)DNA序列，例如啟動子序列，此序列決定基因的表達條件。基因的轉錄區域可能包含非翻譯區域，包括內含子、5'-非翻譯區域(UTR)、3'-UTR及編碼序列。術語"核酸"或"重組核酸"指多聚核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)以及在適當的情況下指核糖核酸(RNA)。關于基因序列的"表達"這一術語是指基因的轉錄，以及在適當的情況下指產生的mRNA轉錄物翻譯為蛋白質這一過程。因此，通過本文可以清楚了解蛋白質的翻譯是開放閱讀框序列的轉錄以及翻譯的結果。術語"操縱子"指從一個共同啟動子轉錄為一個轉錄單元的兩個或多個基因。在某些實施方案中，這些構成操縱子的基因為鄰接基因。應當了解，通過修飾共同的啟動子可以對整個操縱子的轉錄進行修飾(如增加、減少或缺失)此外，可以對操縱子內的任何基因或基因組合進行修飾，以改變被編碼多肽的功能或活性。修飾可以提高被編碼多肽的活性。此外，修飾可以賦予被編碼蛋白質新活性。代表性的新活性包括能夠使用替代性底物和/或能夠在替代性環境條件下起作用。"載體"指任何能夠在生物體、細胞或細胞組分間傳播和/或轉移核酸的工具。載體包括病毒、噬菌體、前病毒、質粒、噬菌粒、轉座子和人工染色體，例如YACs(酵母菌人工染色體)、BACs(細菌人工染色體)和PLACs(植物人工染色體)，及"游離體"類，即能夠自主復制或整合進宿主細胞的染色體中。載體也可以是棵體RNA多聚核苷酸、棵體DNA多聚核苷酸、在同一條鏈上包含DNA和RNA的多聚核苷酸、聚賴氨酸結合的DNA或RNA、肽結合DNA或RNA、脂質體結合DNA，或自然界中不能游離存在的一類多聚核苷酸，或者可以是包含一種或多種上述多聚核苷酸構建體的生物體，例如土壤才干菌^纟田菌。71"轉化，，指將載體引入宿主細胞的過程。可通過包括電穿孔、顯微注射、生物彈射(或粒子轟擊介導的遞送)或農桿菌介導轉化的任何一種方式實現轉化(或轉導、轉染)。如本發明所屬領域的技術人員所公認的，由于遺傳密碼的簡并性，許多具有不同核苷酸序列的DNA化合物可用于編碼本發明中的某個氨基酸序列。本文對編碼上述生物合成酶的天然DNA序列的引用僅用于描述本發明的一個實施方案，公開的內容包括對本發明提供的方法中利用的酶和多肽的氨基酸序列進行編碼的任何序列的DNA化合物。按照類似方式，通常可以允許多肽的氨基酸序列中一個或多個氨基酸的替代、缺失和插入，而不對其所需的活性造成損害或嚴重損害。本發明包括具有可置換氨基酸序列的多肽，并且本文所示的DNA序列編碼的氨基酸序列僅用于描述本發明的實施方案。本發明以重組DNA表達載體或質粒的形式提供核酸分子，如下文詳述，此核酸分子編碼一種或多種目標酶。一般情況下，此類載體能夠在宿主微生物的細胞質內復制或整合進宿主微生物的染色體DNA中。在這兩種情況下，此載體是穩定載體(即，即使只存在選擇壓力，經過多次細胞分裂，此載體仍能存在下去，)或短暫載體(即隨著細胞分裂，此載體會逐漸在宿主微生物中丟失)。本發明提供經分離(即不純，以自然界中沒有的豐度和/或濃度存在于制品中)和純化(即基本上不含污染物質，或基本上不含有自然界中發現的與相應DNA在一起的物質)的DNA分子。本文提供一個或多個生物合成基因的異源表達方法以及此方法所用的重組DNA表達載體，這些基因涉及正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和/或2-苯基乙醇的生物合成。因此，包含此類核酸的重組表達載體包括在本發明的范圍內。術語"表達載體"指一種能夠被引入宿主微生物或無細胞轉錄和翻譯系統的核酸。表達載體可永久或暫時存在于微生物中，不論是作為染色體的一部分或作為其他DNA存在于微生物中或任何細胞器中，例如細胞質中的復制載體。一個表達載體同樣含有啟動RNA表達的啟動子，在微生物或細胞抽提物中RNA通常被翻譯成多肽。為了有效地將RNA翻譯成蛋白質，表達載體通常還要含有核糖體結合點序列，此序列位于待表達基因編碼序列起始密碼子的上游。其他元件如增強子、分泌信號序列、轉錄終止序列以及一個或多個標記基因也可能存在于表達載體中，通過標記基因可以識別和/或選擇含有栽體的宿主微生物。當轉化細胞在合適的選擇培養基中生長時，利用可選標記即具有抗生素抗性或對抗生素敏感的基因賦予轉化細胞可選表型。表達載體的各種組分可以有很大差異，這取決于載體的用途和供載體進行復制或啟動表達的宿主細胞。適用于大腸桿菌、酵母菌、鏈霉菌及其他常用細胞中基因表達和載體維持的表達載體組分已廣為人知，且可以購買。例如，本發明所述的載體含有能夠在真核或原核宿主微生物中起作用的合適啟動子。啟動子可以含有調控序列，來調控與宿主微生物生長有關的表達，或在某種化學或物理刺激下引起基因表達的開啟和關閉。對于大腸桿菌和其他細菌宿主而言，可以利用源自生物合成酶、抗生素抗性酶及噬菌體蛋白基因的啟動子，這些啟動子包括半乳糖啟動子、乳糖(lac)啟動子、麥芽糖啟動子、色氨酸(trp)啟動子、p-內酰胺酶(bla)啟動子、噬菌體XPL啟動子和T5啟動子。此外，也可以利用合成啟動子，例如tac啟動子(第4,551,433號美國專利)。對于大腸桿菌表達載體，包含大腸桿菌的復制起點例如pUC、plP、pl和pBR是有用的。因此，重組表達載體包含至少一個表達系統，反過來，表達系統由至少部分PKS和/或其他可通過操作連結到啟動子的生物合成基因編碼序列和可選的終止序列組成，啟動子和終止序列能夠作用，使編碼序列在相容的宿主細胞里表達。通過利用本發明所述重組DNA表達載體進行轉化，從而對宿主細胞進行修飾，使其含有表達系統序列，此序列可能位于染色體外，或者被整合進染色體中。可根據標準PCR擴增技術以及下迷實施例中的流程，利用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，并采用合適的低聚核苷酸引物，對本發明所述的核酸進行擴增。被擴增的核酸可被克隆到合適的載體上，并通過DNA序列分析表征。此外，可通過標準技術制備核苷酸序列的相應低聚核普酸，例如利用DNA自動合成器。應當了解，編碼與本文所述的酶同源的多肽的分離核苷酸分子，能夠通過向編碼特定多肽的核苷酸序列引入一個或多個核普酸置換、增加或缺失制備，這樣可向編碼蛋白質引入一個或多個氨基酸置換、增加或缺失。可利用標準技術，例如定點誘變和PCR介導誘變，將突變引入多聚核苷酸中。與那些可能需要進行非保守氨基酸置換(見上文)的位點不同，一些位點更適宜進行保守氨基酸置換。"保守氨基酸置換"指用具有相似側鏈的氨基酸殘基替換氨基酸。73本發明所屬領域對具有相似側鏈的氨基酸殘基家族進行了定義。這些氨基酸家族包括堿性側鏈氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈氨基酸(如天門冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈氨基酸(如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、P-分支側鏈氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳烴側鏈氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。在另一實施方案中，提供了生產正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇的方法。此方法包含存在合適底物的情況下，以及在適于將底物轉化為正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基l-丁醇、3-甲基1-丁醇或2-苯基乙醇的條件下，培養本發明提供的重組微生物，可采用技術人員熟知的方法檢測本發明提供的微生物產生的醇。此類方法包括質語法，詳見以下說明及表6。適于本發明提供的重組微生物的生長和保存的培養條件見下述實施例。正如技術人員所公認的，此類條件可以根據每種微生物的需求進行修改。如前所述，描述本發明所用的包括使用載體、啟動子的分子生物學技術以及其他許多相關專題的一般性文檔，包括Berger與Kimmel的《分子克隆技術指南》，第152巻《酶學方法》(AcademicPress,Inc.,圣地亞哥，加利福尼亞)("Berger");Sambrook等的《分子克隆實驗手冊》第二版，第1-3巻，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989("Sambrook")和《現代分子生物學實驗技術》，F.M.Ausubel等編著，《現代實驗技術》，GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.聯合出版，(1999年增補)("Ausubel")。足以幫助技術人員掌握體外擴增方法(包括聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、QP復制酶擴增和其他RNA聚合酶介導技術(例如NASBA))以例如用于生產本發明所述的同源核酸的實驗技術實例可在以下文獻中找到Mullis等人(1987)U.S.Pat.No.4,683,202;InnisW"/.,eds.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPressInc.SanDiego,Calif.)("Innis");Arnheim&Levinson(Oct.1,1990)C&EN36-47;TheJournalOfNIHResearch(1991)3:81-94;Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173;Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874;Lomell等人(1989)J.Clin.Chem35:1826;Landegren等人(1988)Science241:1077-1080;VanBrunt(1990)Biotechnology8:291-294;WuandWallace(1989)Gene4:560;Barringer等人(1990)Gene89:117;andSooknananandMalek(1995)Biotechnology13:563-564.Improvedmethodsforcloningz力v"raamplifiednucleicacidsaredescribedinWallace&a/.,U.S.Pat.No.5,426,039.ImprovedmethodsforamplifyinglargenucleicacidsbyPCRaresummarizedinCheng等人(1994)Nature369:684-685及其參考文獻，其中產生了高達40kb的PCR擴增子。技術人員會認識到，從本質上講，任何RNA都能用逆轉錄酶和聚合酶轉變為雙鏈DNA,以適用于限定消化、PCR擴增及測序。詳見上述Ausubel、Sambrook和Berger等的文獻。合適的培養條件包括培養基的pH、離子強度、營養含量等；溫度；產化合物的其他培養條件。能夠作為宿主細胞的微生物的合適培養條件已熟知。本發明通過以下實施例進行闡述，此實施例是以i兌明的方式而不是限制性的方式提供。本發明的代表性微生物根據《布達佩斯條約》于2008年2月7日保存在美國模式培養物保藏所，郵箱弗吉尼亞州馬納薩斯1549號，郵編20108，ATCC號碼為_(名稱為SA237的微生物)和ATCC號碼為(名稱為CRS-BuOH23的微生物)。保存的微生物存放在經認可的存放處。在保存方最近一次收到發放樣本的請求后五年內；或自保存之日起至少三十年內；或處于相關專利的實施壽命內(以最長時間計)，如微生物發生突變、沒有活力或遭到破壞，則可對其進行更換。專利一經授權，即會不可撤消地去掉專利申請中關于對公眾獲得這些細胞系的所有限制。實施例用于PCR反應的KODDNA聚合酶購自EMDChemicals(圣地亞哥，加利福尼亞)。所有限制性內切酶和熱銅:磷酸酶(antarcticphosphatase)均來自NewEnglandBiolabs(伊普斯威奇，馬薩諸塞州)。快速DNA連接試劑盒來自Roche(曼海姆，德國)。低聚核苷酸購自Operon(亨茨維爾，阿拉巴馬州)培養基中的所有抗生素和試劑均購自SigmaAldrich(圣路易斯，密蘇里州)或FisherScientifics(休斯頓，田納西州)。表10中列出了所使用的低聚核苷酸。表10:表10采用的菌林、質粒和低聚核苷酸菌林基因型BW25113recZ/朋必/ZA,-/w"http://ore(F/,'(WStoc戶ZM/"XL-1BLUE(TetR))BW25113F'BW25113(,ral)36，pm4"+，/ac/9Z廁75(TetR))CRS21CRS22BW25113F'A膨"，CRS23BW25113F'A應M，禍，,緒CRS24BW25113F'A"uM，織z城,MCRS31CRS-BuOH2BW25113F'Am"A她卜pCS49/pSA62/pSA551CRS-BuOH11BW25113FA/mt4，to%，〃v萬，/7v/十pCS49/pSA62/pSA551CRS-BuOH12BW25113F'+pCS49/pSA62/pSA551CRS-BuOH18BW25113F'Am"A織z城歸+pCS49/pCS51/pSA551CRS-BuOH19BW25113FAme"，織歸，,M十pCS49/pCS20/pSA551CRS-BuOH20BW25113F'A靴M，織歸,,M+pCS49/pCS50/pSA551CRS-BuOH23BW25113FAwe試&%，；7vS，Wv/，+pCS49/pSA62/pSA551CRS-BuOH31BW25113F+pSA62/pSA551CRS-BuOH32BW25113F十pCS49/pSA62/pSA551質粒基因型pZA31-lucPLtetOi::/wc(W)，pl5Aori;CmKpZS24-MCSlPUac/ara"::MCS1;pSC101ori;KanRpCS20PiJacOi::,afc^(EC)-/ew^ffCZ)(EC);pl5Aori;KanRpCS27PLlacOi::MCS1;pi5Aori;KanRpCS49PiJacOi::■*SC(ECATCC21277);pSClOlori;SpecRpCS50PiJacOi::tafc/(EC)-/CD(ECG462Dmut);pi5Aori;KanRpCS51PLlacO,::z7vX(EC)-/"/4*SCZ)(ECG462Dmut);pl5Aori;KanRpSA55IPJacCh::A:,w/(LL)-at//^(SC)，ColElori;AmppCS59PJacCh::決M5C(EC);pSC101ori;SpecRpSA62PiJacCh::〃"(EQ-Zew/lgaXEC),pi5Aori;KanR引物名稱序列3'tofcSr&//*力fJcc65CTAGAGCTCGAAGGAGATATACCATGAAACCAGTAACGTTATACGATG(序列ID號83)CTAGAGCTCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC(序列ID號84)CGAGCGGTACCATGCATATTACATACGATCTGCCGG(序列ID號86)ACGCAGTCGACTTAAGCGTCAACGAAACCGGTGATT(序列ID號86)TCAGGTACCATGCGAGTGTTGAAGTTCGGCGGTACAT(序列ID號87)TCAAAGCTTTTACTGATGATTCATCATCAATTTACGCAA(序列ID號88)蘿#。義應Vf蘿BW251130r"Sr"d/acZ^w/w^5"ZfaraA4L>u3z^/w/^A^7》在比較時被指定為野生型(WT)(DatsenkoandWanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97,6640—6645,2000)。在一些異丁醇實驗中，JCL16(m5T14用作野生型(WT)。利用Keio保藏菌抹作為供體，通過PI轉導實現宿主we",W/z、,7vS、"v/、a^五，pto、Ml4和基因的缺失(Baba等，Mol.SystemsBiol.2,2006)。通過位于各連續敲除基因間的pCP20(Datsenko和Wanner,如上所述)，以去除被插入到目標基因區域中的kanR。然后，采用合適的引物進行菌落PCR，以驗證基因片段的去除情況。XL-1BLUE(Stratagene,拉荷亞，加利福尼亞州CA)用于擴增所有的質粒。_#在^^々建。按照本文其他地方所述設計和構建pSA40、pSA55和pSA62。用引物/"c/Saclf和/oc/Sadr從大腸桿菌MG1655基因組DNA擴增/ac/基因。然后，PCR產物經過Sacl的消化，并連接到用相同的酶切割過的pSA55開環載體中，切割點位于氨千西林抗性基因的啟動子后，由此生成pSA55L利用義應Yf^"^『257/3WT基因組DNA和引物WWfAcc65和rSalIPCR擴增WcB基因。其PCR產物經過凝膠純化，并用Acc65和77Sall消化。然后，將經過消化的片段連接到用同一對酶切割過的pSA40開放載體中，由此生成pCS14。為將pCS14的復制起點從colEl置換為pl5A,用Sacl和AvrII消化pZA31-luc。較短的片段經過凝膠純化，被克隆到用相同的酶切割過的pCS14質粒中，由此生成pCS16。使用A106和A109作為引物、使用義應Yf麥BW25113基因組DNA作為模板，對操縱子/eiM5CD進行擴增。其PCR產物經過Sail和BglII的切割，連接到經Sail和BamHI消化過的pCS16中，由此生成pCS20。為構建與pSA40相同但具有pl5A復制起點的表達質粒，我們將用Sacl和AvrII消化pZA31-luc獲得的pl5A片段克隆到用相同限制性內切酶切割過的pSA40開》丈載體中，由此生成pCS27。采用重疊延伸剪接技術(SOE)以G462Df和G462Dr為引物，大腸桿菌BW25113WT基因組DNA為模板獲得/eWWCD構建/eM*G462D突變體。然后，消化SOE產物，并將其克隆到限制性位點Acc65和Xbal，以此生成PZE—leuABCD。接下來，利用獲得的質粒為模板，A106和A109為引物，進行PCR擴增獲取/ew/Pv9CD。此產物經過Sail和BglIT的切割，連接到經SalI和BamHI消化過的pCS27中，由此生成pCS48。以A110和A112為引物，從義應一/^"BW25113WT基因組DNA擴增出z/"基因。然后，用Acc65和Xhol切割；7^4基因，并將其連接到用Acc65和Sall消化過的pCS48開放載體中，由此生成pCS51。以WcSfAcc65和Wc6rSal1為引物，從義應許漭S『25"3WT基因組DNAPCR擴增WW基因。得到的PCR產物經過凝膠純化，并用Acc65和Sail進行消化，然后，連接到用同一對酶切割過的pCS48開放載體中，由此生成pCS50。以thrAfAcc65和thrCrHindin為引物，對WT進行PCR擴增。獲得的產物經過Acc65和HindIII的消化，連接到用同一對酶切割過的pSA40上，由此生成pCS41。為將pCS14的復制起點從co正l置換到pSC101，用Sacl和AvrII消化pZS24-MCSl。較短的片段經過凝膠純化，被克隆到用相同的酶切割過的pCS41質粒中，由此生成pCS59。以thrAfAcc65和thrCrHindIII為引物，從大量生產蘇氨酸的微生物ATCC21277中分離的基因組DNA進行PCR擴增抗反饋抑制突變體以及f/2M和ArC。最終產物經過Acc65和HindIII的消化，連接到用同一對酶切割過的pSA40上，由此生成pCS43。為將pCS43的復制起點從co正l置換到pSC101,用Sacl和AvrII消化pZS24-MCSl。較短的片段經過凝膠純化，被克隆到用相同的酶切割過的pCS43質粒中，由此生成pCt49。通過P1轉導，分別從菌林JWXXX和JWXXX(Baba等)中缺失支鏈氨基酸轉氨酶(由z/v￡編碼)和酪氨酸轉氨酶(由編碼)。為了克隆L-纈氨酸生物合成基因i),7v///CD(EC)和ii)(BS)以及,7vCD(EC),利用Sacl和AwII消化，將pZS24-MCSl中的低拷貝復制起點(ori)轉移并連接到i)pSA54和ii)pSA69的相應位點，由此分別生成質粒pIAAl和pIAAll。為了從乳酸乳球菌中克隆yb'w/以及從釀酒酵母中克隆爿D//2，利用Sacl和AvrII消化以去除pSA55的ColEl復制起點，并用經相同限制性內切酶消化過的pSA54的p15A復制起點置換，由此生成pIAA13。為了更好地控制這些基因的表達，以lacISacIf和lacISacIr為引物，用KOD從大腸桿菌MG1655基因組DNA擴增/ac/，并連接到準備與氨千西林抗性基因、bla—同表達的pCS22的Sacl位點上，由此生成pIAA12質粒。為了在染色體的BW25113/F，上過度表達/e"BC，D操縱子，用Pli^o-i啟動子置換天然啟動子和前導序列。以lac01KanSOEf和lac01LeuAlr為引物，用KOD聚合酶以從pZE12-luc中擴增Puac(m啟動子。以KanLeuOlf和Kanlac01SOEr為引物，從pKD13中擴增編碼抗卡那霉素的基因加入lpL的各反應產物作為4莫4反，并以KanLeu02f和lac01LeuA2r為引物，采用SOE技術并以KOD聚合酶進行擴增。以leuKOvl和leuKOv2為引物，從卡那霉素耐受克隆的基因組DNA擴增出所述新構建體，然后，對其進行序列分析以確定克隆的準確性。為了從質粒中過度表達/e^4SCD操縱子，利用Sacl和AvrII去除來自pSA54的pl5A復制起點，并連接到pCS22的相應點位上(ColEl,CmR,PLiacal:/e"BCD)，由此生成pIAA2質粒。為了更嚴格的表達，按照前文所述的生成pIAA12的方式對/ac/進行擴增，并將其連接到與氯霉素抗性基因一同表達的pCS22上，由此生成pIAA15質粒。通過連接經Xhol和Ndel消化過的pIAA15的5.5kb片段以及連接經相同限制性內切酶切割過的pZE12-leuABCD(Co正l,AmpR,Pli恥(m:/eMy4(G"^^4)SCD)2.3kb片段，生成含有編碼IPMS(G462D)的/eW(0/3^5J)的pIAA16質粒。為了控制表達水平，置換pIAA15中的RBS，以與pIAA16相匹配。為此，將經過HindIII和Ndel消化過的pIAA16的5.6kb片段與經相同酶消化過的pIAA15的2.2kb片段連接起來，由此生成pIAA17。媒券產與凝券。對于最初的生產試驗，菌林在改良的M9培養基(每升水含6gNa2HP04，3gKH2P04，lgNH4CI,0.5gNaCl，lmMMgS04,1mMCaCl2,10mg維生素Bl)中生長，此培養基包含10g/L的葡萄糖、5g/L的酵母抽提物以及1000X微量金屬混合物A5(每升水含2.86gH3B03，1.81gMnCl2.4H20，0.222gZnS04-7H20，0.39gNa2Mo04.2H20,0.079gCuS04.5H20，49.4mgCo(N03)2'6H20)。-從3ml過夜的LB培養基中取1%接種到置于125mL螺旋蓋瓶中的10mL新鮮培養基中，并在37°C旋轉搖床上培養4小時。然后，向培養基中加入1mlIPTG在30°C下生長18個小時進行誘導根據需要加入抗生素(氨千西林lOOpg/mL,氯霉素35pg/mL，卡那霉素50jxg/mL)。對于一些醇發酵實驗，從LB平板上挑出單個菌落，并將其接種到含有適量抗生素(氨芐西林100貼/mL、卡那霉素50pg/mL和壯觀霉素50嗎/mL)的3mlLB培養基中。然后，將此LB培養基置于37。C旋轉搖床(250rpm)上過夜培養。之后，再將該過夜培養物接種(1%vol/vol)到置于250ml錐形瓶中的20ml含有以下物質的M9培養基中(6gNa2HP04，3gKH2P04,0.5gNaCl,lgNH4Cl，lmMMgS04,10mg維生素Bl和O.lmMCaCl2,每升水)30g/L的葡萄糖、5g/L的酵母抽提物、適量抗生素以及1000X微量金屬混合物A5(每升水含2.86gH3B03，1.81gMnCl2-4H20，0.222gZnS04.7H20,0.39gNa2Mo04'2H20,0.079gCuS04-5H20，49.4mgCo(N03)2'6H20)。將此培養基置于37。C的旋轉搖床(250rpm)上培養，直到其006()()達到0.4-0.6。然后，取12mL培養基轉移到250ml螺旋蓋錐形瓶中，并加入ImMIPTG進行誘導。將被誘導的培養物置于30。C旋轉搖床(240rpm)上培養。在接下來的三到四天里，打開螺旋蓋錐形瓶取樣，并采用離心分離或過濾的方式處理培養液，以回收上清液。在所述的一些實驗中，在誘導的同時直接加入8g/L蘇氨酸到細胞培養物中。除非另有說明，所有a-酮酸實驗均在"富"氧條件下進行。對于富氧實驗，將3mL的LB過夜培養物取1%接種到裝在250mL帶擋板搖瓶的10mL培養液中。對于缺氧實驗，則如前所述對置于125mL螺旋蓋燒并瓦中的10mL培養液接種。所有培養物都在37。C下培養4小時，并加入lmMIPTG誘導，再在30°C下培養18個小時后收獲培養物。如前所述執行終產物實驗，不同之處為使用置于250mL螺旋蓋燒瓶中的20mL含有5g/L葡萄糖的改良M9培養基。/七'談#趁濟。用配備火焰離子化檢測器的氣相色譜儀(GC)對產生的醇類化合物進行定量測定。此系統由5890AGC型(惠普，埃文代爾，賓夕法尼亞州)和7376A型自動進樣器、取樣器和控制器(惠普)組成。將培養液的上清液(O.lml)以分流進樣模式(分流比為1:15)進樣，并使用甲醇作為內標物。用購自AgilentTechnologies(圣克拉拉，加利福尼亞州)的DB醫WAX毛細管柱(30m，0.32mm-內徑，0.50pm-膜厚)分離醇產物。初始GC爐溫為40°C，保持5min,然后，以15°C/min的梯度逐漸升溫，直到升至120。C。接著，以50。C/min的梯度逐漸升溫，直到升至230。C，保持4min。以氦氣作為載氣，進氣壓力為9.3psi。進樣器和檢測器保持在225°C。以分流進樣模式注射0.5ul培養物上清液，分流比為1:15。使用甲醇作為內標物。對于其他分泌的代謝產物，向配備自動取樣器(Agilent科技)和BioRad(Biorad實驗室，Hercules，加利福尼亞州)AminexHPX87柱(5mMH2S04,0.6ml/min,柱溫65°C)的Agilent1100HPLC儀載入過濾的上清液(20uL)。通過折光率檢測器檢測葡萄糖，用光電二極管陣列檢測器檢測有機酸，檢測波長為210nm。對標準曲線應用外推法測定濃度。對于其他分泌的代謝產物，將過濾的上清液(0.02mL)加樣到配備自動取樣器(Agilent科技)和BioRad(Biorad實驗室，Hercules,加利福尼亞州)AminexHPX87柱(0.5mMH2S04，0.6ml/min，柱溫650C)的Agilent1100HPLC儀上。通過折光率檢測器檢測葡萄糖，用光電二極管陣列檢測器檢測有機酸，檢測波長為210nm。對標準曲線應用外推法測定濃度。丄-鑌^凝^丄-^^凝i參合4邊徑差^^4込邀多產43-f差-7-T寧。為了在大腸桿菌中生成3-甲基-l-丁醇，從丙酮酸到3-甲基-l-丁醇的整條途徑都要過度表達。iMHCD(義廯并^V、kivd(ADH2(凍潘#凈)都在Puac(M啟動子的控制下通過質粒(pSA54和pSA55)表達。通過用JCL16中的Puaco-!啟動子置換leuA的上游非編碼區域，使leuABCD操縱子得以過度表達。經過18小時的IPTG的誘導，此菌株可生成56mg/L3-甲基-l-丁醇(圖47A)。為了提高3-甲基-l-丁醇的產量，使用來自枯草芽孢桿菌的alsS置換ilvffl，置換后顯示3-甲基-l-丁醇的產量得以增加(67mg/L)(圖47A)。為了增強亮氨酸生物合成途徑的表達水平，leuABCD也被克隆到pl5A衍生的質粒中，并在PUac(M啟動子的控制下表達。leuABCD基于質粒的表達提高了含有ilvIH(177mg/L)或alsS(124mg/L)(圖47B)菌林中的3-甲基-l-丁醇產量，但alsS的過度表達也導致異丁醇產量的急劇增加。宿主中爭奪碳和還原能力的途徑^皮缺失。與野生型(WT)背景相比，aW五、yh仿C、W/l4、pto、和的缺失提高了大腸桿菌中異丁醇的產量。對于表達0/W的菌林，當3-曱基-l-丁醇途徑被轉入此菌抹時，3-曱基-l-丁醇的最終滴定濃度為76mg/L(圖47B)。雖然3-甲基-l-丁醇的累積量減少，但醇產量是由異丁醇決定，其最終濃度超過1.3g/L。由于此過程異丁醇的滴定濃度是目標產物的10倍，因此，對此過程及代謝途徑進行檢查以解釋結果。^^^虔i^^s4W^源，。如圖50所示，2-酮丁酸和2-酮戊酸分別是正丙醇和正丁醇的前體。2-酮丁酸是源自蘇氨酸的常見中間產物，并且是異亮氨酸生物合成的一個前體，2-酮戊酸則是少見的代謝產物，可用于細胞合成非天然氨基酸-正纈氨酸。為了增加用于生產正丁醇的2-酮戊酸累積量，利用質粒pSA62過度表達來自大腸桿菌的基因和/ew^4iCD以i)引導2-酮丁酸方向的較高代謝通量和ii)使正纈氨酸化學合成途徑成為主要的2-酮戊酸生產途徑(圖50)。Kivd和Adh2也通過pSA551得以過度表達，使兩種酮酸轉化為乂十應的醇。除了ybvd和ADH2以外，,7v乂和/e"SCD的過度表達使BWWT中正丙醇和正丁醇的產量提高了5倍，從實際上無法檢測的量分別提高到約60mg/L和30mg/L(圖51)。然而，氨基酸生物合成在轉錄和酶水平上的天然反饋調控對蘇氨酸的生成有持續影響，從而，導致24小時后正丙醇和正丁醇產量處于穩定狀態，異丁醇和乙醇產量則穩步增長，以消耗過量的NADH。為了確認蘇氨酸限制是不是主要瓶頸，在誘導時向大腸桿菌培養基中加入8g/L蘇氨酸。結果證實了此設想在72小時內，丙醇和丁醇的量逐漸累積并達到2g/L,這兩種醇的量大約都增長到了10倍。既然蘇氨酸造成的ThrA轉錄衰減和別構反饋抑制是主要調控機制，在非天然啟動子后的ThrA的抗反饋突變體有助于解除對蘇氨酸合成的調控，因此能夠提高下游醇的產量。抗反饋ThrA(標記為ThrA*，是一種具有超級生產蘇氨酸能力的菌抹，ATCC21277)。此菌抹的Z/2M^C操縱子被克隆到pCS49質粒并在PLlac01啟動子的控制下進行表達。為了進行比較，WTAM5C操縱子被克隆到pCS59并在PLlac01的控制下表達。加入ThrA4BC過度表達后，正丙醇和正丁醇的產量比無ThrA*BC的菌林提高三到四倍(圖51)。在相同的BWWT背景下及在BWAweL4、AW/2、Az7vS、A"v/,Aat//^條件下，帶有WTThrABC過度表達的菌抹比帶有ThrA*BC過度表達的相同菌抹的兩種目標醇產量低10~20%(圖51和圖54)。這證實了雖然胞內蘇氨酸累積量較少，但仍然能在較低水平上影響WTThrA的活性。正如異丙醇產量降低所解釋的(圖51)，AM*5C的存在有助于引導代謝產物通量更多地朝向蘇氨酸途徑，從而，提高了正丙醇和正丁醇的總生產能力。《爭'/^^徑W潘統。為了進一步增加丙醇和丁醇生產的滴定濃度，去除參與竟爭的不良反應的酶，以避免對期望中間產物的消耗及降解。由于蘇氨酸的產生是2-酮丁酸合成中的重要^v險點，應首先失活高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶weL4和蘇氨酸脫氬酶W/;,以降低期望的蛋氨酸合成前體的損耗，并阻礙蘇氨酸生成2-氨基-3-酮丁酸的分解代謝。隨著we"和的破壞，正丙醇和正丁醇的總產量增加到約1.2g/L(如圖52所示)，其中正丙醇占主要部分。在正丁醇的生產上可以見到這兩個基因的缺失影響不太顯著，其可能是由于2-酮丁酸被分向參與異亮氨酸途徑和/或提供乙酰-CoA的原因。為了進一步保留乙酰-CoA和2-酮丁酸這兩個生成正丁醇的主要前體，需破壞纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成中的第一步酶反應。去除乙酰羥酸合成酶同功酶(AHASI)的大催化亞基(由//vS編碼)以及AHASIII的催化亞基(由,7v/編碼)能夠導致產生上述氨基酸的營養缺陷體。這兩種額外的缺失導致正丁醇產量增加兩倍(圖52)，正丙醇產量保持不變。另外，由于消除了異丁醇和(2-，3-)甲基-丁醇的前體，從而，也幾乎中止其生產。異丁醇累積量很少可能是由IlvE催化的纈氨酸合成途徑中最后一步反應的逆反應造成，這一途徑導致培養基(補充酵母抽提物)中的纈氨酸被消耗并被反轉化為它的前體2-酮基-異戊酸。為了降低乙醇產量，需缺失義廯并^"基因。雖然的破壞未能顯著增加C3和C4醇的總產量，但是由于它使醇的生成量從0.25g/L降83至)J0.1g/L左右，因此，實際上增加了特異性。隨著這些基因從基因組中消除，最終菌林(Awe"、A,7v5、A,7v/、A^/M")的正丙醇和正丁醇產量比例接近1:1,且乙醇的積累量很少，異丁醇和(2-,3-)甲基-丁醇的產量處于基礎水平。,,祭/七'^戎^:錄##力攀^溯/定。由于本發明所述的正丙醇和正丁醇的生產強烈依賴于宿主的氨基酸生物合成機器，因此，需要證實蘇氨酸下游的必要醇前體不受細胞中存在的各種氨基酸調控機制的限制，特別是異亮氨酸和亮氨酸分別抑制IlvA和LeuA的酶活性。TdcB是大腸桿菌的異化蘇氨酸脫水酶，其可替代IlvA催化蘇氨酸生成2-酮丁酸的脫氨基作用，同時它又天生對異亮氨酸反饋抑制不敏感。為了評估這種替代性酶對生產的益處，fcfc5通過pCS20中的/eW5CD在PJacOl后過度表達。結果顯示，TdcB催化的兩種目標醇產量比IlvA低70%(圖53)。很有可能通過添加酵母抽提物產生的微量異亮氨酸對IlvA酶活性的抑制作用并不顯著。因此，在給定的實驗條件下，TdcB對反饋抑制的不敏感與其自身的酶活相比顯得不太重要。類似地，存在于酵母抽提物中的亮氨酸對LeuA的反饋抑制可用于構建并才企測/eW*反饋不敏感突變體G462D。通過使用SOE進行定點導向誘變，在/^4*上引入點突變，在pCS51質粒中過度表達產生的/e"*SCD操縱子。如圖53所示，反饋不敏感的LeuA*未能提高正丙醇和正丁醇的產量。這再次證實了存在于細胞中的亮氨酸的量很可能低于能夠對LeuA酶活性起不良作用的抑制水平。aCftS-萬wC時25j!丙寧弄jHT寧及岸諷產參。圖54顯示了具有pCS49、pSA62和pSA551質粒(CRS-BuOH23)的最終菌林BWAmeL4、Afc^、A,7v8、A,7v/、Aat/Z/五產生醇和代謝產物的時間過程。在72小時內，丙醇和丁醇的產量幾乎呈直線上升，到第三天結束時似乎達到高峰。同樣的模式也可見于乙醇生產中。Afl^/背景中生成的乙醇可能是由于Kivd對丙酮酸的親和性較小所致。另一方面，醇生產階段后，主要代謝產物乙酸和乳酸的胞外產量繼續顯著增長，這可能是乙酰-Coa和NADH過量所致。如圖54所示，對葡萄糖的消耗主要發生于醇生產階段，并且似乎與細胞生長無關。頭24小時過后，細胞停止生長，并在醇生產階段以后的幾天似乎仍然保持停止。^:發,參w移,及^^^參襲W^/^么麥詢主要的混合酸發酵基因^//2丑.W/2丄戶to,/y^以各種組合形式被缺失，以進一步表征本發明的C3/C4醇生產體系。如表12所示，乙醇的生產主要消耗過量的NADH,而aW五的破壞則導致乳酸更加顯著的積累。當W/l4被缺失后，乙醇的分泌量約為lg/L,而乙酸的產量也有所增加。在pto和敲除菌林中均觀察到葡萄糖消耗量的減少。aW五、/J/L4、/to的缺失及它們的組合的缺失都會導致丙醇和丁醇產量的降低，/^/S對這一方面的影響不太顯著。這說明乙酰-CoA的大量積累是由丙酮酸脫氫酶復合體(PDHc)而非PflB復合體的活性造成。表11發酵基因敲除對目標醇及次要副產物水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>采用本文所述的材料和方法對細胞進行72小時的培養。表中所示為第72小時時間點的數據。通過異源hvd和W/72以及大腸桿菌/ewA8CD#AM*8C的過度表達，本發明闡述了正丙醇和正丁醇的生產。利用2-酮戊酸生產正丁醇不可避免地會涉及到中間產物2-酮基丁酸和非自然的正纈氨酸生物合成途徑。由于Kivd對2-酮酸和2-酮丁酸的親合力相近，并且2-酮丁酸是LeuA的第二底物，所以正丙醇與正丁醇被一同生產出來，且數量也接近。對蘇氨酸生物合成的去調節以及對we"和催化的分支途徑的消除成功地保持了蘇氨酸的積累，并且提高了正丙醇和正丁醇生產的滴定濃度。另一方面，賴氨酸生物合成雖然與蘇氨酸途徑岔開，但是并沒有消除其參與細菌細胞壁合成的重要中間體二氨基庚二酸。然而，要考慮賴氨酸營養缺陷體的重要性。通過合理的設計，蘇氨酸超生產也能體現在/;;^4缺失的有益影響中。通過利用鈍化的AHASI和III中斷纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑，可以進一步提高正丁醇生產能力，使正丁醇的產量增加兩倍，但是對正丙醇沒什么效果。這種選擇性增加要歸因于i)可利用的2-酮丁酸和乙酰-CoA增多；ii)亮氨酸途徑中，其天然底物釋放必要的酶LeuABCD。如圖54所示，在實驗條件下，每種醇的產量約為13~15mg/L/hr。菌抹對正丙醇和正丁醇耐受性的增強可進一步提高生產能力。轉錄調控與減弱是氨基酸調控的兩種主要機制，由于本發明中的所有必要基因被克隆到非天然啟動子之后并被表達且不具有前導序列，因此這兩種機制對本發明中的關鍵酶影響很小。另一方面，不能忽略由酶的氨基酸產物特別是IlvA和LeuA引起的酶別構反饋抑制。TdcB是生物降解型蘇氨酸脫水酶，它在過量氨基酸和稀少葡萄糖存在情況下為厭氧生長的細胞提供代謝能。它的表達是通過分解代謝物抑制進行轉錄控制，并通過降低其對蘇氨酸的Km值由其別構效應因子AMP進行激活。由于高濃度的丙酮酸和一些2-酮酸(包括2-酮丁酸)會抑制TdcB的酶活，因此當沒有足夠的AMP來抵消負面影響時，這些中間代謝物的積累對TdcB酶活力有有害影響，并且，當細胞內缺乏足夠的AMP水平時，由于TdcB對蘇氨酸的Km值比IlvA的高，脫氨基速率會減慢，因此造成醇的總生產能力的下降，見圖53(缺乏異亮氨酸的情況下，提純的大腸桿菌//v」的Km:8mM，缺乏AMP的情況下，大腸桿菌TdcB的Km=20mM)。對于LeuA*突變體，有可能是在亮氨酸合成途徑中朝2-酮基-異戊酸方向選擇的G462D突變體導致了它對2-酮丁酸親合力的降低。減少半好氧培養環境中發酵副產物的努力已經引起了對現有生產系統中NADH(P)H平衡的注意。蘇氨酸的生物合成需要消耗三分子的NADPH和兩分子的ATP，而起始于2-酮基丁酸的正丁醇和正丙醇的生產所消耗的NADH分別為零凈分子和一凈分子。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶由基因p/x;編碼，其組成性作用能夠補充蘇氨酸途徑中消耗的草酰乙酸(OAA)并維持TCA循環的進行。在半好氧條件下，TCA循環的部分活性會導致產生過多的還原能力，因此，乙醇和乳酸等發酵產物可用來消耗過多的NADH。如表11所示，乙醇是更好的NADH消耗者，其消耗的NADH比乳酸產生的NADH多一分子。aW五破壞后，乳酸的分泌會更顯著；另一方面，當W/l4缺失時，約lg/L乙醇累積在培養液中。隨著氧氣逐漸減少造成的TCA循環活力降低，以及涉及糖酵解的下游途徑的失效，乙酸的生產似乎是產生ATP的主要來源及消耗過量乙酰-CoA和/或丙酮酸的來源。通過比較圖51和54中的WT菌林和CRS-BuOH23菌抹，便能解釋丁醇生產與乙酸分泌間的負相關性。正如預期的那樣,/to的消除降低了葡萄糖的消耗以及細胞在特定培養體系中的生長。然而，不能消除乙酸的生產，原因正在調查。從培養液中曱酸的缺乏及;y^敲除對細菌的丁醇生產能力影響不顯著可以看出，PDHc似乎是乙醇生產階段的乙酰-CoA的主要提供者。最初的假設是，正丁醇的產量要遠高于3-甲基-l-丁醇的產量，這是由基因產物A:m/和/ez^4對底物a-酮異戊酸的爭奪造成。為了驗證這一假設，對異丁醇和3-甲基-l-丁醇的a-酮酸前體即hvd底物進行了檢查。為了達到這一目的，在Puaeo-!的控制下將/e^SCD和a/,W-//vCD在衍生自ColEl的質粒(源自pSC101的質粒)中進行表達。在缺氧及富氧條件下，此異丁醇前體和/eW底物即a-酮異戊酸(KIV)是主要產物(圖48A)。KIV的最終濃度分別為0.25和0,29g/L，而3-甲基-l誦丁醇前體即a誦酮基異己酸(KIC)未檢測到(〈5mg/L)。為了增加KIC的累積量，我們將RBS的天然序列改變成更加共有的序列來^是高/e"的表達水平。/eW基因產物的的增加表達使KIC的濃度增加到0.20g/L，但KIV仍是主要產物(0.37g/L)(圖48A)。該結果表明，3-曱基-l-丁醇產量的降低并不完全出于對KIV的爭奪，而是由于/a^基因產物(異丙基蘋果酸合成酶)活性低造成。異丙基蘋果酸合成酶(IPMS)催化KIV與乙酰-CoA的縮合反應。a-酮異戊酸的累積可能是由于a-酮基異己酸合成的游離L-蘇氨酸引起IPMS反饋抑制造成。為了解除/e^基因產物的反饋抑制，可以采取兩種策略第一種，采用IPMS(IPMS(G462D)的反饋不敏感突變體；第二種，通過缺失//vii'(支鏈氨基酸轉移酶)和(y/W(酪氨酸轉氨酶)，使L-亮氨酸合成途徑的最后一步反應失活，這兩種同工酶負責將a-酮基異己酸轉化為L-亮氨酸。當IPMS(G462D)被表達時，產物的分配明顯流向KIC,最終產物濃度為1.61g/L,而KIV累積量減少到0.17g/L(圖48A)。在表達WTIPMS的菌抹中，//vE失活使KTC的產量增加到0.53g/L,//v￡和(y^的缺失則使KIC的累積量進一步增加到1.23g/L(圖48B)。A,7vE和A,7vEA/^5背景下的KIV產量與/7v￡"_yrS+菌林中的KIV產量接近，其最終濃度分別為0.40g/L和0.37g/L。通過將AZ/v五及A,7v五A(yM宿主菌抹與IPMS(G462D)的表達結合起來，KIC的產量可分別增加到2.31g/L和1.95g/L(圖48B)。由于KIC產量增加，所以用WTIPMS或IPMS(G462D)改變丙酮酸生成3-甲基-l-丁醇的整條反應途徑。與酮酸生產相似，在//V^(y^+背景下，帶有WTIPMS的菌抹仍然產生大量異丁醇(169mg/L)，但3-甲基-l-丁醇是主要產物(308mg/L)(圖49A)。正如預期的那樣，當IPMS(G462D)在//v纊，3+背景下表達時，3-曱基-l-丁醇是主要產物，其最終滴定濃度為459mg/L,異丁醇的累積量僅為15mg/L(圖49)。通過突變解除IPMS反饋抑制后，產物分配從使用WTIPMS的1.8:1(3-曱基-l-丁醇:異丁醇)變為超過30:1。其他常見代謝副產物包括丙酮酸、延胡索酸和乙酸的積累量極少(表12)。表123-甲基-l-丁醇生成菌林的代謝副產物l代謝產物濃度(g/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>aND=未檢測到其他代謝產物例如乳酸和琥珀酸均未檢測到。當測定表達WT/e"基因產物的A//vEA(yW菌抹生產的3-甲基-l誦丁醇時，測定結果與包含變異IPMS的菌林相似。3-曱基-l-丁醇的最終累積濃度為553mg/L，而異丁醇僅為42mg/L(圖49)。這相當于大于13:1的3-甲基-l-丁醇和異丁醇的產物分配比。本發明提供了生產高級醇的合成方法，此醇可以用作下一代生物燃料。本文提供的實施例以大腸桿菌為宿主細胞，對其進行代謝修飾，使其包含重組生物合成途徑。但是，應當了解，其他微生物如釀酒酵母也可提供合適的宿主細胞，使其包含重組生物合成途徑。這些宿主微生物生長速度快且均為兼性厭氧生物，這就保證了用于大規^莫生產、靈活經濟的工藝設計的可行性。但是，從其他微生物引入非自然途徑這一做法具有一定的缺點異源途徑的表達可能導致代謝失衡，異源代謝產物的累積可能引起細胞毒性。例如，丙酮丁醇梭菌的正丁醇生產途徑具有三種帶有輔酶A(CoA)的中間代謝產物。這種途徑的過度表達會導致游離CoA庫^f皮耗盡，從而，擾亂大腸桿菌的代謝。為了實現目標外源產物的高產，需要尋找與宿主相容的途徑。本文提供的修飾微生物利用了大腸桿菌的現有代謝能力，以及降解2-酮酸的埃利希途徑的最后兩步反應的一系列底物，而不是直接將1-丁醇生產的共同途徑直接轉入非自然宿主大腸桿菌。2-酮酸是氨基酸生物合成的中間產物。這些代謝物可通過具有廣泛底物范圍的2-酮酸脫羧酶(KDC)轉化為乙醛，然后，通過醇脫氬酶(ADH)轉化為醇。采用這種策略需要兩個非天然步驟，即通過將氨基酸生物合成途徑的中間代謝物轉入醇生產途徑來生產生物燃料(圖1A)。氨基酸生物合成途徑產生各種2-酮酸(圖1B)。在當今研究中，有六種不同的2-酮酸用于醇生產。異亮氨酸生物合成途徑產生2-酮丁酸和2-酮基-3-甲基-戊酸，它們可分別轉化為正丙醇和2-甲基-l-丁醇。纈氨酸生物合成途徑產生2-酮基-異戊酸，此化合物是異丁醇的前體。亮氨酸生物合成途徑產生2-酮基-4-甲基-戊酸，此化合物是3-甲基-l-丁醇的底物。苯丙氨酸生物合成途徑產生苯丙酮酸，此化合物可生成2-苯基乙醇。正纈氨酸生物合成途徑是亮氨酸生物合成的副反應，產生正丁醇的底物即2-酮基戊酸。2-酮酸脫羧酶活性可由以下基因之一產生來自顏^,鉤々PDC6;來自逸^逸嫌蘿的ybvc/;來自被潘綍鉤々777/3fbi-銜岸己凝應凌躇J以及來自丙源r舉凝處的pdc。醇脫氫酶(Adh)活性由來自麟源發鉤々爿D/^提供。纈氨酸由兩個丙酮酸分子合成，其反應途徑有四步且由四個酶催化，包括AHAS(,/v/W基因產物)、還原異構酶(,7vC基因產物)、二雍酸脫水酶基因產物)和轉氨酶B("v￡基因產物)。與其他微生物一樣，這些酶也能催化從丙酮酸和2-酮基丙酸生成L-異亮氨酸的合成反應。后者是通過蘇氨酸脫水酶(Z/v乂基因產物)由L-蘇氨酸生成。AHAS是支鏈氨基酸合成的關鍵酶。纈氨酸引起AHASI和AHASIII的反饋抑制，前者由//v67V編碼，后者由乙酰羥酸合成酶操縱子//v///編碼，研究顯示其小調控亞基TlvN和IlvH是對纈氨酸的敏感性所必需的。此醇類生產策略中的一個酶是KDC,這種酶在植物、酵母和真菌中常見，但是在細菌中比較罕見。產生的乙醛可由Adh轉化為醇，Adh存在于許多微生物中。一些KDCs具有廣泛的底物范圍，另外一些則比較特異。為了測試內源2-酮酸作為大腸桿菌KDC底物的能力，用五種KDC及釀酒酵母的醇脫氫酶2(Adh2)進行了過度生產，這五種KDC包括來自麟潘摔鉤々Pdc6、ArolO、Thi3;來自逸^#乙承豚的Kivd;以及來自^4￥7"舉凝霧的Pdc。表達這些外源基因的大腸桿菌培養物在含有0.2M葡萄糖的基本培養基中生長。GC-MS分析(見表13)顯示，表達A:/w/或爿i^川的菌林產生了所有預期的醇。尸DC6和丙源7"舉炎^"/^c產生的種類沒有這么多，而顏源#母未表現出預期的活性。表13顯示了用大腸桿菌KDC和ADH產生的以下醇。KDCKivdARO10PDC6THI3Pdc(C.A.)質粒pSA55pSA56pSA49pSA57pSA59產物(pM)正丙醇520290125未檢測到未4企測到異丁醇52422094260未檢測到75正丁醇22095未檢測到未才全測到未4企測到2-曱基-I-丁醇76665256未檢測到未才企測到3-甲基-l-丁醇1495109992未才全測到未檢測到2-苯基乙醇324469未才全測到未檢測到175結果檢測到微量的醛，這說明Adh2具有足夠的活性。這個結杲證實了Kivd是一種具有活性且功能全面的脫羧酶，因此，適于本發明的目的。向表達hvd的大腸桿菌培養物中加入各種2_酮酸(見表12)，證實了相應醇類的特異性產量增加2-23倍。2-酮酸的補充也顯著降低了其他醇類的產量。結果表明，增加2-酮酸的通量有利于提高醇的生產能力以及醇生產的特異性。表13顯示在補充以下2-酮酸時的醇產量tototo1苯丙酮酸.酮丁酸.酮基-異戊酸.酮戊酸.酮基-3-曱基戊酸.酮基-4-曱基戊酸產物(tiM)正丙醇2138未4企測到未檢測到未才全測到未檢測到8異丁醇9810016未檢測到未檢測到未斗全測到64正丁醇492未沖企測到3926未4全測到未4全測到232-曱基-l-丁醇1315未檢測到未檢測到5284未檢測到未檢測到3-曱基-l-丁醇未檢測到未才全測到52未才企測到37561052-笨基乙醇2610966未才企測到未才全測到726990對現有的大腸桿菌代謝途徑進行基因改造，以」提高特定2-酮酸的產量，從而生產所需的醇。為了生產異丁醇，對,7v///CD基因進行擴增，以增強2-酮異戊酸的生物合成(圖1B)。大腸桿菌的,7v//f操縱子編碼乙酰鞋酸合成酶，這是異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸生物合成途徑中的第一個酶。乙酰羥酸合成酶III同工酶由兩個亞基即,7v/基因產物(乙酰乳酸合成酶m的大亞基)和,/v/f基因產物(乙酰乳酸合成酶的小亞基)組成，其能夠催化大腸桿菌K-12中的異亮氨酸、亮氨酸及纈氨酸的生物合成的第一步共同反應。大腸桿菌的//v///操縱子編碼乙酰羥酸合成酶，這是異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸生物合成途徑中的第一個酶。大腸桿菌的,7vC基因編碼乙酰羥酸還原異構酶，這是平行進行的異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑中的第二個酶。大腸桿菌的ilvD基因編碼二羥酸脫水酶，這是異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑中的第三個酶。在質粒中構建由PLlac01控制的編碼〃v/、；7v//、,7v(:和//vZ)基因的操縱子。然后，將擴增的Ilv途徑與合成醇的生產途徑合并(Kivd和Adh2)以實現異丁醇生產。作為,7v///CZ)途徑的表達結果，此菌^f朱產生了23mM異丁醇，此產量比不具備/7v/Z/CD途徑過度表達的菌抹的產量高5倍(見下表14和圖2A)。表14顯示通過ilvIHCD途徑及其過度表達的醇生產，如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>結果顯示此合成途徑有效，并且能夠為高效的異丁醇生產提供所需的2-酮異戊酸。為了進一步提高異丁醇的產量，缺失一個或多個有助于副產物生成的基因，其中包括Mk/W、/w>/yW和/或"to。這些缺失會提高可供,7v///CD途徑使用的丙酮酸水平。事實上，此菌林產出了30mM異丁醇，說明這些缺失有利于異丁醇的生產。此外，此菌抹將葡萄糖轉化為異丁醇，產率為在16到24小時內每克葡萄糖產生0.21g異丁醇(圖2A，右圖)。圖42所示的其他數據還說明，這些缺失也能增加可供乙酰乳酸合成酶途徑使用的丙酮酸水平，從而影響異丁醇的生產，使64小時后異丁醇的產量從JCL16的4.5g/L(61mM)增加到JCL260的13.2g/L(356mM)。結果說明了此策略的潛力，因為產率已達到理論最大值的50%,并且并未對反應途徑和生產條件進行詳細優化。這種高產率得益于合成途徑與宿主細胞生理特性的完全相容。下表中提供了菌抹SA237的其他產率數據時間(小時-小時)產率(g/g)時間(小時)(g/L)0-16~0.3200.0016-40-0.416~7.17240-64-0.3640~12.0164-88-0.3264-17.1188-112-0.3388~19.410-40-0.34112~21.890-64-0.350-88-0.340-112-0.3430。CM9+0.5%YEO.lmMIPTG0-112小時內乙醇的產量為0.0037g/g(240mg/L)。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>起始的36g/L葡萄糖是丁=0時的值，在40.1小時時，再向培養基中添加30g葡萄糖。不同小時數的葡萄糖值代表相應時間點的葡萄糖濃度(g/L)(例如，在16小時，約22.8g的葡萄糖被代謝掉)。類似的策略被用于制備生產正丁醇的微生物。正丁醇在其天然微生物中的生產途徑被用于發酵培養，此途徑中的許多酶都是氧氣敏感型及CoA依賴型。數據顯示，通過在不具有正丁醇發酵途徑的大腸桿菌中過度表達hvt/或爿iO川，此細胞能夠在非發酵培養中由葡萄糖生產少量正丁醇(見表13),從而說明此細胞中存在相應的2-酮酸前體即2-酮戊酸。但是，2-酮戊酸不是大腸桿菌的常見代謝物。為了增加2-酮戊酸合成量，利用具有廣泛底物特異性的/e^萬CZ)途徑，此途徑的天然底物是2-酮異戊酸(圖1B)。通過利用較小的底物如2-酮丁酸-此底物的甲基數比2-酮異戊酸少一個(圖1A)，可按照與亮氨酸生物合成中類似的轉化方式合成2-酮戊酸。2-酮丁酸可由L-蘇氨酸在蘇氨酸脫水酶的催化下生成，此酶由//v乂基因編碼，或采用在問號鉤端螺旋體血清型和詹氏甲烷暖球菌中發現的另一種途徑，以乙酸和丙酮酸為起始物進行合成。在后一種途徑中，2-酮丁酸由種蘋酸通過異丙基蘋果酸異構酶(LeuCD)和(3-異丙基蘋果酸脫氫酶(LeuB)生成。為生產正丁醇，我們構建了一種在PLlacOl控制下編碼z/vA/ewASO)途徑的操縱子。具有,7vJ-/e"SCD途徑的菌抹產生了0.6mM正丁醇，這一數量比不具有,/v4-/e^4SCD途徑過度表達的菌抹增加了3倍(見下表15和圖2B)。表15顯示通過蘇氨酸途徑過度表達生產醇KDCkivdkivdkivdkivd質粒pSA55pSA55pSA62pSA55pSA62pSA54pSA62菌林JCU6J(X16KX16SA2030.8。/。L-蘇氨酸--++產物(pM)乙醇2450234332431493正丙醇520135675929849異丁醇224243221061未l全測到正丁醇220583315792322-甲基-l-丁醇76614442002未4全測到3-曱基-l-丁醇149540741349未4企測到2-苯基乙醇324358269524此外，當在培養基中補加0.8%的L-蘇氨酸時，觀察到正丁醇的產量會明顯增加到3.2mM，說明可通過IlvA介導的反應(見圖2C)由L-蘇氨酸生成2-酮戊酸。為了進一步提高正丁醇產量，將咖D基因缺失。此基因編碼二羥酸脫水酶-一種既能生成2-酮異戊酸(亮氨酸和纈氨酸的一種前體)又能生成2-酮基-3-甲基戊酸(異亮氨酸的一種前體)的酶。由于以下兩個原因此基因的缺失是有益的首先，；7vD的缺失消除了/e"5CD途徑的天然底物2-酮異戊酸，從而，減少了竟爭性底物抑制；其次，,7v/;的缺失消除了Kivd的竟爭性底物2-酮基-3-甲基戊酸和2-酮基-4-甲基-戊酸。正如預期的那樣，,/vD的缺失提高了正丁醇產量(圖2C)。由于^t^yf^"中L-蘇氨酸的高產已用于商業化生產，所以可以利用上述策略對生產蘇氨酸的菌抹進行修飾，以制備出能產生正丁醇的菌抹。為了進一步改善，有必要增加/ew/^O)途徑對非天然底物2-酮丁酸的活性，并提高Kivd對2-酮戊酸的特異性。由于2-酮丁酸也是正丙醇的底物(圖1B),因此，94增加可獲得的2-酮丁酸量也能提高正丙醇的產量(圖2B和圖2C,右圖)。從而，增加/eW5CD活性及KDC的特異性對正丁醇的高效生產至關重要。正丁醇和正丙醇生產菌CRS-BuOH23產生的醇狀況和產量如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>合計=正丙醇+正丁醇；最終乙醇116.2mg/L3-甲基-l-丁醇生產菌產生的醇狀況和產量如下表所示:3<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>兩種不同2-甲基-l-丁醇菌產生的醇狀況和產率如下表所示:2-甲基-l-丁醇菌1(AFC-2MB-01BW25113:pAFC46:kivd(乳酸乳球菌)AHD2(釀酒酵母)ilvA(谷氨酸棒桿菌)pAFC3:ilvGM(鼠傷寒沙門氏菌)ilvCD(大腸桿菌)PCS49:thrAFBRBC(大腸桿菌))時間(小時-小時)2MB產率(g/g)醇總產率(g/g)乙醇產率乙醇mg/L0-90.0260.0810.063230.69-150.0500.1710.019156.115-180.0430.1640.016196.018-210.0380.1630.016226.221-240.0370.1570.017271.624-270.0340.1440.017288.727-330.0460.1460.022376.433-390.0310.1230.018329.52-曱基-l-丁醇菌2(AFC-2MB-02:CRS22:BW25113AmetAAtdhpAFC46:kivd(乳酸乳球菌)AHD2(釀酒酵母)ilvA(谷氨酸棒桿菌)pAFC3:ilvGM(鼠傷寒沙門氏菌)ilvCD(大腸桿菌)PCS49:thrAFBRBC(大腸桿菌))時間(小時-小時)2MB產率醇總產率乙醇產率乙醇mg/L0-90.1830.3050.243301.79-150.0890.1610.014133.415-180.0830.1640.014166.518-210.0800.1690.016214.821-240.0730.1610.016256.724-270.0650.1490.017315.127-330.0580.1380.017326.533-390.0640.1510.018344.8醇總產率=2-曱基-1-丁醇、3-曱基-l-丁醇、異丁醇、正丁醇和正丙醇96大腸桿菌等非天然宿主缺乏對高級醇的耐受性。對微生物而言，異丁醇和正丁醇一樣有毒，天然的正丁醇生產菌可以耐受濃度為2%的正丁醇。為了顯示耐受性改善的潛在可能，采用連續轉移的體外進化法富集能夠提高異丙醇耐受性的突變體菌抹。數據顯示，1.5y。的異丁醇抑制野生型大腸桿菌(JCL16)。但是，經過5輪逐步提高異丁醇濃度的繼代轉移后，在2%的異丁醇中發現了生長的突變體(圖3)。這種水平的溶劑耐受性與正丁醇的天然生產菌相似或更好，說明大腸桿菌能夠適應高濃度的長鏈醇。可以利用其它策略如gTME,以進一步改善耐受性。本文所述的策略用于用大腸桿菌和其他微生物生產生物燃料。本策略利用了氨基酸生產技術并驅動氨基酸代謝中間物向2-酮酸降解途徑進行，以用于醇類的生產。本策略避免了CoA介導的化學反應，此反應存在于天然菌生產正丁醇的途徑中，并使工業規^莫的其他高級復雜醇合成成為可能。生產其他醇的具體策略可根據本文提供的合成路徑方便地設計。例如，可通過改變苯丙氨酸的合成途徑實現2-苯基乙醇的生產，在大腸桿菌中此途徑已被有效擴展。這些策略也可輕松應用于酵母或其他工業微生物。對于異丁醇的合成，其完整的合成途徑不依賴于CoA,且僅需丙酮酸作為前體。將這些策略應用于酵母時，這種特性避免了乙酰-CoA的線粒體區室化問題。這些用于異丁醇和正丁醇生產的策略提供的理論產率(0.41g/g葡萄糖)與天然正丁醇產生菌的相同。利用本發明所屬領域的技術人員熟知的方法來完成基因缺失。簡而言之，即使用BW25113(m^r』4z!tocZ,』6/isd尺5"AraiMA4/^Zlr/iaiM￡)LD7S)作為親本(例如，野生型)微生物。如文獻中所述，缺失a^￡\W/l4、/W8C、/w、py7萬和,7vZ)序列(Datsenko和Wanner,ProcNatlAcadSciU.S.A97:6640(2000))。以JW2294(Baba爭乂，MolSystBiol2:E1-E11(2006))作為供體，通過PI轉導缺失pto序列。從XL-1BLUE轉移F'以提供/oc"。本研究使用的菌種列于表16中。具體地說，為了缺失pto,去除了第2,412,772-2,414,893個核苷酸；為了缺失yk仿C，去除了第4,377,400-4,378,540個核苷酸；為了缺失a^f,去除了第1,294,669-1,297,344個核苷酸；為了缺失W/",去除了第1,439,878-1,440,867個核苷酸；為了缺失fnr，去除了第1,396,798-1,397,550個核普酸；為了缺失/y^，去除了第950,508-952,784個核苷酸。97表16<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>pSA46包含尸DC6序列。以A65和A66作為引物，(ATCC)的基因組DNA為PCR模板擴增尸DC6序列(見表17),用Acc651和Sphl消化PCR產物。然后，克隆到用同樣的酶切割過的pZE12-luc(3)中。pSA49包含y4D//2序列。以A67和A68為引物，以釀酒酵母(ATCC)的基因組DNA為PCR模板來克隆爿Z)/^(見表17)，用Sphl和Xbal消化PCR產物。然后，克隆到用同樣的酶切割過的pSA46中。通過用pl5A置換pSA49的復制起點來構建pSA53，用Sacl和AvrII消化pZA31-luc。較短的片段經過純化克隆到用同樣的酶切割過的pSA49質粒中。pSA55包含hvc/序列，此序列通過以A96和A97為引物、以乳酸乳球菌基因組DNA為模板進行PCR反應獲取(見表17)。然后，用Acc651和Sphl消化PCR產物，再克隆到用同樣的酶切割過的pSA49中。pSA56包含ARO10序列。以A98和A99為引物，以釀酒酵母(ATCC)的基因組DNA為PCR模板擴增ARO10序歹寸(見表17)。用Acc651和Sphl消化PCR產物，然后克隆到用同樣的酶切割過的pSA49中。pSA57包含序列。以A100和A101為引物，以釀酒酵母(ATCC)的基因組DNA為PCR模板擴增序列(見表17)。用Acc651消化PCR產物。用Sphl消化pSA49，用Klenow片段平端化，然后，用Acc651消化。這條鏈與PCR產物相連。pSA58包含從丙酮丁醇梭菌獲得的/x/c序列。以A102和A103為引物，以基因組DNA為PCR模板擴增獲得/^c序列(見表17),用Acc651和Sphl消化PCR產物。然后，克隆到用同樣的酶切割過的pSA49中。通過用PLlac01取代pZE21-MCSl的PLtet01序列，以構建pSA40。然后，用AatII和Acc651消化pZE12-luc，較短片段經過純化并克隆到經相同酶切割過的pZE21-MCSl質粒中。pSA45包含/7vC序列。以A71和A72為引物，以大腸桿菌MG1655的基因組DNA為模板，通過PCR反應獲得,7vC序列(見表17)。然后，用Sail和Xmal消化PCR產物，再克隆到用同樣的酶切割過的pSA40中。pSA47包含,7vD序列。以A74和A84為引物，以大腸桿菌MG1655的基因組DNA為模板，通過PCR反應獲得//vD序列(見表17)。然后，用BspEI和Mlul消化PCR產物，再克隆到用Sall和Mlul酶切割過的pSA45中。pSA51包含,7v/和//vif序列。以A70和A83為引物，以大腸桿菌MG1655的基因組DNA為PCR^f莫板擴增獲得該序列(見表17)。然后，用Bsal和Sail消化PCR產物，再克隆到用Acc651和Sail酶切割過的pSA40中。pSA52包含/7v//下游的纟/vC和//vD序列。用Sail和Mlul消化pSA47。較短的片段經過純化，克隆到用同樣的酶切割過的pSA51質粒中。通過將用Sacl和AvrII消化的pZA31-luc的pl5A的復制起點轉移到pSA52質粒中構建pSA54。pSA59包含/eM5CD序列。以A106和A109為引物，以大腸桿菌MG1655的基因組DNA為PCR模板擴增該序列(見表17)，用Sail和BglII消化PCR產物。然后，克隆到用Sail和BamHI切割過的pSA40中。pSA60包含〃v乂序列。以A104和A105為引物，以大腸桿菌MG1655的基因組DNA為PCR模板擴增該序列(見表17)。然后，用Acc651和Xhol消化PCR產物，再克隆到用Acc651和Sail切割過的pSA59中。將pZA31-luc中的pl5A復制起點克隆到pSA60質粒中，以構建pSA62。對本文提供的代表性質粒的部分描述列于表18中。pSA66包含a/M序列的3，片段。以A123和A124為引物，以枯草芽孢桿菌的基因組DNA為模板，通過PCR反應獲得alsS序列(見表17)。然后，用Acc651和Sail消化PCR產物，再克隆到用同樣的酶切割過的pSA40中。99pSA67包含a/W序列。以A125和126為引物，以枯草芽孢桿菌的基因組DNA為模板，通過PCR反應獲得alsS序列的5，片段(見表17)。然后，用BsrGI和Xbal消化PCR產物，再克隆到用Acc651和Xbal切割過的pSA66中。pSA68包含alsS下游的,7vC和z/vD序列。用Sail和Mlul消化pSA47。較短的片段經過純化，克隆到用同樣的酶切割過的pSA67質粒中。用Sacl和AvrII消化pZA31-luc中的復制起點pl5A,然后，轉移至pSA68質粒中，以構建pSA69。<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>用于PCR和克隆過程的低聚核普酸代表性清單見表17。應當了解，可以根據用于PCR和/或克隆過程的特定序列對此代表性性低聚核苷酸進行修飾。<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>A102CGAGCGGTACCATGAAGAGTGAATACACAATTGGAAG(17)A103GCCTGCGCATGCCTAATTATTTTGATTTGCAAAACGT(18)A104CGAGCGGTACCATGGCTGACTCGCAACCCCTGTCCG09)A105CCGCTCGAGCTAACCCGCCAAAAAGAACCTGAAC(20)A106ACGCAGTCGACAAGAGACAAGGACCCAAACCATGAGCCAG(21)A109GGAAGATCTTTAATTCATAAACGCAGGTTGTTTTGC(22)A123GCCACCCGTCTCCGTACCATGTTGACAAAAGCAACAAAAGAAC(23)A124ACGCAGTCGACCTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAGT(24)A125CGAGCTGTACAATGTTGACAAAAGCAACAAAAGAAC(25)A126TCTCTAGAAAGGGTACCGGCAGCTTG(26)在異丁醇生產的代表性的過程中，用pSA69和pSA55質粒對宿主菌林JCL260進行轉化。轉化涂板培養基為LB+0.5%葡萄糖+50mg/L卡那霉素+200mg/L氨千西林。將新鮮轉化子接種到2mL培養基中，培養基的成分為LB+0.5%葡萄糖+50mg/L卡那霉素+200mg/L氨千西林。然后，在37。C和290rpm轉速下對培養物進行過夜培養。從過夜培養物中取200jiL接種到置于250mL螺旋蓋燒瓶的20mL培養基M9+lx微量金屬混合物A5+7.2%葡萄糖+3%胰蛋白胨+30mg/L卡那霉素+100mg/L氨千西林中。然后，將此培養物置于37。C/260rpm下培養。當OD600在1-2(~5hr)之間時，用0.1mMIPTG誘導3軎養物，再在30°C/260rpm下培養24小時。應當通過過濾法(硫胺素)或高壓蒸汽消毒滅菌法對上述溶液分別滅菌。培養基采用過濾法滅菌。采用氣相色譜法測定異丁醇的產量，測定結果見表42-44。在圖42中，培養方法如下制備含有以下物質的M9培養基7.2°/。葡萄糖，0.5%酵母提取物，100昭/mL氨千西林，30卩ig/mL卡那霉素和1000x微量金屬混合物A5。各種包含pSA55和pSA69的敲除菌抹在含有3mLLB培養基的試管內于37°C下在旋轉搖床(250rpm)上過夜預培養。然后，按1:100的比例將此過夜的培養物稀釋到裝在250ml螺旋蓋錐形瓶的20mL新鮮培養基中。細胞在37。C下生長至OD咖2.0左右，然后，添加O.lmMIPTG。添加IPTG后，置于旋轉搖床(250rpm)上并在30°C下培養64小時。在16小時、40小時和64小時時打開螺旋蓋取樣，用GC/FID分析培養樣本。在圖43中，培養過程如下制備含有以下物質的M9培養基3.6%葡萄糖，100pg/mL氨節101西林，30|ig/mL卡那霉素和1000x微量金屬混合物A5。SA237(JCL260,包含pSA55和pSA69)在含有3mlLB培養基的試管內在37°C下在旋轉搖床(250rpm)上過夜預培養。然后，以1:100的比例將此過夜的培養物稀釋到裝在250mL螺旋蓋錐形瓶(紅色)或250ml錐形瓶(藍色)的20mL新鮮培養基中。細胞在37°C下生長至0D6Q。0.3左右。然后，添加O.lmMIPTG。添加IPTG后，置于旋轉搖床(250rpm)上并在30°C下培養72hr。在24小時、48小時和72小時時對培養樣本的異丁醇濃度、0D6。。和pH進行測定。在圖45中，培養過程如下制備用于培養的M9培養基，其含有3.6%葡萄糖，100ng/mL氨千西林，30昭/mL卡那霉素和1000x微量金屬混合物A5。再向此培養基中添加0.8%酪蛋白氨基酸(紅色)、2%胰蛋白胨(綠色)或0.5%酵母提取物(藍色)。SA237(JCL260,包含pSA55和pSA69)在含有3mLLB培養基的試管內37。C下在旋轉搖床上(250rpm)過夜預培養。然后，以1:100的比例將此過夜的培養物稀釋到裝在250mL螺旋蓋錐形瓶的20mL新鮮培養基中。細胞在37°C下生長至OD6。。0.8左右。然后，添加O.lmMIPTG。添加IPTG后，置于旋轉搖床(250rpm)上并在30。C下培養198小時。在每個時間點測定培養物的異丁醇濃度、葡萄糖濃度、0D6。。和pH。40小時時，向所有培養物中添加lmL的36%葡萄糖。在112小時時，向含有酪蛋白氣基酸的培養物(紅色)和含有胰蛋白胨的培養物(綠色)中加入5mL新鮮培養基；在112小時時，向含有酵母提取物的培養物(藍色)添加5mL新鮮培養基和2mL的36%葡萄糖。上述實施例的目的在于向本發明所屬領域技術人員完整公開和描述如何制造和使用公開內容中的設備、系統和方法的實施例，不限定發明者所考慮的發明范圍。對本發明所屬領域的技術人員顯而易見的對實施本發明的上迷方法的修改涵蓋在下列權利要求的范圍內。本說明書提到的所有專利和出版物表明了本發明所屬領域的技術人員的當前技能水平。本發明引用的所有參考文獻以引用方式并入本文中，引用程度如同單獨、完整引用各參考文獻。本發明已對一些實施方案進行了描迷。然而，應當了解，可在不偏離本發明精神和范圍情況下對其作出各種修改。因此，其他實施方案也在下迷權利要求的范圍內。權利要求1.一種產生選自下組的醇類的重組微生物(a)正丙醇(b)異丁醇，且每克葡萄糖的異丁醇產率約為0.12-約0.41g異丁醇(c)正丁醇(d)2-甲基1-丁醇(e)3-甲基1-丁醇(f)2-苯基乙醇其中，醇類由一種包含2-酮酸的代謝物生成。2.根據權利要求1所述的重組微生物，其中，此微生物經過112小時的培養，產生的乙醇低于240mg/L。3.根據權利要求1或2所述的重組微生物，其中，在相似條件下培養時，此微生物的醇生產狀況實質上與ATCC登記號為no._或_(分別為SA237或CRS-BuOH23)的微生物醇生產狀況一致。4.根據權利要求1所述的重組微生物，其中，異丁醇的產率約為0.33-0.36g異丁醇/g葡萄糖。5.根據權利要求1所述的重組微生物，其中，經過約16-64小時的培養，異丁醇產率約為0.36-0.40g異丁醇/g葡萄糖。6.根據權利要求4或5所述的重組微生物，其中，每克葡萄糖的乙醇產率低于0.0037g/g。7.根據權利要求1所述的重組微生物，其中，此微生物選自棒狀桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、沙門氏桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、歐文氏菌屬、泛菌屬、摩根菌屬、果膠桿菌屬、變形菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、酵母屬、德克酵母屬(dekkera)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)和畢赤氏酵母屬。8.根據權利要求1所迷的重組微生物，其中，為了產生醇類，對生物體內氨基酸的生物合成途徑進行了修飾。9.根據權利要求1所迷的重組微生物，其中，2-酮酸選自2-酮基丁酸、2-酮異戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-曱基戊酸、2-酮基-4-甲基-戊酸以及苯丙酮酸。10.根據權利要求1所述的重組微生物，其中，與其親本微生物相比，此微生物的乙醇生產能力較低。11.根據權利要求1或10所述的重組微生物，其中，此微生物的乙酰-coA轉化為乙醇的能力降低或受到抑制。12.根據權利要求1或10所述的重組微生物，其中，此重組微生物的乙醇脫氫酶減少，因此，其乙醇生產能力降低。13.根據權利要求12所述的重組微生物，其中，此微生物源自大腸桿菌。14.根據權利要求13所述的重組微生物，其中乙醇脫氫酶為adhE、其同源體或突變體。15.根據權利要求14所述的重組微生物，此微生物包含adhE的缺失或敲除及其同源體或突變體的缺失或敲除。16.根據權利要求1或10所述的重組微生物，其中，此微生物含有將丙酮酸轉化為a-酮基-異戊酸的酶的表達或增加表達。17.根據權利要求16所述的重組微生物，其中，酶為2-酮酸脫羧酶。18.根據權利要求1所述的重組微生物，與其親本微生物相比，此微生物含有2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性的增加。19.根據權利要求17或18所述的重組微生物，其中，2-酮酸脫羧酶選自Pdc、Pdcl、Pdc5、Pdc6、ArolO、Thi3、Kivd、KdcA和前迷各種酶的同源體或突變體，以及與前述任何一種酶具有至少60%同一性且具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。20.根據權利要求17或18所述的重組微生物，其中，2-酮酸脫羧酶由與選自以下基因的核酸有至少60%同一性的多聚核苷酸編碼；tfc，p""，/A'5，/%ifc<5，ora76，AzXhvJ、fefc4和前述任一基因的同源基因或突變體，或它們的片段，其中，這種多聚核香酸編碼一種具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。21.根據權利要求20所述的重組微生物，其中，2-酮酸脫羧酶由一種源自hW基因或其同源基因的多聚核苦酸編碼。22.根據權利要求18所述的重組微生物，其中，醇脫氫酶選自Adhl、Adh2、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、Sfal和前述任一酶的同源體或突變體，以及一種與前述任何一種酶有至少60%同一性并具有醇脫氫酶活性的多肽。23.根據權利要求18所述的重組微生物，其中，醇脫氫酶由一種與選自以下的一種核酸有至少60%同一性的多聚核苷酸編碼aW八^//^,ad/d、at//^.aW5、aW6、s/a7基因和前述任一基因的同源基因，其中，這種多聚核苦酸編碼一種具有2-醇脫氫酶活性的蛋白。24.根據權利要求1所述的重組微生物，其中，此重組微生物包含一個基因的一處或多處缺失或敲除，這個基因編碼的酶能夠催化乙酰-coA轉化為乙醇；催化丙酮酸轉化為乳酸；催化延胡索酸轉化為琥珀酸；催化乙酰-coA和磷酸轉化為coA和乙酰磷酸;催化乙酰-coA和甲酸轉化為coA和丙酮酸；催化乙酰-coA的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代異戊酸)的縮合反應，2-異丙基蘋果酸和3-異丙基蘋果酸的異構化反應；催化a-酮酸轉化為支鏈氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；催化丙酮酸酯轉化為乙酰-coA;催化支鏈氨基酸的形成；催化蘇氨酸生成a-酮丁酸的反應；催化蛋氨酸生物合成的第一步反應；以及催化蘇氨酸的分解代謝。25.根據權利要求1或24所述的重組微生物，其中，此重組微生物包含選自下組基因的一處或多處缺失at^五、W/l4、yh/8C、/"r、pto、py/仏/ew丄/e"3、/ewC、/ewD,z7v￡\，5、；wx8、//vi、W、//v/4、膨L4、緣和前述任一基因的同源基因及自然產生的突變體。26.根據權利要求1所述的重組微生物，其包含一種選自下組的基因型(a)選自下組基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、Apta、AleuA、AleuB,AleuC、AleuD、ApoxB、厶ilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增加表達，其中，此微生物可生成正丙醇。(b)選自下組基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AleuA、AilvE、ApoxB、AilvA及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增加表達，其中此微生物可生成異丁醇。(c)選自下組基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、Apta、ApoxB、AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增加表達，其中此微生物可生成正丁醇。(d)選自下組基因的缺失或敲除AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增加表達，其中此微生物可生成2-甲基-l-丁醇。(e)選自下組基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AilvE、AtyrB及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增加表達，其中此微生物可生成3-甲基-l-丁醇。(f)選自下組基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AleuA、AilvE、ApoxB、AilvA及其j壬何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增加表達，其中此微生物可生成2-苯基乙醇。27.根據權利要求26的重組微生物，其中，ThrABC是一種抗反饋抑制ThrA承。28.—種重組微生物，與其親本微生物相比，含有以下酶的表達增加或活性增力口(a)乙酰羥酸合成酶；(b)乙酰羥酸還原異構酶；(c)二羥酸脫水酶；(d)2-酮酸脫羧酶；(e)醇脫氫酶；并且其中此重組微生物含有至少一個編碼以下一種酶的基因敲除或破壞乙醇脫氫酶、乳酸脫氳酶、延胡索酸還原酶、磷酸乙酰基轉移酶、甲酸乙酰基轉移酶及其任何組合；其中，此重組微生物產生異丁醇。29.—種重組微生物，與其親本微生物相比，舍有以下酶的表達增加或活性增力口(a)乙酰乳酸合成酶；(b)乙酰羥酸還原異構酶；(c)二羥酸脫水酶；(d)2-酮酸脫羧酶；和(e)醇脫氫酶；此重組微生物含有至少一個編碼以下一種酶的基因敲除或破壞乙醇脫氬酶、乳酸脫氫酶、延胡索酸還原酶、磷酸乙酰基轉移酶、甲酸乙酰基轉移酶及其任何組合；其中，此重組微生物產生異丁醇。30.根據權利要求28或29所述的重組微生物，與親本微生物相比，其還含有丙酮酸通量的增加。31.根據權利要求28或29所述的重組微生物，其中，所述敲除或破壞包括od/^,似M,/re仿C.//7萬或pto基因、其任何組合或其任何同源基因或其任何自然產生的突變基因的缺失或表達破壞。32.根據權利要求28或29所述的重組微生物，其中，所述敲除或破壞包括W/l4、/WBC基因或其任何同源基因或任何自然產生的突變基因的缺失或表達《皮壞。33.根據權利要求28或29所述的重組微生物，其中，所述敲除或破壞包括選自下組基因的缺失或破壞"W五、W/l4,./hiSC、pto、Zm*、其任何組合，及其任何同源基因或任何自然產生的突變基因。34.根據權利要求33所述的重組微生物，包含aW￡>W/l4、/WB(:和及其同源基因或突變基因的缺失或破壞。35.根據權利要求33所述的重組微生物，包含aJ/7f,W/L4、/raC'、/to和及其同源基因或突變基因的缺失或破壞。36.根據權利要求33所述的重組微生物，包含adM、W/L4、/k仿C和/w，及其同源基因或突變基因的缺失或破壞。37.根據權利要求28或29所述的重組微生物，包含^fM:,/W丄/WBC.和的在A失或,皮壞、。38.根據權利要求28或29所述的重組微生物，其中，微生物為大腸桿菌。39.根據權利要求38所述的重組微生物，其中，敲除包含缺失此重組微生物基因組的一部分，約為大腸桿菌基因組的第1,397,551-第1,439,877個核香酸。40.根據權利要求28所述的重組微生物，其中，乙酰鞋酸合成酶由一種源自z7v//f操縱子或其同源體的多聚核香酸編碼。41.根據權利要求40所述的重組微生物，其中，//v///操縱子的,/v/基因編碼乙酰羥酸合成酶大亞基多肽。42.根據權利要求40所述的重組微生物，其中，//v/Z/操縱子的,7v/f基因編碼乙酰羥酸合成酶小亞基多肽。43.根據權利要求29所述的重組微生物，其中乙酰羥酸合成酶是來自枯草芽孢桿菌的a/W。44.根據權利要求28或29所述的重組微生物，其中，乙酰鞋酸還原異構酶由一種源自//vC基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。45.根據權利要求28或29所述的重組微生物，其中，二羥酸脫水酶由一種源自《7vD基因或其同源基因的多聚核香酸編碼。46.根據權利要求28或29所述的重組微生物，其中，2-酮酸脫羧酶由一種源自A:/w/基因或其同源基因的、或乂W(9川基因、或其同源基因的多聚核苷酸編碼。47.根據權利要求28或29所述的重組微生物，其中，醇脫氬酶由一種源自爿D//2基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。48.根據權利要求28或29所述的重組微生物，包含ATCC登記號為no.(名稱為SA237)的一種表型。49.根據權利要求28或29所述的重組微生物，包含ATCC登記號為no.(名稱為CRS-BuOH23)的基因組。50.—種重組微生物，與親本微生物相比，含有以下酶的表達增加或活性增加(a)2-異丙基蘋果酸合成酶；(b)(3-異丙基蘋果酸脫氫酶；(c)異丙基蘋果異構酶；(d)蘇氨酸脫水酶；其中，此重組微生物產生正丁醇。51.根據權利要求50所迷的重組微生物，與親本微生物相比，此孩i生物還可含有2-酮異戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸或2-酮基-4-甲基戊酸或其任何組合的水平減少。52.根據權利要求50所迷的重組微生物，與其親本微生物相比，此微生物還含有//vD基因缺失或表達破壞。53.根據權利要求50所述的重組微生物，其中，2-異丙基蘋果酸合成酶由一種源自/ed基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核香酸編碼。54.根據權利要求50所述的重組微生物，其中，P-異丙基蘋果酸合成酶由一種源自/ewS基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。55.根據權利要求50所述的重組微生物，其中，異丙基蘋果酸異構酶由一種源自/ewCD操縱子或其同源體的多聚核苷酸編碼。56.根據權利要求55所述的重組微生物，其中，/ewCD操縱子的/^C基因編碼異丙基蘋果酸異構酶大亞基多肽。57.根據權利要求55所述的重組微生物，其中，/ewCD操縱子的/ewD基因編碼異丙基蘋果酸異構酶小亞基多肽。58.根據權利要求50所述的重組微生物，其中，蘇氨酸脫水酶由一種源自基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。59.根據權利要求50所述的重組微生物，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有以下酶的表達或活性的增加^粦酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氬酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶或蘇氨酸脫水酶或其任何組合。60.根據權利要求50到59中任一項所述的的重組微生物，其中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶或蘇氨酸脫K酶分別由源自pyc,"5/C、//rv4>o/>//7rS>//2rC:、、《/"^8、tofc8基因，或其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。61.根據權利要求50所述的重組微生物，包含ATCC登記號為no._(命名為CRS-BuOH23)的一種表型。62.根據權利要求50所述的重組微生物，包含ATCC登記號為no._(命名為CRS-BuOH23)的基因組。63.—種重組微生物，與親本微生物相比，含有以下酶的表達或活性的增力口(a)a-異丙基蘋果S吏合成酶(b))3-異丙基蘋果酸脫氫酶(c)異丙基蘋果異構酶；Cd)蘇氨酸脫水酶；其中，此重組微生物產生正丙醇。64.根據權利要求63所述的重組微生物，其中，a-異丙基蘋果酸合成酶由一種源自a'mj基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核普酸編碼。65.根據權利要求63所述的重組微生物，其中，(3-異丙基蘋果酸脫氬酶由一種源自/wfi基因、其同源基因或自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。66.根據權利要求63所述的重組微生物，其中，異丙基蘋果酸異構酶由一種源自/a/CD操縱子、其同源體或其自然產生的突變體的多聚核苷酸編碼。67.根據權利要求66所述的重組微生物，其中，/ewCD操縱子的to/C基因編碼異丙基蘋果酸異構酶大亞基多肽。68.根據權利要求66所述的重組微生物，其中，/ez/CD操縱子的/ewD基因編碼異丙基蘋果酸異構酶小亞基多肽。69.根據權利要求64所述的重組微生物，其中，c/m^基因是一種詹氏甲烷暖球菌cz附v4基因。70.—種重組微生物，與親本微生物相比，含有以下酶的表達或活性的增加(a)蘇氨酸脫水酶(b)乙酰羥酸合成酶；(c)乙酰羥酸還原異構酶；(d)二羥酸脫水酶；(e)2-酮酸脫羧酶；(f)醇脫氫酶；其中，此重組微生物產生2-甲基-l-丁醇。71.根據權利要求70所述的重組微生物，其中，蘇氨酸脫水酶由一種源自z7v^基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核香酸編碼。72.根據權利要求70所述的重組微生物，其中，乙酰羥酸合成酶由一種源自z/v/Z/操縱子、其同源體或其自然產生的突變體的多聚核苷酸編碼。73.根據權利要求70所述的重組微生物，其中，乙酰羥酸還原異構酶由一種源自；/vC基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。74.根據權利要求70所述的重組微生物，其中，二羥酸脫水酶由一種源自//vD基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核普酸編碼。75.根據權利要求70所述的重組微生物，其中，2-酮酸脫羧酶由源自/bvd基因、其同源基因或其自然產生的突變基因；或尸DC6基因、其同源基因或其自然產生的突變基因；或基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。76.根據權利要求70到75中任何一條所迷的重組微生物，其中，醇脫氬酶由一種源自爿Z)/Z2基因，或其同源基因的多聚核苷酸編碼。77.—種重組微生物，與親本微生物相比，含有以下酶的表達或活性的增力口(a)乙酰羥酸合成酶或乙酰乳酸合成酶；(b)乙酰羥酸還原異構酶；(c)二輕酸脫水酶；(d)2-異丙基蘋果酸合成酶；(e)異丙基蘋果酸異構酶(f)卩-異丙基蘋果酸脫氫酶(g)2-酮酸脫羧酶；(h)醇脫氫酶；其中，此重組微生物產生3-甲基-l-丁醇。78.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，乙酰羥酸合成酶由一種源自z7v/H操縱子、其同源體或其自然產生的突變體的多聚核苷酸編碼。79.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，乙酰乳酸合成酶由一種源自z/vA/G操縱子、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。80.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，乙酰乳酸合成酶由一種源自,7viV5操縱子、其同源體或其自然產生的突變體的多聚核苷酸編碼。81.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，乙酰羥酸還原異構酶由一種源自,7vC基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。82.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，二羥酸脫水酶由一種源自//vD基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苦酸編碼。83.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，2-異丙基蘋果酸合成酶由一種源自/eW基因、其同源基因或自然發生的突變基因的多聚核香酸編碼。84.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，異丙基蘋果酸異構酶由一種源自/ewCD操縱子、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核普酸編碼。85.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，P-異丙基蘋果酸脫氬酶由一種源自/ew5基因、其同源基因或自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。86.根據權利要求77所述的重組微生物，其中，2-酮酸脫羧酶由源自基因、其同源基因；或尸DC6基因、其同源基因；或基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苦酸編碼。87.根據權利要求77到86中任一項所述的重組微生物，其中，醇脫氬酶由一種源自v4D/^基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核普酸編碼。88.—種重組微生物，與親本微生物相比，含有以下酶的表達或活性的增加(a)分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶；(b)分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶；(c)2-酮酸脫羧酶；和(d)醇脫氬酶；其中，此重組微生物產生苯基乙醇。89.根據權利要求88所述的重組微生物，其中，分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶由一種源自/7/2"基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。90.根據權利要求88所述的重組微生物，其中，分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶由一種源自tyrA基因、其同源基因或其自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。91.根據權利要求88所述的重組微生物，其中，2-酮酸脫羧酶由源自A:m/基因、其同源基因、或尸DC6基因、其同源基因、或基因、其同源基因或它們自然產生的突變基因的多聚核苷酸編碼。92.根據權利要求88到91中任一項所述的重組微生物，其中，醇脫氫酶由一種源自基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。93.—種生產一種能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為正丁醇的重組微生物的方法，此方法包括用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苦酸轉化微生物2-異丙基蘋果酸合成酶活性、P-異丙基蘋果酸脫氫酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性和蘇氨酸脫水酶活性。94.根據權利要求93所述的方法，其中，按照此方法生產的重組微生物包括在存在葡萄糖時產生的醇的狀況與ATCC登記號為no._(名稱為CRS-BuOH23)的微生物產生的醇的狀況實質相似。95.—種生產一種能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為異丁醇的重組微生物的方法，此方法包括用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核普酸轉化一種微生物乙酰羥酸合成酶活性、乙酰輕酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。96.根據權利要求95所述的方法，其中，按照此方法生產的重組微生物包括在存在葡萄糖時產生的醇狀況與ATCC登記號為no._(名稱為SA237)的微生物產生的醇狀況實質相似。97.—種生產一種能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為正丙醇的重組微生物的方法，此方法包含用一種或多種編碼具有以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化一種微生物a-異丙基蘋果酸合成酶活性、P-異丙基蘋果酸脫氫酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性和蘇氨酸脫水酶活性。98.—種生產一種將合適的底物或代謝中間物轉化為2-甲基-l-丁醇的重組微生物的方法，此方法包含用一種或多種編碼具有以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化一種微生物蘇氨酸脫水酶活性、乙酰羥酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。99.一種生產一種能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為3-曱基-l-丁醇的重組《效生物的方法，此方法包含用一種或多種編碼具有以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化一種微生物乙酰羥酸合成酶活性或乙酰乳酸合成酶活性、乙酰鞋酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-異丙基蘋果酸合成酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性、p-異丙基蘋果酸脫氬酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。100.—種生產能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為苯基乙醇的一種重組微生物的方法，此方法包含用一種或多種編碼具有以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化一種微生物分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶活性、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。101.—種命名為SA237且其ATCC登記號為no._的重組微生物。102.—種命名為CRS-BuOH23且具有ATCC登記號no._重組微生物。103.—種生產醇的方法，此方法包含(a)提供權利要求l、28、29、50、63、70、77、78、101或102中任何一項所述的重組微生物；(b)在a)存在一種合適的底物或代謝中間產物，并在將合適的底物轉化為醇的條件下培養微生物；(c)基本上純化醇。104.根據權利要求103所述的方法，其中，醇選自正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和2-苯基乙醇。105.根據權利要求103所述的方法，其中，底物或代謝中間產物包含2-酮酸。106.根據權利要求105所述的方法，其中，2-酮酸選自2-酮基丁酸、2-酮異戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸、2-酮基-4-甲基-戊酸和苯丙酮酸。107.根據權利要求103所述的方法，其中，底物包含葡萄糖，醇包含異丁醇。108.根據權利要求107所述的方法，其中，產率包括約0.12-0.41g異丁醇/g葡萄糖。全文摘要本文提供了一種用于生產生物燃料的代謝修飾微生物。具體而言，本文提供了由合適的底物生產包括異丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇的高級醇的方法。文檔編號C12P7/02GK101688175SQ200880009662公開日2010年3月31日申請日期2008年2月8日優先權日2007年2月9日發明者凱文·M·史密斯,安東尼·F·卡恩,渥美正太,羅·普·克萊爾·沈,詹姆士·C·里奧,邁克爾·R·康諾申請人:加利福尼亞大學董事會